CN115884985A

CN115884985A - 用于治疗癌症的组合物和方法

Info

Publication number: CN115884985A
Application number: CN202180026330.6A
Authority: CN
Inventors: R·罗布; P·伦讷特
Original assignee: Aleta Biotherapeutics Inc
Current assignee: Aleta Biotherapeutics Inc
Priority date: 2020-03-06
Filing date: 2021-03-08
Publication date: 2023-03-31
Also published as: US20230220095A1; WO2021178960A2; JP2023516089A; CA3174678A1; WO2021178960A3; KR20230025655A; EP4114864A4; MX2022011027A; EP4114864A2; AU2021231083A1; IL296039A

Abstract

描述了组合物，例如包含蛋白质治疗剂的组合物，以及使用此类组合物用于治疗癌症的方法。

Description

用于治疗癌症的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年3月6日提交的美国临时专利申请号62/986,310的优先权，所述申请的全部内容以引用的方式并入本文。

背景技术

过继性细胞疗法(ACT)是一种将细胞从供体取出、离体培养和/或操作，然后施用于患者以治疗疾病的治疗方法。在ACT中已使用多种细胞类型来试图治疗若干种类别的病症。对于癌症的治疗，ACT通常涉及淋巴细胞(诸如嵌合抗原受体(CAR)T细胞)的转移。然而，接受ACT的受试者可能会复发。因此，仍然需要用于使用过继性细胞疗法治疗癌症的改进的方法。

发明内容

本公开提供了可用于治疗癌症和/或用于启动或调节免疫应答的方法和组合物。在一些实施方案中，本发明提供了可用于癌症初始治疗的方法和组合物。在一些实施方案中，本发明提供了可用于在复发后治疗癌症的方法和组合物。在一些实施方案中，本发明提供了可用于治疗多发性骨髓瘤的方法和组合物。

在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括向所述受试者施用包含抗原结合多肽和多肽抗原的融合蛋白，从而治疗所述受试者，其中(i)所述受试者先前接受过和/或正在接受过继性细胞疗法(ACT)，(ii)所述受试者先前对所述ACT表现出至少一种有益反应，并且(iii)在施用所述融合蛋白之前，所述受试者对所述ACT表现出至少一种无益反应。在一些实施方案中，ACT包括施用选自由以下组成的组的细胞：NK细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自体或异体CAR-T细胞、骨髓衍生细胞、诱导多能干细胞(IPSC)、γδT细胞、恒定NK细胞和NK-T细胞和其他可用细胞类型。在一些实施方案中，所述融合蛋白包含2种或更多种抗原结合多肽。

在一些实施方案中，有益反应包括所述癌症的清除、消退和/或稳定，例如，在限定的时间段内(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12年)。在一些实施方案中，有益反应包括不存在所述癌症的复发、反复和/或转移，例如，在限定的时间段内(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12年)。在一些实施方案中，无益反应包括所述癌症的复发、反复和/或转移。

在一些实施方案中，在施用融合蛋白之前，所测量的ACT靶抗原的表达水平相对于对照水平(例如，对所述ACT表现出至少一种有益反应的受试者中所述靶抗原的表达水平；和/或在所述受试者先前对所述ACT表现出有益反应的时间段期间，所述受试者中所述靶抗原的表达水平)降低。

在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗先前接受过和/或正在接受包括结合靶抗原的细胞的ACT的受试者的方法，所述方法包括：如果来自所述受试者的样品(例如，生物样品，例如，肿瘤样品)中所述靶抗原的表达水平相对于对照水平(例如，对所述ACT表现出至少一种有益反应的受试者中所述靶抗原的表达水平；和/或在所述受试者先前对所述ACT表现出有益反应的时间段期间，所述受试者中所述靶抗原的表达水平)降低，则向所述受试者施用融合蛋白，其中所述融合蛋白包含抗原结合多肽和多肽抗原，从而治疗所述受试者。

在一些实施方案中，本公开提供了一种选择用包括结合靶抗原的细胞的ACT治疗的受试者的方法，所述方法包括：测量来自所述受试者的样品(例如，生物样品，例如，肿瘤样品)中所述靶抗原的表达水平；比较所述表达水平与对照水平(例如，对所述ACT表现出至少一种有益反应的受试者中所述靶抗原的表达水平；和/或在所述受试者先前对所述ACT表现出有益反应的时间段期间，所述受试者中所述靶抗原的表达水平)；并且如果所述靶抗原的表达水平相对于所述对照水平降低，则选择所述受试者用所述ACT和融合蛋白治疗，其中所述融合蛋白包含抗原结合多肽和多肽抗原。

在一些实施方案中，本公开提供了治疗具有或患有多发性骨髓瘤的受试者的方法，所述方法包括：向所述受试者施用包含以下的融合蛋白：(a)抗原结合多肽，其结合选自由以下组成的组的第一多发性骨髓瘤抗原：CD38；CS1/SLAMF7；GPRC5D；CD208(LAMP3)；CD307e(FCRL5)；ITGA8；ITGB7；CD138；CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；吨(GalNAcα1-O-Ser/Thr)；唾液酸-Tn(STn)(NeuAcα2-6-GalNAcα1-O-Ser/Thr)；和BCMA；以及(b)多肽抗原，其包含选自由以下组成的组的第二多发性骨髓瘤抗原：BCMA、CD38、SLAMF7、CD208、CD307e、CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；和CD138，其中所述第一多发性骨髓瘤抗原和所述第二多发性骨髓瘤抗原是不同的；其中所述受试者正在接受或将接受用于治疗多发性骨髓瘤的ACT(例如，CAR-T细胞疗法)。

在一些实施方案中，本公开的融合蛋白包含一种或多种抗原结合多肽。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白包含两种或更多种抗原结合多肽。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白包含一种或多种相同的抗原结合多肽。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白包含一种或多种结合相同抗原的抗原结合多肽。在一些实施方案中，本公开提供了一种治疗方法，其中所述融合蛋白包含：第一抗原结合多肽，其结合选自由以下组成的组的第一多发性骨髓瘤抗原：CD38；CS1/SLAMF7；GPRC5D；CD208(LAMP3)；CD307e(FCRL5)；ITGA8；ITGB7；CD138；CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr)；唾液酸-Tn(STn)(NeuAcα2-6-GalNAcα1-O-Ser/Thr)；和BCMA；(b)第二抗原结合多肽，其结合选自由以下组成的组的第二多发性骨髓瘤抗原：CD38；CS1/SLAMF7；GPRC5D；CD208(LAMP3)；CD307e(FCRL5)；ITGA8；ITGB7；CD138；CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr)；唾液-Tn(STn)(NeuAcα2-6-GalNAcα1-O-Ser/Thr)；和BCMA；以及(c)多肽抗原，其包含选自由以下组成的组的第三多发性骨髓瘤抗原：BCMA、CD38、SLAMF7、CD208、CD307e、CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；和CD138，其中所述第三多发性骨髓瘤抗原与所述第一和第二多发性骨髓瘤抗原不同。在一些实施方案中，所述第一多发性骨髓瘤抗原和所述第二多发性骨髓瘤抗原是相同的。在一些实施方案中，所述第一多发性骨髓瘤抗原和所述第二多发性骨髓瘤抗原是CD38。在一些实施方案中，所述第一和第二抗原结合多肽是相同的，并且所述融合蛋白包含所述相同抗原结合多肽的两个拷贝。在一些实施方案中，所述第一和第二抗原结合多肽以约50nM至约2μM的Kd与所述第一和第二多发性骨髓瘤抗原结合。在一些实施方案中，所述融合蛋白以相对于健康或非肿瘤细胞更高的亲合力与表达所述第一和第二多发性骨髓瘤抗原(例如，CD38)的肿瘤细胞结合。在一些实施方案中，所述融合蛋白以约1至约40nM的Kd与所述肿瘤细胞结合。

附图说明

图1展示了Daudi细胞上BCMA的低表达和CD38的高表达。

图2展示了如通过抗HIS标签抗体检测的BCMA-抗CD38融合蛋白与Daudi细胞的结合。

图3展示了如通过抗BCMA抗体检测的BCMA-抗CD38融合蛋白与Daudi细胞的结合。

图4展示了转染HEK293细胞之后GPRC5D的表达水平。

图5展示了如通过抗HIS标签抗体检测的四种不同的抗GPRC5D-BCMA融合蛋白与表达GPRC5D的HEK293细胞的结合。

图6展示了如通过抗BCMA抗体检测的四种不同的抗GPRC5D-BCMA融合蛋白与表达GPRC5D的HEK293细胞的结合。

图7展示了抗BCMA CAR-T细胞，而不是未转导的供体匹配T细胞(UTD)，能够杀伤培养物中的多发性骨髓瘤细胞。

图8A至8B展示了仅在抗GPRC5D-BCMA融合蛋白的存在下，抗BCMA CAR-T细胞才能够杀伤表达GPRC5D的HEK293细胞。图8A示出结合BCMA的CAR-T 397杀伤H929骨髓瘤细胞(阳性对照)。图8B示出仅在添加包含抗GPRC5D结合多肽和BCMA多肽抗原的融合蛋白时，结合BCMA的CAR-T 397才杀伤用GPRC5D瞬时转染的BCMA阴性HEK293T细胞。融合蛋白以500ng/ml或100ng/ml添加。值得注意的是，CAR-T 397在不存在融合蛋白#538的情况下不杀伤细胞。

图9示出与多发性骨髓瘤抗原和多肽抗原结合的抗原结合多肽的示例性组合。

定义

为了使本发明更容易理解，下文首先定义了某些术语。在整个说明书中阐述了以下术语和其他术语的附加定义。

施用：如本文所用，术语“施用”是指向受试者或系统施用组合物。向动物受试者(例如，人)施用可以通过任何适当的途径进行。例如，在一些实施方案中，可经支气管(包括通过支气管滴注)、颊、肠内、皮间、动脉内、皮内、胃内、髓内、肌内、鼻内、腹膜内、鞘内、静脉内、脑室内、特定器官内(例如，肝内)、黏膜、鼻腔、口腔、直肠、皮下、舌下、局部、气管(包括通过气管滴注)、透皮、阴道和玻璃体施用。在一些实施方案中，可经瘤内或瘤周施用。在一些实施方案中，施用可涉及间歇给药。在一些实施方案中，施用可涉及连续给药(例如，灌注)至少选定的时间段。

过继性细胞疗法：如本文所用，“过继性细胞疗法”或“ACT”涉及将具有抗肿瘤活性的免疫细胞转移至癌症患者中。在一些实施方案中，ACT是一种治疗方法，其涉及使用具有抗肿瘤活性的淋巴细胞、将这些细胞体外扩增至大量并将它们输注到患癌宿主中。

剂：如本文所用，术语“剂”可以指任何化学类别的化合物或实体，包括例如多肽、核酸、糖类、脂质、小分子、金属或其组合。从上下文将清楚地看出，在一些实施方案中，剂可以是或包含细胞或生物体，或其级分、提取物或组分。在一些实施方案中，剂是或包含天然产物，因为剂存在于和/或得自自然界。在一些实施方案中，剂是或包含一种或多种人造实体，因为剂是通过人手动操作来设计、工程化和/或产生的，和/或不存在于自然界。在一些实施方案中，剂可以以分离的或纯的形式使用；在一些实施方案中，剂可以以粗制的形式使用。在一些实施方案中，潜在的剂作为集合或库提供，例如可以被筛选以鉴定或表征它们中的活性剂。可以根据本发明使用的剂的一些具体实施方案包括小分子、抗体、抗体片段、适体、核酸(例如，siRNA、shRNA、DNA/RNA杂交体、反义寡核苷酸、核酶)、肽、肽模拟物等。在一些实施方案中，剂是或包含聚合物。在一些实施方案中，剂不是聚合物和/或基本上不含任何聚合物。在一些实施方案中，剂含有至少一种聚合部分。在一些实施方案中，剂缺少或基本上不含任何聚合部分。

改善：如本文所用，“改善”是指对一种状态的预防、减轻和/或缓解，或对受试者状态的改进。改善包括但不要求完全恢复或完全预防疾病、病症或病状。

氨基酸：如本文所用，术语“氨基酸”在其最广泛的意义上是指可以被并入到多肽链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，氨基酸具有一般结构H₂N-C(H)(R)-COOH。在一些实施方案中，氨基酸是天然存在的氨基酸。在一些实施方案中，氨基酸是合成的氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是d-氨基酸；在一些实施方案中，氨基酸是l-氨基酸。“标准氨基酸”是指通常存在于天然存在的肽中的二十种标准l-氨基酸中的任一种。“非标准氨基酸”是指除标准氨基酸之外的任何氨基酸，无论其是合成制备的还是得自天然来源的。如本文所用，“合成的氨基酸”涵盖化学修饰的氨基酸，其包括但不限于盐、氨基酸衍生物(诸如酰胺)和/或取代物。氨基酸(包括肽中的羧基和/或氨基末端氨基酸)可以通过甲基化、酰胺化、乙酰化、保护基团和/或使用其他化学基团的取代来修饰，这些可以改变肽的循环半衰期而不对它们的活性产生不利影响。氨基酸可以参与二硫键。氨基酸可以包含一种或多种翻译后修饰，诸如与一种或多种化学实体(例如，甲基、乙酸基、乙酰基、磷酸基、甲酰基部分、类异戊二烯基、硫酸基、聚乙二醇部分、脂质部分、碳水化合物部分、生物素部分等)缔合。术语“氨基酸”与“氨基酸残基”可互换使用，并且可以指游离氨基酸和/或肽的氨基酸残基。从使用此术语的上下文中将清楚它是指游离氨基酸还是肽的残基。

抗体：如本文所用，术语“抗体”是指包含足以赋予与特定靶抗原的特异性结合的经典免疫球蛋白序列元件的多肽。如本领域已知的，天然产生的完整抗体是大约150kD的四聚体剂，其由彼此缔合的两条相同的重链多肽(各约50kD)和两条相同的轻链多肽(各约25kD)构成，通常称为“Y形”结构。每条重链由至少四个结构域(每个结构域长约110个氨基酸)构成，所述结构域包括个氨基末端可变(VH)结构域(位于Y结构的顶端)，然后是三个恒定结构域：CH1、CH2和羧基末端CH3(位于Y的茎的基部)。称为“开关”的短区域将重链可变区和恒定区连接起来。“铰链”将CH2和CH3结构域连接至抗体的其余部分。此铰链区中的两个二硫键将完整抗体中的两个重链多肽彼此连接起来。每条轻链由两个结构域构成，所述结构域包括一个氨基末端可变(VL)结构域，然后是一个羧基末端恒定(CL)结构域，两个结构域通过另一个“开关”彼此分开。完整抗体四聚体由两个重链-轻链二聚体构成，其中所述重链和轻链通过单个二硫键彼此连接；另外两个二硫键将重链铰链区彼此连接起来，使得所述二聚体彼此连接并形成四聚体。天然产生的抗体也被糖基化，通常在CH2结构域上。天然抗体中的每个结构域都具有特征为“免疫球蛋白折叠”的结构，所述“免疫球蛋白折叠”由两个β折叠(例如，3-、4-或5-链折叠)彼此填充在压缩的反平行β桶中形成。每个可变结构域含有称为“互补决定区”的三个超变环(CDR1、CDR2和CDR3)和四个稍微不变的“框架”区(FR1、FR2、FR3和FR4)。当天然抗体折叠时，FR区形成了为结构域提供结构框架的β折叠，并且来自重链和轻链的CDR环区域在三维空间中聚集在一起，使得它们形成位于Y结构的顶端的单个超变抗原结合位点。天然存在的抗体的Fc区域与补体系统的元件结合，并且也与效应细胞上的受体结合，所述效应细胞包括例如介导细胞毒性的效应细胞。如本领域已知的，Fc区域对Fc受体的亲和力和/或其他结合属性可以通过糖基化或其他修饰来调节。在一些实施方案中，根据本公开产生和/或利用的抗体包含糖基化的Fc结构域，包括具有修饰的或工程化的此类糖基化的Fc结构域。出于本公开的目的，在某些实施方案中，包含如天然抗体中存在的足够的免疫球蛋白结构域序列的任何多肽或多肽复合物可以称为和/或用作“抗体”，无论此类多肽是天然产生的(例如，由生物体对抗原作出反应而产生)还是通过重组工程化、化学合成或其他人工系统或方法产生的。在一些实施方案中，抗体是多克隆的；在一些实施方案中，抗体是单克隆的。在一些实施方案中，抗体具有小鼠、兔、灵长类动物或人抗体所特有的恒定区序列。在一些实施方案中，如本领域已知的，抗体序列元件完全是人的，或者是人源化的、灵长类动物化的、嵌合的等。此外，如本文所用，术语“抗体”可在适当的实施方案(除非另有说明或从上下文可以清楚地看出)中指在替代展示中利用抗体结构和功能特征的任何本领域已知或开发的构建体或形式。例如，在一些实施方案中，根据本公开利用的抗体的形式选自但不限于：完整的IgG、IgE和IgM、双特异性抗体或多特异性抗体(例如，

等)、双互补位抗体或多互补位抗体、单链Fv、多肽Fc融合物、Fab、骆驼抗体(camelid antibody)、掩蔽抗体(masked antibody)(例如，/>

)、小型模块化免疫药物(“SMIPsTM”)、单链或串联双抗体/>

VHH、/>

微型抗体、/>

锚蛋白重复蛋白或/>

DART、TCR样抗体、

微蛋白、

和/>

在一些实施方案中，抗体可能缺少在天然产生时具有的共价修饰(例如，聚糖的附接)。在一些实施方案中，抗体可含有共价修饰(例如，聚糖、有效载荷(例如，可检测部分、治疗部分、催化部分等)或其他侧基(例如，聚乙二醇等)的附接)。

抗体依赖性细胞毒性：如本文所用，术语“抗体依赖性细胞毒性”或“ADCC”是指被抗体结合的靶细胞被免疫效应细胞杀伤的现象。不希望受任何特定理论的束缚，ADCC通常被理解为涉及携带Fc受体(FcR)的效应细胞，其可以识别并随后杀伤抗体包被的靶细胞(例如，在细胞表面上表达抗体结合的特定抗原的细胞)。介导ADCC的效应细胞可包括免疫细胞，所述免疫细胞包括但不限于自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、嗜酸性粒细胞中的一种或多种。

