CN115876899A - 一种聚乙二醇衍生物样品前处理及测定含量的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种聚乙二醇衍生物样品的前处理及测定含量的方法方法，属于化学分析技术领域。所述方法采用聚乙二醇衍生物N3‑PEG3‑SPA与苄胺进行衍生化反应，再进行HPLC检测，得到其含量。N3‑PEG3‑SPA由于含有容易水解的活性酯基团，不能直接进行HPLC分析检测其纯度，本发明的方法，样品与苯胺进行衍生化反应前处理，经过色谱条件的优化，包括柱温、流速、波长，流动相和色谱柱的优化之后，本发明的技术方案中HPLC的含量分析方法，步骤简单，操作简便，方法的准确度高、重复性好、灵敏度高。
Description
技术领域
本发明涉及化学分析领域，具体涉及一种聚乙二醇衍生物样品的前处理及测定含量的方法。
背景技术
聚乙二醇衍生物是一种新型和用途广泛的化学中间体。叠氮(三聚乙二醇)丙酸琥珀酰亚胺酯 是一种短链的单分散聚乙二醇衍生物，通用名称：N3-PEG3-SPA，CAS：1245718-89-1，其分子结构式 如下所示：
N3-PEG3-SPA是由三甘醇原料依次与丙烯酸叔丁酯和叠氮磷酸二苯酯等反应，然后经历还原、水解 以及缩合得到的一端叠氮基一端丙酸活性酯的聚乙二醇衍生物，产品的主要作用是丙酸活性酯能与蛋白质 分子或小分子药物上的氨基或者羟基通过酰胺缩合或者酯缩合进行偶联，改变药物分子的结构，进而优化 其理化性质。
目前，国内外尚无有关检测聚乙二醇衍生物N3-PEG3-SPA的分析方法的报道，主要原因是聚乙二醇 衍生物由于其结构、合成方法、纯化方法、及检测方法的特殊性，其组成通常比较复杂，许多成分容易对 检测造成干扰。
发明内容
本发明提供了一种聚乙二醇衍生物N3-PEG3-SPA样品的前处理的方法，该方法能降低样品中其他杂 质的干扰，充分提取样品中的聚乙二醇衍生物N3-PEG3-SPA。在此基础上，本发明还提供了一种测定样 品中的聚乙二醇衍生物N3-PEG3-SPA含量的方法。该方法准确度高、重复性好、灵敏度高。
本发明以三甘醇为起始物料，通过图1所示工艺合成一端为叠氮而另一端为活性酯的单分散PEG衍 生物N3-PEG3-SPA，由于活性酯易水解的特性导致其纯化比较困难，常规的工艺质量控制标准尤其是杂 质含量难以达到药物修饰后的申报审批要求，所以本研究旨在开发一种生产工艺和分析方法以优化 N3-PEG3-SPA的纯度并控制单杂含量：
如上N3-PEG3-SPA的合成路线
本发明第一方面涉及一种聚乙二醇衍生物N3-PEG3-SPA样品的前处理的方法，包括如下步骤：
(1)将N3-PEG3-SPA样品进行衍生化反应，得到反应液；
(2)将步骤(1)中得到的反应液转移至容量瓶中，并用乙腈定容，摇匀；
(3)取步骤(2)中的溶液过滤膜，得到样品溶液。
本发明第一方面的某些实施方式中，步骤(1)中，衍生化反应是将聚乙二醇衍生物N3-PEG3-SPA 样品与苄胺在二氯甲烷中反应。
本发明第一方面的某些实施方式中，步骤(1)中，衍生化反应中聚乙二醇衍生物N3-PEG3-SPA样 品与苄胺的摩尔比为1:1至1:3。
本发明第一方面的某些实施方式中，步骤(1)中，衍生化反应的反应温度为20℃-40℃。
本发明第一方面的某些实施方式中，步骤(1)中，衍生化反应的反应时间为30min至3小时。
本发明第一方面的某些实施方式中，步骤(2)中，反应液中如有沉淀，沉淀也一并转移至容量瓶中。
本发明第一方面的某些实施方式中，样品前处理方法中，样品溶液中N3-PEG3-SPA样品浓度为 2mg/mL～5mg/mL，优选3mg/mL～4mg/mL，例如3mg/mL、3.5mg/mL、4mg/mL、4.5mg/mL。
本发明第二方面涉及一种测定样品中的聚乙二醇衍生物N3-PEG3-SPA含量的方法，包括如下步骤：
(1)按照本发明第一方面所述的前处理方法获得的样品溶液；
(2)对步骤(1)得到的样品溶液进行HPLC检测；
(3)根据步骤(2)获得的检测结果计算出样品中的聚乙二醇衍生物N3-PEG3-SPA含量。
本发明第二方面的某些实施方式，步骤(2)中，HPLC的检测条件包括如下a至f中的一项或多项：
