CN115867535A - 经取代的苯甲酰胺作为trex1的调节剂 - Google Patents

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Abstract

提供了式(I)的化合物：(I)和其药学上可接受的盐以及其组合物，所述化合物和所述药学上可接受的盐以及所述组合物可用于治疗与TREX1相关的各种病状。

Description

经取代的苯甲酰胺作为TREX1的调节剂
相关申请
本申请要求于2020年5月27日提交的美国临时申请第63/030,590号的优先权的权益，所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
与非自身的先天免疫系统识别有关的癌症需要潜在免疫疗法，并且需要潜在免疫疗法以用于检测和防止潜在的危险。癌细胞在抗原上不同于其正常对应物并且类似于病毒感染发出危险信号来警示免疫系统。这些包含损伤相关分子模式(DAMP)和病原体相关分子模式(PAMP)的信号进一步激活先天免疫系统，从而保护宿主免受各种威胁(《细胞与感染微生物学前言(Front.Cell Infect.Microbiol.)》2012,2,168)。
异位表达的单链DNA(ssDNA)和双链DNA(dsDNA)是已知的PAMP和/或DAMP，其由环状GMP-AMP合酶(cGAS)(一种核酸传感器)识别(《自然(Nature)》2011,478,515-518)。在感测到胞质DNA后，cGAS催化环状二核苷酸2',3'-cGAMP(一种干扰素基因的ER跨膜衔接蛋白刺激因子(STING)的强效第二信使和激活剂)的产生(《细胞报告(Cell Rep.)》2013,3,1355-1361)。STING激活通过TBK1触发IRF3的磷酸化，这进而导致I型干扰素的产生和干扰素刺激基因(ISG)的激活；这是激活先天免疫和启动适应性免疫的先决条件。因此I型干扰素的产生构成了先天免疫与适应性免疫之间的关键桥梁(《科学(Science)》2013,341,903-906)。
过量I型IFN可能对宿主有害并且诱导自身免疫性，因此，存在抑制I型IFN介导的免疫激活的负反馈机制。3'修复核酸外切酶I(TREX1)是负责去除异位表达的ssDNA和dsDNA的3'-5'DNA核酸外切酶，并且因此是cGAS/STING途径的关键阻遏物(《美国国家科学院院刊(PNAS)》2015,112,5117-5122)。
I型干扰素和下游促炎性细胞因子应答对于免疫应答的发展和其有效性至关重要。I型干扰素通过引发如CD40、CD80和CD86等共刺激性分子的上调来增强树突状细胞和巨噬细胞吸收、处理抗原、向T细胞呈递和交叉呈递抗原的能力，以及所述树突状细胞和巨噬细胞刺激T细胞的效力(《实验医学杂志(J.Exp.Med.)》2011,208,2005-2016)。I型干扰素还结合其自身的受体并且激活干扰素应答基因，所述干扰素应答基因有助于激活参与适应性免疫的细胞(《欧洲分子生物学组织报告(EMBO Rep.)》2015,16,202-212)。
从治疗的角度来看，I型干扰素和可以诱导I型干扰素产生的化合物具有用于治疗人类癌症的潜力(《自然免疫学评论(Nat.Rev Immunol.)》2015,15,405-414)。干扰素可以直接抑制人类肿瘤细胞增殖。另外，I型干扰素可以通过触发来自先天性和适应性免疫系统两者的细胞的激活来增强抗肿瘤免疫性。重要地，PD-1阻断的抗肿瘤活性需要预先存在的肿瘤内T细胞。通过将冷肿瘤转变为热肿瘤并由此引发自发的抗肿瘤免疫，I型IFN诱导疗法有可能扩大对抗PD-1疗法有应答的患者群以及增强抗PD1疗法的有效性。
人类和小鼠遗传研究表明TREX1抑制可能适合于全身递送途径并且因此TREX1抑制性化合物可以在抗肿瘤治疗领域中发挥重要作用。TREX1是癌细胞对放射治疗作出应答的免疫原性有限的关键决定因素[《细胞生物学趋势(Trends in Cell Biol.)》,2017,27(8),543-4；《自然通讯(Nature Commun.)》,2017,8,15618]。TREX1由遗传毒性应激诱导并且参与保护胶质瘤和黑色素瘤细胞以免受抗癌药物的影响[《生物化学与生物物理学学报(Biochim.Biophys.Acta)》,2013,1833,1832-43]。STACT-TREX1疗法在多种鼠癌症模型中表现出稳健的抗肿瘤功效[Glickman等人,Poster P235,第33届癌症免疫治疗学会年会(33rd Annual Meeting of Society for Immunotherapy of Cancer),华盛顿特区(Washington DC),2018年11月7-11日]。(TREX1)表达与宫颈癌细胞体外生长和体内疾病进展相关[《科学报告(Scientific Reports)》1019,9,351]。除肿瘤学外，也存在支持IFN途径激动剂可用于抗病毒疗法，例如STING激动剂通过刺激IFN途径和上调ISG的表达诱导对乙型肝炎病毒的先天性抗病毒免疫应答[《抗微生物剂化学疗法(Antimicrob.AgentsChemother.)》2015,59:1273–1281]，并且TREX1抑制对HIV 1型的先天免疫反应[《自然免疫学(Nature Immunology)》,2010,11(11),1005]。
发明内容
本文提供了具有式I的化合物：
Figure BDA0003964828930000021
和其药学上可接受的盐以及其组合物，其中R1、R2、R3、R4、R5、m、n和p如本文所描述。所公开的式I的化合物、其药学上可接受的盐和其组合物调节TREX1，并且可用于多种治疗性应用，例如，治疗癌症。因此，包含其用于治疗对抑制TREX1有应答的疾病的用途。
除了式I的化合物的用途之外，还提供了尤其是用于治疗对抑制TREX1有应答的疾病的具有式VI的化合物和组合物：
Figure BDA0003964828930000031
或其药学上可接受的盐，其中R1a、R2a、R3a、R4a、R5a、R6a、m1、n1和p1如本文所描述。
具体实施方式
1.化合物综述
在第一实施例中，本文提供了式I化合物：
Figure BDA0003964828930000032
或其药学上可接受的盐，其中
R1为卤基、羟基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基或卤代(C1-C4)烷氧基；
R2为氢、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、-(C1-C4)烷基ORa、-C(O)Rb、-C(O)ORb、-C(O)NRbRc、-C(O)NRbRc、5至7元杂芳基或4至7元杂环基，其中所述杂芳基和杂环基各自任选地被选自R6的1至3个基团取代；
R3为卤基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷氧基、-NRbRc或CN；
R4为卤基、羟基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷氧基、CN、-NRbRc、-C(O)Rb、-C(O)ORb、-C(O)NRbRc、-SRb、-C(O)NRbRc、-S(O)2Rb、-S(O)Rb、-NRbC(O)Rc、-NRbC(O)ORc、-NRbC(S)ORc和-NRbC(O)NcRd；
环A为含氮5至7元杂芳基；
R5为卤基、羟基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷氧基、氧基、-(C1-C4)烷基ORd、-(C1-C4)烷基C(O)Rd、-(C1-C4)烷基C(O)ORe、-(C1-C4)烷基C(O)NRdRe、-C(O)Rd、-C(O)ORd、-C(O)NRdRe、-C(O)NRdSO2(C1-C4)烷基、CN、-NRdRe、-C(O)NRdSO3H、-NRdC(O)Re、-NRdC(O)ORe、-NRdC(S)ORe、-NRdC(O)NeRf、-NRdC(S)NReRfc、-NRdS(O)2NReRf、-C(S)Rd、-S(O)2Rd、-S(O)Rd、-C(S)ORd、-C(S)NRdRe、-NRdC(S)Re、-SRd、-(C1-C4)烷基C(O)NRdRe、-(C1-C4)烷基C(O)NRdSO2(C1-C4)烷基、-(C1-C4)烷基NRdRe、-(C1-C4)烷基C(O)NRdSO3H、-(C1-C4)烷基NRdC(O)Re、-(C1-C4)烷基NRdC(O)ORe、-(C1-C4)烷基NRdC(S)ORe、-(C1-C4)烷基NRdC(O)NeRf、-(C1-C4)烷基NRdC(S)NReRf、-(C1-C4)烷基NRdS(O)2NReRf、-(C1-C4)烷基C(S)Rd、-(C1-C4)烷基S(O)2Rd、-(C1-C4)烷基S(O)Rd、-(C1-C4)烷基C(S)ORd、-(C1-C4)烷基C(S)NRdRe、-(C1-C4)烷基NRdbC(S)Re、-(C1-C4)烷基SRd、5至7元杂芳基或4至7元杂环基，其中所述杂芳基和杂环基各自任选地被选自R7的1至3个基团取代；
Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf各自独立地为氢、(C1-C4)烷基或卤代(C1-C4)烷基；
R6和R7各自独立地为卤基、羟基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷氧基、CN或氧基；
m和n各自独立地为0、1、2或3；并且
p为0或1。
在第二实施例中，本文提供了尤其是用于治疗对抑制TREX1有应答的疾病的式VI化合物：
Figure BDA0003964828930000041
或其药学上可接受的盐，其中
R1a、R2a、R4a和R5a各自独立地为卤基、羟基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷氧基、CN、-NRb1Rc1、-C(O)Rb1、-C(O)ORb1、-C(O)NRb1Rc1、-SRb1、-C(O)NRb1Rc1、-S(O)2Rb1、-S(O)Rb1、-NRb1C(O)Rc1、-NRb1C(O)ORc1、-NRb1C(S)ORc1和-NRb1C(O)Nc1Rd1；
R3a为氢、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、-(C1-C4)烷基ORa、-C(O)Rb、-C(O)ORb、-C(O)NRbRc、-C(O)NRbRc、5至7元杂芳基或5至7元杂环基，其中所述杂芳基和杂环基各自任选地被选自R7a的1至3个基团取代；
环A为杂芳基；
R6a为卤基、羟基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷氧基、氧基、-(C1-C4)烷基ORd1、-(C1-C4)烷基C(O)Rd1、-(C1-C4)烷基C(O)ORe1、-(C1-C4)烷基C(O)NRd1Re1、-C(O)Rd1、-C(O)ORd1、-C(O)NRd1Re1、-C(O)NRd1SO2(C1-C4)烷基、CN、-NRd1Re1、-C(O)NRd1SO3H、-NRd1C(O)Re1、-NRd1C(O)ORe1、-NRd1C(S)ORe1、-NRd1C(O)Ne1Rf1、-NRd1C(S)NRe1Rfc1、-NRd1S(O)2NRe1Rf1、-C(S)Rd1、-S(O)2Rd1、-S(O)Rd1、-C(S)ORd1、-C(S)NRd1Re1、-NRd1C(S)Re1、-SRd1、-(C1-C4)烷基C(O)NRd1Re1、-(C1-C4)烷基C(O)NRd1SO2(C1-C4)烷基、-(C1-C4)烷基NRd1Re1、-(C1-C4)烷基C(O)NRd1SO3H、-(C1-C4)烷基NRd1C(O)Re1、-(C1-C4)烷基NRd1C(O)ORe1、-(C1-C4)烷基NRd1C(S)ORe1、-(C1-C4)烷基NRd1C(O)Ne1Rf1、-(C1-C4)烷基NRd1C(S)NRe1Rf1、-(C1-C4)烷基NRd1S(O)2NRe1Rf1、-(C1-C4)烷基C(S)Rd1、-(C1-C4)烷基S(O)2Rd1、-(C1-C4)烷基S(O)Rd1、-(C1-C4)烷基C(S)ORd1、-(C1-C4)烷基C(S)NRd1Re1、-(C1-C4)烷基NRb1C(S)Re1、-(C1-C4)烷基SRd1、5至7元杂芳基或4至7元杂环基，其中所述杂芳基和杂环基各自任选地被选自R8a的1至3个基团取代；
Ra1、Rb1、Rc1、Rd1、Re1和Rf1各自独立地为氢、(C1-C4)烷基或卤代(C1-C4)烷基；
R7a和R8a各自独立地为卤基、羟基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷氧基、CN或氧基；并且
m1、n1和p1各自独立地为0、1、2或3。
2.定义
当结合地用于描述可能具有多个连接点的化学基团时，连字符(-)表示所述基团与定义其的变量的连接点。例如，-NRbC(O)ORc和-NRbC(S)ORc意指此基团的连接点出现在氮原子上。
术语“卤基”和“卤素”是指选自氟(氟代，-F)、氯(氯代，-Cl)、溴(溴代，-Br)和碘(碘代，-I)的原子。
术语“烷基”当单独使用或作为如“卤代烷基”等较大部分的一部分等时，意指饱和直链或支链单价烃基。