抗体片段：如本文所用，“抗体片段”包括完整抗体的一部分，例如像抗体的抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab'、F(ab')₂和Fv片段；三抗体；四抗体；线性抗体；单链抗体分子；和由抗体片段形成的多特异性抗体。例如，抗体片段包括分离的片段、“Fv”片段(由重链和轻链的可变区组成)、轻链和重链可变区通过肽接头连接的重组单链多肽分子(“scFv蛋白”)、由抗体重链的可变区组成的重组单结构域抗体(例如，VHH)和由模拟超变区的氨基酸残基组成的最小识别单元(例如，重链可变区(VH)的超变区、轻链可变区(VL)的超变区、VH内的一个或多个CDR结构域，和/或VL内的一个或多个CDR结构域)。在许多实施方案中，抗体片段含有足够的亲本抗体序列，所述抗体片段是结合与亲本抗体结合的抗原相同的抗原的片段；在一些实施方案中，片段以与亲本抗体相当的亲和力结合抗原和/或与亲本抗体竞争结合抗原。抗体的抗原结合片段的实例包括但不限于Fab片段、Fab'片段、F(ab')₂片段、scFv片段、Fv片段、dsFv双抗体、dAb片段、Fd'片段、Fd片段、重链可变区和分离的互补决定区(CDR)。抗体的抗原结合片段可以通过任何方式产生。例如，抗体的抗原结合片段可以通过使完整抗体片段化来以酶促或化学方式产生和/或可以由编码部分抗体序列的基因以重组方式产生。或者或另外，抗体的抗原结合片段可以完全地或部分地以合成方式产生。抗体的抗原结合片段可任选地包含单链抗体片段。或者或另外，抗体的抗原结合片段可包含例如通过二硫键联连接在一起的多条链。抗体的抗原结合片段可任选地包含多分子复合物。功能性抗体片段通常包含至少约50个氨基酸并且更通常包含至少约200个氨基酸。

抗原：如本文所用，术语“抗原”是指引发免疫反应的剂；和/或与T细胞受体(例如，当由MHC分子呈递时)或与抗体或抗体片段结合的剂。在一些实施方案中，抗原引发体液反应(例如，包括抗原特异性抗体的产生)；在一些实施方案中，抗原引发细胞反应(例如，涉及T细胞，其受体与抗原特异性相互作用)。在一些实施方案中，抗原与抗体结合并且可或可不诱导生物体中的特定生理反应。一般而言，抗原可以是或包括任何化学实体，例如像小分子、核酸、多肽、碳水化合物、脂质、聚合物(在一些实施方案中除了生物聚合物(例如，除了核酸或氨基酸聚合物))等。在一些实施方案中，抗原是或包含多肽。在一些实施方案中，抗原是或包含聚糖。本领域普通技术人员将理解，一般而言，抗原可以以分离的或纯的形式提供，或者可以以粗制的形式提供(例如，与其他材料一起，例如在含抗原来源的提取物诸如细胞提取物或其他相对粗制的制剂中)，或者可存在于细胞上或细胞中。在一些实施方案中，抗原是重组抗原。

抗原呈递细胞：如本文所用，短语“抗原呈递细胞”或“APC”具有本领域理解的含义，是指加工抗原并将抗原呈递至T细胞的细胞。示例性APC包括树突细胞、巨噬细胞、B细胞、某些活化的上皮细胞和能够进行TCR刺激和适当T细胞共刺激的其他细胞类型。

大约或约：如本文所用，术语“大约”或“约”在应用于一个或多个目标值时，是指与所述参考值相似的值。在某些实施方案中，除非另有说明或另外可从上下文中明显看出，否则术语“大约”或“约”是指落入所述参考值的任一方向(大于或小于)的25％、20％、19％、18％、17％、16％、15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％或更小的值的范围(除非此类数值将超过可能值的100％)。

结合：应当理解，如本文所用，术语“结合”通常是指两个或更多个实体之间或之中的非共价缔合。“直接”结合涉及实体或部分之间的物理接触；间接结合涉及通过与一个或多个中间实体的物理接触进行物理相互作用。两个或更多个实体之间的结合可通常在多种环境中的任一种中被评估，包括单独或在更复杂系统的环境中研究相互作用的实体或部分(例如，当与载体实体以共价方式或以其他方式缔合和/或在生物系统或细胞中时)。

癌症：术语“癌症”、“恶性肿瘤”、“赘生物”、“肿瘤”和“癌”在本文中可互换使用，是指细胞表现出相对反常的、不受控制的和/或自主的生长，使得其表现出特征为显著失控的细胞增殖的异常生长表型。一般而言，本申请中用于检测或治疗的目标细胞包括癌前(例如，良性)细胞、恶性细胞、转移前细胞、转移性细胞和非转移性细胞。本公开的教义可以与任何和所有癌症相关。略举数例非限制性的实例，在一些实施方案中，本公开的教义被应用于一种或多种癌症，例如像造血癌症(包括白血病、淋巴瘤(霍奇金(Hodgkins)淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤)、骨髓瘤和骨髓增生性病症)；肉瘤、黑色素瘤、腺瘤、实体组织癌、鳞状细胞癌(口腔、咽、喉和肺)、肝癌、泌尿生殖癌症(诸如前列腺癌、宫颈癌、膀胱癌、子宫癌和子宫内膜癌以及肾细胞癌)、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、皮肤或眼内黑色素瘤、内分泌系统癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、头颈癌、乳腺癌、胃肠道癌和神经系统癌、良性病变(诸如乳头状瘤)等。

组合疗法：如本文所用，术语“组合疗法”是指受试者同时暴露于两种或更多种治疗方案(例如，两种或更多种治疗剂)的那些情况。在一些实施方案中，两种或更多种剂可以同时施用；在一些实施方案中，此类剂可以依次施用；在一些实施方案中，此类剂以重叠的给药方案施用。

剂型：如本文所用，术语“剂型”和“单位剂型”是指用于待治疗患者的治疗剂的物理离散单位。每个单位含有预定量的活性物质，所述活性物质据计算可产生所需治疗效果。然而，应理解组合物的总剂量将由主治医师在合理医学判断范围内决定。

给药方案：如本文所用，术语“给药方案”是指单独施用于受试者、通常以时间段分开的一组单位剂量(通常多于一个)。在一些实施方案中，给定的治疗剂具有推荐的给药方案，其可以涉及一个或多个剂量。在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量，每个剂量彼此间隔相同长度的时间段；在一些实施方案中，给药方案包括多个剂量以及间隔开各别剂量的至少两个不同的时间段。在一些实施方案中，给药方案内的所有剂量具有相同的单位剂量量。在一些实施方案中，给药方案内的不同剂量具有不同的量。在一些实施方案中，给药方案包括第一剂量量的第一剂量，随后是与第一剂量量不同的第二剂量量的一个或多个另外的剂量。在一些实施方案中，给药方案包括第一剂量量的第一剂量，随后是与第一剂量量相同的第二剂量量的一个或多个另外的剂量。在一些实施方案中，当跨相关人群施用时，给药方案与期望的或有益的结果相关(即，是治疗性给药方案)。

效应子功能：如本文所用，“效应子功能”是指由抗体Fc区域与Fc受体或配体相互作用产生的生物化学事件。效应子功能包括但不限于抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞介导的吞噬作用(ADCP)和补体介导的细胞毒性(CMC)。在一些实施方案中，效应子功能是在抗原结合后起作用的功能或独立于抗原结合而起作用的功能或两者都有。

效应细胞：如本文所用，“效应细胞”是指表达一种或多种Fc受体并介导一种或多种效应子功能的免疫系统的细胞。在一些实施方案中，效应细胞可包括但可不限于单核细胞、巨噬细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、血小板、大颗粒淋巴细胞、朗格汉斯细胞(Langerhans'cell)、自然杀伤(NK)细胞、T淋巴细胞、B淋巴细胞中的一种或多种，并且可以来自任何生物体，包括但不限于人、小鼠、大鼠、兔和猴。

表达：如本文所用，核酸序列的“表达”是指以下事件中的一种或多种：(1)从DNA序列产生RNA模板(例如，通过转录)；(2)RNA转录物的加工(例如，通过剪接、编辑、5'帽形成和/或3'末端形成)；(3)将RNA翻译成多肽或蛋白质；和/或(4)多肽或蛋白质的翻译后修饰。

融合蛋白：如本文所用，术语“融合蛋白”通常是指包含至少两个区段的多肽，每个区段都显示出与肽部分的高度氨基酸同一性，所述肽部分(1)天然存在，和/或(2)代表多肽的功能性结构域。通常，如果所述两个区段是如下的部分，则含有至少两个此类区段的多肽被认为是融合蛋白：(1)未天然包含在同一肽中，和/或(2)先前在单个多肽中未彼此连接，和/或(3)通过人手动操作而彼此连接。

基因：如本文所用，术语“基因”具有本领域所理解的含义。本领域普通技术人员将理解，术语“基因”可包括基因调控序列(例如，启动子、增强子等)和/或内含子序列。还应理解，基因的定义包括对不编码蛋白质而是编码功能性RNA分子(诸如tRNA、RNAi诱导剂等)的核酸的提及。为了清楚起见，我们注意到，如在本申请中使用的，术语“基因”通常是指编码蛋白质的核酸的一部分；此术语可任选地涵盖调控序列，这对于本领域普通技术人员来说从上下文中将是清楚的。此定义并非旨在排除术语“基因”对非蛋白质编码表达单元的应用，而是澄清在大多数情况下，本文件中使用的术语是指蛋白质编码核酸。

基因产物或表达产物：如本文所用，术语“基因产物”或“表达产物”通常是指从基因转录的RNA(加工前和/或加工后)或由从基因转录的RNA编码的多肽(修饰前和/或修饰后)。

免疫反应：如本文所用，术语“免疫反应”是指在动物中引发的反应。免疫反应可指细胞免疫、体液免疫或者可涉及两者。免疫反应也可仅限于免疫系统的一部分。例如，在某些实施方案中，免疫原性组合物可诱导增加的γ型干扰素(IFNγ)反应。在某些实施方案中，免疫原性组合物可诱导粘膜IgA反应(例如，如在鼻腔和/或直肠冲洗液中测量的)。在某些实施方案中，免疫原性组合物可诱导全身性IgG反应(例如，如在血清中测量的)。在某些实施方案中，免疫原性组合物可诱导病毒中和抗体或中和抗体反应。在某些实施方案中，免疫原性组合物可诱导T细胞的细胞溶解(CTL)反应。

改进、增加或减少：如本文所用，术语“改进”、“增加”或“减少”或语法等同物表示相对于基线测量值(诸如在本文所述的治疗开始之前在同一个体中的测量值，或在没有本文所述的治疗的情况下在对照个体(或多个对照个体)中的测量值)的值。

核酸：如本文所用，“核酸”在其最广泛的意义上是指并入或可并入寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。在一些实施方案中，核酸是经由磷酸二酯键联并入或可并入寡核苷酸链中的化合物和/或物质。从上下文可以清楚地看出，在一些实施方案中，“核酸”是指单个核酸残基(例如，核苷酸和/或核苷)；在一些实施方案中，“核酸”是指包含单个核酸残基的寡核苷酸链。在一些实施方案中，“核酸”是或包含RNA；在一些实施方案中，“核酸”是或包含DNA。在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核酸残基、包含所述残基或由所述残基组成。在一些实施方案中，核酸是一个或多个核酸类似物、包含所述类似物，或由所述类似物组成。在一些实施方案中，核酸类似物与核酸的不同之处在于它不利用磷酸二酯主链。例如，在一些实施方案中，核酸是一个或多个“肽核酸”、包含所述“肽核酸”或由所述“肽核酸”组成，所述“肽核酸”是本领域已知的并且在主链中具有肽键而不是磷酸二酯键，这被认为在本发明的范围内。或者或另外，在一些实施方案中，核酸具有一个或多个硫代磷酸和/或5'-N-亚磷酰胺键联，而不是磷酸二酯键。在一些实施方案中，核酸是一个或多个天然核苷(例如，腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)、包含所述天然核苷，或由所述天然核苷组成。在一些实施方案中，核酸是一种或多种核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫代胞苷、甲基化碱基、插入碱基及其组合)、包含所述类似物，或由所述类似物组成。在一些实施方案中，核酸包含一个或多个与天然核酸中的糖相比修饰的糖(例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖和己糖)。在一些实施方案中，核酸具有编码功能性基因产物诸如RNA或蛋白质的核苷酸序列。在一些实施方案中，核酸包含一个或多个内含子。在一些实施方案中，核酸可通过以下方法中的一种或多种来制备：从天然来源分离、通过基于互补模板的聚合进行酶促合成(体内或体外)、在重组细胞或系统中复制以及化学合成。在一些实施方案中，核酸的长度为至少3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475，500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000或更多个残基。在一些实施方案中，核酸是单链的；在一些实施方案中，核酸是双链的。在一些实施方案中，核酸具有包含至少一个元件的核苷酸序列，所述元件编码多肽或是编码多肽的序列的补体。在一些实施方案中，核酸具有酶活性。

可操作地连接：如本文所用，“可操作地连接”是指并置，其中所述组分所处于的关系允许其以预期的方式起作用。与一种或多种编码序列“可操作地连接”的控制序列以使得在与控制序列相容的条件下实现一种或多种编码序列的表达的方式连接。“可操作地连接”的序列包括与目标基因相邻的表达控制序列和反式或在远处起作用以控制目标基因的表达控制序列两者。如本文所用，术语“表达控制序列”是指影响与多核苷酸序列连接的编码序列的表达和加工所必需的多核苷酸序列。表达控制序列包含适当的转录起始序列、终止序列、启动子序列和增强子序列；高效的RNA加工信号，诸如剪接和多腺苷酸化信号；稳定细胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(即，科扎克(Kozak)共有序列)；提高蛋白质稳定性的序列；以及在需要时，提高蛋白质分泌的序列。此种控制序列的性质因宿主生物体而不同。例如，在原核生物中，此类控制序列通常包含启动子、核糖体结合位点和转录终止序列，而在真核生物中，此类控制序列通常包含启动子和转录终止序列。术语“控制序列”旨在包含自身的存在对于表达和加工必不可少的组分，并且还可以包含自身的存在是有利的额外组分，例如前导序列和融合配偶体序列。

互补位：如本文所用，术语“互补位”是指与抗原表位结合的抗原结合多肽(例如，抗体)的一部分。如本文所用，术语“双互补位”(在本文所述的抗体或构建体的情况下)是指包含两个互补位的抗体或构建体，每个互补位与单一抗原上的不同表位结合。如本文所用，术语“多互补位”(在本文所述的抗体或构建体的情况下)是指包含两个或更多个互补位的抗体或构建体，每个互补位与单一抗原上的不同表位结合。在一些实施方案中，本文所述的多互补位抗体或构建体的两个或更多个互补位与单一抗原上的非重叠表位结合。在一些实施方案中，本文所述的多互补位抗体或构建体的两个或更多个互补位与单一抗原上的两个表位结合，所述两个表位可共享1、2或3个氨基酸。

药学上可接受的：如本文所用，术语“药学上可接受的”是指在合理医学判断范围内适合与人类和动物的组织接触使用而没有过量毒性、刺激性、过敏反应或其他问题或并发症并且与合理的效益/风险比率相称的物质。

多肽：如本文所用，“多肽”一般来说是至少两个通过肽键彼此附接的氨基酸的串。在一些实施方案中，多肽可包含至少3-5个氨基酸，每个氨基酸通过至少一个肽键附接至其他氨基酸。在一些实施方案中，多肽可长于5个氨基酸，每个氨基酸通过至少一个肽键附接至其他氨基酸。本领域普通技术人员将理解，多肽有时包含“非天然”氨基酸或仍能够任选地整合到多肽链中的其他实体。

蛋白质：如本文所用，术语“蛋白质”是指多肽(即，至少两个通过肽键彼此连接的氨基酸的串)。蛋白质可以包含除氨基酸之外的部分(例如，可以是糖蛋白、蛋白聚糖等)且/或可以其他方式加工或修饰。本领域普通技术人员将理解，“蛋白质”可为由细胞产生的完整多肽链(具有或不具有信号序列)，或者可为其一部分。普通技术人员将理解，蛋白质有时可包含多于一条多肽链，例如通过一个或多个二硫键连接或通过其他方式缔合。多肽可含有L-氨基酸、D-氨基酸或两者并且可含有本领域已知的多种氨基酸修饰或类似物中的任一种。有用的修饰包括例如末端乙酰化、酰胺化、甲基化等。在一些实施方案中，蛋白质可包含天然氨基酸、非天然氨基酸、合成氨基酸及其组合。

参考：如本文所用，“参考”描述了标准或对照，比较是相对于所述标准或对照进行的。例如，在一些实施方案中，将目标剂、动物、个体、群体、样品、序列或值与参考或对照的剂、动物、个体、群体、样品、序列或值进行比较。在一些实施方案中，与目标测试或测定基本同时进行参考或对照的测试和/或测定。在一些实施方案中，参考或对照是历史参考或对照，任选地体现在有形介质中。如本领域技术人员将理解的，通常在与评估下的条件或情况相当的条件或情况下对参考或对照进行测定或表征。本领域技术人员将理解何时存在足够的相似性来证明对特定可能的参考或对照的依赖和/或比较。

反应：如本文所用，在受试者(患者或实验生物体)的上下文中，“反应”、“反应的”或“反应性”是指受试者病状的改变，所述改变是由于治疗而发生的，或与治疗相关的。在某些实施方案中，反应是有益的反应。在某些实施方案中，有益的反应可包括受试者的病状稳定(例如，预防或延迟在没有治疗的情况下预期或通常观察到发生的恶化)、病状的一种或多种症状的改善(例如，频率和/或强度降低)，和/或病状的治愈前景改进等。在某些实施方案中，对于具有癌症的受试者，有益反应可包括：受试者对癌症疗法或疗法组合具有积极的临床反应；受试者对癌症有自发反应；受试者的癌症部分或完全缓解；受试者已清除癌症；受试者没有癌症的复发、反复或转移；受试者具有积极的癌症预后；受试者未经历癌症疗法或疗法组合的毒性反应或副作用。在某些实施方案中，对于具有癌症的受试者，有益反应发生在过去或正在进行中。