a.色谱柱为C18色谱柱；
优选地，色谱柱为Waters,Xbridge shield RP C18色谱柱；Extend-C18色谱柱；
优选地，色谱柱规格为150mm(长度)×4.6mm(内径),3μm(粒径)；
b.柱温为25℃～35℃；优选为30℃；
c.柱流量为0.8mL/min至1.2mL/min；优选为1.0mL/min；
d.进样量为2～10μL；
e.检测器为紫外检测器；
优选地，检测波长为190nm-210nm；
f.流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为高氯酸水溶液，流动相B为乙腈；
优选地，流动相A中高氯酸水溶液的浓度为0.1‰～2.0‰；优选为0.5‰；
优选地，流动相的洗脱程序如下表所示：
| 时间(min) | A(％) | B(％) |
| 0.00 | 90 | 10 |
| 4.00 | 90 | 10 |
| 10.00 | 50 | 50 |
| 15.00 | 40 | 60 |
| 17.00 | 10 | 90 |
| 20.00 | 10 | 90 |
| 20.10 | 90 | 10 |
| 24.00 | 90 | 10 |
本发明第二方面的某些实施方式中，紫外检测器用于检测210nm波长处的吸光度。
在本发明的技术方案中，创造性地采用聚乙二醇衍生物N3-PEG3-SPA与苄胺进行衍生化反应，再进 行HPLC检测，得到其含量。N3-PEG3-SPA由于含有容易水解的活性酯基团，不能直接进行HPLC分析 检测其纯度，本发明的方法，样品与苯胺进行衍生化反应前处理，经过色谱条件的优化，包括柱温、流速、 波长，流动相和色谱柱的优化之后，本发明的技术方案中HPLC的含量分析方法，步骤简单，操作简便， 方法的准确度高、重复性好、灵敏度高。
综上所述，本发明包括以下有益的技术效果：
1、本发明提供的聚乙二醇衍生物N3-PEG3-SPA样品前处理的方法，可以避免样品中活性酯基团水 解，产生杂质，干扰含量测定；
2、本发明提供的聚乙二醇衍生物N3-PEG3-SPA的含量分析方法，步骤简单，操作简便，方法的准 确度高、重复性好、灵敏度高。
在本发明的描述中，需要理解的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或 暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明 示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非 另有明确具体的限定。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的 描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示 例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体 特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾 的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进 行结合和组合。
附图说明
图1为实施例4中的核磁图；
图2为实施例5中的色谱图。
具体实施方式
为了使本领域的技术人员更好地理解本发明的技术方案，下面进一步披露一些非限制实施例，对本发 明作进一步的详细说明。
本发明所使用的试剂均可以从市场上购得或者可以通过本发明所描述的方法制备而得。
本发明中，min表示分钟；h表示小时；g表示克；ml表示毫升；
本发明中，HPLC表示高效液相色谱法。
本发明中，其中，高氯酸水溶液的浓度指的是体积浓度，例如：5‰的高氯酸水溶液指的是取0.5mL 70.0-72.0％的高氯酸溶液溶于1000mL水中，混匀。
以下实施例和对比例所使用的材料如下：
乙腈：色谱纯。
苄胺：分析纯。
高氯酸：分析纯。
二氯甲烷：分析纯。
水：电导率≥18.2MΩ·cm的超纯水。
聚乙二醇衍生物N3-PEG3-SPA：购买或自制。
Azide-PEG3-NHS标准品：购买。
