CN115887455A

CN115887455A - 钙离子通道阻滞剂阿折地平在制备治疗子宫内膜癌的药物中的应用

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Publication number: CN115887455A
Application number: CN202210931184.8A
Authority: CN
Inventors: 王建六; 周静怡; 黄婷; 王甲琪
Original assignee: Peking University Peoples Hospital
Current assignee: Peking University Peoples Hospital
Priority date: 2022-08-04
Filing date: 2022-08-04
Publication date: 2023-04-04
Anticipated expiration: 2042-08-04
Also published as: CN115887455B

Abstract

本发明公开了一种钙离子通道阻滞剂阿折地平的药物新用途。所述新用途包括下述方面：1)在制备预防和/或治疗子宫内膜癌的产品中的应用；2)在制备抑制子宫内膜癌细胞的增殖和/或克隆形成能力的产品中的应用。本发明首先对19种上市的钙离子通道阻滞剂在子宫内膜癌Ishikawa、Hec‑1A和AN3CA细胞上进行药效筛选，实验发现马尼地平、阿折地平和西尼地平对子宫内膜癌细胞有明显的抑制增殖的效果。进一步克隆形成和EdU实验发现阿折地平具有较优的抑制子宫内膜癌细胞增殖的能力。进一步动物实验证明了阿折地平抑制子宫内膜癌进展的能力。

Description

钙离子通道阻滞剂阿折地平在制备治疗子宫内膜癌的药物中的应用

技术领域

本发明属于医药领域，具体涉及钙离子通道阻滞剂阿折地平在制备治疗子宫内膜癌的药物中的应用。

背景技术

子宫内膜癌(endometrialcancer，EC)是常见的妇科恶性肿瘤之一，其发病率逐年增加，且子宫内膜癌的发病年龄呈现年轻化趋势^[1]。目前，外科手术切除、放疗和化疗是治疗子宫内膜癌的主要手段。然而，传统的抗肿瘤药物在治疗过程中会产生毒副作用，影响患者的整体健康。加之年轻的EC患者有保留生育功能的需求，因此开发新的药物对EC患者进行安全有效的保守治疗成为目前的研究热点。

现阶段早期子宫内膜癌患者保守治疗最常用的药物是孕激素，但并非所有患者都对孕激素反应良好，因孕激素受体阴性、孕激素耐药等原因造成患者不能接受保守治疗或者初治有效后期复发的情况临床并不罕见^[2]。因此，开发新的子宫内膜癌治疗药物，对子宫内膜癌患者的保守治疗尤为重要。

钙离子通道阻滞剂(Calcium channel blocker,CCB)是一类选择性作用于电压依赖性钙离子通道的药物，临床常用于治疗高血压和心脏疾病。前期文献证明钙离子通道的激活与多种肿瘤的发生和进展紧密相关^[3-5]。电压依赖性钙离子通道主要分为高电位激活钙通道(L-,N-,P/Q-,R-型)和低电位激活钙通道(T型)。L型钙通道可以调控肿瘤细胞PD-L1的表达，增强肿瘤微环境中T细胞对肿瘤的杀伤效果^[6,7]。T型钙离子通道可以抑制乳腺癌、肝癌和黑色素瘤等多种肿瘤的增殖，还参与肿瘤的分化、细胞凋亡等生物学过程^[8]。因此，钙离子通道阻滞剂能否用于治疗子宫内膜癌成为我们下一步要解决的问题。

参考文献：

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[8]Antal L,Martin-Caraballo M.T-type Calcium Channels inCancer.Cancers(Basel).2019.11(2).