在某些实施方案中，反应是无益反应。在某些实施方案中，无益反应可包括受试者的病状恶化、病状的一种或多种症状没有改善(例如，频率和/或强度没有降低)，和/或病状的治愈前景恶化等。在某些实施方案中，对于具有癌症的受试者，无益反应可包括：受试者对癌症疗法或疗法组合具有消极的临床反应；受试者的癌症没有缓解；受试者没有清除癌症；受试者的癌症复发、反复或转移；受试者具有消极的癌症预后；受试者经历了癌症疗法或疗法组合的毒性反应或副作用。在某些实施方案中，对于具有癌症的受试者，无益反应发生在过去或正在进行中。在某些实施方案中，反应的存在、程度和/或性质可根据特定标准进行测量和/或表征。在某些实施方案中，这样的标准可包括临床标准和/或客观标准。在某些实施方案中，用于评估反应的技术可包括但不限于临床检查、正电子发射断层扫描、胸部X射线、CT扫描、MRI、超声、内窥镜检查、腹腔镜检查、样品中特定标志物的存在或水平、细胞学,和/或组织学。在目标反应是肿瘤对疗法的反应的情况下，本领域技术人员将了解用于评估这种反应的多种已建立的技术，包括例如用于测定肿瘤负荷、肿瘤大小、肿瘤分期等。用于评估对治疗的反应的方法和指南讨论于例如，Therasse等人,J.Natl.Cancer Inst.,2000,92(3):205-216；和Seymour等人,Lancet Oncol.,2017,18:e143-52。可以以任何适当的方式选择确切的反应标准，条件是在比较肿瘤组、患者或实验生物体组，和/或细胞、器官、组织或细胞组分组时，基于用于测定反应率的相同或可比较的标准评估待比较的组。本领域的普通技术人员将能够选择适当的标准。

受试者：“受试者”意指哺乳动物(例如，人，在一些实施方案中包括产前人的形式)。在一些实施方案中，受试者患有相关疾病、病症或病状。在一些实施方案中，受试者易患疾病、病症或病状。在一些实施方案中，受试者表现出疾病、病症或病状的一种或多种症状或特征。在一些实施方案中，受试者不表现出疾病、病症或病状的任何症状或特性。在一些实施方案中，受试者是具有易患疾病、病症或病状或者患上疾病、病症或病状的风险所特有的一个或多个特征的人。在一些实施方案中，受试者是患者。在一些实施方案中，受试者是被施用和/或已被施用诊断和/或疗法的个体。

患有：“患有”疾病、病症或病状(例如，癌症)的个体已被诊断出和/或表现出疾病、病症或病状的一种或多种症状。

症状得到减轻：根据本发明，当特定疾病、病症或病状的一种或多种症状的量级(例如，强度、严重程度等)或频率减小时，“症状得到减轻”。为了清楚起见，特定症状发作的延迟被认为是所述症状的频率减小的一种形式。这并不意味着本发明仅限于消除症状的情况。本发明特别考虑了使得一种或多种症状得到减轻(并且受试者的病状因此得到“改善”)，尽管并未完全消除的治疗。

治疗剂：如本文所用，短语“治疗剂”通常是指当施用至生物体时引起所需药理学效应的任何剂。在一些实施方案中，如果剂在整个适当的群体中表现出统计学显著的效应，则所述剂被认为是治疗剂。在一些实施方案中，适当的群体可以是模式生物体群体。在一些实施方案中，可通过各种标准(诸如某个年龄组、性别、遗传背景、预先存在的临床病状等)来定义适当的人群体。在一些实施方案中，治疗剂是可用于减轻、改善、缓解、抑制、预防、延迟疾病、病症和/或病状的一种或多种症状或特征的发作、降低其严重程度和/或降低其发生率的物质。在一些实施方案中，“治疗剂”是在可上市用于施用于人之前已经或需要由政府机构批准的剂。在一些实施方案中，“治疗剂”是需要医学处方才能施用于人的剂。

治疗有效量：如本文所用，术语“治疗有效量”意指当根据治疗给药方案施用于患有或易患疾病、病症和/或病状的群体时，足以治疗所述疾病、病症和/或病状的量。在一些实施方案中，治疗有效量是降低疾病、病症和/或病状的一种或多种症状的发生率和/或严重程度、稳定其一种或多种特性，和/或延迟其发作的量。本领域普通技术人员将理解，术语“治疗有效量”实际上并不需要在特定个体中实现成功治疗。相反，治疗有效量可以是当施用于需要这种治疗的患者时在大量受试者中提供特定所需的药理学反应的量。例如，在一些实施方案中，“治疗有效量”是指当在本发明疗法的情况下施用于有需要的个体时，将阻断、稳定、减弱或逆转在所述个体中发生的癌症支持过程，或者将增强或增加所述个体中的癌症抑制过程的量。在癌症治疗的情况下，“治疗有效量”是当施用于被诊断患有癌症的个体时，将预防、稳定、抑制或减少个体中癌症的进一步发展的量。本文所述组合物的特别优选的“治疗有效量”逆转(在治疗性治疗中)恶性肿瘤诸如胰腺癌的发展或者帮助实现或延长恶性肿瘤的缓解。施用于个体以治疗所述个体中的癌症的治疗有效量可与被施用来促进缓解或抑制转移的治疗有效量相同或不同。与大多数癌症疗法一样，本文所述的治疗方法不应被解释为、局限于或以其他方式限于癌症的“治愈”；相反，治疗方法涉及使用所述组合物“治疗”癌症，即对具有癌症的个体的健康产生期望的或有益的改变。此类益处已被肿瘤学领域的熟练医疗保健提供者所认可，并且包括但不限于患者病状的稳定、肿瘤大小的减小(肿瘤消退)、生命功能的改善(例如，癌组织或器官的功能的改善)、进一步转移的减少或抑制、机会性感染的减少、生存能力的增加、疼痛的减少、运动功能的改善、认知功能的改善、能量感的改善(活力、不适减少)、幸福感的改善、正常食欲的恢复、健康体重增加的恢复及其组合。此外，还可以通过从肿瘤(诸如胰腺癌)部位采集癌细胞样品(例如，在治疗过程中)并测试癌细胞的代谢和信号标志物水平以监测癌细胞的状态以在分子水平上证实癌细胞退化到恶性程度较低的表型来评估个体中特定肿瘤的消退(例如，作为本文所述治疗的结果)。例如，通过采用本发明的方法诱导的肿瘤消退将通过发现一种或多种促血管生成标志物的减少、抗血管生成标志物的增加、在诊断患有癌症的个体中表现出异常活动的代谢途径、细胞间信号传导途径或细胞内信号传导途径的正常化(即，朝向存在于未患癌症的正常个体中的状态的改变)来表明。本领域普通技术人员将理解，在一些实施方案中，治疗有效量可以单一剂量配制和/或施用。在一些实施方案中，治疗有效量可以多个剂量配制和/或施用，例如，作为给药方案的一部分。

治疗：如本文所用，术语“治疗(treatment)”(还有“治疗(treat)”或“治疗(treating)”)是指部分或完全减轻、改善、缓解、抑制特定疾病、病症和/或病状(例如，癌症)的一种或多种症状、特征和/或诱因、延迟其发作、降低其严重性和/或降低其发生率的物质的任何施用。此类治疗可以针对不表现出相关疾病、病症和/或病状的迹象的受试者和/或针对仅表现出疾病、病症和/或病状的早期迹象的受试者。或者或另外，此类治疗可针对表现出相关疾病、病症和/或病状的一种或多种确定迹象的受试者。在一些实施方案中，治疗可针对已被诊断为患有相关疾病、病症和/或病状的受试者。在一些实施方案中，治疗可以针对已知具有在统计学上与相关疾病、病症和/或病状的发展的风险增加相关的一种或多种易感因素的受试者。

肿瘤浸润淋巴细胞：如本文所用，术语“肿瘤浸润淋巴细胞”是指罹患癌症(诸如黑色素瘤)的受试者的白细胞，其已离开血流并已迁移到肿瘤中。在一些实施方案中，肿瘤浸润淋巴细胞具有肿瘤特异性。

载体：如本文所用，“载体”是指能够转运另一个与其缔合的核酸的核酸分子。在一些实施方案中，载体能够在宿主细胞诸如真核和/或原核细胞中进行染色体外复制和/或表达与其连接的核酸。能够指导可操作地连接的基因的表达的载体在本文中称为“表达载体”。

具体实施方式

其中，本发明提供了可用于治疗癌症的方法和组合物。具体地，本公开包括在使用细胞治疗剂的疗法期间或之后癌症复发的治疗方法和用于治疗的组合物。在一些实施方案中，使用细胞治疗剂的疗法是过继性细胞疗法(ACT)，诸如CAR-T细胞疗法。

过继性细胞疗法复发

过继性细胞疗法(ACT)是将细胞从供体中取出、离体培养和/或操作然后施用于患者用于治疗疾病的潜在治疗程序。在ACT中已使用多种细胞类型来试图治疗若干种类别的病症。在一些实施方案中，ACT包括使用异体细胞。在一些实施方案中，ACT包括使用自体细胞。在一些实施方案中，ACT包括使用CAR-T细胞、CAR-NK细胞、TCR-T细胞、TIL细胞、异体NK细胞或自体NK细胞。通常，ACT包括施用表达结合靶抗原的抗原受体的淋巴细胞。在一些实施方案中，靶抗原是如本文所述的肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。

在一些实施方案中，本公开提供了受试者的癌症的治疗方法和用于治疗的组合物，所述受试者先前对ACT有反应(例如，对ACT表现出一种或多种临床有益反应)并且不再对ACT有反应(例如，对ACT表现出一种或多种先前临床有益反应水平的降低和/或对ACT表现出至少一种无益反应)。在一些实施方案中，本公开提供了先前对ACT有反应且不再对ACT有反应的受试者的多发性骨髓瘤的治疗方法和用于治疗的组合物。在一些实施方案中，本公开提供了用于在ACT期间或之后治疗癌症复发的包含融合蛋白的组合物和方法。

在一些实施方案中，受试者已经接受或正在接受ACT，先前对ACT表现出至少一种有益反应，并且随后对ACT表现出至少一种无益反应。在一些实施方案中，受试者已经接受或正在接受ACT，并通过使用用于治疗癌症的包含融合蛋白的组合物和方法的组合疗法进行治疗，并且随后测量反应。反应是有益的还是无益的可以根据特定标准测量和/或表征。在某些实施方案中，这样的标准可包括临床标准和/或客观标准。在某些实施方案中，用于评估反应的技术可包括但不限于临床检查、正电子发射断层扫描、胸部X射线、CT扫描、MRI、超声、内窥镜检查、腹腔镜检查、样品中特定标志物的存在或水平、细胞学和/或组织学。肿瘤的有益或无益反应可以由本领域技术人员使用多种已建立的用于评估此类反应(包括例如用于测定肿瘤负荷、肿瘤大小、肿瘤分期等中的一者或多者)的技术来评估。用于评估治疗反应的方法和指南讨论于Therasse等人,J.Natl.Cancer Inst.,2000,92(3):205-216；和Seymour等人,Lancet Oncol.,2017,18:e143-52。

在一些实施方案中，有益反应导致肿瘤负荷、肿瘤大小和/或肿瘤分期(例如，相对于ACT开始前的受试者和/或ACT期间任何阶段的受试者的肿瘤负荷、肿瘤大小和或肿瘤分期)的可测量的降低。在一些实施方案中，有益反应是疾病稳定性(SD)。在一些实施方案中，有益反应包括癌症的清除、消退和/或稳定，例如在限定的时间段内(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12年)。在一些实施方案中，有益反应包括不存在癌症复发、反复和/或转移，例如在限定的时间段内(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12年)。

在一些实施方案中，无益反应导致肿瘤负荷、肿瘤大小、和/或肿瘤分期(例如，相对于ACT开始后的受试者和/或ACT期间任何阶段的受试者的肿瘤负荷、肿瘤大小和/或肿瘤分期)的可测量的增加。在一些实施方案中，对ACT表现出无益反应的受试者表现出进行性疾病(PD)的一种或多种体征或症状。在一些实施方案中，多发性骨髓瘤中的PD被定义为与对照样品或来自受试者的先前样品(例如，在开始ACT之前和/或ACT开始后获得的最小值)相比，血清M组分增加≥25％，绝对增加≥0.5g/dL；和/或尿M组分绝对增加≥200mg/24小时；和/或涉及和未涉及的游离轻链水平之间的差异绝对增加>10mg/dL。在一些实施方案中，PD被定义为骨髓浆细胞绝对百分比≥10％；和/或新的骨病变或软组织浆细胞瘤的发展，或任何现有骨病变或软组织浆细胞瘤的大小明显增加(>1个病变的大小从最低点的增加≥50％，或先前的>1cm的病变在短轴上的最长直径增加≥50％)；和/或高钙血症的发展(校正血清钙>11.5mg/dL或2.65mmol)。在一些实施方案中，PD需要在分类为疾病进展之前的任何时间和/或在任何新疗法的开始通过相同方法进行两次连续评估。

在一些实施方案中，多发性骨髓瘤的复发被定义为进行性疾病。在一些实施方案中，多发性骨髓瘤的复发定义为通过免疫固定或电泳再次出现血清或尿M蛋白；和/或在骨髓中发展≥5％的浆细胞；和/或出现任何其他进展迹象(例如，新的浆细胞瘤、溶骨性病变、高钙血症)。

在一些实施方案中，表现出无益反应的受试者表现出在ACT中使用的细胞的靶抗原的损失或下调(例如，相对于在ACT开始之前和/或在ACT期间的任何阶段的靶抗原水平)。在一些实施方案中，肿瘤通过表现出较低的抗原表达或表现出抗原损失(例如，相对于在ACT开始之前和/或在ACT期间的任何阶段的抗原表达水平)来逃脱ACT。在一些实施方案中，受试者的肿瘤通过表现出较低的抗原密度(例如，相对于ACT开始之前和/或在ACT期间的任何阶段的抗原密度水平)来逃脱ACT。在一些实施方案中，受试者肿瘤上的抗原密度可低于CAR-T活性所需的阈值(参见例如，Watanabe,K.等人J.Immunol.194,911-920(2015)；Walker,A J.等人Mol.Ther.25,2189-2201(2017))。在一些实施方案中，测量抗原表达和/或将其相对于适当的对照进行比较。在一些实施方案中，适当的对照是在使用ACT的疗法开始之前受试者中的ACT靶抗原的表达水平和/或密度。在一些实施方案中，适当的对照是在未患癌症的个体中的ACT靶抗原的表达水平和/或密度。在一些实施方案中，适当的对照是群体中ACT靶抗原的表达水平和/或密度。

本公开的方法可用于治疗已经接受或正在接受任何ACT治疗的受试者。本公开的方法可用于治疗已经接受或正在接受任何CAR-T疗法治疗的受试者。在一些实施方案中，本公开的方法可用于治疗患有多发性骨髓瘤的受试者，所述受试者已经或正在接受任何ACT治疗。用于治疗多发性骨髓瘤的示例性ACT包括：Shah等人,Journal of ClinicalOncology 36,增刊第15号(2018年5月20日)8006-8006；Kloess等人,Transfus MedHemother 2019；46:4-13；以及Themeli等人,Nat Biotechnol,31(10),928-33Oct 2013。在一些实施方案中，本公开的方法可用于治疗患有多发性骨髓瘤的受试者，所述受试者已经或正在接受任何CAR疗法治疗。用于治疗多发性骨髓瘤的示例性CAR-T疗法包括：Brudno,J.N.等人,J.Clin.Oncol.2018,36,2267-2280.；Cohen,AD.等人；J.Clin.Investig.2019,130；Raje,N等人N.Engl.J.Med.2019,380,1726-1737；Xu,J.等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA2019,116,9543-9551；Mailankody,S.等人；Blood 2018,132(增刊第1版),959；Li,C.等人；.Blood 2018,132(增刊第1版),1013Wang,BY等人,Blood(2019)134(增刊第1版):579；Raje等人,N Engl J Med 2019；380:1726-1737。

在一些实施方案中，本公开的融合蛋白在接受ACT之前施用于受试者。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白与ACT同时施用于受试者。在一些实施方案中，本公开的融合蛋白在受试者已经接受或正在接受ACT之后施用于受试者。

在一些实施方案中，

CAR-T疗法复发

通常，CAR-T疗法包括施用表达结合靶抗原的嵌合抗原受体(CAR)的T细胞。在一些实施方案中，CAR-T靶抗原是如本文所述的肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。

在一些实施方案中，本公开部分基于以下认识：某些接受CAR-T疗法治疗癌症的复发(例如，停止表现出对CAR-T疗法的一种或多种有益反应，如本文所述)个体可以通过施用如本文所述的融合蛋白从复发中“拯救”。在一些实施方案中，本公开提供了用于在CAR-T疗法期间或之后治疗表现出癌症复发的受试者的包含融合蛋白的组合物和方法。

在一些实施方案中，本公开部分基于以下认识：某些接受CAR-T疗法治疗癌症的个体对疗法的反应欠佳，因此可能复发，并因此接受治疗以防止复发。在一些实施方案中，本公开提供了包含融合蛋白的组合物和方法，用于治疗预期对或对CAR T细胞疗法反应欠佳的受试者，例如，已实现稳定疾病、部分反应、非常好的部分反应或完全反应而没有实现最小残留疾病消极状态的患者。(参见，例如，ww w.cibmtr.org/manuals/fim/l/en/topic/multiple-myeloma-response-criteri a)。

已观察到CAR-T疗法治疗多发性骨髓瘤取得了积极成果(Rosen,Cancers 2019,11,2024)。然而，由于CAR-T疗法治疗多发性骨髓瘤后复发，BCMA CAR T细胞的长期功效并不理想，并且治愈MM仍然困难重重。参见例如，Wang,BY等人,Blood(2019)134(Supplement_1):579；Raje等人,N Engl J Med 2019；380:1726-1737。