实施例1化合物IV的合成
将化合物N3-PEG3-tBu(23kg)加入到100L反应釜中，加入40L四氢呋喃和10L盐酸(6M)。反 应体系升温至55℃，搅拌14小时，TLC显示反应完毕。减压旋除四氢呋喃，然后用冷却好的氢氧化钠 溶液调pH为7-8。用乙酸乙酯(10L×3)洗水体系3次。再用4M盐酸调水溶液pH为5-6。水相用乙酸 乙酯(10L×3)萃取3次，合并有机相并将有机相用无水硫酸钠干燥。有机相收集浓缩后得到粗品经柱层 析(硅胶，V(石油醚)∶V(乙酸乙酯)＝1∶1)纯化，得到9kg(mmol)淡黄色液体，液相纯度为95.3％的 N3-PEG3-COOH(TLC检测显示产品点紧邻处有一个杂质点)。将液相纯度为95.3％的N3-PEG3-COOH 加入到50L的球釜，将1388g的氢氧化钠用20L水溶解，加入冰块冷却，待冷却后加入球釜，开冷却循 环降温使反应体系保持在5℃以下。搅拌10min使反应物充分混合，加入5L的乙酸乙酯洗涤水相，同时 往水相加入250ml的浓盐酸，搅拌5min后分液。水相继续加入5L的乙酸乙酯和250ml的浓盐酸，重复 此萃取操作四次，用TLC跟踪直至水相中无产品。将有机相合并并且用无水硫酸钠干燥，有机相浓缩后得到约8.2kg液相纯度为98％的淡黄色液体N3-PEG3-COOH产品。产率为30.8％。
1H NMR(CDCl3，400MHz)，δ：9.88(s,1H,COOH)；3.78～3.74(t,2H,J＝3.8Hz,CH2CH2COOH)； 3.69～3.62(m,10H,CH2CH2O)；3.40～3.38(t,2H,J＝3.4Hz,CH2COOH)；2.65～2.62(t,2H,J＝2.6 Hz,CH2N3)。
实施例2化合物V的合成
于50L反应釜内，加入N3-PEG3-COOH(3830g)，加入20L溶剂DCM，搅拌2min使其混合均匀， 冰浴条件下将反应体系冷却至0℃左右，分批加入3356g DCC固体，约30min加完。搅拌5min后再分 批加入1961g NHS，将反应体系自然回温到室温并保持反应过夜。TLC监测反应结束后，反应液里面有 大量的固体，分四次冷冻抽滤固体。抽滤完后，将反应液加入到50L的反应釜内，分两次加入10L的水洗 涤，溶液乳化严重，加入工业盐搅拌2min静置分液。有机相用无水硫酸钠干燥，有机相收集浓缩后得到 约5kg粗产品，将粗产品加入到50L的球釜，加5L水和8.5L的甲醇，剧烈搅拌5min，液面上出现白色 固体，再将白色固体抽滤除去，水相加入(PE/EA＝2/1)溶剂(15L×2)洗涤两次。将水相转移至釜内， 加入15L DCM萃取，水相再次加入DCM 10L萃取，萃取至TLC检测水相无产品。合并有机相并用无水 硫酸钠干燥，有机相收集浓缩后得到4.9kg黄色液体。往4.9kg黄色的粗产品加入5L左右的二氯甲烷， 搅拌1min使其充分混合溶解，一次加入15L的水洗涤五次，12L的水洗涤五次，10L的水洗涤两次，将 有机相用无水硫酸钠干燥，浓缩除去溶剂得到3.7kg粗产品。粗品用甲基叔丁基醚打浆四次，得到液相为 97％且单杂含量都在1％以下的产品2.5kg，经柱层析(硅胶，V(二氯甲烷)∶丙酮)＝100/1-10/1)纯化， 得到2.3kg淡黄色液体，液相纯度为97.92％且单杂含量都在1％以下。定量核磁含量为98.16％。
1H NMR(CDCl3，400MHz)，δ：3.89～3.84(t,2H,J＝3.9Hz,CH2CH2COOH)；3.72～3.64(m,10H, CH2CH2O)；3.42～3.38(t,2H,J＝3.4Hz,CH2COOH)；2.90～2.88(t,2H,J＝2.9Hz,CH2N3)；2.82(s, 4H,NHS)。
实施例3核磁内标法分析N3-PEG3-SPA产品含量
采用400MHz牛津中科高分辨核磁共振波谱仪进行核磁分析，以氘代氯仿为溶剂，以萘(99％，w/w％； MACKLIN)作为内标。以万分之一的天平精密称取样品和内标20mg左右，用1ml氘代氯仿配制成混合 的溶液。实验条件如下：测定温度：22℃；观察频率:399.95MHz谱宽：325.95Hz脉冲宽度：15us,采 集时间：5s；脉冲延迟时间：25s；扫描次数：16次。