发明内容

本发明的目的是提供一种钙离子通道阻滞剂阿折地平的药物新用途。

第一方面，本发明所提供的钙离子通道阻滞剂阿折地平的新用途是其在制备预防和/或治疗子宫内膜癌的产品中的应用。

第二方面，本发明所提供的钙离子通道阻滞剂阿折地平的新用途是其在制备子宫内膜癌细胞增殖抑制剂中的应用。

第三方面，本发明所提供的钙离子通道阻滞剂阿折地平的新用途是其在制备抑制子宫内膜癌细胞的克隆形成能力的产品中的应用。

第四方面，本发明所提供的钙离子通道阻滞剂阿折地平的新用途是其在预防和/或治疗子宫内膜癌中的应用。

第五方面，本发明所提供的钙离子通道阻滞剂阿折地平的新用途是其在抑制子宫内膜癌体内肿瘤进展中的应用。

第六方面，本发明还要求保护一种产品。

本发明所要求保护的产品，其活性成分包括所述阿折地平；所述产品具有如下任一功效：

1)预防和/或治疗子宫内膜癌；

2)抑制子宫内膜癌细胞增殖；

3)抑制子宫内膜癌细胞的克隆形成能力。

所述产品中，活性组分阿折地平的质量含量可为0.1-99％。

上述各方面中，所述阿折地平(Azelnidipine)的CAS号：123524-52-7；

上述阿折地平包括其各种形式的药学上可接受的盐。

上述各方面中，所述子宫内膜癌包括I型子宫内膜癌和II型子宫内膜癌。

上述各方面中，所述子宫内膜癌细胞具体可为Ishikawa、HEC-1A、AN3CA和RL95-2细胞。

其中，Ishikawa为孕激素受体阳性腺癌细胞；HEC-1A为孕激素受体阴性腺癌细胞；AN3CA为孕激素受体阴性腺癌细胞；RL95-2为孕激素受体阳性腺鳞癌细胞。

上述各方面中，所述产品可为药物或药物制剂。

需要的时候，在上述药物中还可以加入一种或多种药学上可接受的载体；所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

上述药物可以制成注射液、片剂、粉剂、颗粒剂、胶囊、丸剂、口服液、悬浮剂或乳剂等多种形式；上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

上述药品可通过口服、注射、喷射、渗透、吸收、物理或化学介导的方法导入机体如肌肉、皮内、皮下、静脉、粘膜组织；或是被其他物质混合或包裹后导入机体。

本发明首先对19种上市的钙离子通道阻滞剂在子宫内膜癌Ishikawa、Hec-1A和AN3CA细胞上进行药效筛选，实验发现马尼地平(Manidipine)、阿折地平(Azelnidipine)和西尼地平(Cilnidipine)对子宫内膜癌细胞有明显的抑制增殖的效果。进一步克隆形成和EdU实验发现阿折地平(Azelnidipine)具有较优的抑制子宫内膜癌细胞增殖的能力。进一步动物实验证明了阿折地平(Azelnidipine)抑制子宫内膜癌进展的能力。RNA测序和western blotting明确阿折地平(Azelnidipine)可能通过激活Ishikawa细胞内质网应激发挥抑癌作用。

附图说明

图1为阿折地平、西尼地平、马尼地平及醋酸甲羟孕酮(5μM)抑制Ishikawa、Hec-1A和AN3CA细胞克隆形成的能力。

图2为阿折地平、西尼地平、马尼地平及醋酸甲羟孕酮(10μM)对RL95-2细胞的增殖的抑制作用。

图3为钙离子通道阻滞剂阿折地平(5mg/kg和10mg/kg)对Ishikawa构建的子宫内膜癌皮下移植瘤模型的进展抑制作用。

图4为钙离子通道阻滞剂阿折地平(15μM)对Ishikawa细胞内质网应激相关蛋白表达的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

实施例1

19种上市的钙离子通道阻断剂(CCB)对子宫内膜癌细胞Ishikawa(I型，孕激素敏感)、HEC-1A(II型，孕激素不敏感)和AN3CA(I/II型，孕激素不敏感)的增殖抑制作用

1.实验材料和方法

子宫内膜癌细胞ISK、HEC-1A和AN3CA购自于美国组织培养库ATCC；磷酸盐缓冲液(PBS)、DME/F12培养基购自于Macgene公司；血清和DMSO购自于Gibco公司；胰酶、CCK8购自于苏州新赛美生物技术有限公司；19种钙离子通道阻滞剂(CCB)购自于MCE公司，具体货号如下表1所示。醋酸甲羟孕酮(MPA)购自于Selleck公司(产品目录号为S2567)。实验仪器为Molecular devices公司的Colone Select Imager。

表1 19种钙离子通道阻滞剂(CCB)