融合蛋白

本公开尤其提供融合蛋白。在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含一种或多种抗原结合多肽(或其抗原结合片段)和一种或多种多肽抗原。在一些实施方案中，融合蛋白是“结合蛋白”或“桥接蛋白”，例如，其结合或桥接本文所述的肿瘤抗原和细胞(例如，本文所述的作为ACT的一部分施用的细胞(例如，CAR-T细胞))。在最广泛的意义上，本文所述的融合蛋白包含(i)一种或多种结合肿瘤抗原的抗原结合多肽；和(ii)一种或多种是ACT(例如，CAR-T细胞)靶标的多肽抗原，并且融合蛋白“桥接”此类ACT(例如，CAR-T细胞)与此类肿瘤抗原。例如，在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含(i)一种或多种结合第一多发性骨髓瘤抗原的抗原结合多肽；和(ii)是ACT(例如，CAR-T细胞)靶标的第二多发性骨髓瘤抗原(例如，不同于第一多发性骨髓瘤抗原)，并且融合蛋白“桥接”此类ACT(例如，CAR-T细胞)与此类第一多发性骨髓瘤抗原。

在一些实施方案中，一种或多种多肽抗原连接(例如，融合)至一种或多种抗原结合多肽之一的氨基末端。在一些实施方案中，一种或多种多肽抗原连接(例如，融合)至一种或多种抗原结合多肽之一的羧基末端。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含2、3、4种或更多种抗原结合多肽(或其抗原结合片段)和多肽抗原。例如，在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含(i)与CD38结合的抗原结合多肽(或其抗原结合片段)，(ii)与GPRCSD结合的抗原结合多肽(或其抗原结合片段)，以及(iii)BCMA多肽。本公开的其他融合蛋白包含例如2、3种或更多种不同的抗原结合多肽，其中每一种与本文所述的不同的多发性骨髓瘤抗原结合(例如，图9中所示)，以及(ii)本文所述的多肽抗原(例如，图9中所示)。

半衰期延长部分

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含至少一个异源部分，其为“半衰期延长部分”。半衰期延长部分可包含，例如，(i)XTEN多肽；(ii)Fc；(iii)人血清白蛋白(HSA)，(iv)白蛋白结合多肽或脂肪酸，(v)人绒毛膜促性腺激素β亚基的C末端肽(CTP)，(vi)脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸聚合物(PAS)；(vii)同型氨基酸聚合物(HAP)；(viii)人转铁蛋白；(ix)聚乙二醇(PEG)；(x)羟乙基淀粉(HES)，(xi)聚唾液酸(PSA)；(xii)阻断嵌合分子与清除受体结合的清除受体或其片段；(xiii)低复杂性肽；(xiv)vWF；(xv)弹性蛋白样肽(ELP)重复序列；(xvi)与人工GLK的融合；或(xv)其任何组合。参见，例如，Strohl,BioDrugs,29:215-239(2015)。

在一些实施方案中，半衰期延长部分包含XTEN多肽或由其组成。XTEN的非限制性实例公开于美国专利公开号2012/0263701和WO 2016/065301。

在一些实施方案中，半衰期延长部分包含例如来自IgG1、IgG2或IgG4的Fc区，例如铰链、CH2和CH3结构域。Fc区可包括一个或多个降低效应子功能的取代。例如，Fc区来自IgG2并且可能包含以下这些突变之一或两者：V234A和G237A，它们可降低效应子功能。示例性异源部分还包括，例如，FcRn结合部分(例如，与FcRn结合的完整Fc区或其部分)、单链Fc区(scFc区，例如，如美国公开号2008/0260738和国际公开号WO 2008/012543和WO2008/1439545中所述)，或可加工的scFc区。在一些实施方案中，异源部分可包括非多肽部分(诸如聚乙二醇(PEG)、羟乙基淀粉(HES)、聚唾液酸)或这些部分的任何衍生物、变体或组合的附接位点。

在一些实施方案中，半衰期延长部分包含人血清白蛋白(HSA)或其功能片段。白蛋白或其片段或变体的实例公开于例如美国专利公开号US2008/0194481、US2008/0004206、US2008/0161243、US2008/0261877或US2008/0153751，或PCT申请公开号WO2008/033413、WO2009/058322或者WO2007/021494。在某些实施方案中，半衰期延长部分可包含白蛋白结合部分，其包含白蛋白结合肽、细菌白蛋白结合结构域、白蛋白结合抗体片段或其任何组合。例如，白蛋白结合蛋白可以是细菌白蛋白结合蛋白、抗体或抗体片段，包括结构域抗体(参见例如，美国专利号6,696,245)。例如，白蛋白结合蛋白可以是细菌白蛋白结合结构域，诸如链球菌蛋白G中的一种(Konigand Skerra(1998)J.Immunol.Methods 218,73-83)。可以使用的白蛋白结合肽的其他实例描述于例如美国公开号US2003/0069395；美国公开号US2007/0269422；Vosjan等人,Mol Cancer Ther；11(4):1017-25或Dennis等人(2002)J.Biol.Chem.277,35035-35043。

在某些实施方案中，半衰期延长部分可包含人绒毛膜促性腺激素的C末端肽(CTP)或其片段、变体或衍生物的β亚基。已知插入到重组蛋白的一个或多个CTP肽能增加此蛋白的体内半衰期。参见，例如，美国专利号5,712,122和美国专利申请公开号US 2009/0087411。

在某些实施方案中，半衰期延长部分可包含PAS序列。如本文使用的PAS序列意指主要包含丙氨酸和丝氨酸残基或主要包含丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸残基的氨基酸序列，所述氨基酸序列在生理条件下形成无规卷曲构象。因此，PAS序列是包含丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸、基本由丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸组成，或由丙氨酸、丝氨酸和脯氨酸组成的结构单元、氨基酸聚合物或序列盒，其可用作本文所述的融合蛋白的一部分。PAS序列的非限制性实例公开于例如美国专利公开号2010/0292130和PCT申请公开号WO 2008/155134 A1。

在一些实施方案中，半衰期延长部分是可溶性聚合物，包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖或聚乙烯醇。在一个实施方案中，半衰期延长部分是PEG。聚乙二醇可具有约200、500、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500、10,000、10,500、11,000、11,500、12,000、12,500、13,000、13,500、14,000、14,500、15,000、15,500、16,000、16,500、17,000、17,500、18,000、18,500、19,000、19,500、20,000、25,000、30,000、35,000、40,000、45,000、50,000、55,000、60,000、65,000、70,000、75,000、80,000、85,000、90,000、95,000或100,000kDa的平均分子量。在一些实施方案中，聚乙二醇可具有分支结构，如描述于例如美国专利号5,643,575；Morpurgo等人,Appl.Biochem.Biotechnol.56:59-72(1996)；Vorobjev等人,Nucleosides Nucleotidesl8:2745-2750(1999)；以及Caliceti等人,Bioconjug.Chem.10:638-646(1999)。

抗原结合多肽

如本文所述，本公开提供了包含一种或多种抗原结合多肽或其片段的融合蛋白。在一些实施方案中，抗原结合多肽靶向肿瘤抗原，例如肿瘤特异性抗原(TSA)或肿瘤相关抗原(TAA)。TSA是(或被认为是)肿瘤细胞独有的，不会出现在身体中的其他细胞上(例如，在其他细胞上不会明显出现)。TAA不是肿瘤细胞所独有的，而是也在正常细胞上表达(例如，在不能诱导对抗原的免疫耐受状态的条件下表达)。例如，TAA在免疫系统未成熟并且不能反应的胚胎发育期间可以是在正常细胞上表达的抗原，或者它们可以是在正常细胞上通常以低水平存在但在肿瘤细胞上以较高水平表达的抗原。

在一些实施方案中，抗原结合多肽结合是或包含一种或多种与多发性骨髓瘤相关的抗原性癌症表位的肿瘤抗原。在一些实施方案中，抗原结合多肽靶向以下肿瘤抗原中的一种或多种和/或与其结合：CD38；CS1/SLAMF7；GPRC5D；CD208(LAMP3)；CD307e(FCRL5)；ITGA8(整合素a8)；CD138；ITGB7(活化整合素β-7)、CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)和/或BCMA。在一些实施方案中，抗原结合多肽靶向一种或多种抗原和/或与其结合，所述抗原鉴定于Frigyesi等人,Blood.2014；123(9):1336-1340、Rosen等人Nat Med.2017Dec；23(12):1436-1443，或Muccio等人,Cytometry Part B(ClinicalCytometry)90B:81-90(2016)。已经发表了描述有用的抗肿瘤抗体的各种评论文章(参见例如，Adler等人,Hematol.Oncol.Clin.North Am.26:447-81(2012)；Li等人,DrugDiscov.Ther.7:178-84(2013)；Scott等人,Cancer Immun.12:14(2012)；以及Sliwkowski等人,Science 341:1192-1198(2013))。示例性抗原结合多肽包括，例如，达拉木单抗(daratumumab)、菲泽妥单抗(felzartamab)(MOR202)、伊沙妥昔单抗(isatuximab)；埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、BT062、HuLuc63、贝兰他单抗莫福汀(belantamab mafodotin)(GSK2857916)、雷英妥昔单抗(indatuximab ravtansin)；维汀-阿妥昔珠单抗(azintuxizumab vedotin)(ABBV-838)。

在一些实施方案中，抗原结合多肽包含SEQ ID NO:15-18或25、27、29、31、33、35、37、39、57或58的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，抗原结合多肽包含与SEQ IDNO:15-18或25、27、29、31、33、35、37、39、57或58具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，抗原结合多肽靶向对肿瘤上的蛋白质进行的一种或多种翻译后修饰和/或与其结合。在一些实施方案中，抗原结合多肽靶向肿瘤上蛋白质上的一个或多个糖基修饰和/或与其结合。在一些实施方案中，抗原结合多肽靶向Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr)和/或唾液酸-Tn(STn)(NeuAcα2-6-GalNAcαl-O-Ser/Thr)糖型和/或与其结合。参见Posey等人,Immunity 44,第1444-1454页,2016年6月21日。

在一些实施方案中，抗原结合多肽是抗体或其片段。在一些实施方案中，抗体或其片段包括例如，完整的IgG、IgE、IgA和IgM、双特异性抗体或多特异性抗体(例如，

等)、单链Fv、多肽Fc融合物、Fab、骆驼抗体、掩蔽抗体(例如，/>

)、小型模块化免疫药物(“SMIPsTM”)、单链或串联双抗体/>

VHH、/>

微型抗体、/>

锚蛋白重复蛋白或/>

DART、TCR样抗体、

微蛋白、/>

和/>

在一些实施方案中，抗原结合多肽是双特异性抗体或其部分。在一些实施方案中，这种双特异性抗体或其部分结合本文所述的一种或多种肿瘤抗原，例如，所述肿瘤抗原一起定义特定的肿瘤类型。

在一些实施方案中，融合蛋白是双互补位融合蛋白。在一些实施方案中，双互补位融合蛋白包含本文所述的两种或更多种抗原结合多肽和至少一种多肽抗原。在一些实施方案中，所述两种或更多种抗原结合多肽结合本文所述的相同肿瘤抗原的不同表位。在一些实施方案中，双互补位融合蛋白是或包含两个抗体片段和至少一个额外的非抗体多肽。在一些实施方案中，融合蛋白是或包含scFv、VHH和至少一种多肽抗原。

所述两种或更多种抗原结合多肽和至少一种多肽抗原可在双互补位融合蛋白内以任何次序配置。在一些实施方案中，所述多肽抗原连接(例如，融合)至两种或更多种抗原结合多肽之一的氨基末端。在一些实施方案中，所述多肽抗原连接(例如，融合)至两种或更多种抗原结合多肽之一的羧基末端。例如，包含抗原结合多肽A；抗原结合多肽B；以及多肽抗原的双互补位融合蛋白可配置为以下配置中的任一种：(i)抗原结合多肽A-抗原结合多肽B-多肽抗原；(ii)抗原结合多肽B-抗原结合多肽A-多肽抗原；(iii)多肽抗原-抗原结合多肽A-抗原结合多肽B；(iv)多肽抗原-抗原结合多肽B-抗原结合多肽A；(v)抗原结合多肽B-多肽抗原-抗原结合多肽A；(vi)抗原结合多肽A-多肽抗原-抗原结合多肽B。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含两种或更多种抗原结合多肽(或其抗原结合片段)和一种或多种多肽抗原(例如，本文所述的融合蛋白是二价的)。在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白的两种或更多种抗原结合多肽结合相同抗原。在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白的两种或更多种抗原结合多肽结合相同表位。在一些实施方案中，所述两种或更多种抗原结合多肽是相同的多肽。

在一些实施方案中，两种或更多种抗原结合多肽是低亲和力结合剂。在一些实施方案中，融合蛋白包含两种或更多种抗原结合多肽，其中所述两种或更多种抗原结合多肽以低亲和力与靶抗原特异性结合。在一些实施方案中，低亲和力抗原结合多肽以约50nM至约2μM之间的Kd与靶抗原结合。在一些实施方案中，低亲和力抗原结合多肽以约50-100nM；75-125nM；100-150nM；125-175nM；150-200nM；175-225nM；200-250nM；225-275nM；250-300nM；275-325nM；300-350nM；325-375nM；350-400nM；375-425nM；400-450nM；425-475nM；450-500nM；475-525nM；500-550nM；525-575nM；550-600nM；575-625nM；600-650nM；625-675nM；650-700nM；675-725nM；700-750nM；725-775nM；750-800nM；775-825nM；800-850nM；825-875nM；850-900nM；875-925nM；900-950nM；925-975nM；950-1.0μM；975-1.25μM；1.0-1.50μM；1.25-1.75μM；1.50-2.00μM；1.75-2.25μM；2.0-2.50μM；50-100nM；100-200nM；200-300nM；300-400nM；400-500nM；500-600nM；600-700nM；700-800nM；800-900nM；900nM-1.0μM；1.0μM-1.1μM；1.1μM-1.2μM；1.2μM-1.3μM；1.3μM-1.4μM；1.4μM-1.5μM；1.5μM-1.6μM；1.6μM-1.7μM；1.7μM-1.8μM；1.8μM-1.9μM；1.9μM-2.0μM之间的Kd与靶抗原结合。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含两种或更多种抗原结合多肽，其中每一种以低亲和力(例如，如本文所述)与靶抗原特异性结合，并且此类融合蛋白以高亲合力(例如，如本文所述)与靶细胞(例如，表达靶抗原的细胞)结合。在一些实施方案中，包含两种或更多种抗原结合多肽(每种多肽以低亲和力与靶抗原特异性结合)的融合蛋白以高亲合力(例如，如本文所述)与以高水平(例如，相对于对照水平(例如，健康细胞上的靶抗原水平或健康细胞群体上靶抗原的平均水平)更高的水平)表达靶抗原的靶细胞结合。在一些实施方案中，包含两种或更多种抗原结合多肽(每种多肽以低亲和力与靶抗原特异性结合)的融合蛋白以低亲合力(例如，如本文所述)与以低水平(例如，相对于对照水平(例如，靶肿瘤细胞上的靶抗原水平或靶肿瘤细胞群体上靶抗原的平均水平)更低的水平)表达靶抗原的非靶细胞(例如，健康细胞)结合。在一些实施方案中，这种融合蛋白以高亲合力与靶细胞结合(例如，Kd为约0.00025、0.0005、0.00075、0.001、0.0025；0.005、0.0075、0.01、0.025、0.05、0.075、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、5、10、15、20、25、30、35、40nM)。在一些实施方案中，这种融合蛋白以低亲合力与非靶细胞结合(例如，Kd大于约40nM)。

产生以低亲和力结合靶抗原的抗原结合多肽(例如，抗体或抗原结合片段)的方法和制备与(例如，以更高的亲合力)相对于第二细胞群体(例如，表达低水平抗原的细胞群体)的一个细胞群体(例如，表达高水平抗原的细胞群体)选择性结合的构建体的方法是本领域已知的，并且已经描述于例如，Bacac等人,Clin Cancer Res；22(13)July 1,2016；US20200216559A1；US2020/0199251；US 2013/0209355；Drent等人,Molecular Therapy第25卷第8号August 2017；和Seckinger等人,Cancer Cell 31,第396-410页,2017年3月13日；所述文献中的每一个都以引用的方式并入本文。确定抗原结合多肽的亲和力的方法是本领域已知的，并且由本文引用的参考文献描述。在一些实施方案中，抗原结合多肽的亲和力可以通过表面等离子共振(例如，Biacore)来测量。在一些实施方案中，抗原结合多肽的亲和力可以通过生物层干涉法测量。在一些实施方案中，抗原结合多肽的亲和力通过与表达所述抗原的细胞结合来测量。在一些实施方案中，抗原结合多肽的亲和力通过荧光激活细胞分选(FACS)测量。在一些实施方案中，抗原结合多肽的亲和力通过酶联免疫吸附测定(ELISA)测量。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中的两种或更多种抗原结合多肽中的至少一种结合CD38。在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白中的两种或更多种抗原结合多肽中的一种或多种是或包含抗体或其抗原结合片段，如描述于Drent等人,MolecularTherapy第25卷第8号August 2017；US 2013/0209355；或US 2020/0199251，所述文献中的每一个都以引用的方式并入本文。

抗体或片段可通过本领域已知的用于合成抗体的任何方法产生(参见例如，Harlow等人,Antibodies:A Laboratory Manual,(Cold Spring Harbor LaboratoryPress,第2版1988)；Brinkman等人,1995,J.Immunol.Methods 182:41-50；WO 92/22324；WO98/46645)。可使用描述于例如Morrison,1985,Science 229:1202的方法产生嵌合抗体，并通过描述于例如美国专利号6,180,370的方法产生人源化抗体。