“烷氧基”意指通过氧连接原子连接的由-O-烷基表示的烷基。例如，“(C1-C4)烷氧基”包含甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基。
术语“卤代烷基”包含单卤代烷基、多卤代烷基和全卤代烷基，其中卤素独立地选自氟、氯、溴和碘。
“卤代烷氧基”是通过氧原子与另一部分连接的卤代烷基，例如，-OCHF2或-OCF3。
术语氧基意指基团＝O。
单独使用或作为较大部分的一部分使用的术语“杂芳基”是指含有1-4个选自N、O和S的5至12元(例如，4至6元)芳香族基团。杂芳基可以是单环或双环的，如大小允许的。单环杂芳基包含例如噻吩基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、三唑基、四唑基、噁唑基、异噁唑基、三嗪基、四嗪基、噁二唑基、噻唑基、异噻唑基、噻二唑基、吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基等。双环杂芳基包含其中单环杂芳环与一个或多个芳基或杂芳环稠合的基团。非限制性实例包含吲哚基、咪唑并吡啶基、苯并噁唑基、苯并氧代二唑基、吲唑基、苯并咪唑基、苯并噻唑基、喹啉基、喹唑啉基、喹喔啉基、吡咯并吡啶基、吡咯并嘧啶基、吡唑并吡啶基、噻吩并吡啶基、噻吩并嘧啶基、吲哚嗪基、嘌呤基、萘啶基和蝶啶基。应理解，当指定时，杂芳基上的任选的取代基可以存在于任何可取代位置上并且包含例如连接杂芳基的位置。
术语“杂环基”意指含有1至4个独立地选自N、O和S的杂原子的4至12元饱和或部分不饱和杂环。杂环可以在形成稳定结构的任何杂原子或碳原子处与其侧基连接。杂环基可以是单环或双环的。单环饱和杂环基或部分不饱和杂环基的实例包含但不限于四氢呋喃基、四氢噻吩基、四氢吡喃基、吡咯烷基、吡咯烷酮基、哌啶基、噁唑烷基、哌嗪基、二氧杂环烷基、二氧戊环基、吗啉基、二氢呋喃基、二氢吡喃基、二氢吡啶基、四氢吡啶基、二氢嘧啶基和四氢嘧啶基。双环杂环基包含例如与以下稠合的不饱和杂环基：另一不饱和杂环基、环烷基或芳香族环或杂芳基环，例如，苯并二氧杂环戊烯基、二氢苯并噁嗪基、二氢苯并二噁英基、6,7-二氢-5H-吡咯并[2,1-c][1,2,4]三唑基、5,6,7,8-四氢咪唑并[1,2-a]吡啶基、1,2-二氢喹啉基、二氢苯并呋喃基、四氢萘啶、吲哚啉酮、二氢吡咯并三唑、喹啉酮、苯并二氢吡喃基(chromanyl)和二氧杂螺癸烷。还应理解，当指定时，杂环基上的任选的取代基可以存在于任何可取代位置上并且包含例如连接杂环基的位置。
术语“螺环”是指共享一个环原子(例如，碳)的两个环。
术语“稠合”是指彼此共享两个相邻环原子的两个环。
术语“桥接”是指彼此共享三个环原子的两个环。
术语“TREX1”是指3'修复核酸外切酶1或DNA修复核酸外切酶1，其是在人类中由TREX1基因编码的酶。Mazur DJ,Perrino FW(1999年8月).“编码哺乳动物3'-->5'核酸外切酶的TREX1和TREX2 cDNA序列的鉴定和表达(Identification and expression of theTREX1 and TREX2 cDNA sequences encoding mammalian 3'-->5'exonucleases)”.《生物化学杂志(J Biol Chem.)》274(28):19655–60.doi:10.1074/jbc.274.28.19655.PMID10391904；Hoss M,Robins P,Naven TJ,Pappin DJ,Sgouros J,Lindahl T(1999年8月).“与大肠杆菌DnaQ/MutD蛋白同源的人DNA编辑酶(A human DNAediting enzyme homologous to the Escherichia coli DnaQ/MutD protein)”.《欧洲分子生物学学会杂志(EMBO J.)》18(13):3868-75.doi:10.1093/emboj/18.13.3868.PMC1171463.PMID10393201。此基因编码人细胞中主要的3'->5'DNA核酸外切酶。蛋白质是可以为人DNA聚合酶提供校对功能的非加工性核酸外切酶。所述蛋白质也是SET复合物的组分，并且用于在颗粒酶A介导的细胞死亡期间迅速降解带切口DNA的3'末端。缺乏功能性TREX1的细胞表现出慢性DNA损伤检查点激活和内源性单链DNA底物的核外积累。似乎TREX1蛋白通常作用于由处理异常复制中间体产生的单链DNA多核苷酸物种。TREX1的这种作用减弱DNA损伤检查点信号传导并阻止病理性免疫激活。TREX1根据细胞内在抗病毒监测代谢内源性逆转录元件的逆转录单链DNA，从而产生强效的I型IFN应答。TREX1通过降解细胞质中的病毒cDNA来帮助HIV-1逃避胞质感测。
术语“TREX2”是指3'修复核酸外切酶2，其是在人类中由TREX2基因编码的酶。此基因编码具有3'至5'核酸外切酶活性的核蛋白。编码的蛋白质参与双链DNA断裂修复，并且可以与DNA聚合酶δ相互作用。具有此活性的酶参与DNA复制、修复和重组。TREX2是主要在角化细胞中表达并且有助于表皮对UVB诱导的DNA损伤作出应答的3'-核酸外切酶。TREX2生物化学和结构性质类似于TREX1，但是两者并不相同。所述两种蛋白质共享二聚体结构并且可以在体外以几乎相同的kcat值处理ssDNA和dsDNA底物。然而，与酶动力学、结构域和亚细胞分布相关的若干个特征将TREX2与TREX1区分开来。TREX2在体外对DNA底物的亲和力是TREX1在体外对DNA底物的亲和力的1/10。与TREX1相比，TREX2缺乏可以介导蛋白质-蛋白质相互作用的COOH-末端结构域。TREX2位于细胞质和细胞核两者中，而TREX1存在于内质网中并且在颗粒酶A介导的细胞死亡期间或在DNA损伤后被动员到细胞核中。
术语“受试者”和“患者”可以互换使用，并且意指需要治疗的哺乳动物，例如，伴侣动物(例如，狗、猫等)、农场动物(例如，牛、猪、马、绵羊、山羊等)和实验室动物(例如，大鼠、小鼠、豚鼠等)。通常，受试者是需要治疗的人。
术语“抑制(inhibit/inhibition/inhibiting)”包含生物活性或过程的基线活性的降低。
如本文所使用的，术语“治疗(treatment、treat和treating)”是指逆转、缓解、延迟如本文所描述的疾病或病症或其一种或多种症状的发作或抑制其进展。在一些方面，可以在出现一种或多种症状后施用治疗，即，治疗性治疗。在其它方面，可以在不存在症状的情况下施用治疗。例如，可以在症状发作之前(例如，根据症状历史和/或根据暴露于特定生物体或其它易感因素)向易感个体施用治疗，即，预防性治疗。还可以在症状已经消退之后继续治疗，例如以延迟其复发。
术语“药学上可接受的载体”是指不会破坏与其一起调配的化合物的药理活性的无毒的载体、佐剂或媒剂。可用于本文所述组合物的药学上可接受的载体、佐剂或媒剂包含但不限于离子交换剂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白，如人血清白蛋白、缓冲物质，如磷酸盐、甘氨酸、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物脂肪酸的偏甘油酯混合物、水、盐或电解质，如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、胶体二氧化硅、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素类物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、蜡、聚乙二醇-聚氧丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂。
对于在药物中的使用，本文所描述的化合物的盐是指无毒的“药学上可接受的盐”。药学上可接受的盐形式包含药学上可接受的酸性/阴离子或碱性/阳离子盐。本文所描述的化合物的合适的药学上可接受的酸加成盐包含例如无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硝酸和硫酸)的盐和有机酸(如乙酸、苯磺酸、苯甲酸、甲磺酸和对甲苯磺酸)的盐。具有如羧酸等酸性基团的本发明教导的化合物可以与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。合适的药学上可接受的碱性盐包含例如铵盐、碱金属盐(如钠盐和钾盐)和碱土金属盐(如镁和钙盐)。具有季铵基团的化合物也含有抗衡阴离子，如氯离子、溴离子、碘离子、乙酸根、过氯酸根等。此类盐的其它实例包含盐酸盐、氢溴酸盐、硫酸盐、甲烷磺酸盐、硝酸盐、苯甲酸盐以及与如谷氨酸等氨基酸的盐。
术语“有效量”或“治疗有效量”是指将引发受试者的所需或有益生物或医疗应答的本文所描述的化合物的量，例如介于0.01-100mg/kg体重/天之间的剂量。
3.化合物
在第二实施例中，式I的化合物或其药学上可接受的盐中的R2为氢、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、-(C1-C4)烷基ORa、5至7元杂芳基或4至7元杂环基，其中所述杂芳基或杂环基各自独立地被选自R6的1至3个基团取代；R3为卤基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基或CN；并且m和n各自独立地为0、1或2，其中其余变量如上文针对式I所描述。
在第三实施例中，式I的化合物或其药学上可接受的盐中的R3为卤基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基或卤代(C1-C4)烷氧基；其中其余特征如上文针对式I或第二实施例所描述。可替代地，作为第三实施例的一部分，式I的化合物或其药学上可接受的盐中的R3为卤基或卤代(C1-C4)烷基，其中其余特征如上文针对式I或第二实施例所描述。在另一个替代方案中，作为第三实施例的一部分，式I的化合物或其药学上可接受的盐中的R3为氟、氯、甲基、甲氧基或CF3，其中其余特征如上文针对式I或第二实施例所描述。在另一个替代方案中，作为第三实施例的一部分，式I的化合物或其药学上可接受的盐中的R3为氟、氯或CF3，其中其余特征如上文针对式I或第二实施例所描述。
在第四实施例中，式I的化合物具有式II：
Figure BDA0003964828930000091
或其药学上可接受的盐，其中变量如上文针对式I或第二实施例或第三实施例所描述。
在第五实施例中，式I或II的化合物或其药学上可接受的盐中的R2为氢或(C1-C4)烷基，其中变量如上文针对式I或第二实施例或第三实施例所描述。
在第六实施例中，式I的化合物具有式III：
Figure BDA0003964828930000092
或其药学上可接受的盐，其中变量如上文针对式I或第二或第三实施例所描述。
在第七实施例中，式I、II或III的化合物或其药学上可接受的盐中的R4为卤基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基或卤代(C1-C4)烷氧基或CN，其中其余变量如上文针对式I或第二、第三或第五实施例所描述。可替代地，作为第七实施例的一部分，式I、II或III的化合物或其药学上可接受的盐中的R4为氯、甲基或甲氧基，其中其余变量如上文针对式I或第二、第三或第五实施例所描述。在另一个替代方案中，作为第七实施例的一部分，式I、II或III的化合物或其药学上可接受的盐中的R4为卤基，其中其余变量如上文针对式I或第二、第三或第五实施例所描述。在另一个替代方案中，作为第七实施例的一部分，式I、II或III的化合物或其药学上可接受的盐中的R4为氯，其中其余变量如上文针对式I或第二、第三或第五实施例所描述。
在第八实施例中，式I、II或III的化合物或其药学上可接受的盐中的m为0、1或2，其中其余变量如上文针对式I或第二、第三、第五或第七实施例所描述。可替代地，作为第八实施例的一部分，式I、II或III的化合物或其药学上可接受的盐中的m为0或1，其中其余变量如上文针对式I或第二、第三、第五或第七实施例所描述。
在第九实施例中，式I的化合物具有式IV：
Figure BDA0003964828930000101
或其药学上可接受的盐，其中其余变量如上文针对式I或第二、第三、第五、第七或第八实施例所描述。
在第十实施例中，式I、II、III或IV的化合物或其药学上可接受的盐中的环A是吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基或吡唑基，其中其余变量如上文针对式I或第二、第三、第五、第七或第八实施例所描述。可替代地，作为第十实施例的一部分，式I、II、III或IV的化合物或其药学上可接受的盐中的环A是吡啶基，其中其余变量如上文针对式I或第二、第三、第五、第七或第八实施例所描述。
在第十一实施例中，式I的化合物具有式V：
Figure BDA0003964828930000102
或其药学上可接受的盐，其中变量如上文针对式I或第二或第三实施例所描述。
在第十二实施例中，式I、II、III、IV或V的化合物或其药学上可接受的盐中的R5位于相对于环A的连接点的对位，其中其余变量如上文针对式I或第二、第三、第五、第七、第八或第十实施例所描述。