结果计算：
Ws(％)＝(As*Nr*Mr*Mws*Wr)/(Ar*Ns*Ms*Mwr)；
As为被测样品定量峰的峰面积；
Ar为内标物质定量峰的峰面积；
Nr为内标物质定量峰包含的质子数；
Ns为被测样品定量峰包含的质子数；
Mr为称取的内标质量；
Ms为称取的样品质量；
Mws样品分子量；
Mwr内标分子量128.17；
Wr为内标的质量百分含量；
样品称样量：23.9mg；内标称样量:21.0mg，7.90ppm和7.53ppm处为内标峰，以产品3.84ppm处 的H来计算产品含量，内标结果如下：
Ws(％)＝(As*Nr*Mr*Mws*Wr)/(Ar*Ns*Ms*Mwr)
实施例4缩合剂对N3-PEG3-SPA的纯度和含量影响
表2缩合剂对化合物N3-PEG3-SPA纯度和收率的影响
在N3-PEG3-COOH(IV)与NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)反应过程中，分别采用DCC，EDCI，DIC 作为缩合剂进行对比试验。三个反应结束后都有固体析出，我们将固体分四次冷冻抽滤除掉，滤液用盐水 洗涤两遍，有机相干燥并减压除去溶剂后直接送检，以99％纯度的萘为内标进行内标法核磁分析。核磁数 据经计算所得结果如表2所示，EDCI作为缩合剂得到的产品含量最低，仅为82.45％，而DIC和DCC分 别达到了92.10％和98.16％。同时根据图2所示核磁图发现，以EDCI和DIC作为缩合剂，产品在2.89ppm 和2.82处NHS的特征峰积分明显超出理论值(理论积分为6)，经过多次处理该处的特征峰积分并没有 减少，推测可能存在一个含有活性酯基团的杂质，而这个主要杂质也是导致EDCI和DIC缩合反应产物含 量低(分别为82.45％和92.10％)的主要原因。而以DCC作为缩合剂批次的产品在2.89ppm和2.82处 符合理论值，即DCC是最优的缩合剂。
实施例5聚乙二醇衍生物N3-PEG3-SPA含量的测定
色谱条件：
溶液配置：
空白溶液：乙腈。
制备空白：称取苄胺12mg于装有2mL二氯甲烷的试管中，室温搅拌1.5小时，然后转移至100mL 容量瓶，用空白溶液稀释至刻度，摇匀。
系统适用性溶液：称取苄胺32mg和Azide-PEG3-NHS标准品69mg分别加入装有2mL二氯甲烷的试 管中，室温搅拌1.5小时，然后转移至100mL容量瓶中，用空白溶液稀释至刻度，摇匀。
报告限溶液：取系统适用性溶液0.1mL至100mL容量瓶，用空白溶液稀释至刻度，摇匀。
样品溶液：称取苄胺32mg、称取69mg聚乙二醇衍生物N3-PEG3-SPA样品分别加入装有2mL二氯 甲烷的试管中，室温搅拌1.5小时，然后转移至100mL容量瓶，用空白稀释至刻度，摇匀。
将上述溶液在前述的色谱条件下，按照下式的序列表1进行HPLC检测：
结果计算：
按照下列公司计算样品的纯度：
纯度，％area:
Acomponent＝Azide-PEG3-NHS或单个杂质的峰面积
Atotal＝样品中所有峰面积的总和
N3-PEG3-SPA由于含有容易水解的活性酯基团，不能直接进行HPLC分析检测其纯度，所以采用衍 生化分析方法是比较可靠的途径。将采用DIC，EDCI，DCC作为缩合剂得到的三个批次N3-PEG3-SPA 按照前述标准操作规程进行苄胺衍生化后直接进行HPLC分析，结果如图2所示。衍生化产品保留时间在 11.65min处，而过量的苄胺保留时间在9.1min，其余的峰都是杂质峰。我们标示了主要的杂质峰，分布 在6.3min、8.5min、9.5min、9.7min、10.8min、10.9min、11.5min、13.0min、14.4min、14.8min、 16.0min处。紫外检测对照发现EDCI批次和DIC批次在11.5min和16.0min处各有一个单杂超过1％ 的杂质峰，且11.5min处杂质峰与主峰位置非常接近，尤其是EDCI批次在11.5min杂质积分面积占比 13.09％，而DCC批次衍生物未检出保留时间为11.5min的杂质，且所有的单杂含量占比小于1％。由于N3-PEG3-SPA易水解，不能长时间暴露于空气和水中，我们尝试通过柱层析对EDCI批次的N3-PEG3-SPA 进行快速柱层析纯化，但是发现柱层析纯化后再经苄胺衍生化依然存在11.5min的杂质，且杂质的积分面 积占比基本没有减少。说明该杂质性质与产物极其相似，通过常规纯化方法很难除去。