多肽抗原

如本文所述，在一些实施方案中，融合蛋白包含多肽抗原。在一些实施方案中，多肽抗原是本文所述的肿瘤抗原。

在一些实施方案中，多肽抗原是作为ACT的一部分递送或施用给受试者的细胞的靶标(例如，结合或被识别)。例如，在一些实施方案中，多肽抗原是在ACT中施用的细胞(例如，携带CAR的细胞(例如，CAR-T细胞))上的抗原受体的靶标(例如，结合或被识别)。在一些实施方案中，受试者已经接受或正在接受CAR-T细胞的疗法，并且本文所述的融合蛋白中包含的多肽抗原与CAR-T细胞的靶抗原相同。在一些实施方案中，受试者已经接受或正在接受第一CAR-T细胞的疗法，并且本文所述的融合蛋白中包含的多肽抗原是不同于第一CAR-T细胞的靶抗原的靶抗原，例如，与第二CAR-T细胞的靶抗原相同。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含选自由以下组成的组的多肽抗原：BCMA、CD38、SLAMF7、CD208、CD307e、ITGA8；ITGB7；CD272、CD229、CD48、CD150、CD86、CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)和CD138。

在一些实施方案中，本文所述的融合蛋白包含(i)与多发性骨髓瘤抗原结合的抗原结合多肽和(ii)如图9所示的多肽抗原的组合。

蛋白质治疗剂

在一些实施方案中，可产生如本文所述的融合蛋白，并将其用作治疗剂。此类多肽可包含在组合物(例如，药物组合物)中，并用作蛋白质治疗剂。

多种制备多肽的方法是本领域已知的并且可用于制备包含在蛋白质治疗剂中的多肽。例如，多肽可通过利用被工程化以表达编码多肽的核酸的宿主细胞系统重组产生。基因的重组表达可包括构建含有编码多肽的多核苷酸的表达载体。一旦获得了多核苷酸，就可以使用本领域已知的技术通过重组DNA技术来产生用于产生多肽的载体。已知方法可用于构建含有多肽编码序列和适当的转录和翻译控制信号的表达载体。这些方法包括例如体外重组DNA技术、合成技术和体内基因重组。

可以通过常规技术将表达载体转移到宿主细胞中，然后可通过常规技术培养转染的细胞以产生多肽。

可使用多种宿主表达载体系统(参见例如，美国专利号5,807,715)。此类宿主表达系统可用于产生多肽，并在需要时随后进行纯化。此类宿主表达系统包括微生物，诸如用含有多肽编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌(例如，大肠杆菌和枯草芽孢杆菌)；用含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母(例如，酵母菌属(Saccharomyces)和毕赤酵母属(Pichia))；用含有多肽编码序列的重组病毒表达载体(例如，杆状病毒)感染的昆虫细胞系统；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒，CaMV；烟草花叶病毒，TMV)感染或用含有多肽编码序列的重组质粒表达载体(例如，Ti质粒)转化的植物细胞系统；或者拥有含有源自哺乳动物细胞的基因组(例如，金属硫蛋白启动子)或源自哺乳动物病毒(例如，腺病毒晚期启动子；痘苗病毒7.5K启动子)的启动子的重组表达构建体的哺乳动物细胞系统(例如，COS、CHO、BHK、293、NS0和3T3细胞)。

对于细菌系统，可以使用多种表达载体，包括但不限于大肠杆菌表达载体pUR278(Ruther等人,1983,EMBO 12:1791)；pIN载体(Inouye和Inouye,1985,Nucleic AcidsRes.13:3101-3109；Van Heeke和Schuster,1989,J.Biol.Chem.24:5503-5509)等。pGEX载体还可用于表达外源多肽，如具有谷胱甘肽5转移酶(GST)的融合蛋白。

对于在哺乳动物宿主细胞中的表达，可利用基于病毒的表达系统(参见例如Logan和Shenk,1984,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:355-359)。表达的效率可通过包含适当的转录增强子元件、转录终止子等来增强(参见例如，Bittner等人,1987,Methods inEnzymol.153:516-544)。

此外，可选择以所需的特定方式调节插入序列的表达或修饰和加工基因产物的宿主细胞株。不同的宿主细胞对于蛋白质和基因产物的翻译后加工和修饰具有特征性和特异性的机制。可以选择适当的细胞系或宿主系统以确保表达的多肽的正确修饰和加工。此类细胞包括例如已建立的哺乳动物细胞系和昆虫细胞系、动物细胞、真菌细胞和酵母细胞。哺乳动物宿主细胞包括例如BALB/c小鼠骨髓瘤细胞系(NSO/1，ECACC No:85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6，CruCell,Leiden,The Netherlands)；通过SV40转化的猴肾CV1细胞系(COS-7，ATCC CRL 1651)；人胚胎肾细胞系(293细胞或被亚克隆以在悬浮培养基中生长的293细胞，Graham等人,J.Gen Virol.,36:59,1977)；人纤维肉瘤细胞系(例如，HT1080)；婴儿仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO，Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980)；小鼠塞尔托利细胞(mouse sertoli cell)(TM4，Mather,Biol.Reprod.,23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1 ATCC CCL 70)；非洲绿猴肾细胞(VERO-76，ATCC CRL-1 587)；人宫颈癌细胞(HeLa,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK，ATCC CCL 34)；水牛大鼠肝细胞(buffalo rat liver cell)(BRL 3A，ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138，ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2，HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562，ATCC CCL51)；TRI细胞(Mather等人,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68,1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝细胞瘤细胞系(Hep G2)。

为了长期高产率生产重组蛋白，将宿主细胞工程化以稳定表达多肽。可用通过本领域已知的适当表达控制元件控制的DNA转化宿主细胞，所述表达控制元件包括启动子、增强子、序列、转录终止子、聚腺苷酸化位点和可选标志物。可使用重组DNA技术领域公知的方法来选择所需的重组克隆。

一旦通过重组表达产生了本文所述的蛋白质，就可以通过本领域已知的任何纯化方法，例如通过色谱法(例如，离子交换色谱法、亲和色谱法和尺寸排阻柱色谱法)、离心、差异溶解度或通过任何其他用于纯化蛋白质的标准技术来对其进行纯化。例如，可通过适当选择亲和柱(诸如具有色谱柱的蛋白质A柱)、过滤、超滤、盐析和透析程序并将其组合来分离和纯化抗体(参见Antibodies:A Laboratory Manual,Ed Harlow,David Lane,ColdSpring Harbor Laboratory,1988)。此外，如本文所述，多肽可与异源多肽序列融合以促进纯化。或者或另外，多肽或融合蛋白可部分或完全通过化学合成来制备。

病毒递送

在一些实施方案中，编码本文所述融合蛋白的核酸可被引入病毒载体中。在一些实施方案中，这种病毒载体可用于将融合蛋白引入到癌细胞(例如，肿瘤细胞)中。此类融合蛋白的引入可增加对受试者免疫系统和/或一种或多种额外治疗剂的易感性(参见例如，WO2017/075533)。

载体设计

编码本文所述的融合蛋白的核酸序列可被克隆到多种类型的载体内。例如，核酸可被克隆到质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒内。其他载体可包括表达载体、复制载体、探针生成载体、测序载体和病毒载体。在其他实例中，所述载体可以是泡沫病毒(FV)载体，一种由泡沫病毒属(spumavirus)制成的逆转录病毒载体。病毒载体设计和技术是本领域熟知的，如Sambrook等人,(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2001)以及其他病毒学和分子生物学手册中所述。

病毒转导

病毒在将核酸递送至特定细胞类型方面非常有效，同时通常避免被感染的宿主免疫系统检测到。这些特征使某些病毒成为作为将细胞治疗靶标引入到癌细胞(例如，实体瘤细胞)中的媒介物的有吸引力的候选者。已经开发了许多基于病毒的系统，用于将基因转移到哺乳动物细胞中。病毒载体的实例包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒、慢病毒、痘病毒、I型单纯疱疹病毒、疱疹病毒、癌病毒(例如，鼠白血病病毒)等。一般而言，合适的载体含有在至少一种生物体中起作用的复制起点、启动子序列、便利的限制性核酸内切酶位点和一种或多种可选标志物(例如，WO 01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

慢病毒和逆转录病毒转导可通过添加聚凝胺(SantaCruz sc-134220；MilliporeTR-1003-G；Sigma 107689)来增强，所述聚凝胺(也称为海美溴铵(hexamehtrinebromide))是用于增加逆转录病毒转导效率的阳离子聚合物。

例如，逆转录病毒提供了基因递送系统的平台。逆转录病毒是属于逆转录病毒科(viral family Retroviridae)的包膜病毒。一旦进入宿主细胞，所述病毒就会通过使用病毒逆转录酶将其RNA转录成DNA进行复制。逆转录病毒DNA作为宿主基因组的一部分进行复制，并被称为前病毒。可使用本领域已知的技术将所选的基因插入到载体中并包装到逆转录病毒颗粒中。然后可将重组病毒分离并递送到受试者体内的细胞。许多逆转录病毒系统是本领域已知的(参见例如，美国专利号5,994,136、6,165,782和6,428,953)。

逆转录病毒包括α逆转录病毒属(Alpharetrovirus)(例如，禽白血病病毒)、β逆转录病毒属(Betaretrovirus)(例如，小鼠乳腺肿瘤病毒)、δ逆转录病毒属(Deltaretrovirus)(例如，牛白血病病毒和人嗜T淋巴细胞病毒)、ε逆转录病毒属(Epsilonretrovirus)(例如，大眼梭鲈皮肤肉瘤病毒(Walleye dermal sarcoma virus))和慢病毒属(Lentivirus)。在一些实施方案中，逆转录病毒是逆转录病毒科慢病毒属，例如其特征在于长孵育期。慢病毒能够感染非分裂细胞，这在逆转录病毒中是独特的；慢病毒可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此可以用作有效的基因递送载体。在一些实例中，慢病毒可以是但不限于人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)、猴免疫缺陷病毒(S1V)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、马传染性贫血(EIA)和维斯纳病毒(visna virus)。来源于慢病毒的载体提供了在体内实现显著水平的基因转移的手段。

在一些实施方案中，载体是腺病毒载体。腺病毒是一大类含有双链DNA的病毒。腺病毒复制宿主细胞的DNA，同时使用宿主的细胞机制合成病毒RNA DNA和蛋白质。本领域已知腺病毒影响复制和非复制细胞，容纳大的转基因，并且编码蛋白质而无需整合到宿主细胞基因组中。

在一些实施方案中，使用AAVP载体。AAVP载体是原核-真核载体的杂合体，所述杂合体是重组腺相关病毒和噬菌体的遗传顺式元件的嵌合体。AAVP将噬菌体和AAV载体系统的所选元件组合，从而提供在细菌中易于产生并且几乎没有或没有包装限制，同时允许感染哺乳动物细胞并整合到宿主染色体中的载体。含有许多适当的元件的载体是可商购获得的，并且可通过标准方法进一步修饰以包含必要的序列。除此之外，AAVP不需要辅助病毒或反式作用因子。此外，因为不形成AAV衣壳，所以消除了AAV对哺乳动物细胞的原生趋性(native tropism)。其他方法和细节见美国专利8,470,528和Hajitou A.等人,Cell,125:358-398。

在一些实施方案中，使用人乳头状瘤(HPV)假病毒。DNA质粒可以被包装到乳头状瘤病毒L1和L2衣壳蛋白中，以产生可有效递送DNA的假病毒粒子。封装可保护DNA免受核酸酶的影响，并提供具有高稳定水平的靶向递送。许多与使用病毒载体相关的安全性问题可用HPV假病毒来减轻。其他方法和实例见Hung,C.等人,Plos One,7:7(e40983)；2012,美国专利8,394,411，以及Kines,R.等人,Int J of Cancer,2015。

在一些实施方案中，使用溶瘤病毒。溶瘤病毒疗法可选择性地在癌细胞中复制病毒，并且随后可以在肿瘤内扩散，例如不影响正常组织。或者，溶瘤病毒可优先感染并杀伤细胞而不会对正常组织造成损害。溶瘤病毒还可有效地诱导对自身以及对受感染的肿瘤细胞的免疫反应。通常，溶瘤病毒分为两类：(I)天然优先在癌细胞中复制并且在人中不致病的病毒。示例性(I)类溶瘤病毒包括自主细小病毒、粘液瘤病毒(痘病毒)、新城病病毒(NDV；副粘病毒)、呼肠孤病毒和塞内卡谷病毒(Seneca Valley Virus)(微小核糖核酸病毒)。第二类(II)包括进行基因操作以用作疫苗载体的病毒，包括麻疹病毒(副粘病毒)、脊髓灰质炎病毒(微小核糖核酸病毒)和痘苗病毒(痘病毒)。此外，溶瘤病毒可包括被基因工程化成具有在正常细胞而非癌细胞中复制所需的基因突变/缺失的那些病毒，包括腺病毒、单纯疱疹病毒和水泡性口炎病毒。溶瘤病毒可因其低遗传抗性的可能性而被用作病毒转导方法，因为溶瘤病毒可以靶向多种途径并以肿瘤选择性方法复制。由于原位病毒扩增，肿瘤内的病毒剂量可随时间增加(与随时间减少的小分子疗法相比)，并且可建立安全特征(即，药物和免疫敏感性)。

施用

本公开的某些实施方案包括向受试者施用例如可有效治疗受试者的量的本文所述的蛋白质治疗剂和/或包含蛋白质治疗剂的组合物的方法。在一些实施方案中，所述方法有效地治疗受试者的癌症。

本文所述的多肽(例如，蛋白质治疗剂)可并入药物组合物中(例如，用作蛋白质治疗剂)。包含多肽的药物组合物可通过本领域技术人员已知的方法配制(参见例如Remington's Pharmaceutical Sciences第1447-1676页(Alfonso R.Gennaro编,第19版1995))。药物组合物可以可注射制剂的形式肠胃外施用，所述制剂包含水或另一种药学上可接受的液体中的无菌溶液或悬浮液。例如，药物组合物可通过将多肽与药学上可接受的媒介物或介质(诸如无菌水和生理盐水、植物油、乳化剂、悬浮剂、表面活性剂、稳定剂、调味赋形剂、稀释剂、媒介物、防腐剂、粘合剂)适当地组合，然后以普遍接受的制药实践所需的单位剂量形式混合来配制。在药物制剂中包含的活性成分的量是提供在指定范围内的合适剂量。

注射用无菌组合物可根据常规制药实践使用注射用蒸馏水作为媒介物进行配制。例如，生理盐水或含有葡萄糖的等渗溶液和其他补充剂诸如D-山梨醇、D-甘露糖、D-甘露糖醇和氯化钠可以用作注射用水溶液，任选地与合适的增溶剂组合，所述增溶剂例如，醇诸如乙醇和多元醇诸如丙二醇或聚乙二醇，以及非离子表面活性剂诸如聚山梨醇酯80^TM、HCO-50等。

油性液体的非限制性实例包括芝麻油和大豆油，并且它可与苯甲酸苯甲酯或苯甲醇组合作为增溶剂。可包含的其他项目是缓冲剂(诸如磷酸盐缓冲剂或乙酸钠缓冲剂)、舒缓剂(诸如盐酸普鲁卡因)、稳定剂(诸如苯甲醇或苯酚)和抗氧化剂。配制的注射剂可以包装在合适的安瓿中。

施用途径可以是肠胃外的，例如通过注射施用、经鼻施用、经肺施用或经皮施用。施用可以是全身的或局部的，通过静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射、皮下注射。

可根据受试者的年龄和状况选择合适的施用方式。含有多肽的药物组合物的单剂量可选自0.001至1000mg/kg体重的范围。另一方面，剂量可以在0.001至100000mg/体重的范围内选择，但本公开不限于这些范围。施用剂量和方法可根据受试者的体重、年龄、状况等而变化，并且可根据本领域技术人员的需要合适地选择。

受试者鉴定

在一些实施方案中，鉴定和/或选择受试者以施用如本文所述的融合蛋白。例如，在一些实施方案中，可根据多发性骨髓瘤的诊断鉴定和/或选择受试者治疗。在一些实施方案中，可根据难治性或抗性多发性骨髓瘤的诊断鉴定和/或选择受试者治疗。在一些实施方案中，可根据接受ACT疗法的处方鉴定和/或选择受试者进行治疗。在一些实施方案中，可根据ACT疗法复发的证据鉴定和/或选择受试者治疗。在一些实施方案中，可根据一种或多种测量或观察到的多发性骨髓瘤复发迹象(例如，无益反应、用于ACT的细胞的靶抗原的损失或下调或进行性疾病)鉴定和/或选择受试者治疗。在一些实施方案中，将融合蛋白施用于受试者。在一些实施方案中，在施用融合蛋白疗法后，受试者对ACT疗法表现出积极的临床反应，例如，表现出基于一种或多种临床标准和/或客观标准的改善(例如，表现出肿瘤负荷、肿瘤大小和/或肿瘤分期的降低)。

本文所述的方法可包括准备和/或提供报告，诸如电子的、基于网络的或纸质形式的报告。所述报告可包括来自本文所述方法的一个或多个输出，例如肿瘤负荷、肿瘤大小和/或肿瘤分期、疾病的稳定性、靶抗原的损失或下调。在一些实施方案中，生成报告，诸如以纸质或电子形式，其鉴定癌症患者的一种或多种肿瘤抗原的存在或不存在，以及任选地，生成推荐的癌症疗法过程。在一些实施方案中，报告包括癌症患者的标识符。在一个实施方案中，报告呈基于网络的形式。

在一些实施方案中，另外或或者，报告包括关于预后、抗性或潜在或建议的治疗选项的信息。报告可包括关于以下方面的信息：治疗选项的可能有效性、治疗选项的可接受性，或将治疗选项应用于(例如，报告中鉴定的)癌症患者的可取性。例如，所述报告可包括关于癌症疗法施用的信息或建议，例如向患者施用预先选择的剂量或以预先选择的治疗方案(例如与一种或多种替代癌症疗法组合)施用。所述报告可自执行本文所述方法之后的7、14、21、30或45天内被递送至例如本文所述的实体。在一些实施方案中，报告是个性化癌症治疗报告。

在一些实施方案中，生成报告以记录使用本文所述的方法每次测试癌症受试者的情况。可每隔一段时间(诸如每月、每两个月、每六个月或每年，或者更频繁或更不频繁地)重新评估癌症受试者，以监测受试者对癌症疗法的反应性和/或一种或多种(例如，本文所述的)癌症症状的改善。在一些实施方案中，所述报告可至少记录癌症受试者的治疗历史。