在第十三实施例中，式I、II、III、IV或V的化合物或其药学上可接受的盐中的R5为卤基、氧基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、-C(O)ORb、-NRbRc、-C(O)NRbRc、-(C1-C4)烷基ORb、-(C1-C4)烷基C(O)Rb、-(C1-C4)烷基C(O)NRbRc、-C(O)NRbSO2(C1-C4)烷基、5至6元杂芳基，其中所述杂芳基任选地被选自R7的1至3个基团取代，其中其余变量如上文针对式I或第二、第三、第五、第七、第八、第十或第十二实施例所描述。可替代地，作为第十三实施例的一部分，式I、II、III、IV或V的化合物或其药学上可接受的盐中的R5为氧基、CF3、CH3、C(O)OCH3、C(O)OH、CH2COOH、NH2、CONH2、CH2CONH2、CONHCH3、CH2OH、CH2CH2OH、CONHSO2CH3、四唑基、吡唑基、三唑基或吡唑基，其中所述吡唑基任选地被羟基取代，其中其余变量如上文针对式I或第二、第三、第五、第七、第八、第十或第十二实施例所描述。
在第十四实施例中，式I、II、III、IV或V的化合物或其药学上可接受的盐中的n为0、1或2，其中其余变量如上文针对式I或第二、第三、第五、第七、第八、第十、第十二或第十三实施例所描述。可替代地，作为第十四实施例的一部分，式I、II、III、IV或V的化合物或其药学上可接受的盐中的n为1或2，其中其余变量如上文针对式I或第二、第三、第五、第七、第八、第十、第十二或第十三实施例所描述。在另一个替代方案中，作为第十四实施例的一部分，式I、II、III、IV或V的化合物或其药学上可接受的盐中的n为2，其中其余变量如上文针对式I或第二、第三、第五、第七、第八、第十、第十二或第十三实施例所描述。
在第十五实施例中，式VI的化合物或其药学上可接受的盐中的R3a为氢、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、-(C1-C4)烷基ORa、5至7元杂芳基或4至7元杂环基，其中所述杂芳基和杂环基各自任选地被选自R7a的1至3个基团取代；并且m1、n1和p1各自独立地为0、1或2，其中其余变量如上文针对式VI所描述。
在第十七实施例中，式VI的化合物或其药学上可接受的盐中的R1a为卤基，其中其余变量如上文针对式VI或第十五实施例所描述。
在第十七实施例中，式VI的化合物具有式VII：
Figure BDA0003964828930000121
或其药学上可接受的盐，其中变量如上文针对式VI或第十五或第十六实施例所描述。
在第十八实施例中，式VI或VII的化合物或其药学上可接受的盐中的R2a为卤基、羟基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基或(C1-C4)烷氧基，其中变量如上文针对式VI或第十五或第十六实施例所描述。可替代地，作为第十八实施例的一部分，式VI或VII的化合物或其药学上可接受的盐中的R2a为卤基，其中变量如上文针对式VI或第十五或第十六实施例所描述。
在第十九实施例中，式VI的化合物具有式VIII：
Figure BDA0003964828930000122
或其药学上可接受的盐，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六或第十八实施例所描述。
在第二十实施例中，式VI的化合物具有式IX：
Figure BDA0003964828930000123
或其药学上可接受的盐，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六或第十八实施例所描述。
在第二十一实施例中，式VI、VII、VIII或IX的化合物或其药学上可接受的盐中的R4a为卤基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基或卤代(C1-C4)烷氧基，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六或第十八实施例所描述。可替代地，作为第二十一实施例的一部分，式VI、VII、VIII或IX的化合物或其药学上可接受的盐中的R4a为氟、氯、甲基、甲氧基或CF3，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六或第十八实施例所描述。在另一个替代方案中，作为第二十一实施例的一部分式VI、VII、VIII或IX的化合物或其药学上可接受的盐中的R4a为卤代(C1-C4)烷基或卤基，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六或第十八实施例所描述。在另一个替代方案中，作为第二十一实施例的一部分式VI、VII、VIII或IX的化合物或其药学上可接受的盐中的R4a为氟、氯或CF3，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六或第十八实施例所描述。
在第二十二实施例中，式VI、VII、VIII或IX的化合物或其药学上可接受的盐中的R3a为氢或(C1-C4)烷基，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六、第十八或第二十一实施例所描述。
在第二十三实施例中，式VI的化合物具有式X：
Figure BDA0003964828930000131
或其药学上可接受的盐，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六或第十八实施例所描述。
在第二十四实施例中，式VI、VII、VIII、IX或X的化合物或其药学上可接受的盐中的R5a为卤基或(C1-C4)烷氧基，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六、第十八或第二十一实施例所描述。可替代地，作为第二十四实施例的一部分，式VI、VII、VIII、IX或X的化合物或其药学上可接受的盐中的R5a为氯、甲基或甲氧基，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六、第十八或第二十一实施例所描述。在另一个替代方案中，作为第二十四实施例的一部分，式VI、VII、VIII、IX或X的化合物或其药学上可接受的盐中的R5a为卤基，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六、第十八或第二十一实施例所描述。在另一个替代方案中，作为第二十四实施例的一部分，式VI、VII、VIII、IX或X的化合物或其药学上可接受的盐中的R5a为氯，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六、第十八或第二十一实施例所描述。
在第二十五实施例中，式VI、VII、VIII、IX或X的化合物或其药学上可接受的盐中的m1为0、1或2，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六、第十八、第二十一或第二十四实施例所描述。
在第二十六实施例中，式VI、VII、VIII、IX或X的化合物或其药学上可接受的盐中的环A为5至7元杂芳基，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六、第十八、第二十一、第二十四或第二十五实施例所描述。可替代地，作为第二十四实施例的一部分，式VI、VII、VIII、IX或X的化合物或其药学上可接受的盐中的环A为含氮5至7元杂芳基，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六、第十八、第二十一、第二十四或第二十五实施例所描述。在另一个替代方案中，作为第二十四实施例的一部分，式VI、VII、VIII、IX或X的化合物或其药学上可接受的盐中的环A为吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基或吡唑基，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六、第十八、第二十一、第二十四或第二十五实施例所描述。在另一个替代方案中，作为第二十四实施例的一部分，式VI、VII、VIII、IX或X的化合物或其药学上可接受的盐中的环A为吡啶基，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六、第十八、第二十一、第二十四或第二十五实施例所描述。
在第二十七实施例中，式VI的化合物具有式XI：
Figure BDA0003964828930000141
或其药学上可接受的盐，其中变量如上文针对式VI或第二十一、第二十四、第二十五或第二十六实施例所描述。
在第二十八实施例中，式VI、VII、VIII、IX、X或XI的化合物或其药学上可接受的盐中的R6a为卤基、氧基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、-C(O)ORb1、-NRb1Rc1、-C(O)NRb1Rc1、-(C1-C4)烷基ORb1、-(C1-C4)烷基C(O)Rb1、-(C1-C4)烷基C(O)NRb1Rc1、-C(O)NRb1SO2(C1-C4)烷基、5至6元杂芳基，其中所述杂芳基任选地被选自R7a的1至3个基团取代，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六、第十八、第二十一、第二十四、第二十五或第二十六实施例所描述。可替代地，作为第二十八实施例的一部分，式VI、VII、VIII、IX、X或XI的化合物或其药学上可接受的盐中的R6a为氧基、CF3、CH3、C(O)OCH3、C(O)OH、CH2COOH、NH2、CONH2、CH2CONH2、CONHCH3、CH2OH、CH2CH2OH、CONHSO2CH3、四唑基、吡唑基、三唑基或吡唑基，其中所述吡唑基任选地被羟基取代，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六、第十八、第二十一、第二十四、第二十五或第二十六实施例所描述。
在第二十九实施例中，式VI、VII、VIII、IX、X或XI的化合物或其药学上可接受的盐中的n1为0、1或2，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六、第十八、第二十一、第二十四、第二十五、第二十六或第二十八实施例所描述。可替代地，作为第二十九实施例的一部分，式VI、VII、VIII、IX、X或XI的化合物或其药学上可接受的盐中的n1为1或2，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六、第十八、第二十一、第二十四、第二十五、第二十六或第二十八实施例所描述。在另一个替代方案中，作为第二十九实施例的一部分，式VI、VII、VIII、IX、X或XI的化合物或其药学上可接受的盐中的n1为0或1，其中变量如上文针对式VI或第十五、第十六、第十八、第二十一、第二十四、第二十五、第二十六或第二十八实施例所描述。
具有式I和VI的化合物在范例中进一步公开并且包含在本公开中。包含其药学上可接受的盐以及中性形式。
4.用途、调配和施用
本文所描述的化合物和组合物通常对调节TREX1的活性是有用的。在一些方面，本文所描述的化合物和药物组合物抑制活性TREX1。
在一些方面，本文所描述的化合物和药物组合物可用于治疗与TREX1功能相关的病症。因此，本文提供了治疗与TREX1功能相关的病症的方法，所述方法包括向有需要的受试者施用治疗有效量的本文所描述的化合物、或其药学上可接受的盐、或包括所公开的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。还提供了本文所描述的化合物、或其药学上可接受的盐、或包括所公开的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物用于制造用于治疗与TREX1功能相关的病症的药物的用途。还提供了本文所描述的化合物、或其药学上可接受的盐、或包括所公开的化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物，其用于治疗与TREX1相关的病症。
在一些方面，本文所描述的化合物和药物组合物可用于治疗癌症。
在一些方面，由本文所述的化合物和药物组合物治疗的癌症选自结肠癌、胃癌、甲状腺癌、肺癌、白血病、胰腺癌、黑色素瘤、多发性黑色素瘤、脑癌、CNS癌、肾癌、前列腺癌、卵巢癌、白血病和乳腺癌。
在一些方面，由本文所描述的化合物和药物组合物治疗的癌症选自肺癌、乳腺癌、胰腺癌、结直肠癌和黑色素瘤。
在某些方面，本文所描述的药物组合物被调配成用于向需要此类组合物的患者施用。本文所描述的药物组合物可以口服、肠胃外、通过吸入喷雾、局部、经直肠、经鼻、经颊、经阴道或经由植入式贮器施用。如本文所使用的术语“肠胃外”包含皮下、静脉内、肌内、关节内、滑膜内、胸骨内、鞘内、肝内、病灶内以及颅内注射或输注技术。在一些实施例中，所述组合物口服、腹膜内或静脉内施用。本文所描述的药物组合物的无菌可注射形式可以是水性或油性悬浮液。这些悬浮液可以使用适当的分散剂或湿润剂以及悬浮剂根据本领域中已知的技术进行调配。