详细实验方法描述如下：

1)选取处于对数生长期的三株子宫内膜癌细胞系ISK、HEC-1A和AN3CA，吸去DME/F12培养基，并加入1ml PBS洗去残余血清并吸去PBS。

2)每皿加入1ml胰酶，放于37°培养箱进行消化。

3)显微镜下观察细胞消化情况，待细胞成圆形，每皿加入2ml含10％FBS的DME/F12培养基中和胰酶。

4)用1ml枪头进行吹打，将液体转移到15ml离心管中，1000rpm 5min离心。

5)离心结束后吸去上清，加入2ml培养基吹打成单细胞悬液，使用细胞计数仪进行计数并调整细胞浓度ISK为6×10⁵个/ml，Hec-1A和AN3CA均为7×10⁵个/ml。

6)在96孔板中每孔加入对应细胞液100微升，混匀放于37℃培养箱中。

7)细胞静置12h后将不同浓度梯度的DMSO和CCBs加入96孔板中，每个浓度8个复孔，三次独立实验。

8)在培养箱培养48h后使用Clone Select Imager进行检测。根据细胞占96孔板底面积的百分比和加入的CCB药物浓度计算CCB对子宫内膜癌细胞的增殖抑制效果，进一步用Graphpad prism计算IC₅₀值。

2.实验结果

表2为19种钙离子通道阻滞剂和醋酸甲羟孕酮对不同子宫内膜癌细胞株的半数致死量。醋酸甲羟孕酮(MPA)是子宫内膜癌保守治疗的经典药物，以MPA阳性对照，结果显示在Ishikawa,Hec-1A和AN3CA细胞中，分别有8种、14种和15种CCB抑制细胞增殖的效果强于MPA。三株细胞系中IC₅₀均低于15μM的CCB有3种，分别是马尼地平(Manidipine)、阿折地平(Azelnidipine)和西尼地平(Cilnidipine)。马尼地平(Manidipine)是T/L型CCB，均具有多个分子靶点，对三株细胞具有明显的增殖抑制效果。阿折地平(Azelnidipine)特异性地作用于CACNB1，Ishikawa的IC₅₀为13.61±0.18μM，Hec-1A的IC₅₀为11.8±0.63μM，AN3CA的IC₅₀为14.86±0.69μM。西尼地平(Cilnidipine)是N/L型CCB，Ishikawa的IC₅₀为10.87±2.0μM，Hec-1A的IC₅₀为14.56±1.36μM，AN3CA的IC₅₀为14.12±0.46μM。本实验初步筛选出抑制子宫内膜癌细胞增殖效果较佳的三种CCB。

表2 19种钙离子通道阻滞剂和醋酸甲羟孕酮对不同子宫内膜癌细胞株的半数致死量

实施例2

钙离子通道阻滞剂对Ishikawa、Hec-1A和AN3CA细胞克隆形成的影响

1.实验材料和方法

0.5％结晶紫购自于Solarbio；甲醇购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，PBS、培养基等实验材料来源同实施例1。

具体实验方法如下：

①将对数生长期的细胞消化，离心，重悬，计数并调整浓度，六孔板每孔铺1000个细胞，等待细胞贴壁。

②细胞贴壁后按照以下分组给药：阴性对照组；MPA阳性对照组；马尼地平(Manidipine)5μM；阿折地平(Azelnidipine)5μM和西尼地平(Cilnidipine)5μM。对应加入含不同浓度药物的DME/F12培养基2ml，定期更换培养基，共培养10天后进行染色计数。