在一个实施方案中，所述方法还包括向另一方提供报告。另一方可是例如癌症受试者、护理人员、医师、肿瘤科医生、医院、诊所、第三方付款人、保险公司或政府机关。

肿瘤

本公开提供了可用于治疗任何癌症或肿瘤的技术。在一些实施方案中，肿瘤是或包括血液恶性肿瘤，包括但不限于多发性骨髓瘤或骨髓增生性肿瘤。

在一些具体实施方案中，肿瘤是或包括晚期肿瘤和/或难治性肿瘤。在一些实施方案中，当在肿瘤中(例如，在从肿瘤获得的组织样品诸如活检样品中)观察到某些病理且/或当通常不认为患有此类肿瘤的癌症患者是常规化学疗法的候选者时，肿瘤表征为晚期肿瘤。在一些实施方案中，将肿瘤表征为晚期肿瘤的病理可包括肿瘤大小、遗传标志物的表达改变以及肿瘤细胞对邻近器官和/或淋巴结的侵袭。在一些实施方案中，当患有此种肿瘤的患者对一种或多种已知的治疗方式(例如，一种或多种常规化学治疗方案)有抗性时且/或当特定患者已表现出对一种或多种此类已知的治疗方式的抗性(例如，缺乏反应性)时，肿瘤表征为难治性肿瘤。

组合疗法

在一些实施方案中，蛋白质治疗剂与细胞治疗剂、抗体-药物缀合物、抗体和/或多肽组合施用。在一些实施方案中，细胞治疗剂(例如，CAR-T细胞)靶向和/或杀伤肿瘤的程度高于在不存在组合的疗法的情况下观察或测量到的水平。

包含本文所述的蛋白质治疗剂的药物组合物可以任选地含有一种或多种额外治疗剂(诸如癌症治疗剂，例如化学治疗剂或生物剂)和/或与其组合施用。可与本文所述的蛋白质治疗剂组合使用的化学治疗剂的实例包括铂化合物(例如，顺铂、卡铂和奥沙利铂(oxaliplatin))、烷化剂(例如，环磷酰胺、异环磷酰胺、苯丁酸氮芥、氮芥、噻替哌(thiotepa)、美法仑(melphalan)、白消安(busulfan)、丙卡巴肼(procarbazine)、链脲佐菌素、替莫唑胺(temozolomide)、达卡巴嗪(dacarbazine)和苯达莫司汀(bendamustine))、抗肿瘤抗生素(例如，柔红霉素(daunorubicin)、多柔比星(doxorubicin)、伊达比星(idarubicin)、表柔比星(epirubicin)、米托蒽醌(mitoxantrone)、博来霉素(bleomycin)、丝裂霉素C(mytomycin C)、普卡霉素(plicamycin)和更生霉素(dactinomycin))、紫杉烷(例如，紫杉醇(paclitaxel)和多烯紫杉醇(docetaxel))、抗代谢药(例如，5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷、培美曲塞(pemetrexed)、硫鸟嘌呤、氟尿苷、卡培他滨(capecitabine)和甲氨蝶呤)、核苷类似物(例如，氟达拉滨(fludarabine)、氯法拉滨(clofarabine)、克拉屈滨(cladribine)、喷司他丁(pentostatin)和奈拉滨(nelarabine))、拓扑异构酶抑制剂(例如，拓扑替康(topotecan)和伊立替康(irinotecan))、去甲基化剂(例如，阿扎胞苷(azacitidine)和地西他滨(decitabine))、蛋白酶体抑制剂(例如，硼替佐米(bortezomib))、表鬼臼毒素(例如，依托泊苷(etoposide)和替尼泊苷(teniposide))、DNA合成抑制剂(例如，羟基脲)、长春花生物碱(例如，长春新碱(vincristine)、长春地辛(vindesine)、长春瑞滨(vinorelbine)和长春花碱(vinblastine))、酪氨酸激酶抑制剂(例如，伊马替尼(imatinib)、达沙替尼(dasatinib)、尼罗替尼(nilotinib)、索拉非尼(sorafenib)和舒尼替尼(sunitinib))、亚硝基脲(例如，卡莫司汀(carmustine)、福莫司汀(fotemustine)和洛莫司汀(lomustine))、六甲嘧胺(hexamethylmelamine)、米托坦(mitotane)、血管生成抑制剂(例如，沙利度胺(thalidomide)和来那度胺(lenalidomide))、类固醇(例如，泼尼松(prednisone)、地塞米松(dexamethasone)和泼尼松龙(prednisolone))、激素类剂(例如，他莫昔芬(tamoxifen)、雷洛昔芬(raloxifene)、亮丙瑞林(leuprolide)、比卡鲁胺(bicalutamide)、格拉司琼(granisetron)和氟他胺(flutamide))、芳香化酶抑制剂(例如，来曲唑(letrozole)和阿那曲唑(anastrozole))、三氧化二砷、维甲酸、非选择性环氧合酶抑制剂(例如，非类固醇抗炎剂、水杨酸盐、阿司匹林(aspirin)、吡罗昔康(piroxicam)、布洛芬(ibuprofen)、吲哚美辛(indomethacin)、萘普生(naprosyn)、双氯芬酸(diclofenac)、托美丁(tolmetin)、酮洛芬(ketoprofen)、萘布美通(nabumetone)和奥沙普秦(oxaprozin))、选择性环氧合酶2(COX-2)抑制剂或其任何组合。

可在本文所述的组合物和方法中使用的生物剂的实例包括单克隆抗体(例如，利妥昔单抗、西妥昔单抗、盘尼图玛单抗(panetumumab)、托西莫单抗、曲妥珠单抗、阿仑单抗、吉妥单抗、贝伐珠单抗、卡妥索单抗、地舒单抗、奥滨尤妥珠单抗、奥法木单抗、雷莫芦单抗(ramucirumab)、帕妥珠单抗、伊匹单抗、纳武单抗(Nivolumab)、尼妥珠单抗、派姆单抗(lambrolizumab)、匹地利珠单抗(pidilizumab)、司妥昔单抗(siltuximab)、BMS-936559、RG7446/MPDL3280A、MEDI4736、曲美木单抗(tremelimumab))、酶(例如，L-门冬酰胺酶)、细胞因子(例如，干扰素和白介素)、生长因子(例如，集落刺激因子和促红细胞生成素)、癌症疫苗、基因治疗载体或其任何组合。

在一些实施方案中，本文所述的治疗方法是针对医学病状的其他治疗已失效或通过其他方式在治疗中不太成功的受试者进行的。此外，本文所述的治疗方法可与医学病状的一种或多种额外治疗结合进行。例如，所述方法可包括在施用本文所述的蛋白质治疗剂或其组合物之前、基本上同时或之后施用癌症方案，例如非清髓性化学疗法、手术、激素疗法和/或照射。在某些实施方案中，已施用本文所述的蛋白质治疗剂的受试者还可以用抗生素和/或一种或多种额外的药剂来治疗。

本文中提及的所有公开、专利申请、专利和其它参考文献(包括GenBank登录号)以引用的方式整体并入。此外，所述材料、方法和实施例仅是说明性的而非意图具有限制性。除非另外定义，否则本文使用的所有技术术语和科学术语具有与本发明所属领域中的普通技术人员通常所理解相同的含义。尽管与本文所述的方法和材料相似或等效的方法和材料可用于本发明的实践或测试，但本文描述了合适的方法和材料。

通过以下实施例进一步说明本公开。仅出于说明目的提供实施例。它们不应被解释为以任何方式限制本公开的范围或内容。

例示

本公开的示例性氨基酸和核苷酸序列列出于下表中：

实施例1：抗体-BCMA融合蛋白的构建与表达

CD38在多发性骨髓瘤(MM)上高度表达，并且是高度成功的上市的抗CD38 mAb达拉木单抗的靶标。构建了包含BCMA和结合CD38的scFv的融合蛋白。BCMA被置于scFv的N末端(SEQ ID NO.13，构建体#493)或C末端(SEQ ID NO.14，构建体#494)。两种构建体都在C末端添加了HIS标签用于检测和纯化。两种构建体都含有BCMA细胞外结构域(ECD,aa 1-54Q02223,SEQ ID NO.23)。为N末端融合蛋白添加信号序列，并在两种构建体的BCMA ECD与scFv之间添加重复4次的接头GGGGS(SEQ ID NO.24)(G4Sx4)。抗CD38 scFv序列含有可变轻链VL、G4Sx4接头和可变重链VH。抗CD38 scFv序列来源于WO2011154453的Seq ID No.2和Seq ID No.27(本文分别为SEQ ID No.57和58)。将构建体化学合成并克隆到具有His标签的pcDNA3.1(+)潮霉素载体(GenScript)中。按照制造商的方案(Invitrogen)，通过使用脂质转染胺2000(lipofectamine 2000)用质粒DNA转染293T细胞来产生含有BCMA融合蛋白的细胞培养上清液。在转染后2-3天，通过在4℃下以12,000rpm旋转收集的细胞培养基4分钟以去除细胞，然后收集澄清的培养基，来收获上清液。

纯化细胞培养基中分泌的构建体，并评估其与人Daudi肿瘤细胞系的结合。Daudi细胞表达非常低水平的BCMA和高水平的CD38(图1)。

Daudi细胞得自ATCC并在含有10％FCS的RPMI中培养。使用抗BCMA-PE标记的抗体(BioLegend,#357504)对细胞中的BMCA进行染色，并且使用抗CD38-PE标记的抗体(BioLegend，#356604)对细胞中的CD38进行染色，或用如本文所述的含有BCMA的融合蛋白来染色。将细胞与抗体或来自A493或A494产生细胞的上清液如下孵育。将Daudi细胞用人Fc封闭剂(BD Biosciences,#BDB564129)封闭10分钟，洗涤，然后稀释至每50μl 5x10e5个细胞。对于每个样品，每孔等分50μl细胞。对于直接染色，将50μl中的5μl抗体与细胞在4℃下孵育30分钟。用FACS缓冲液(FB：PBS，1％BSA，0.1％叠氮化钠)洗涤后，用最终浓度为2％的FB中的多聚甲醛固定细胞。对于BCMA融合蛋白结合，添加50μl的A493或A494上清液或在FB中3倍连续稀释的上清液，并在4℃下孵育30分钟。将细胞用FB洗涤2次，然后将其用抗His-PE抗体(R&D系统，#ICO5OP)或抗BCMA-PE抗体(BioLegend，#357504)在4℃下染色30分钟，将细胞沉淀并在FB中洗涤2次，然后如上进行固定。在BD Accuri 6流式细胞仪上分析样品并使用BD Accuri 6软件进行分析。

两种BCMA融合蛋白的结合可以很容易地通过抗HIS标签抗体(图2)或抗BCMA抗体(图3)检测到。

两种BCMA-抗CD38融合蛋白在皮摩尔范围内与Daudi细胞上的CD38结合，其中N末端构建体#493使用任一检测试剂都结合得更好一点。这些结果表明可以很容易地制备基于BCMA的融合蛋白。虽然已经报道了BCMA位于Fc的N末端的BCMA-Fc融合物(Marsters S等人,Current Biology 2000,10:785-788)，但是据我们所知，文献中没有报道BCMA与其他蛋白质或抗体片段之间的其他融合物，也没有将BCMA置于任何蛋白质的C末端的BCMA-Fc融合物。

实施例2：BCMA-抗GPRC5D结合蛋白的结合数据

最近的工作已经鉴定了在MM上高度表达的新靶标，即称为GP RC5D的GPCR(Smith等人,Sci.Transl.Med.11,eaau7746(2019))。此外，还描述了一系列对GPRC5D有用的scFv(WO2016090312A1)。基于这些公开，从反向翻译的序列(来自Brentjen等人WO2016090312A1的SEQ ID NO.114、115、116和117)化学合成4种抗GPRC5D scFv(构建体522-525；分别为SEQID NO.15-18)表达构建体并将其克隆到GenScript的pcDNA3.1(+)hygro载体中。表达构建体含有编码为VL-G4Sx3-VH-His的scFv。

scFv表达构建体在HEK293细胞中瞬时表达，并在GPRC5D表达HEK293细胞上评估上清液的结合。所有四种scFv都很好地与GPRC5D表达细胞结合(未显示)。因此，制备了四种新的融合蛋白构建体，所述构建体包含这些融合到被置于scFv的C末端的BCMA细胞外结构域(ECD)的scFv，所述构建体在C末端添加有HIS标签(构建体536-539，分别为SEQ ID NO.19-22)。为了制备C末端BCMA ECD融合物，对构建体A494进行扩增以获得载体骨架和BCMA ECD。PCR片段由抗GPRC5D scFv模板A522-525生成，并使用一步无缝克隆混合物(CoWinBiosciences,CW3034S)将这些片段与A494骨架组装以生成A536-539。这些表达构建体编码抗GPRC5DscFv-G4Sx3接头-BCMA ECD-His。

表达构建体在HEK细胞中瞬时表达。通过ELISA分析量化细胞培养上清液中的融合蛋白表达水平。简而言之，将96孔板在4℃下用0.1M碳酸盐中的1.0μg/ml A493和A494的PE抗人BCMA抗体(Biolegend，#357504)(pH为9.5)或1.0μg/ml A536、A537、A538、A539和A540的抗人BCMA抗体(Biolegend，#357502)包被过夜。将板在室温下用TBS中的0.3％脱脂牛奶封闭1小时。在TBST(0.1MTris、0.5M NaCl、0.05％吐温20)中洗涤3次之后，使用TBS中的1％BSA的3倍稀释液滴定融合蛋白上清液，并在室温下孵育1小时。将以3倍稀释液从1μg/ml开始的纯化的BCMA-His(Aero Biosystems,#BCA-H522y)用作标准曲线。然后，添加1:2000稀释的100μl HRP-抗his抗体(Biolegend,#652504)，并在室温下避光孵育1小时。然后，添加1-Step Ultra TMB-ELISA溶液(Thermo Fisher)以产生过氧化物酶信号，并在405nm处读板。使用四参数逻辑(4PL)回归拟合标准曲线以计算未知上清液浓度。

评估来自融合蛋白表达HEK细胞的上清液与用GPRC5D表达质粒转染的HEK293细胞的结合。使用抗HIS标签抗体(图5)或抗BCMA抗体(图6)很容易检测到所有四种构建体与高表达GPRC5D细胞的结合(图4)。在所有四种构建体中检测到亚纳摩尔结合。

因此，与四种不同的针对GPCR(称为GPRC5D，是一种在人MM上高度上调的抗原)的scFv的C末端融合的BCMA ECD被良好表达并以亚纳摩尔效力与瞬时表达GPRC5D的HEK293细胞结合。这提供了能够与在人多发性骨髓瘤上高度表达的抗原有效结合的含有BCMA的融合蛋白，以及具有被置于scFv的C末端的BCMA的含有BCMA的融合蛋白的第二个实施例。

实施例3：针对BCMA的CAR-T细胞

许多针对BCMA表达细胞的CAR-T细胞已在文献中发表，并在临床试验中有多个实施例(Carpenter等人,Clin Cancer Res.2013年4月15日；19(8):2048-60；Friedman等人2018Hum Gene Ther.:29(5):585-601)。我们开发了靶向BCMA的CAR-T细胞，描述于US2012/0082661A1和Carpenter等人,Clin Cancer Res.2013年4月15日；19(8):2048-60。

CAR BCMA构建体含有通过接头GSTSGSGKPGSGEGSTKG分隔的抗BCMA CAR序列VL-VH(由来自鼠抗BCMA抗体C11D5.3的重链和轻链序列组成的抗BCMA CAR(来自US2012/0082661A1的SEQ ID NO.3和4)；我们的SEQ ID NO.12(#397))(Cooper等人2003 Blood101:1637-1644)。所述构建体还包含FLAG标签、CD28接头、跨膜结构域和细胞内结构域(aa114-220 P10747)，以及4-1BB(aa 214-255 Q07011)和CD3ζ细胞内结构域(aa 52-164P20963)。化学合成抗BCMA scFv序列并将其克隆到含有MSCV启动子的修饰的慢病毒质粒pCDH-EF1a(Systems Biosciences,#CD514B-1)中。转化为NEB稳定胜任细胞后，鉴定正确的分离物，并使用不含内毒素的大量制备试剂盒(CoWin Biosciences)制备了大规模质粒制剂。为产生慢病毒粒子，将以下Aldevron包装质粒和转基因质粒(每个T75烧瓶)合并并在1.5mL Opti-MEM(Invitrogen)中轻轻混合：7μg BCMA CAR质粒、5.7μg VSVG质粒(5037-10pALD-VSV-GA)、7μg GagPol质粒(5035-10pALD GagPol-A)和2.8μg Rev质粒(5033-10pALD-Rev-A)。然后添加45μL的Trans-IT(Mirus,#MIR6604)转染试剂并混合。使混合物在室温下络合20分钟。在转染前将受体细胞293FT铺种在含有10％FBS的DMEM中以获得70％汇合度。在转染之前，将293FT细胞上的生长培养基更换为10mL Opti-MEM。将DNA/Trans-IT混合物滴加到T25烧瓶中。将烧瓶孵育24小时，并将培养基更换为不含抗生素的DMEM+10％FBS(每天)，持续3天。收获的培养基储存在4℃下。通过向上清液中添加5X PEG-IT(SystemsBiosciences,LV825A-1)、混合并在4℃下孵育72小时来沉淀病毒粒子。将混合物在3000RCF下离心30分钟，去除残留的上清液，并且将沉淀重新悬浮在200μl PBS中并储存在-80℃下。通过在3天后使用抗Flag抗体染色和流式细胞术分析测定CAR表达，在SupT1细胞上滴定病毒粒子。

为了产生和表征BCMA CAR，收集来自正常人供体的PBMC，并使用磁珠技术(MACs^tm)分离CD3阳性人原代T细胞。将纯化的CD3+阳性人原代T细胞在补充有50IU/ml IL-2的ImmunoCult-XF T细胞扩增培养基(无血清/无异源物)中以3x10⁶个细胞/mL的密度培养，用CD3/CD28 T细胞活化试剂(STEMCELL Technologies)活化并在第1天在1X Transdux(来自SBI)的存在下用BCMA CAR397慢病毒颗粒(使用滴定后测定的体积)转导。使细胞增殖直到在第10天收获。扩增后，将CAR T细胞用抗FLAG抗体染色以测量CAR表达。简而言之，在10℃下将100,000个细胞与1:100稀释在PBS中的抗FLAG抗体(Thermo Fisher)孵育60分钟，然后与抗兔APC(1:100稀释，Thermo Fisher)孵育。此外，使用1:100稀释的抗CD8 MEM-31抗体(Invitrogen)针对CD8对CAR T细胞进行染色。将细胞重新悬浮在PBS中并以最终浓度为2％的多聚甲醛固定。使用BD Accuri C6流式细胞仪分析细胞群体。