本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在本发明内容、精神和范围内对本文 所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。本领域技术人员可以借鉴本文 内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而 易见的，它们都被视为包括在本发明内。
Claims (10)
1.一种测定聚乙二醇衍生物样品N3-PEG3-SPA含量的方法，包括：
(1)将N3-PEG3-SPA样品进行衍生化反应，得到反应液；
(2)将步骤(1)中得到的反应液转移至容量瓶中，并用乙腈定容，摇匀；
(3)取步骤(2)中的溶液过滤膜，得到样品溶液；
(4)将步骤(3)得到的样品溶液进行HPLC检测；
(5)根据步骤(4)获得的检测结果计算出样品中的聚乙二醇衍生物N3-PEG3-SPA含量；
其中，步骤(1)中，衍生化反应是将聚乙二醇衍生物N3-PEG3-SPA样品与苄胺在二氯甲烷中反应。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，衍生化反应的反应温度为20℃-40℃。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(1)中，衍生化反应的反应时间为30min至3小时。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(3)中，样品溶液中N3-PEG3-SPA样品浓度为2mg/mL～5mg/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤(4)中，HPLC的检测条件包括如下a至f中的一项或多项：
a.色谱柱为C18色谱柱；
b.柱温为25℃～35℃；
c.柱流量为0.8mL/min至1.2mL/min；
d.进样量为2μL～10μL；
e.检测器为紫外检测器，检测波长为190nm-210nm；
f.流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为高氯酸水溶液，流动相B为乙腈。
6.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤a中，色谱柱为Waters,Xbridge shield RPC18色谱柱或Extend-C18色谱柱中的一种。
7.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤f中，流动相A中高氯酸水溶液的浓度为0.1‰～2.0‰。
8.根据权利要求5所述的方法，其中，步骤f中，流动相的洗脱程序如下表所示：
9.一种测定聚乙二醇衍生物样品N3-PEG3-SPA含量的方法，包括：
(1)将N3-PEG3-SPA样品与苄胺在二氯甲烷中进行衍生化反应，得到反应液；
(2)将步骤(1)中得到的反应液转移至容量瓶中，并用乙腈定容，摇匀；
(3)取步骤(2)中的溶液过滤膜，得到样品溶液，样品溶液浓度为2mg/mL～5mg/mL；
(4)将步骤(3)得到的样品溶液进行HPLC检测；
(5)根据步骤(4)获得的检测结果计算出样品中的聚乙二醇衍生物N3-PEG3-SPA含量；
其中，步骤(4)中HPLC的检测条件，
色谱柱为Waters,Xbridge shield RP C18色谱柱或Extend-C18色谱柱中的一种；
流动相包括流动相A和流动相B，其中，流动相A为0.1‰～2.0‰高氯酸水溶液，流动相B为乙腈。
10.根据权利要求8所述的方法，其中，步骤(4)中，色谱柱规格为150mm长度×4.6mm内径，3μm粒径；和/或进样量为2μL～10μL。
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