③将细胞用4℃预冷的PBS进行清洗，5min/次，共两次。

④吸去PBS，每孔加入甲醇1ml，室温避光固定15min。

⑤吸去甲醇，PBS清洗细胞3次，每次5min。注意每次加液沿着管壁轻缓加入，避免将细胞克隆冲掉。

⑥加入0.5％结晶紫染液，染色30min，后吸去染液，加入PBS冲洗至结晶紫被完全洗脱。

⑦拍照并计数。

2.实验结果

如图1所示，图1为钙离子通道阻滞剂马尼地平(Manidipine)、阿折地平(Azelnidipine)和西尼地平(Cilnidipine)(5μM)对Ishikawa、Hec-1A和AN3CA细胞克隆形成的影响示意图。图中阴性对照组为加入同等剂量的DMSO组，阳性对照组为加入同等剂量的MPA组。图中的每一个点即代表一个细胞集落。图1结果显示，相较于阴性对照组，加入10μM的马尼地平(Manidipine)、阿折地平(Azelnidipine)和西尼地平(Cilnidipine)组的三株细胞群落数均明显减少。值得注意的是，加入Azelnidipine后细胞群落数降低最为明显。图1右侧为细胞集落的数目，数据显著性差异采用ONE WAY ANNOVA法分析(Graphpad Prism软件)，*给药组与对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。本实验证明了马尼地平(Manidipine)、阿折地平(Azelnidipine)和西尼地平(Cilnidipine)，尤其是阿折地平(Azelnidipine)，对ISK和Hec-1A细胞的克隆形成有明显的抑制作用。

实施例3

阿折地平对RL95-2细胞增殖的影响

1.实验材料和方法

EdU试剂盒购自于上海碧云天生物技术有限公司；乙醇购自于生工生物工程(上海)股份有限公司，PBS、培养基等实验材料来源同实施例1。

具体实验方法如下：

①处于对数生长期的RL95-2细胞消化/重悬后以10000/孔种在96孔板中；

②待细胞静置12小时后，原有的培养液被吸出，含有不同药物的新鲜培养基被加入到孔中；

③48小时后，将EdU工作液加入到96孔板中。继续孵育细胞2小时；

④EdU标记细胞完成后，去除培养液，并加入1ml 75％的乙醇，室温固定15分钟。

⑤吸去固定液后，每孔用1mlPBS洗涤细胞3次，每次5min。

⑥配制Click反应液，每孔加入0.5ml Click反应液，室温避光孵育30分钟。

⑦吸去Click反应液，用PBS洗涤3次，并利用Confocal观测细胞的荧光阳性比例。

2.实验结果

如图2所示，阴性对照组为加入同等剂量的DMSO组，阳性对照组为加入同等剂量的MPA组。右侧为EdU阳性的细胞比例，数据显著性差异采用ONE WAY ANNOVA分析，*给药组与阴性对照组比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。图2结果显示，相较于对照组，加入5μM阿折地平组的RL95-2细胞EdU阳性细胞比例明显降低。本实验证明了阿折地平对RL95-2细胞的增殖有明显的抑制作用。

实施例4

阿折地平(Azelnidipine)对小鼠皮下移植瘤(Ishikawa细胞)的生长抑制作用

1.实验材料和方法

①实验材料：

4-5周的Balb/c雌鼠购自于北京维通利华实验动物技术有限公司，饲养于SPF级动物房。阿折地平购自于MCE公司。

②药物配制：

称取一定量的阿折地平(Azelnidipine)，溶于DMSO中(DMSO终浓度为10％)，加入40％PEG300后混匀至溶液澄清，再加入5％Tween-80震荡，保证溶液澄清。每次注射用药现用现配。

③动物体内给药：

将5周龄的小鼠右侧腋下植入Ishikawa细胞，每只小鼠约植入3x10^6个细胞。肿瘤移植7天后给药，小鼠随机分3组(每组5只)：对照组；阿折地平(Azelnidipine)5mg/kg给药组；阿折地平(Azelnidipine)5mg/kg给药组。按不同的药物浓度腹腔注射0.1mL，每天给药。每两天一次测量肿瘤长L(mm)和宽W(mm)，肿瘤体积计算公式V(mm³)＝0.5×L(mm)×W(mm)²。每两天一次称量小鼠体重。连续给药14天后，处死小鼠，剥离肿瘤并拍照。

2.实验结果

图3为阿折地平对小鼠皮下移植瘤的生长抑制作用。Vehicle为对照组。其中图3中A为小鼠成瘤图片，从图中可以较直观地看出，相较于对照组，给药组小鼠的肿瘤生长均受到抑制。图3中B为小鼠肿瘤的重量，阿折地平5mg/kg和10mg/kg均显著降低肿瘤的肿瘤。数据显著性差异采用ONE WAY ANOVA法分析(Graphpad Prism软件)，*给药组与对照组比较，*p<0.05，***p<0.001。图3中C为小鼠肿瘤体积的生长曲线，横坐标为时间，纵坐标为肿瘤体积大小。实验结果显示阿折地平5mg/kg对小鼠肿瘤的生长有一定抑制作用，但无显著性差异。数据显著性差异采用ONE WAY ANOVA法分析(Graphpad Prism软件)，*给药组与对照组比较，ns:not significant,*p<0.05。本实验证明阿折地平能够抑制小鼠皮下移植瘤(Ishikawa细胞)的生长。