在一些方面，药物组合物是口服施用的。
用于任何特定患者的具体剂量和治疗方案将取决于各种因素，包含所采用的具体化合物的活性、年龄、体重、总体健康状况、性别、饮食、施用时间、排泄率、药物组合和治疗医生的判断以及被治疗的特定疾病的严重程度。组合物中的本文所描述的化合物的量还将取决于药物组合物中的特定化合物。
范例
化学合成
以下的代表性实例旨在帮助展示本公开，并且其不旨在也不应解释为限制本发明的范围。
除非另有说明，否则所使用的一般起始材料从商业来源获得或在其它实例中制备。
缩写词
ACN 乙腈
AcOH 乙酸
AIBN α,α'-偶氮异丁腈
DCE 1,2-二氯乙烷
DCM 二氯甲烷(Dichloromethane/methylene chloride)
DEA 二乙胺
DIEA N,N-二异丙基乙胺
DMA N,N-二甲基乙酰胺
DMAP N,N-二甲基吡啶-4-胺
DMC 2-氯-1,3-二甲基咪唑啉氯化物
DMF N,N-二甲基甲酰胺
DMSO 二甲基亚砜
EtOAc 乙酸乙酯
HATU 2-(3H-[1,2,3]三唑并[4,5-b]吡啶-3-基)-1,1,3,3-四甲基-异脲六氟磷酸盐
HCl 氯化氢
HPLC 高效液相色谱法
IPA 2-丙醇
LAH 氢化锂铝
LC/MS 液相色谱法/质谱法
K2CO3 碳酸钾
MeOH 甲醇
MS 质谱法
NaBH(OAc)3 三乙酰氧基硼氢化钠
NaCNBH4 氰基硼氢化钠
NaOH 氢氧化钠
NaHCO3 碳酸氢钠
Na2SO4 硫酸钠
RT 室温
TEA 三乙胺
TFA 三氟乙酸
THF 四氢呋喃
通常通过TLC或LC-MS监测反应进程。使用以下方法之一记录LC-MS。
LCMS方法-1：
Figure BDA0003964828930000171
Figure BDA0003964828930000181
LCMS方法-2：
Figure BDA0003964828930000182
LCMS方法-3：
Figure BDA0003964828930000183
LCMS方法-4：
Figure BDA0003964828930000184
LCMS方法-5：
Figure BDA0003964828930000191
LCMS方法-6：
Figure BDA0003964828930000192
在室温下记录NMR，除非在Varian Inova 400或500MHz光谱仪上(溶剂峰用作参考)或在Bruker 300或400MHz光谱仪上(TMS峰用作内部参考)另有说明。
一般关键中间体程序
中间体1[(3,5-二氯苯基)甲基][(吡啶-3-基)甲基]胺盐酸盐的合成
Figure BDA0003964828930000193
步骤1.在惰性气氛下，将1-(吡啶-3-基)甲胺(4.70mL，46.2mmol)与3,5-二氯苯甲醛(4.04g，23.1mmol)在甲醇(83mL)中组合。添加氰基硼氢化钠(2.90g，46.2mmol)和乙酸(2.63mL，46.2mmol)。将反应混合物在室温下搅拌4小时。将反应混合物浓缩，容纳于乙酸乙酯中，并用饱和NaHCO3溶液洗涤两次。将有机相在真空下浓缩。将残余物溶解在THF中，然后添加HCl(4M于1,4-二噁烷中)。将沉淀的HCl盐过滤，用THF洗涤，并且在真空下干燥，以得到呈白色固体的[(3,5-二氯苯基)甲基][(吡啶-3-基)甲基]胺盐酸盐(5.859g，40.5％)。MSES m/z：267.1[M+H]+。
中间体2[(2,4-二氯苯基)甲基][(吡啶-3-基)甲基]胺盐酸盐的合成
Figure BDA0003964828930000201
步骤1.在N2惰性气氛下，将1-(吡啶-3-基)甲胺(4.70mL，46.2mmol)溶解在甲醇(83mL)中，然后添加2,4-二氯苯甲醛(4.04g，23.1mmol)、氰基硼氢化钠(2.90g，46.2mmol)和乙酸(2.63mL，46.2mmol)。将反应在室温下搅拌4小时。将反应混合物浓缩，容纳于乙酸乙酯中，并用饱和NaHCO3溶液洗涤两次。将有机相浓缩。将残余物溶解在THF中，然后添加HCl(4M于1,4-二噁烷中)。将沉淀的HCl盐过滤，用THF洗涤，并且在真空下干燥，以得到呈白色固体的[(2,4-二氯苯基)甲基][(吡啶-3-基)甲基]胺盐酸盐(5.692g，39.4％)。MS ES m/z：267.1[M+H]+。
中间体3(1-(2,3-二氯苯基)丙-1-胺)的合成
Figure BDA0003964828930000202
步骤1.在-50℃下在氩气气氛下向2,3-二氯苯甲腈(1.00g，5.814mmol)和THF(10.00mL)的搅拌溶液中逐滴添加EtMgBr(1.55g，11.628mmol)。将所得混合物在氩气气氛下在室温下搅拌1小时。在0℃下将反应用饱和NH4Cl(水溶液)淬灭。用EtOAc(3x20mL)萃取水层。将所得混合物在真空下浓缩，以得到呈黄色油的(1-(2,3-二氯苯基)丙-1-亚胺)(930mg，79％)，并且直接用于下一步骤。
Figure BDA0003964828930000203
步骤2.在0℃下向(1-(2,3-二氯苯基)丙-1-亚胺)(900mg，4.454mmol)和EtOH(60.00mL)的搅拌溶液中分批添加NaBH4(336.99mg,8.907mmol)。将所得混合物在0℃下搅拌2小时。在0℃下将反应用饱和NH4Cl(水溶液)淬灭。用EtOAc(3x100mL)萃取水层。将所得混合物在真空下浓缩，以得到呈黄色固体的(1-(2,3-二氯苯基)丙-1-胺)(832mg，91％)。ESMS m/z：204.0[M+H]+。
1-(2,4-二氯苯基)-N-(吡啶-3-基甲基)-1-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)甲胺(中间体4)的合成
Figure BDA0003964828930000211
步骤-1：2,4-二氯苯甲酸甲酯：向2,4-二氯苯甲酸(1.5g，7.85mmol)于MeOH(10ml)中的搅拌溶液中添加浓硫酸(1ml)，并且将反应混合物在80℃下加热16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物用水(100ml)淬灭并且用乙酸乙酯(3x100ml)萃取。将合并的有机层用盐水(100ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩。将粗化合物通过使用combi-快速色谱法纯化以获得纯标题化合物(1.4g，87％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.88(s,3H),7.57(dd,J＝8.4Hz,J＝2.0Hz,1H),7.79(d,J＝1.6Hz,1H),7.86(d,J＝8.4Hz,1H).
步骤-2：(2,4-二氯苯基)(1H-吡唑-4-基)甲酮：在N2(g)气氛下在-78℃下，向4-溴-1H-吡唑(1.0g，6.85mmol)于THF(10ml)中的溶液中添加n-BuLi(6.3ml，16.44mmol)，并且在-78℃下将反应混合物搅拌5-10分钟。将反应混合物在室温下搅拌1小时。1小时后，将反应混合物冷却至-78℃，并且在-78℃下添加2,4-二氯苯甲酸甲酯(1.4g，6.85mmol)并允许到达室温，并且在室温下搅拌1小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物用饱和的NH4Cl溶液(100ml)淬灭并且用乙酸乙酯(3x100ml)萃取。将合并的有机层用盐水(100ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩。将粗化合物通过使用combi-快速色谱法纯化以获得纯标题化合物(0.6g，51.3％)。ES MS m/z：239.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ7.56(bs,2H),7.91(s,1H),8.29(s,1H),13.65(s,1H)。
步骤-3：(2,4-二氯苯基)(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)甲酮：向(2,4-二氯苯基)(1H-吡唑-4-基)甲酮(0.900g，3.73mmol)于甲苯(10ml)中的溶液中添加3,4-二氢吡喃(0.470g，5.6mmol)，然后在室温下添加TEA(0.1ml)。将反应混合物在100℃下加热48小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物在真空下浓缩以得到粗化合物，所述粗化合物在不经过进一步纯化的情况下用于下一步骤(0.780g，粗)。
步骤-4：1-(2,4-二氯苯基)-N-(吡啶-3-基甲基)-1-(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)甲胺：向(2,4-二氯苯基)(1-(四氢-2H-吡喃-2-基)-1H-吡唑-4-基)甲酮(0.780g，2.4mmol)于甲苯(10ml)中的溶液中添加吡啶-3-基甲胺(0.389g，3.6mmol)，然后添加异丙醇钛(IV)(1.4g，4.8mmol)，并且将反应混合物在90℃下加热10小时。添加NaCNBH3(0.223g，3.6mmol)和MeOH(20ml)，并且将反应混合物在80℃下加热另外16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，向反应混合物反应混合物中添加水(50ml)并搅拌10分钟。10分钟后，将反应混合物过滤，并且用DCM(2x50ml)洗涤。将滤液浓缩以得到粗产物。粗化合物在不经过进一步纯化的情况下用于下一步骤(0.650g，粗)。
2-(5-(((2,4-二氯苄基)氨基)甲基)吡啶-2-基)乙酸甲酯(中间体5)的合成
Figure BDA0003964828930000221
步骤-1：2-(5-氰基吡啶-2-基)丙二酸二甲酯：在室温下向6-溴烟腈(10.0g，54.641mmol)和丙二酸二甲酯(10.82g，81.9mmol)于DMF(100ml)中的搅拌溶液中添加Cs2CO3(53.40g，163.9mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物倒入冰冷水中(100ml)并且用乙酸乙酯(3x100ml)萃取。将合并的有机层用盐水(100ml)洗涤，并且经Na2SO4干燥。在真空下蒸发以获得粗化合物。使用柱色谱法将粗化合物纯化以获得纯化合物(9.2g，71％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.81(s,6H),5.04(s,1H),7.68(d,J＝8.0Hz,1H),8.01(d,J＝6.4Hz,1H),8.85(s,1H)。
步骤-2：2-(5-氰基吡啶-2-基)乙酸甲酯：在室温下向2-(5-氰基吡啶-2-基)丙二酸二甲酯(8.0g，34.2mmol)于DMSO(80ml)中的搅拌溶液中添加NaCl的水溶液(2.19g，37.5mmol)。将反应混合物在130℃下搅拌过夜。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物倒入冰冷水中(100ml)并且用乙酸乙酯(3x100ml)萃取。将合并的有机层用盐水(100ml)洗涤，并且经Na2SO4干燥，并在真空下蒸发以获得粗化合物。使用柱色谱法将粗化合物纯化以获得纯化合物(2.7g，44％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.78(s,3H),3.97(s,2H),7.49(d,J＝8.0Hz,1H),7.97(d,J＝8.0Hz,1H),8.87(s,1H)。
步骤-3：2-(5-(氨基甲基)吡啶-2-基)乙酸甲酯：在0℃下向2-(5-氰基吡啶-2-基)乙酸甲酯(0.50g，2.8mmol)于MeOH(5ml)中的搅拌溶液中分批添加NiCl2 6H2O(0.067g，0.28mmol)，随后添加NaBH4(0.750g，19.4mmol)。将反应混合物在室温下搅拌过夜。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物通过硅藻土过滤，并且将滤液在真空下蒸发以获得粗化合物。使用RP-HPLC将粗化合物纯化以获得纯化合物(0.400g，78％)。ES MS m/z：181.1[M+H]+。
步骤-4：2-(5-(((2,4-二氯苄基)氨基)甲基)吡啶-2-基)乙酸甲酯：在室温下向2-(5-(氨基甲基)吡啶-2-基)乙酸甲酯(0.300g，1.66mmol)和2,4-二氯苯甲醛(0.291g，1.66mmol)于1,2-二氯乙烷(3ml)中的搅拌溶液中添加AcOH(0.3ml)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。添加氰基硼氢化钠(0.156g，2.49mmol)和甲醇(0.3ml)，并且将反应混合物在室温下搅拌另外1小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物倒入冰冷水中(20ml)并且用乙酸乙酯(2x20ml)萃取。将合并的有机层用盐水(30ml)洗涤，并且经Na2SO4干燥。在真空下蒸发以获得粗化合物。使用柱色谱法将粗化合物纯化以获得纯化合物(0.200g，35％)。ES MS m/z：339.4[M+H]+。