显示用BCMA CAR397直接杀伤BCMA阳性细胞系H929。H929细胞(ATCC)在含有10％FCS的RPMI1640中生长。表达荧光素酶的H929细胞系通过用慢病毒(Gencopoeia,#LPP-HLUC-Lv105-100-C)转导并且用嘌呤霉素选择而产生。将细胞(1x 10e4/50μL/well)在含有10％FBS且不含抗生素的RPMI(RPMI/FBS)中接种于96孔圆底板中。将BCMA CAR397或供体匹配的非转导T细胞解冻并通过在550RCF下离心10分钟用RPMI/FBS洗涤一次。添加CAR T细胞50μL至孔中，以分别得到30:1、10:1、5:1或1:1的CAR:靶细胞比率。将板在37℃下孵育48小时。将板在550RCF下离心5分钟，用PBS冲洗沉淀，并再次旋转。然后，将20μL 1x裂解缓冲液(Promega,#E1500)添加到沉淀中，并将裂解物转移到96孔不透明组织培养板(FisherScientific,#353296)中。在具有分配底物(Promega,#E1500)的注射器的光度计中读板。基于实验细胞相对于对照(未处理)细胞的平均发光损失来计算杀伤百分比。

在使用BCMA ECD融合蛋白的细胞毒性情况下，在25μLRPMI/FBS中制备500μg/ml和100μg/ml的桥接蛋白#538的稀释液并将其添加到具有1x10e4个表达GPRC5D的293T细胞的每个孔中。所述细胞表达靶标GPRC5D，但不表达BCMA，因此可以测量桥接蛋白的功效。GPRC5D细胞系是通过使用脂质转染胺并按照制造商的方案(Invitrogen)将cDNA(GenScript,OHu02831D)转染到表达荧光素酶的293T细胞中来产生的。在G418选择后分离克隆，然后将其用于细胞毒性测定。将BCMA CAR397细胞解冻并通过在550RCF下离心10分钟用含有10％FBS的RPMI洗涤一次。在添加到靶细胞中之前，将CAR T细胞在37℃下在RPMI/FBS中孵育6小时。将CAR T细胞25μL添加到孔中，以得到10:1的CAR:靶细胞比率。步骤的其余部分与如本文所述的直接CAR杀伤相同。

BCMA定向的CAR-T显示它能够杀伤培养物中的人H929 MM细胞，如图7所示。

实施例4：使用BCMA桥接蛋白直接杀伤BCMA阴性细胞。

用购自Genscript的GPRC5D cDNA转染表达荧光素酶的GPRC5D、CD38和BCMA阴性的293T细胞。表达GPRC5D的克隆被瞬时转染(参见图4)。将融合蛋白构建体(#538)(包含与BCMA融合的识别GPRC5D的scFv)的两种稀释液添加到表达GPRC5D的293T细胞中。如本文所述(参见实施例3)，进行细胞毒性测定以确定融合蛋白桥接293T细胞与由抗原结合多肽(GPRC5D)结合的抗原和识别多肽抗原(BCMA)的CART细胞的能力，从而促进BCMA靶向CART细胞杀伤缺乏BCMA的细胞。如图8B所示，仅在存在BCMA桥接蛋白的情况下，GPRC5D表达细胞才被BCMA-CART细胞杀伤。表达BCMA的H929细胞用作构建体#538杀伤活性的阳性对照。

实施例5：产生具有延长半衰期的BCMA结合蛋白，并评估结合和细胞毒性

如本文所述产生包含抗CD38 scFv；BCMA；以及白蛋白结合结构域的融合蛋白。如本文所述产生包含抗GPRC5D scFv；BCMA；以及白蛋白结合结构域的融合蛋白。融合蛋白将在融合蛋白的N或C末端或在融合蛋白的中心与白蛋白结合结构域序列Alb8连接。Alb8将来源于氨基酸序列：GenBank登录号AUE82538(aa 1-115)。

将评估融合蛋白与表达CD38或GPRC5D的细胞的结合。将评估融合蛋白在体外将BCMA定向的CAR T细胞桥接到CD38阳性细胞和/或GPRC5D阳性细胞的能力。将评估融合蛋白在体外触发BCMA定向的CAR-T细胞对CD38阳性细胞和/或GPRC5D阳性细胞的细胞毒性活性的能力。融合蛋白的血浆半衰期将在正常小鼠体内进行测试。

实施例6：使用含有BCMA的融合蛋白在体内直接杀伤BCMA低或BCMA阴性细胞

评估BCMA-抗GPRC5D-抗白蛋白融合蛋白的药代动力学

从Jackson Laboratories订购了十只6-8周龄的雌性NOD-scid IL2Rγ-null(NSG)小鼠，并将其用于确定蛋白质的PK。小鼠以5mg/kg进行IV注射。在0、30分钟、90分钟、6小时、24小时、48小时、72小时、9小时和120小时的时间点对血液进行取样。通过尾部采血收集全血。每只小鼠一生中采血2次(最大体积＝100μL)，并且一次是尾部采血。将收集的血液放入EDTA K3试管(Sarstedt，#411504105)中。通过在微量离心机中以8500rpm旋转样品10分钟来处理血液。然后将血浆转移到1.5mL Eppendorf中并冷冻直至研究终止。如滴度ELISA所述进行测量血清中BCMA桥接蛋白的ELISA。

评估BCMA-抗GPRC5D-抗白蛋白融合蛋白活性的功效研究

将稳定表达萤火虫荧光素酶(OPM-2-luc)的OPM-2细胞(DSMZ细胞库)或类似的人骨髓瘤细胞系用于如Smith,EL等人2019所述的骨髓瘤模型中。简而言之，通过尾静脉将OPM-2-luc细胞(1x 10e6)注射到雌性NSG小鼠(Jackson Laboratory)中并且使细胞生长约14天。将小鼠随机分组并且在存在或不存在添加的BCMA桥接蛋白(例如，BCMA ECD-抗GPRC5D scFv-alb8桥接蛋白)的情况下，用1x 10e7个表达BCMA scFv的CAR-T细胞(例如，CAR-397或类似的靶向BCMA的CAR-T细胞)治疗。CAR-397或类似的CAR-T细胞通过尾静脉注射施用，并且桥接蛋白通过腹膜内或静脉内注射施用。桥接蛋白以100μg/注射或以高于或低于100μg的浓度每周给药两次，如由实验结果指导。将CAR GPRC5D用作阳性对照(Smith等人2019)，并且将无CAR T细胞或供体匹配的未转导T细胞用作阴性对照。每周两次监测肿瘤的荧光素酶水平，并且当肿瘤负荷达到我们的IACUC方案和指南中概述的极限时，处死小鼠。使用CD38阳性BCMA低细胞系(例如Daudi细胞)的类似方案可用于评估BCMA-抗CD38结合蛋白的功效，如例如实施例1中所述。

实施例7：基于CD38低亲和力结合剂的二价scFv-BCMA融合蛋白的构建

两个低亲和力scFv或VHH的串联放置允许如本文所述的所得二价融合蛋白以高亲和力结合靶细胞，但前提是靶抗原在细胞表面上高度表达。已经使用scFv 028的轻链VL改组与重链VH鉴定出对CD38具有低亲和力的scFv(参见例如，Drent等人，Molecular Therapy第25卷第8号August 2017)。以二价形式将这些scFv(亲和力低得多)连接在一起，并评估其与CD38-hi细胞系的高亲合力结合(例如，表达高水平CD38)。

第一，使用标准方法构建轻链改组(如描述于Drent等人,supplement Table S1,light chains Al,A3,B1,and B3)后被测定具有极其低亲和力的四种基于028的scFv(例如，如实施例1中所述)。所有构建体(参见SEQ ID No.:25-32)都是化学合成的，并且在C末端包含HIS标签用于检测和纯化。使构建体在HEK细胞中瞬时表达，收获上清液，并通过FACS评估它们与CD38高表达Daudi细胞的结合，如实施例1中所述。

第二，尽管可以使用其他接头，在确认以低亲和力结合CD38的情况下，在两个scFv之间使用各种长度的标准接头(例如重复2到5次的GGGGS(SEQ ID NO.24))产生每个scFv的二价形式，再次在C端添加HIS标签用于检测和纯化。如实施例1中所述，使构建体(参见SEQID No.33-40)在HEK细胞中瞬时表达，收获上清液，并通过FACS评估它们与CD38表达细胞的结合。在CD38-hi Daudi细胞以及在选择的CD38低表达的CD38-lo U937细胞、Molml4细胞或CD38转染的293T细胞上比较构建体的结合。

第三，以高表观亲和力结合Daudi CD38-hi细胞但以较低结合力结合U937或Molml4 CD38-lo细胞的二价构建体进一步作为BCMA融合蛋白进行评估。BCMA将被置于scFv-接头-scFv构建体的N末端(参见SEQ ID NO.43、44、47、48、51、52、55、56)或C末端(SEQID NO.41、42、45、46、49、50、53、54)。此外，还评估了置于两个scFv中间的BCMA(即作为接头或接头的一部分)。所有构建体都在C末端添加了HIS标签用于检测和纯化，并且都含有BCMA细胞外结构域(ECD，aa 1-54 Q02223，SEQ ID NO.23)。再次，如实施例1中所述，使构建体在HEK细胞中瞬时表达，收获上清液，并通过FACS评估它们与CD38表达细胞的结合。在CD38-hiDaudi细胞以及CD38-lo U937或Molml4细胞上比较它们的结合，如实施例1中所述。Daudi细胞得自ATCC并且将其在含有10％FCS的RPMI中培养。U937细胞得自ATCC且Molml4细胞得自DSMZ细胞培养收集物，并且将其在含有10％FCS的RPMI中培养。

通过这种方式，使用选择性结合与CD38-lo细胞(例如，已知表达低水平CD38的正常白细胞亚群)相比的CD38-hi细胞(例如,骨髓瘤肿瘤细胞)的scFv 028的低亲和力变体鉴定二价BCMA融合蛋白。

体内BCMA融合蛋白PK和功效如实施例6中所述进行评估。

实施例8：基于低亲和力美洲驼VHH构建二价VHH-BCMA融合蛋白。

低亲和力美洲驼VHH CD38结合剂以二价形式连接，以产生对CD38-hi细胞具有选择性的高亲合力结合剂。为了产生抗CD38抗体，ProSci,Inc.(Poway,CA)用完全弗氏(Freund's)辅助剂中的带有His标签的CD38细胞外结构域(AcroBiosystems)对一只或多只成年美洲驼进行三次免疫，每只美洲驼总共使用600μg。从美洲驼PBMC中生成噬菌粒库，并通过使用生物素化的CD38 ECD进行淘选来筛选。如下通过ELISA筛选阳性克隆。将板用1μg/mL PBS中的人CD38 ECD包被(4℃过夜)，然后用5％牛奶/PBST(PBS-Tween)在室温下封闭2小时。将含有美洲驼sdAb的大肠杆菌提取物以1:1稀释在封闭缓冲液(PBS/1％BSA)中，并使其在室温下与板结合1小时。用PBST洗涤后，将板结合的sdAb用小鼠抗myc-tag单克隆抗体(mAb)检测1小时，然后用山羊抗小鼠IgG-HRP检测1小时。两次孵育均在封闭缓冲液中进行，然后用PBST洗涤5次。使用过氧化物酶酶促检测来检测结合的HRP。测定阳性克隆的序列，并按照制造商的方案(Qiagen，Germantown，MD)使用抗His Nickel NTA柱从裂解物中纯化出少量。

针对与CD38-hi Daudi细胞的结合筛选纯化的sdAb。简而言之，将Daudi细胞(2.5x10^5)在冰上用Fc封闭剂(BD Pharmingen)封闭10分钟。然后，添加纯化的sdAb稀释液(在FACS缓冲液(PBS+1％BSA+0.1％叠氮化钠)中的3倍连续稀释液，从3μg/ml开始)，并将其在冰上孵育30分钟。将样品用FACS缓冲液洗涤2次，然后在冰上与抗His-PE(每个样品5μ1，R&D Systems)孵育30分钟。接下来，将样品用FACS缓冲液洗涤2次，然后用2％多聚甲醛固定。通过流式细胞术分析样品。

以与实施例7中所述完全相同的二价形式对与Daudi细胞结合并具有100nM至500nM亲和力的sdAb进行评估。简而言之，将sdAb串联放置，通过各种长度的标准接头连接并添加了C末端HIS标签。在HEK细胞中表达后，评估上清液与CD38-hi Daudi相比于CD38-loU937或Molml4细胞的选择性结合。将BCMA ECD添加到显示优先与Daudi细胞结合的那些构建体中，并重新评估这些构建体与两种细胞类型的结合，但通过抗BCMA抗体检测(参见实施例1)，产生对CD38-hi骨髓瘤细胞相比于CD38-lo细胞有选择性的BCMA-抗CD38二价融合蛋白。

如实施例5中所述通过添加白蛋白结合结构域构建选定数量的BCMA-抗CD38融合蛋白。如实施例6中所述，评估针对CD38-hi Daudi或类似肿瘤细胞的体内PK和体内功效。

等效方案

本领域技术人员将认识到，或能够使用不超过常规实验来确定本文所述的发明的具体实施方案的许多等效方案。本发明的范围不意图限于以上说明书，而是如在以下权利要求中所阐述。

序列表

SEQ ID NO.1

SEQ ID NO.2

SEQ ID NO.3

SEQ ID NO.4

SEQ ID NO.5

SEQ ID NO.6

SEQ ID NO.7

SEQ ID NO.8

SEQ ID NO.9

SEQ ID NO.10

SEQ ID NO.11

SEQ ID NO.12

SEQ ID NO.13

SEQ ID NO.14

SEQ ID NO.15

/>

SEQ ID NO.16

SEQ ID NO.17

SEQ ID NO.18

SEQ ID NO.19

SEQ ID NO.20

SEQ ID NO.21

SEQ ID NO.22

SEQ ID NO.23

/>

SEQ ID NO.24

SEQ ID NO.25:A1 VL-028 VH scFv-His氨基酸

SEQ ID NO.26:A1 VL-028 VH scFv-His核苷酸

SEQ ID NO.27:A3 VL-028 VH scFv-His氨基酸

SEQ ID NO.28:A3 VL-028 VH scFv-His核苷酸

SEQ ID NO.29:B1 VL-028 VH scFv-His氨基酸

SEQ ID NO.30:B1 VL-028 VH scFv-His核苷酸

SEQ ID NO.31:B3 VL-028 VH scFv-His氨基酸

SEQ ID NO.32:B3 VL-028 VH scFv-His核苷酸

SEQ ID NO.33:二价A1 VL-028 VH-A1 VL-028 VH scFv氨基酸

SEQ ID NO.34:二价A1 VL-028 VH-A1 VL-028 VH scFv核苷酸

SEQ ID NO.35:二价A3 VL-028 VH-A3 VL-028 VH scFv氨基酸

SEQ ID NO.36:二价A3 VL-028 VH-A3 VL-028 VH scFv核苷酸

SEQ ID NO.37:二价B1 VL-028 VH-B1 VL-028 VH scFv氨基酸

SEQ ID NO.38:二价B1 VL-028 VH-B1 VL-028 VH scFv核苷酸

SEQ ID NO.39:二价B3 VL-028 VH-B3 VL-028 VH scFv氨基酸

SEQ ID NO.40:二价B3 VL-028 VH-B3 VL-028 VH scFv核苷酸

SEQ ID NO.41:二价A1 VL-028 VH-A1 VL-028 VH scFv-BCMA ECD氨基酸

SEQ ID NO.42:二价A1 VL-028 VH-A1 VL-028 VH scFv-BCMA ECD核苷酸

SEQ ID NO.43:BCMA ECD-二价A1 VL-028 VH-A1 VL-028 VH scFv氨基酸

SEQ ID NO.44:BCMA ECD-二价A1 VL-028 VH-A1 VL-028 VH scFv核苷酸

SEQ ID NO.45:二价A3 VL-028 VH-A3 VL-028 VH scFv-BCMA ECD氨基酸

SEQ ID NO.46:二价A3 VL-028 VH-A3 VL-028 VH scFv-BCMA ECD核苷酸

/>

SEQ ID NO.47:BCMA ECD-二价A3 VL-028 VH-A3 VL-028 VH scFv氨基酸

SEQ ID NO.48:BCMA ECD-二价A3 VL-028 VH-A3 VL-028 VH scFv核苷酸

SEQ ID NO.49:二价B1 VL-028 VH-B1 VL-028 VH scFv-BCMA ECD氨基酸

SEQ ID NO.50:二价B1 VL-028 VH-B1 VL-028 VH scFv-BCMA ECD核苷酸

SEQ ID NO.51:BCMA ECD-二价B1 VL-028 VH-B1 VL-028 VH scFv氨基酸

SEQ ID NO.52:BCMA ECD-二价B1 VL-028 VH-B1 VL-028 VH scFv核苷酸

SEQ ID NO.53:二价B3 VL-028 VH-B3 VL-028 VH scFv-BCMA ECD氨基酸

SEQ ID NO.54:二价B3 VL-028 VH-B3 VL-028 VH scFv-BCMA ECD核苷酸

SEQ ID NO.55:BCMA ECD-二价B3 VL-028 VH-B3 VL-028VH scFv氨基酸

SEQ ID NO.56:BCMA ECD-二价B3 VL-028 VH-B3 VL-028 VH scFv核苷酸

SEQ ID NO.57

SEQ ID NO.58

/>

Claims

1.一种治疗具有或患有多发性骨髓瘤的受试者的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用包含以下的融合蛋白：