实施例5

阿折地平激活内质网应激并上调内质网应激相关蛋白的表达

1.实验材料和方法

RNA测序由诺和生物完成。内质网标记染料(ER tracker)购自Thermofisher公司；FAM129A，CHOP购自于Proteintech公司；TRIB3，PCK2和GDF15购自于Abcam公司；HRP标记二抗和荧光二抗购自于Thermofisher公司。RIPA裂解液、上样缓冲液、脱脂奶粉等为实验室常备试剂；配胶试剂盒购自北京博泰斯公司；PVDF膜购自于Merck Millipore公司。具体实验方法如下：

①RNA测序

将Ishikawa细胞经过以下处理：对照组；Azelnidipine(15μM)处理48小时后，PBS洗2遍，加入TRIZOL，至诺和生物进行RNA测序。测序结果的差异基因定义标准为P<0.05且FC≥2。

②ER tracker标记细胞内质网形态

将ER tracker用无血清培养基稀释后孵育Ishikawa细胞30min，后吸去染料，用PBS洗3次，每次5min.于共聚焦下观察细胞内质网形态。

③Western blotting检测内质网相关蛋白的表达

将对照组和经阿折地平(5μM和10μM)处理后的Ishikawa细胞消化处理后，收集上清并用PBS清洗两次。每管中加入适量的蛋白裂解缓冲液提取蛋白。蛋白经历变性、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、显影等步骤。通过上述实验观测药物处理后内质网应激相关蛋白的表达。

2.实验结果

如图4所示，图4为阿折地平发挥抑癌作用的机制。从图中可以看出，阿折地平激活Ishikawa细胞内质网应激、上调内质网应激标记物的表达。图4中A为阿折地平处理Ishikawa细胞后获得的差异基因的火山图，其中上调的差异基因有1375个，下调的差异基因有1432个。图4中B为差异基因的GO富集分析前十项，其中五项与内质网应激相关。图4中C为ER tracker标记的Ishikawa细胞，提示阿折地平作用细胞后内质网成分皱缩、凝聚。D为western blotting检测的阿折地平处理后Ishikawa细胞中内质网应激标记物的表达。本实验结果显示阿折地平可激活细胞内质网应激，进而抑制子宫内膜癌细胞增殖。

Claims

1.阿折地平或其药学上可接受的盐在制备预防和/或治疗子宫内膜癌的产品中的应用。

2.阿折地平或其药学上可接受的盐在制备子宫内膜癌细胞增殖抑制剂中的应用。

3.阿折地平或其药学上可接受的盐在制备抑制子宫内膜癌细胞的克隆形成能力的产品中的应用。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的应用，其特征在于：所述子宫内膜癌包括I型子宫内膜癌和II型子宫内膜癌。

5.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：所述子宫内膜癌细胞选择下述至少一种：Ishikawa、HEC-1A、AN3CA、RL95-2细胞。

6.阿折地平或其药学上可接受的盐在下述至少方面中的应用：

a)预防和/或治疗子宫内膜癌；

b)抑制子宫内膜癌细胞增殖；

c)抑制子宫内膜癌细胞的克隆形成能力。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述子宫内膜癌包括I型子宫内膜癌和II型子宫内膜癌。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述子宫内膜癌细胞选自下述至少一种：Ishikawa、HEC-1A、AN3CA、RL95-2细胞。

9.一种产品，其活性成分包括阿折地平或其药学上可接受的盐；所述产品具有如下任一功效：

1)预防和/或治疗子宫内膜癌；

2)抑制子宫内膜癌细胞增殖；

3)抑制子宫内膜癌细胞的克隆形成能力。

10.根据权利要求9所述的产品，其特征在于：

所述产品中，所述阿折地平或其药学上可接受的盐的质量含量为0.1-99％；

所述子宫内膜癌包括I型子宫内膜癌和II型子宫内膜癌；

所述子宫内膜癌细胞选自下述至少一种：Ishikawa、HEC-1A、AN3CA、RL95-2细胞。