3-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(((2-氯苄基)氨基)甲基)吡啶甲酸乙酯(中间体6)的合成
Figure BDA0003964828930000231
步骤-1：3-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(((2-氯苄基)氨基)甲基)吡啶甲酸乙酯：向3-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-甲酰基吡啶甲酸乙酯(0.6g，2.04mmol)和(2-氯苯基)甲胺(0.35g，2.45mmol)于1,2-二氯乙烷(6.0mL)中的搅拌溶液中添加AcOH(0.6mL)，并且将反应混合物在室温下搅拌1小时。添加NaCNBH3(0.190g，3.06mmol)和MeOH(0.6mL)，并且在室温下搅拌另外1小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物用饱和的NaHCO3溶液(50ml)淬灭并且用二氯甲烷(3x75ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩以得到粗产物。将粗化合物在不进一步纯化的情况下用于下一步骤。ES MS m/z：420.35[M+H]+。
5-(((2-氯苄基)氨基)甲基)嘧啶-2-羧酸甲酯(中间体7)的合成
Figure BDA0003964828930000241
步骤-1：5-(溴甲基)嘧啶-2-羧酸甲酯:向5-甲基嘧啶-2-羧酸甲酯(0.2g，1.31mmol)、N-溴代琥珀酰亚胺(0.268g，1.51mmol)和AIBN(0.086g，0.52mmol)于CCl4(2ml)中的搅拌溶液中回流16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物浓缩以得到粗化合物。将粗化合物用水(10ml)稀释并用乙酸乙酯(2x15 ml)萃取。将合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩。将粗化合物通过使用combi-快速色谱法纯化以获得标题化合物(0.075g，24％)。LCMS:m/z 231.1[M+H]+。
步骤-2：5-(((2-氯苄基)氨基)甲基)嘧啶-2-羧酸甲酯：向5-(溴甲基)嘧啶-2-羧酸甲酯(0.2g，0.86mmol)于DCM(2ml)中的搅拌溶液中添加(2-氯苯基)甲胺(0.134g，0.95mmol)。将反应混合物在室温下搅拌72小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物浓缩。将粗化合物通过使用combi-快速色谱法纯化以获得标题化合物(0.060g，23％)。LCMS：m/z 292.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.98(s,2H),4.00(s,2H),4.12(s,3H),7.28-7.32(m,2H),7.41-7.43(m,2H),9.00(s,2H)。
5-(((1-(3-甲氧基-2-(三氟甲基)苯基)丙基)氨基)甲基)吡啶甲酸甲酯(中间体8)的合成
Figure BDA0003964828930000242
步骤-1：(E)-N-(3-甲氧基-2-(三氟甲基)苯亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺：向3-甲氧基-2-(三氟甲基)苯甲醛(0.3g，1.47mmol)于二氯甲烷(3ml)中的搅拌溶液中添加2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(0.267g，2.20mmol)和硫酸铜(0.469g，2.93mmol)，并且加热到回流，持续24小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物用水(5ml)淬灭并且用乙酸乙酯(3x10ml)萃取。将合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，经Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。将粗化合物通过使用combi-快速色谱法纯化以获得标题化合物(0.3g，66％)。LCMS：m/z 308.4[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.19(s,9H),3.94(s,3H),7.48-7.51(m,2H),7.73(t,J＝8.4Hz,1H),8.82(dd,J＝7.2Hz,J＝3.6Hz,1H)。
步骤-2：N-(1-(3-甲氧基-2-(三氟甲基)苯基)丙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺：在0℃下向(E)-N-(3-甲氧基-2-(三氟甲基)苯亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(0.3g，0.976mmol)于四氢呋喃(3ml)中的溶液中添加乙基溴化镁(1.0M于THF中)(1.46ml，1.464mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌1小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物用饱和氯化铵溶液(5ml)淬灭并且用乙酸乙酯(3x20ml)萃取。将合并的有机层用盐水(20ml)洗涤，经Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。将粗化合物通过使用combi-快速色谱法纯化以获得标题化合物(0.3g，91％)。LCMS:m/z 338.2[M+H]+.1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.88(t,3H),1.07(s,9H),1.60-1.67(m,1H),1.76-1.84(m,1H),3.85(s,3H),4.56-4.61(m,1H),5.57(d,J＝6.8Hz,1H),7.09(d,J＝8.4Hz,1H),7.28(d,J＝8.4Hz,1H),7.56-7.60(t,J＝8.0Hz,1H).
步骤-3：1-(3-甲氧基-2-(三氟甲基)苯基)丙-1-胺HCl盐：向N-(1-(3-甲氧基-2-(三氟甲基)苯基)丙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(0.3g，0.89mmol)于二氯甲烷(3ml)中的溶液中添加含HCl的1,4-二噁烷(1.5ml)，并且将反应混合物在室温下搅拌2小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物在减压下浓缩。将粗化合物用正戊烷研磨以获得标题化合物(0.230g，96％)。LCMS：m/z 234.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.78(t,J＝7.6Hz,3H),1.78-1.85(m,1H),1.96-2.03(m,1H),3.89(s,3H),4.50-4.54(m,1H),7.30(d,J＝8.4Hz,1H),7.41(d,J＝8.0Hz,1H),7.72(t,J＝8.0Hz,1H),8.66(bs,2H).
步骤-4：5-(((1-(3-甲氧基-2-(三氟甲基)苯基)丙基)氨基)甲基)吡啶甲酸甲酯：向1-(3-甲氧基-2-(三氟甲基)苯基)丙-1-胺HCl盐(0.20g，0.741mmol)于1,2-二氯乙烷(2ml)中的混合物中添加三乙胺(0.4ml，2.96mmol)，并且在室温下搅拌30分钟。然后添加分子筛、甲基-5-甲酰基砒啶甲酸酯(0.122g，0.741mmol)和乙酸(0.5ml，8.89mmol)，并且RM搅拌1小时。然后添加NaCNBH3(0.116g，1.85mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌45分钟。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物通过硅藻土床过滤，并且向滤液中添加饱和碳酸氢钠溶液(5ml)并用乙酸乙酯(2x20ml)萃取。将合并的有机层用盐水(20ml)洗涤，经Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。将粗产物通过柱色谱法纯化以得到纯标题化合物(0.140g，49％)。LCMS：m/z 383.6[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.86(t,J＝7.2Hz,3H),1.50-1.66(m,2H),3.04(bs,1H),3.44(d,J＝14.8Hz,1H),3.60(d,J＝14.8Hz,1H),3.86(s,3H),3.88(s,3H),3.98(bs,1H),7.11(d,J＝8.4Hz,1H),7.48(d,J＝8.0Hz,1H),7.60(t,J＝8.0Hz,1H),7.87(d,J＝7.6Hz,1H),7.99(d,J＝8.0Hz,1H),8.57(s,1H).
1-(6-溴吡啶-3-基)-N-(2-氯苄基)甲胺(中间体64)的合成
Figure BDA0003964828930000261
步骤-1：1-(6-溴吡啶-3-基)-N-(2-氯苄基)甲胺：在室温下用氩气将6-溴烟碱醛(0.75g，4.07mmol)、(2-氯苯基)甲胺(0.574g，4.07mmol)和乙酸(1.16ml，20.35mmol)于1-2二氯乙烷(10ml)中的混合物搅拌2小时。添加NaCNBH3(0.384g，6.105mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌另外16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，添加水(20ml)，并将反应混合物用二氯甲烷(2x30ml)萃取。将合并的有机层用盐水(20ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在真空下浓缩。将粗产物通过柱色谱法纯化以得到呈白色固体的纯标题化合物(0.85g，67％)。LCMS：m/z 311.2[M+H]+。
5-(((1-(2-氯-3,4-二甲氧基苯基)丙基)氨基)甲基)吡啶甲酸甲酯(中间体9)的合成
Figure BDA0003964828930000262
步骤-1：2-氯-N,3,4-三甲氧基-N-甲基苯甲酰胺：在室温下向2-氯-3,4-二甲氧基苯甲酸(3.0g，13.85mmol)于干燥DMF(30ml)中的搅拌溶液中添加HATU(7.894g，20.77mmol)。然后逐滴添加DIPEA(4.903ml，27.70mmol)。将反应混合物在室温下搅拌1小时。在室温下添加N,O-二甲基盐酸羟胺(2.026g，20.77mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌4小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物用冰冷水(40ml)稀释，并且用乙酸乙酯(2x80ml)萃取水层。将合并的有机层用盐水(40ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩。将粗化合物通过Combi快速柱色谱法纯化以得到纯标题化合物(2.5g，69.5％)。LCMS:m/z 260.27[M+H]+。
步骤-2：1-(2-氯-3,4-二甲氧基苯基)丙-1-酮：
在0℃下在氮气气氛下向2-氯-N,3,4-三甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(1.0g，3.85mmol)于干燥THF(10ml)中的搅拌溶液中逐滴添加乙基溴化镁(6.40ml，3M溶液于二乙醚中，19.25mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌1.5小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物用饱和氯化铵水溶液(10ml)缓慢淬灭。将水层用乙酸乙酯(3x20ml)萃取。将合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩以得到粗化合物。将粗化合物通过Combi快速柱色谱法纯化以得到纯标题化合物(0.600g，68％)。LCMS:m/z 229[M+H]+.1H NMR(400MHz,CDCl3):δ1.21(t,J＝7.2Hz,3H),2.97(q,J＝7.2Hz,2H),3.89(s,3H),3.98(s,3H),6.87(d,J＝8.8Hz,1H),7.33(d,J＝8.8Hz,1H).