(a)抗原结合多肽，其结合选自由以下组成的组的第一多发性骨髓瘤抗原：CD38；CS1/SLAMF7；GPRC5D；CD208(LAMP3)；CD307e(FCRL5)；ITGA8；ITGB7；CD138；CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr)；唾液酸-Tn(STn)(NeuAcα2-6-GalNAcα1-O-Ser/Thr)；和BCMA；以及

(b)多肽抗原，其包含选自由以下组成的组的第二多发性骨髓瘤抗原：BCMA、CD38、SLAMF7、CD208、CD307e、CD272的；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；和CD138，其中所述第一多发性骨髓瘤抗原和所述第二多发性骨髓瘤抗原是不同的；

其中所述受试者(i)先前接受过与表达所述第二多发性骨髓瘤抗原的癌细胞结合的ACT(例如，CAR-T细胞疗法)，(ii)先前对所述ACT(例如，CAR-T细胞疗法)表现出至少一种有益反应，并且(iii)在施用所述融合蛋白之前，所述受试者对所述ACT(例如，CAR-T细胞疗法)表现出至少一种无益反应。

2.一种治疗具有或患有多发性骨髓瘤的受试者的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用包含以下的融合蛋白：

(a)抗原结合多肽，其结合选自由以下组成的组的第一多发性骨髓瘤抗原：CD38；CS1/SLAMF7；GPRC5D；CD208(LAMP3)；CD307e(FCRL5)；ITGA8；ITGB7；CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr)；唾液酸-Tn(STn)(NeuAcα2-6-GalNAcα1-O-Ser/Thr)；和CD138；以及

(b)BCMA多肽；

其中所述受试者(i)先前接受过与表达BCMA多肽的癌细胞结合的ACT，(ii)先前对所述ACT表现出至少一种有益反应，并且(iii)在施用所述融合蛋白之前，所述受试者对所述ACT表现出至少一种无益反应。

3.一种治疗具有或患有多发性骨髓瘤的受试者的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用包含以下的融合蛋白：

(b)BCMA多肽；

其中所述受试者(i)先前接受过抗BCMACAR-T细胞，(ii)先前对所述抗BCMACAR-T细胞表现出至少一种有益反应，并且(iii)在施用所述融合蛋白之前，所述受试者对所述抗BCMACAR-T细胞表现出至少一种无益反应。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述ACT包括施用选自由以下组成的组的细胞：NK细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自体或异体CAR-T细胞、骨髓衍生细胞、诱导多能干细胞(IPSC)、γδT细胞、恒定NK细胞和NK-T细胞。

5.如权利要求1所述的方法，其中所述方法还包括测量所述第二多发性骨髓瘤抗原的表达水平，例如，在来自所述受试者的样品(例如，生物样品，例如，肿瘤样品)中。

6.如权利要求2或3所述的方法，其中所述方法还包括测量所述BCMA多肽的表达水平，例如，在来自所述受试者的样品(例如，生物样品，例如，肿瘤样品)中。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中所述有益反应包括所述癌症的清除、消退和/或或稳定，例如，在限定的时间段内(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12年)。

8.如权利要求1-7中任一项所述的方法，其中所述有益反应包括不存在所述癌症的复发、反复和/或转移，例如，在限定的时间段内(例如，至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12周，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个月，或至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12年)。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述无益反应包括所述癌症的复发、反复和/或转移。

10.如权利要求5和7-9中任一项所述的方法，其中在施用所述融合蛋白之前，所测量的所述第二多发性骨髓瘤抗原的表达水平相对于对照水平(例如，对所述ACT表现出至少一种有益反应的受试者中所述第二多发性骨髓瘤抗原的表达水平；和/或在所述受试者先前对所述ACT表现出有益反应的时间段期间，所述受试者中所述第二多发性骨髓瘤抗原的表达水平)降低。

11.如权利要求6-9中任一项所述的方法，其中在施用所述融合蛋白之前，所测量的所述BCMA多肽的表达水平相对于对照水平(例如，对所述ACT表现出至少一种有益反应的受试者中所述BCMA多肽的表达水平；和/或在所述受试者先前对所述ACT表现出有益反应的时间段期间，所述受试者中所述BCMA多肽的表达水平)降低。

12.如权利要求10或11所述的方法，其中相对于所述对照降低的表达水平导致所述受试者对所述ACT表现出至少一种无益反应。

13.如权利要求10-12中任一项所述的方法，其中所测量的表达水平为所述对照水平的约90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％、20％、10％或更少。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其还包括将所述ACT施用于所述受试者，例如在施用所述融合蛋白的约6小时、12小时、18小时、24小时、2天、3天、4天、5天、6天、7天内。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中在施用所述融合蛋白之后，所述受试者对所述ACT表现出至少一种有益反应和/或对所述ACT表现出至少一种无益反应的减少。

16.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白包含2种或更多种抗原结合多肽。

17.如权利要求16所述的方法，其中所述融合蛋白包含2种抗原结合多肽。

18.如权利要求17所述的方法，其中所述融合蛋白包含：

(a)第一抗原结合多肽，其结合选自由以下组成的组的第一多发性骨髓瘤抗原：CD38；CS1/SLAMF7；GPRC5D；CD208(LAMP3)；CD307e(FCRL5)；ITGA8；ITGB7；CD138；CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr)；唾液酸-Tn(STn)(NeuAcα2-6-GalNAcα1-O-Ser/Thr)；和BCMA；

(b)第二抗原结合多肽，其结合选自由以下组成的组的第二多发性骨髓瘤抗原：CD38；CS1/SLAMF7；GPRC5D；CD208(LAMP3)；CD307e(FCRL5)；ITGA8；ITGB7；CD138；CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr)；唾液酸-Tn(STn)(NeuAcα2-6-GalNAcα1-O-Ser/Thr)；和BCMA；以及

(c)多肽抗原，其包含选自由以下组成的组的第三多发性骨髓瘤抗原：BCMA、CD38、SLAMF7、CD208、CD307e、CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；和CD138，其中所述第一、第二和第三多发性骨髓瘤抗原是不同的。

19.如权利要求17所述的方法，其中所述融合蛋白包含：

(c)多肽抗原，其包含选自由以下组成的组的第三多发性骨髓瘤抗原：BCMA、CD38、SLAMF7、CD208、CD307e、CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；和CD138，其中所述第三多发性骨髓瘤抗原与所述第一和第二多发性骨髓瘤抗原不同。

20.如权利要求19所述的方法，其中所述第一多发性骨髓瘤抗原和所述第二多发性骨髓瘤抗原是相同的。

21.如权利要求19所述的方法，其中所述第一多发性骨髓瘤抗原和所述第二多发性骨髓瘤抗原是CD38。

22.如权利要求20或21所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合多肽是相同的，并且所述融合蛋白包含所述相同抗原结合多肽的两个拷贝。

23.如权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合多肽以约50nM至约2μM的Kd与所述第一和第二多发性骨髓瘤抗原结合。

24.如权利要求20-23中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白以相对于健康或非肿瘤细胞更高的亲合力与表达所述第一和第二多发性骨髓瘤抗原(例如，CD38)的肿瘤细胞结合。

25.如权利要求24所述的方法，其中所述融合蛋白以约1至约40nM的Kd与所述肿瘤细胞结合。

26.如权利要求18所述的方法，其中所述第一多发性骨髓瘤抗原是CD38，并且所述第二多发性骨髓瘤抗原是GPRC5D。

27.一种治疗具有或患有多发性骨髓瘤的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用：

(a)融合蛋白，其包含(i)多肽，所述多肽结合选自由以下组成的组的第一多发性骨髓瘤抗原：CD38；CS1/SLAMF7；GPRC5D；CD208(LAMP3)；CD307e(FCRL5)；ITGA8；ITGB7；CD138；CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr)；唾液酸-Tn(STn)(NeuAcα2-6-GalNAcα1-O-Ser/Thr)；和BCMA；以及(ii)选自由以下组成的组的第二多发性骨髓瘤抗原：BCMA、CD38、SLAMF7、CD208、CD307e、CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；和CD138，其中所述第一多发性骨髓瘤抗原和所述第二多发性骨髓瘤抗原是不同的；以及

(b)ACT，其中所述ACT包括与表达所述第二多发性骨髓瘤抗原的癌细胞结合的细胞。

28.一种治疗具有或患有多发性骨髓瘤的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用：

(a)融合蛋白，其包含(i)多肽，所述多肽结合选自由以下组成的组的第一多发性骨髓瘤抗原：CD38；CS1/SLAMF7；GPRC5D；CD208(LAMP3)；CD307e(FCRL5)；ITGA8；ITGB7；CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；Tn(GalN Acα1-O-Ser/Thr)；唾液酸-Tn(STn)(NeuAcα2-6-GalNAcα1-O-Ser/Th r)；和CD138；以及(ii)BCMA多肽；以及

(b)ACT(例如，CAR-T细胞疗法)，其中所述ACT包括与表达所述BCMA多肽的癌细胞结合的细胞(例如，CAR-T细胞)。

29.一种治疗具有或患有多发性骨髓瘤的受试者的方法，所述方法包括向受试者施用：

(b)抗BCMACAR-T细胞。

30.如权利要求27或28所述的方法，其中相对于单独接受ACT的对照多发性骨髓瘤受试者，施用所述融合蛋白和所述ACT在治疗多发性骨髓瘤中更有效。

31.如权利要求30所述的方法，其中所述对照多发性骨髓瘤受试者对所述ACT表现出至少一种无益反应。

32.如权利要求29所述的方法，其中相对于单独接受抗BCMA CAR-T疗法的对照多发性骨髓瘤受试者，施用所述融合蛋白和所述抗BCMACAR-T细胞在治疗所述多发性骨髓瘤中更有效。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述对照多发性骨髓瘤受试者对所述抗BCMACAR-T疗法表现出至少一种无益反应。

34.如权利要求30或31所述的方法，其中所述ACT包括施用选自由以下组成的组的细胞：NK细胞、肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)、自体或异体CAR-T细胞、骨髓衍生细胞、诱导多能干细胞(IPSC)、γδT细胞、恒定NK细胞和NK-T细胞。

35.如权利要求27-34中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白包含2种或更多种结合多发性骨髓瘤抗原的多肽。

36.如权利要求35所述的方法，其中所述融合蛋白包含2种结合多发性骨髓瘤抗原的多肽。

37.如权利要求36所述的方法，其中所述融合蛋白包含：

(i)第一多肽，其结合选自由以下组成的组的第一多发性骨髓瘤抗原：CD38；CS1/SLAMF7；GPRC5D；CD208(LAMP3)；CD307e(FCRL5)；ITGA8；ITGB7；CD138；CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr)；唾液酸-Tn(STn)(NeuAcα2-6-GalNAcα1-O-Ser/Thr)；和BCMA；

(ii)第二多肽，其结合选自由以下组成的组的第二多发性骨髓瘤抗原：CD38；CS1/SLAMF7；GPRC5D；CD208(LAMP3)；CD307e(FCRL5)；ITGA8；ITGB7；CD138；CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；Tn(GalNAcαl-O-Ser/Thr)；唾液酸-Tn(STn)(NeuAcα2-6-GalNAcαl-O-Ser/Thr)；和BCMA；以及

(iii)选自由以下组成的组的第三多发性骨髓瘤抗原：BCMA、CD38、SLAMF7、CD208、CD307e、CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；和CD138，其中所述第一、第二和第三多发性骨髓瘤抗原是不同的。

38.如权利要求36所述的方法，其中所述融合蛋白包含：

(ii)第二多肽，其结合选自由以下组成的组的第二多发性骨髓瘤抗原：CD38；CS1/SLAMF7；GPRC5D；CD208(LAMP3)；CD307e(FCRL5)；ITGA8；ITGB7；CD138；CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；Tn(GalNAcα1-O-Ser/Thr)；唾液酸-Tn(STn)(NeuAcα2-6-GalNAcα1-O-Ser/Thr)；和BCMA；以及

(iii)选自由以下组成的组的第三多发性骨髓瘤抗原：BCMA、CD38、SLAMF7、CD208、CD307e、CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；和CD138，其中所述第三多发性骨髓瘤抗原与所述第一和第二骨髓瘤抗原不同。

39.如权利要求38所述的方法，其中所述第一多发性骨髓瘤抗原和所述第二多发性骨髓瘤抗原是相同的。

40.如权利要求38所述的方法，其中所述第一多发性骨髓瘤抗原和所述第二多发性骨髓瘤抗原是CD38。

41.如权利要求39或40所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合多肽是相同的，并且所述融合蛋白包含所述相同抗原结合多肽的两个拷贝。

42.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合多肽以约50nM至约2μM的Kd与所述第一和第二多发性骨髓瘤抗原结合。

43.如权利要求39-41中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白以相对于健康或非肿瘤细胞更高的亲合力与表达所述第一和第二多发性骨髓瘤抗原(例如，CD38)的肿瘤细胞结合。

44.如权利要求43所述的方法，其中所述融合蛋白以约1至约40nM的Kd与所述肿瘤细胞结合。

45.如权利要求37所述的方法，其中所述第一多发性骨髓瘤抗原是CD38，并且所述第二多发性骨髓瘤抗原是GPRC5D。

46.一种治疗具有或患有多发性骨髓瘤的受试者的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用包含编码融合蛋白的核酸的病毒载体，所述融合蛋白包含：

(a)抗原结合多肽，其结合选自由以下组成的组的第一多发性骨髓瘤抗原：CD38；CS1/SLAMF7；GPRC5D；CD208(LAMP3)；CD307e(FCRL5)；ITGA8；ITGB7；CD138；CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；(GalNAcα1-O-Ser/Thr)；唾液酸-Tn(STn)(NeuAcα2-6-GalNAcα1-O-Ser/Thr)；和BCM A；以及

(b)多肽抗原，其包含选自由以下组成的组的第二多发性骨髓瘤抗原：BCMA、CD38、SLAMF7、CD208、CD307e、CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；和CD138，其中所述第一多发性骨髓瘤抗原与所述第二多发性骨髓瘤抗原不同；

47.如权利要求46所述的方法，其中所述融合蛋白包含2种或更多种抗原结合多肽。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述融合蛋白包含2种抗原结合多肽。

49.如权利要求48所述的方法，其中所述融合蛋白包含：

50.如权利要求48所述的方法，其中所述融合蛋白包含：

(a)第一抗原结合多肽，其结合选自由以下组成的组的第一多发性骨髓瘤抗原：CD38；CS1/SLAMF7；GPRC5D；CD208(LAMP3)；CD307e(FCRL5)；ITGA8；ITGB7；CD138；CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；(GalNAcα1-O-Ser/Thr)；唾液酸-Tn(STn)(NeuAcα2-6-GalNAcα1-O-Ser/Thr)；和BCMA；

51.如权利要求50所述的方法，其中所述第一多发性骨髓瘤抗原和所述第二多发性骨髓瘤抗原是相同的。

52.如权利要求50所述的方法，其中所述第一多发性骨髓瘤抗原和所述第二多发性骨髓瘤抗原是CD38。

53.如权利要求51或52所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合多肽是相同的，并且所述融合蛋白包含所述相同抗原结合多肽的两个拷贝。

54.如权利要求51-53中任一项所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合多肽以约50nM至约2μM的Kd与所述第一和第二多发性骨髓瘤抗原结合。

55.如权利要求51-53中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白以相对于健康或非肿瘤细胞更高的亲合力与表达所述第一和第二多发性骨髓瘤抗原(例如，CD38)的肿瘤细胞结合。

56.如权利要求55所述的方法，其中所述融合蛋白以约1至约40nM的Kd与所述肿瘤细胞结合。

57.如权利要求49所述的方法，其中所述第一多发性骨髓瘤抗原是CD38，并且所述第二多发性骨髓瘤抗原是GPRC5D。

58.一种治疗具有或患有多发性骨髓瘤的受试者的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用包含以下的融合蛋白：

(b)多肽抗原，其包含选自由以下组成的组的第二多发性骨髓瘤抗原：BCMA、CD38、SLAMF7、CD208、CD307e、CD272；CD229；CD48；CD150；CD86；CD200；BAFF-R(TNFRSF13C)；和CD138，其中所述第一多发性骨髓瘤抗原和所述第二多发性骨髓瘤抗原是不同的；

其中所述受试者正在接受或将接受用于治疗多发性骨髓瘤的ACT(例如，CAR-T细胞疗法)。

59.如权利要求58所述的方法，其中在所述受试者接受ACT之前将所述融合蛋白施用于所述受试者。

60.如权利要求58所述的方法，其中所述融合蛋白与ACT同时施用。

61.如权利要求58所述的方法，其中所述方法还包括测量所述第二多发性骨髓瘤抗原的表达水平，例如，在来自所述受试者的样品(例如，生物样品，例如，肿瘤样品)中。

62.如权利要求61所述的方法，其中只要所述受试者对所述ACT表现出至少一种有益反应，就继续所述治疗方法。

63.如权利要求58-62中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白包含2种或更多种抗原结合多肽。

64.如权利要求63所述的方法，其中所述融合蛋白包含2种抗原结合多肽。

65.如权利要求64所述的方法，其中所述融合蛋白包含：

66.如权利要求64所述的方法，其中所述融合蛋白包含：

67.如权利要求66所述的方法，其中所述第一多发性骨髓瘤抗原和所述第二多发性骨髓瘤抗原是相同的。

68.如权利要求66所述的方法，其中所述第一多发性骨髓瘤抗原和所述第二多发性骨髓瘤抗原是CD38。

69.如权利要求67或68所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合多肽是相同的，并且所述融合蛋白包含所述相同抗原结合多肽的两个拷贝。

70.如权利要求67-69中任一项所述的方法，其中所述第一和第二抗原结合多肽以约50nM至约2μM的Kd与所述第一和第二多发性骨髓瘤抗原结合。

71.如权利要求67-70中任一项所述的方法，其中所述融合蛋白以相对于健康或非肿瘤细胞更高的亲合力与表达所述第一和第二多发性骨髓瘤抗原(例如，CD38)的肿瘤细胞结合。

72.如权利要求71所述的方法，其中所述融合蛋白以约1至约40nM的Kd与所述肿瘤细胞结合。

73.如权利要求58所述的方法，其中所述第一多发性骨髓瘤抗原是CD38，并且所述第二多发性骨髓瘤抗原是GPRC5D。