步骤-3：5-(((1-(2-氯-3,4-二甲氧基苯基)丙基)氨基)甲基)吡啶甲酸甲酯：在氮气气氛下向5-(氨基甲基)吡啶甲酸甲酯二盐酸盐(0.250g，1.04mmol)于DCE(2.5ml)中的搅拌溶液中逐滴添加Et3N(0.436ml，3.13mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时以释放游离胺。添加1-(2-氯-3,4-二甲氧基苯基)丙-1-酮(0.191g，0.83mmol)、冰乙酸(0.1ml)和4A分子筛(0.500g)，并且将反应混合物在60℃下搅拌16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物冷却至室温。添加氰基硼氢化钠(0.131g，2.09mmol)并将反应混合物在60℃下搅拌3小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物通过饱和碳酸氢钠水溶液(5ml)淬灭。将水层用乙酸乙酯(3x10ml)萃取。将合并的有机层用盐水(5ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩以得到粗化合物。将粗化合物通过Combi快速柱色谱法纯化以得到纯标题化合物(0.170g，53.8％)。LCMS：m/z 379.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.80(t,J＝7.4Hz,3H),1.53-1.61(m,2H),2.95(bs,1H),3.49(d,J＝14.4Hz,1H),3.64(d,J＝15.6Hz,1H),3.72(s,3H),3.82(s,3H),3.86(s,3H),5.76(s,1H),7.08(d,J＝8.4Hz,1H),7.32(d,J＝8.8Hz,1H),7.87(d,J＝7.6Hz,1H),7.99(d,J＝7.6Hz,1H),8.56(s,1H).
5-(((1-(4-氯苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)丙基)氨基)甲基)吡啶甲酸甲酯(中间体10)的合成
Figure BDA0003964828930000281
步骤-1：1-(2-氯-3,4-二羟基苯基)丙-1-酮：将1-(2-氯-3,4-二甲氧基苯基)丙-1-酮(1.00g，4.37mmol)溶解于DCM(10ml)中，并且在-78℃下逐滴添加1M含BBr3的DCM(8.74ml，1.0M于DCM中，8.75mmol)。然后将反应混合物在-78℃下搅拌1小时，并且然后在室温下搅拌2.5小时。通过TLC(含5％甲醇的DCM)监测反应。反应完成之后，将反应混合物用30％氨水淬灭并浓缩。添加甲醇(1ml)，并且将反应混合物浓缩至干燥。将反应混合物用甲醇(1ml)共沸两次。将粗化合物装载在硅藻土上，并通过RP Gold柱色谱法使用乙腈和含0.1％甲酸的水纯化，以得到纯产物(0.420g，47.9％)。LCMS：m/z 199.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.04(t,J＝7.0Hz,3H),2.86(q,J＝7.2Hz,2H),6.79(d,J＝8.4Hz,1H),7.07(d,J＝8.4Hz,1H),9.49(s,1H),10.19(s,1H).
步骤-2：1-(4-氯苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)丙-1-酮：向1-(2-氯-3,4-二羟基苯基)丙-1-酮(0.40g，1.98mmol)于干燥DMF(6.0ml)中的搅拌溶液中添加氟化钾(0.578g，9.96mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟。然后在室温下逐滴添加二碘甲烷(0.20ml，2.38mmol)，并且将反应混合物在100℃下搅拌2小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物用水(10ml)稀释，并且用乙酸乙酯(2x20ml)萃取水层。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩。将粗化合物通过Combi快速柱色谱法纯化以得到纯标题化合物(0.200g，47.2％)。LCMS：m/z 213.12[M++1]和215.1[M+2H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.04(t,J＝7.2Hz,3H),2.93(q,J＝6.8Hz,2H),6.21(s,2H),7.00(d,J＝8.4Hz,1H),7.39(d,J＝8.4Hz,1H).
步骤-3：5-(((1-(4-氯苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)丙基)氨基)甲基)吡啶甲酸甲酯：在氮气气氛下向5-(氨基甲基)吡啶甲酸甲酯二盐酸盐(0.185g，0.78mmol)于DCE(4ml)中的搅拌溶液中逐滴添加Et3N(0.323mL，2.32mmol)。将反应混合物在室温下搅拌2小时以释放游离胺。添加1-(4-氯苯并[d][1,3]间二氧杂环戊烯-5-基)丙-1-酮(0.132g，0.62mmol)、冰乙酸(0.1mL)和4A分子筛(0.300g)，并且将反应混合物在60℃下搅拌16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物冷却至室温。添加氰基硼氢化钠(0.097g，1.55mmol)和甲醇(5滴)。将反应混合物在60℃下搅拌3小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物用饱和碳酸氢钠水溶液(5ml)淬灭。将水层用乙酸乙酯(3x10ml)萃取。将合并的有机层用盐水(5ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩以得到粗化合物。将粗化合物通过Combi快速柱色谱法纯化以得到纯标题化合物(0.088g，39.1％)。LCMS：m/z 363.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.81(t,J＝7.2Hz,3H),1.56-1.64(m,2H),3.51(d,J＝14.8Hz,1H),3.67(d,J＝13.6Hz,1H),3.84(s,1H),3.88(s,3H),6.13(s,2H),6.96(d,J＝8.0Hz,1H),7.11(d,J＝8.4Hz,1H),7.89(d,J＝8.0Hz,1H),8.01(d,J＝7.6Hz,1H),8.58(s,1H).
5-(((1-(2-氯-3-乙氧基苯基)丙基)氨基)甲基)吡啶甲酸甲酯(中间体11)的合成
Figure BDA0003964828930000291
步骤-1：2-氯-3-乙氧基苯甲醛：在室温下向2-氯-3-羟基苯甲醛(1.00g，6.38mmol)于DMF(15ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(1.76g，12.77mmol)。将反应混合物在室温下搅拌30分钟。然后逐滴添加碘乙烷(1.99g，12.77mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌1.5小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物用乙酸乙酯(50ml)稀释，并且用冰冷水(50ml)洗涤，随后用盐水(30ml)洗涤。将合并的有机层经无水硫酸钠干燥并在减压下浓缩以得到粗化合物。将粗化合物通过Combi快速柱色谱法纯化以得到纯标题化合物(1.18g，100％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.43(t,J＝7.0Hz,3H),4.19(q,J＝7.2Hz,2H),7.42-7.48(m,3H),10.38(s,1H)。
步骤-2：1-(2-氯-3-乙氧基苯基)丙-1-醇：在-78℃下在氮气气氛下向2-氯-3-乙氧基苯甲醛(1.10g，5.95mmol)于干燥THF(25ml)中的搅拌溶液中逐滴添加乙基溴化镁(2.38ml，3M溶液于二乙醚中，7.14mmol)。将反应混合物在-78℃下搅拌2小时并且在室温下继续搅拌13小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物通过饱和氯化铵水溶液(20ml)缓慢淬灭。将水层用乙酸乙酯(3x30ml)萃取。将合并的有机层用盐水(20ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩以得到粗化合物。将粗化合物通过Combi快速柱色谱法纯化以得到纯标题化合物(0.698g，54％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.88(t,J＝7.4Hz,3H),1.35(t,J＝7.0Hz,3H),1.43-1.52(m,1H),1.60-1.67(m,1H),4.09(q,J＝6.8Hz,2H),4.80-4.84(m,1H),5.27(d,J＝4.4Hz,1H),6.98(d,J＝7.2Hz,1H),7.14(d,J＝7.2Hz,1H),7.27(d,J＝7.8Hz,1H).
步骤-3：1-(2-氯-3-乙氧基苯基)丙-1-酮：在0℃下在氮气气氛下向1-(2-氯-3-乙氧基苯基)丙-1-醇(0.690g，3.21mmol)于干燥DCM(15ml)中的搅拌溶液中添加氯铬酸吡啶(1.380g，6.43mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌13小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物通过硅藻土床过滤，并且将滤液在减压下浓缩以得到粗化合物。将粗化合物通过Combi快速柱色谱法纯化以得到纯标题化合物(0.681g，99％)。LCMS：m/z 213.2[M++1]和215.3[M+2H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.06(t,J＝7.2Hz,3H),1.36(t,J＝7.0Hz,3H),2.87(q,J＝7.2Hz,2H),4.14(q,J＝6.8Hz,2H),7.08(d,J＝6.8Hz,1H),7.23(d,J＝7.6Hz,1H),7.37(d,J＝7.8Hz,1H).
步骤-4：5-(((1-(2-氯-3-乙氧基苯基)丙基)氨基)甲基)吡啶甲酸甲酯：在氮气气氛下向5-(氨基甲基)吡啶甲酸甲酯二盐酸盐(0.365g，1.53mmol)于DCE(4ml)中的搅拌溶液中逐滴添加Et3N(0.48ml，3.53mmol)。将反应混合物在室温下搅拌3小时以释放游离胺。添加1-(2-氯-3-乙氧基苯基)丙-1-酮(0.250g，1.17mmol)、冰乙酸(0.28ml)和4A分子筛(0.50g)，并且将反应混合物在70℃下搅拌16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物冷却至室温。添加氰基硼氢化钠(0.147g，2.35mmol)并将反应混合物在70℃下搅拌16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物通过饱和碳酸氢钠水溶液(5ml)淬灭。将水层用乙酸乙酯(3x10ml)萃取。将合并的有机层用盐水(5ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩以得到粗化合物。将粗化合物通过Combi快速柱色谱法纯化以得到纯标题化合物(0.240g，56％)。LCMS：m/z 363.35[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.81(t,J＝7.4Hz,3H),1.36(t,J＝6.8Hz,3H),1.52-1.67(m,2H),3.49(d,J＝14.8Hz,1H),3.65(d,J＝14.8Hz,1H),3.87(s,3H),4.00(bs,1H),4.07(q,J＝6.8Hz,2H),6.99(d,J＝8.0Hz,1H),7.21(d,J＝7.6Hz,1H),7.30(d,J＝8.0Hz,1H),7.88(d,J＝7.6Hz,1H),8.00(d,J＝7.6Hz,1H),8.57(s,1H).
5-(((1-(2-氯-3-(氧杂环丁烷-3-基氧基)苯基)丙基)氨基)甲基)吡啶甲酸甲酯(中间体12)的合成
Figure BDA0003964828930000301
步骤-1：2-氯-3-(氧杂环丁烷-3-基氧基)苯甲醛：在室温下向2-氯-3-羟基苯甲醛(1.0g，6.38mmol)于干燥DMF(10ml)中的搅拌溶液中添加碳酸铯(4.16g，12.77mmol)和NaI(0.478g，3.19mmol)。15分钟后，添加含3-碘代氧杂环丁烷(4.70g,25.54mmol)的DMF(5ml)，并且将反应混合物在60℃下加热16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，添加水(50ml)，并将反应混合物用乙酸乙酯(2x100ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩。将粗化合物通过使用combi-快速色谱法纯化以获得纯标题化合物(0.4g，29％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ4.60-4.63(m,2H),4.97-5.00(m,2H),5.43-5.45(m,1H),7.11-7.14(m,1H),7.43-7.50(m,2H),10.39(s,1H).
步骤-2：1-(2-氯-3-(氧杂环丁烷-3-基氧基)苯基)丙-1-醇：在0℃下向2-氯-3-(氧杂环丁烷-3-基氧基)苯甲醛(1.0g，4.71mmol)于干燥THF(25ml)中的搅拌溶液中逐滴添加乙基溴化镁溶液(2.04ml，3M于二乙醚中，6.13mmol)，并且将反应混合物在0℃下搅拌3小时。反应完成之后(通过TLC监测)，添加水(20ml)，并将反应混合物用乙酸乙酯(2x50ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩。将粗化合物通过使用combi-快速色谱法纯化以获得纯标题化合物(0.6g，52％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.90(t,J＝7.6Hz,3H),1.46-1.52(m,1H),1.62-1.69(m,1H),4.55-4.61(m,2H),4.82-4.87(m,1H),4.94-4.97(m,2H),5.31-5.35(m,2H),6.63-6.65(m,1H),7.19-7.28(m,2H).
步骤-3：1-(2-氯-3-(氧杂环丁烷-3-基氧基)苯基)丙-1-酮：在0℃下向1-(2-氯-3-(氧杂环丁烷-3-基氧基)苯基)丙-1-醇(0.606g，2.49mmol)于干燥DCM(9ml)中的搅拌溶液中添加PCC(1.07g，4.99mmol)。将反应混合物在室温下搅拌6小时。反应完成之后(通过TLC监测)，添加水(20ml)，并将反应混合物用乙酸乙酯(2x50ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩。将粗化合物通过使用combi-快速色谱法纯化以获得纯标题化合物(0.5g，83％)。LCMS：m/z 241.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.07(t,J＝7.2Hz,3H),2.89(t,J＝7.2Hz,2H),4.56-4.62(m,2H),4.94-4.99(m,2H),5.36-5.41(m,1H),6.88(d,J＝8.8Hz,1H),7.11-7.16(m,1H),7.35(d,J＝8.0Hz,1H).
步骤-4：5-(((1-(2-氯-3-(氧杂环丁烷-3-基氧基)苯基)丙基)氨基)甲基)吡啶甲酸甲酯：向5-(氨基甲基)吡啶甲酸甲酯二盐酸盐(0.079g，0.33mmol)于DCE(2ml)中的搅拌溶液中添加TEA(0.139ml，0.99mmol)，并且将反应混合物搅拌2小时。向此添加1-(2-氯-3-(氧杂环丁烷-3-基氧基)苯基)丙-1-酮(0.080g，0.26mmol)、乙酸(0.15ml)和分子筛(200mg)。将反应混合物在60℃下加热16小时。将反应混合物冷却至室温，并且添加氰基硼氢化钠(0.041g，0.66mmol)。将反应混合物在60℃下加热3小时。反应完成之后(通过TLC监测)，添加饱和NaHCO3溶液(5ml)，并将反应混合物用乙酸乙酯(2x10ml)萃取。将合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，经Na2SO4干燥，并在真空下蒸发以获得粗化合物。使用柱色谱法将粗化合物纯化以获得纯化合物(60g，46％)。LCMS：m/z 391.6[M+H]+。
5-(((2,3-二氯苄基)氨基)甲基)-4-甲氧基吡啶甲酸甲酯(中间体13)的合成
Figure BDA0003964828930000321
步骤-1：5-氰基-4-甲氧基吡啶甲酸甲酯：向5-溴-4-甲氧基吡啶甲酸甲酯(1.0g，4.06mmol)于NMP(10ml)中的搅拌溶液中添加Zn(CN)2(1.19g，10.10mmol)，并且将混合物用Ar(g)脱气10分钟。向上述混合物中添加Pd(dba)2(0.233g，0.40mmol)，随后添加Pd(dppf)Cl2，并且将反应混合物用Ar(g)吹扫10分钟。将反应混合物在100℃下在油浴中加热4小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物用乙酸乙酯(30ml)稀释，并且添加冷水。将反应混合物用乙酸乙酯(2x30ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，经Na2SO4干燥，并在减压下浓缩以得到呈浅棕色油的期望的化合物。通过combi快速色谱法将粗化合物纯化以获得纯化合物(0.24g，30％)。LCMS：m/z 193.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.80(s,1H),7.80(s,1H),4.12(s,3H),4.07(s,3H).
步骤-2：5-(氨基甲基)-4-甲氧基吡啶甲酸甲酯：在高压釜中向5-氰基-4-甲氧基吡啶甲酸甲酯(0.65g，3.3mmol)于MeOH(10ml)中的搅拌溶液中添加Pd/C(0.065g)，并且将反应混合物用H2(g)吹扫。密封并且将反应混合物在室温下搅拌16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物通过硅藻土床过滤，用MeOH洗涤，并且在减压下浓缩以得到粗化合物，所述粗化合物在不经过进一步纯化的情况下用于下一步骤(0.40g，60％)。％)。LCMS：m/z 197.1[M+H]+。
步骤-3：5-(((2,3-二氯苄基)氨基)甲基)-4-甲氧基吡啶甲酸甲酯：向5-(氨基甲基)-4-甲氧基吡啶甲酸甲酯(0.08g，0.40mmol)和2,3-二氯苯甲醛(0.084g，0.48mmol)于DCE(10ml)中的搅拌溶液中逐滴添加乙酸(0.1ml)，随后添加粉末状分子筛。将反应混合物在室温下搅拌1小时。将氰基硼氢化钠(0.05g，0.80mmol)添加到反应混合物中。将反应混合物在室温下搅拌2小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物通过饱和碳酸氢钠(5mL)淬灭。将水层用乙酸乙酯(2x10mL)萃取。将合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，经Na2SO4干燥，并且在减压下浓缩以得到粗化合物。通过combi快速色谱法将粗化合物纯化以获得纯2-((4-氰基-2,6-二氟苯乙基)氨基)-2-苯乙酸乙酯(0.082g，56％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.55(s,1H),7.67(s,1H),7.49-7.42(m,2H),7.22(t,J＝8Hz,1H),4.03-3.89(m,10H).
5-(((2,3-二氯苄基)氨基)甲基)-4-(二甲基氨基)吡啶甲酸甲酯(中间体14)的合成
Figure BDA0003964828930000331
步骤-1：4-(二甲基氨基)吡啶甲酸甲酯：在室温下向4-(二甲基氨基)吡啶甲酸(3.0g，18.05mmol)于甲醇(60ml)中的搅拌溶液中逐滴添加浓缩H2SO4(1.5ml)。将反应混合物在60℃下搅拌24小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物在减压下浓缩以获得残余物，将所述残余物置于二氯甲烷(2X 50ml)中，并且将合并的有机层用饱和碳酸氢钠溶液(50ml)洗涤，随后用盐水(50ml)洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥并且在减压下浓缩以获得粗化合物，将所述粗化合物用正戊烷研磨以获得标题化合物(2.2g，67％)。LCMS：m/z181.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.02(s,6H),3.84(s,3H),6.78-6.80(m,1H),7.24(d,J＝2.4Hz,1H),8.20(d,J＝5.6Hz,1H).
步骤-2：5-溴-4-(二甲基氨基)吡啶甲酸甲酯：向4-(二甲基氨基)吡啶甲酸甲酯(2.2g，12.21mmol)于DCE(22ml)中的搅拌溶液中添加N-溴代琥珀酰亚胺(2.17g，12.19mmol)，随后添加AIBN(0.4g，2.44mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌10分钟，然后在90℃下加热2小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物浓缩以得到粗化合物。将粗化合物通过combi快速纯化以获得标题化合物(2.2g，69％)。LCMS：m/z 259.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ2.97(s,6H),3.86(s,3H),7.52(s,1H),8.54(s,1H).
步骤-3：4-(二甲基氨基)-5-乙烯基吡啶甲酸甲酯：在室温下向5-溴-4-(二甲基氨基)吡啶甲酸甲酯(2.2g，8.49mmol)于DMSO(22ml)中的搅拌溶液中分批添加三氟乙烯基硼烷钾盐(3.41g，25.45mmol)。将反应混合物在搅拌下用Ar(g)脱气10分钟。向上述混合物中添加K2CO3(3.51g，25.39mmol)并且再次用Ar(g)脱气10分钟，然后添加Pd(dppf)Cl2(1.24g，1.69mmol)，并且将反应混合物在80℃下搅拌1小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物冷却至室温，用冷水稀释，并用乙酸乙酯(2x50ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，经无水Na2SO4干燥并且在减压下浓缩以获得粗化合物，将所述粗化合物通过柱色谱法纯化以获得标题化合物(1.4g，79％)。LCMS：m/z 206.5[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ2.88(s,6H),3.85(s,3H),5.41-5.44(d,J＝11.6Hz,1H),5.80-5.85(m,1H),6.75-6.82(m,1H),7.45(s,1H),8.44(s,1H).
步骤-4：4-(二甲基氨基)-5-甲酰基吡啶甲酸甲酯：在0℃下向4-(二甲基氨基)-5-乙烯基吡啶甲酸甲酯(1.4g，6.79mmol)于1,4-二噁烷(42ml)中的搅拌溶液中添加RuCl3.3H2O(0.017g，0.067mmol)，随后逐滴添加含高碘酸钠溶液(5.78g，27.16mmol)的水(14mL)，并且将反应在室温下搅拌1小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物用水稀释并且用乙酸乙酯(2x50ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，经无水Na2SO4干燥并且在减压下浓缩以获得粗化合物，将所述粗化合物通过柱色谱法纯化以获得标题化合物(0.6g，42％)。LCMS：m/z 209.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.08(s,6H),3.88(s,3H),7.49(s,1H),8.69(s,1H),10.04(s,1H).
步骤-5：5-(((2,3-二氯苄基)氨基)甲基)-4-(二甲基氨基)吡啶甲酸甲酯：向4-(二甲基氨基)-5-甲酰基吡啶甲酸甲酯(0.600g，2.88mmol)于1,2-二氯乙烷(9ml)中的溶液中添加分子筛，随后添加(2,3-二氯苯基)甲胺(0.507g，2.88mmol)和乙酸(2.0ml，34.56mmol)，RM搅拌2小时。然后添加氰基硼氢化钠(0.271g，4.32mmol)，随后添加甲醇(6ml)，并且将反应混合物在室温下搅拌24小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物穿过硅藻土床。向滤液中添加饱和碳酸氢钠溶液(10ml)并用乙酸乙酯(2x20ml)萃取。将合并的有机层用盐水(20ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩以获得标题化合物(0.450g，42％)。LCMS：m/z 368.3[M+H]+。粗中间体在不经过进一步纯化的情况下用于下一步骤。
3-(2,3-二氯苯基)-3-((吡啶-3-基甲基)氨基)丙腈(中间体15)的合成
Figure BDA0003964828930000351
步骤-1：(R,E)-N-(2,3-二氯苯亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺：在室温下向2,3-二氯苯甲醛(3.0g，17.14mmol)于THF(60ml)中的搅拌溶液中添加2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(2.49g，20.53mmol)，并且将反应混合物搅拌15分钟，然后在0℃下缓慢添加Ti(O-iPr)4(9.15g，32.22mmol)。将反应混合物在室温下在N2(g)气氛下搅拌16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物用氯化铵水溶液(30ml)淬灭，用乙酸乙酯(30ml)稀释，穿过硅藻土并用乙酸乙酯洗涤(2x30ml)。将合并的有机层用水进一步洗涤，随后用盐水(30ml)洗涤。将有机层经Na2SO4干燥并且在减压下浓缩以得到粗化合物，将所述粗化合物通过柱色谱法进一步纯化以获得标题化合物(2.8g，59％)。LCMS：分钟；m/z 278.3[M+H]+。
步骤-2：(R)-N-(2-氰基-1-(2,3-二氯苯基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺：在-78℃下向n-BuLi(2.5M于THF中)(7.4mL，18.60mmol)的搅拌溶液中逐滴添加乙腈(0.682g，16.54mmol)，并且将反应混合物在N2(g)气氛下搅拌1小时。在-78℃下添加(R,E)-N-(2,3-二氯苯亚甲基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(2.3g，8.27mmol)于四氢呋喃(60ml)中的溶液，并且将反应混合物进一步搅拌1.5小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物用稀盐酸溶液(5ml)淬灭并且用乙酸乙酯(3x50ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，经Na2SO4干燥，并在减压下浓缩。将粗化合物通过使用反相combi-快速色谱法使用ACN和含0.1％甲酸的水纯化以获得标题化合物(1.8g，68％)。LCMS：m/z 319.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.26(s,9H),2.96-3.08(m,2H),4.97-5.03(m,1H),6.24(d,J＝9.2Hz,1H),7.44(t,J＝8.0Hz,1H),7.63-7.67(m,2H).
步骤-3：3-氨基-3-(2,3-二氯苯基)丙腈HCl盐：向(R)-N-(2-氰基-1-(2,3-二氯苯基)乙基)-2-甲基丙烷-2-亚磺酰胺(1.8g，5.64mmol)于二氯甲烷(20ml)中的搅拌溶液中添加4M含HCl的1,4-二噁烷(8.5ml，33.84mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌2小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物在减压下浓缩。将粗化合物用正戊烷研磨以获得标题化合物(1.4g，98％)。LCMS：m/z 214.9[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.41-3.43(m,2H),5.08-5.12(m,1H),7.56(t,J＝8.0Hz,1H),7.78-7.81(dd,J＝1.2Hz,8.0Hz,1H),7.90-7.92(dd,J＝1.2HZ,8.0Hz,1H),9.14(bs,3H).
步骤-4：3-(2,3-二氯苯基)-3-((吡啶-3-基甲基)氨基)丙腈：向3-氨基-3-(2,3-二氯苯基)丙腈HCl盐(1.6g，7.44mmol)于1,2-二氯乙烷(20ml)和甲醇(1mL)中的混合物中添加三乙胺(3.1ml，22.32mmol)，并且在室温下搅拌30分钟。然后添加分子筛(3.2g)、烟碱醛(0.796g，7.44mmol)和乙酸(1.78g，29.76mmol)，并且将反应混合物搅拌2小时。添加NaCNBH3(0.701g，11.16mmol)并且将反应混合物在室温下搅拌16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物穿过硅藻土床。向滤液中添加饱和碳酸氢钠溶液(10ml)并用乙酸乙酯(2x20ml)萃取。将合并的有机层用盐水洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩。将粗产物通过RP-纯化使用ACN和含0.1％甲酸的水纯化以获得标题化合物(1.55g，68％)。LCMS：m/z 306.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ2.87-2.99(m,2H),3.49(d,J＝14Hz,1H),3.64(d,J＝13.6Hz,1H),4.38(t,J＝6.0Hz,1H),7.34-7.37(m,1H),7.47(t,J＝8.0Hz,1H),7.62(dd,J＝1.2Hz,8.0Hz,1H),7.72-7.75(m,2H),8.45(d,J＝3.6Hz,1H),8.48(bs,1H).
4-(2-氯苯基)-4-((吡啶-3-基甲基)氨基)丁腈(中间体16)的合成
Figure BDA0003964828930000361
步骤-1：(E)-4-(2-氯苯基)-4-((吡啶-3-基甲基)氨基)丁腈：在室温下向4-(2-氯苯基)-4-氧代丁腈(0.3g，1.54mmol)于THF(6ml)中的溶液中添加吡啶-3-基甲胺(0.217g，2.01mmol)，随后在0℃下逐滴添加异丙醇钛(IV)(0.827g，2.91mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物用饱和NH4Cl(15ml)淬灭并用乙酸乙酯(20ml)稀释。将反应混合物通过硅藻土床过滤并用乙酸乙酯(20ml)洗涤。将有机层分离，并将水层用乙酸乙酯(2x20ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，经无水硫酸钠干燥，并在减压下浓缩。粗化合物在不经过进一步纯化的情况下用于下一步骤(0.5g，粗)。LCMS：m/z 284.3[M+H]+。
步骤-2：4-(2-氯苯基)-4-((吡啶-3-基甲基)氨基)丁腈：向(E)-4-(2-氯苯基)-4-((吡啶-3-基甲基)氨基)丁腈(0.5g，1.76mmol)于1,2-二氯乙烷(6ml)和乙醇(2ml)中的搅拌溶液中添加分子筛(1g)。将反应混合物在室温下搅拌10分钟。在0℃下添加氰基硼氢化钠(0.166g，2.64mmol)并将反应混合物在室温下搅拌16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物用含10％甲醇的DCM(50ml)稀释并通过硅藻土床过滤。将滤液浓缩以得到粗化合物，所述粗化合物在不进行进一步纯化的情况下用于下一步骤。LCMS：m/z 286.3[M+H]+。
3-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(((1-(2,3-二氯苯基)丙基)氨基)甲基)吡啶甲酸乙酯(中间体17)的合成
Figure BDA0003964828930000371
步骤-1：3-氨基-5-溴吡啶甲酸乙酯：在室温下将3-氨基-5-溴吡啶甲酸(10g，46.08mmol)、碳酸钾(6.36g，46.08mmol)和碘乙烷(3.70ml，46.08mmol)于二甲基乙酰胺(100ml)中的溶液搅拌16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物倒入冰冷水中，过滤并干燥以得到纯固体化合物(7g，62％)。LCMS：m/z 244.9[M+H]+。
步骤-2：5-溴-3-((叔丁氧基羰基)氨基)吡啶甲酸乙酯：在0℃下向3-氨基-5-溴吡啶甲酸乙酯(3g，12.24mmol)于二氯甲烷中的搅拌溶液中添加三乙胺(5.11ml，36.72mmol)，随后添加二碳酸二叔丁酯(4.0g，18.36mmol)和DMAP(0.299g，2.45mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物倒入冰冷水中(30ml)并且使用二氯甲烷(2x30ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，并且经Na2SO4干燥。在真空下蒸发以获得粗化合物。使用柱色谱法将粗化合物纯化以获得纯化合物(2.8g，66％)。LCMS：m/z 345.3[M+H]+。
步骤-3：3-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-乙烯基吡啶甲酸乙酯：在室温下向5-溴-3-((叔丁氧基羰基)氨基)吡啶甲酸乙酯(2.6g，7.53mmol)和三氟(乙烯基)硼烷钾盐(3.02g，22.55mmol)于二甲基亚砜(26ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(3.12g，22.6mmol)，随后添加PdCl2(dppf)(1.10g，1.50mmol)。将反应混合物用Ar(g)吹扫并且在80℃下搅拌1小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物倒入冰冷水中(30ml)并且用乙酸乙酯(2x30ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，并且经Na2SO4干燥。在真空下蒸发以获得粗化合物。使用柱色谱法将粗化合物纯化以获得纯化合物(1.8g，81％)。LCMS：m/z 293.0[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.34(t,J＝7.2Hz,3H),1.50(s,9H),4.34(q,J＝6.8Hz,2H),5.57(d,J＝10.8Hz,1H),6.05(d,J＝17.6Hz,1H),6.83-6.90(m,1H),8.49(s,1H),8.54(s,1H),10.02(s,1H).
步骤-4：3-((叔丁氧羰基)氨基)-5-甲酰基吡啶甲酸乙酯：向3-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-乙烯基吡啶甲酸乙酯(1.8g，6.16mmol)于1,4-二噁烷(18ml)中的搅拌溶液中添加氯化钌(III)(0.012g，0.06mmol)，随后在0℃下逐滴添加高碘酸钠(5.26g，24.56mmol)于水(54ml)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物倒入冰冷水中(20ml)并且用乙酸乙酯(2x20ml)萃取。将合并的有机层有机层用盐水(30ml)洗涤，并且经Na2SO4干燥。在真空下蒸发以获得粗化合物。使用柱色谱法将粗化合物纯化以获得纯化合物(0.600g，33％)。LCMS：m/z 295.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.34(t,J＝6.8Hz,3H),1.50(s,9H),4.35(q,J＝6.8Hz,2H),8.79(s,1H),8.80(s,1H),10.02(s,1H),10.16(s,1H).
步骤-5：3-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(((1-(2,3-二氯苯基)丙基)氨基)甲基)吡啶甲酸乙酯：向1-(2,3-二氯苯基)丙-1-胺盐酸盐(0.490g，2.04mmol)于1,2-二氯乙烷(6ml)中的搅拌溶液中添加三乙胺(0.71ml，5.093mmol)，并且在室温下搅拌1小时。将3-((叔丁氧羰基)氨基)-5-甲酰基吡啶甲酸乙酯(0.500g，1.69mmol)于1,2-二氯乙烷(6ml)和乙酸(0.1ml)中的溶液添加到反应混合物中，并且在室温下搅拌另外1小时。添加氰基硼氢化钠(0.160g，2.55mmol)和甲醇(2ml)，并且将反应混合物在室温下搅拌另外1小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物倒入冰冷水中(20ml)并且使用乙酸乙酯(2x20ml)萃取。将有机层用盐水(30ml)洗涤，并且将合并的有机层在真空下蒸发以获得粗化合物。使用柱色谱法将粗化合物纯化以获得纯化合物(0.500g，61％)。LCMS：m/z 484.0[M+2H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.85(t,J＝7.6Hz,3H),1.32(t,J＝8Hz,3H),1.49(s,9H),3.49(d,J＝14.8Hz,1H),3.66(d,J＝14.4Hz,1H),4.32(q,J＝6.8Hz,2H),7.39(t,J＝3.2Hz,1H),7.52(d,J＝6.4Hz,1H),7.63(d,J＝6Hz,1H),8.21(s,1H),8.43(s,1H),9.99(s,1H).
3-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(((2,3-二氯苄基)氨基)甲基)吡啶甲酸乙酯(中间体18)的合成
Figure BDA0003964828930000391
步骤-1：3-氨基-5-溴吡啶甲酸乙酯：在室温下将3-氨基-5-溴吡啶甲酸(10g，46.08mmol)、碳酸钾(6.36g，46.08mmol)和碘乙烷(3.70ml，46.08mmol)于二甲基乙酰胺(100ml)中的溶液搅拌16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物倒入冰冷水中，过滤并干燥以得到纯固体化合物(7g，62％)。LCMS：m/z 244.9[M+H]+。
步骤-2：5-溴-3-((叔丁氧基羰基)氨基)吡啶甲酸乙酯：在0℃下向3-氨基-5-溴吡啶甲酸乙酯(3g，12.24mmol)于二氯甲烷中的搅拌溶液中添加三乙胺(5.11ml，36.722mmol)，随后添加二碳酸二叔丁酯(4.0g，18.36mmol)和DMAP(0.299g，2.45mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物倒入冰冷水中(30ml)并且使用二氯甲烷(2x30ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，并且经Na2SO4干燥。在真空下蒸发以获得粗化合物。使用柱色谱法将粗化合物纯化以获得纯化合物(2.8g，66％)。LCMS：m/z 345.3[M+H]+。
步骤-3：3-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-乙烯基吡啶甲酸乙酯：在室温下向5-溴-3-((叔丁氧基羰基)氨基)吡啶甲酸乙酯(2.6g，7.53mmol)和三氟(乙烯基)硼烷钾盐(3.02g，22.55mmol)于二甲基亚砜(26ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(3.12g，22.59mmol)，随后添加PdCl2(dppf)(1.10g，1.50mmol)。将反应混合物用Ar(g)吹扫并且在80℃下搅拌1小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物倒入冰冷水中(30ml)并且用乙酸乙酯(2x30ml)萃取。将合并的有机层用盐水(50ml)洗涤，并且经Na2SO4干燥。在真空下蒸发以获得粗化合物。使用柱色谱法将粗化合物纯化以获得纯化合物(1.8g，81％)。LCMS：m/z 293.0[M+H]+。1HNMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.34(t,J＝7.2Hz,3H),1.50(s,9H),4.34(q,J＝6.8Hz,2H),5.57(d,J＝10.8Hz,1H),6.05(d,J＝17.6Hz,1H),6.83-6.90(m,1H),8.49(s,1H),8.54(s,1H),10.02(s,1H).
步骤-4：3-((叔丁氧羰基)氨基)-5-甲酰基吡啶甲酸乙酯：向3-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-乙烯基吡啶甲酸乙酯(1.8g，6.16mmol)于1,4-二噁烷(18ml)中的搅拌溶液中添加氯化钌(III)(0.012g，0.057mmol)，随后在0℃下逐滴添加高碘酸钠(5.26g，24.56mmol)于水(54ml)中的溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物倒入冰冷水中(20ml)并且用乙酸乙酯(2x20ml)萃取。将合并的有机层有机层用盐水(30ml)洗涤，并且经Na2SO4干燥。在真空下蒸发以获得粗化合物。使用柱色谱法将粗化合物纯化以获得纯化合物(0.600g，33％)。LCMS：m/z 295.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.34(t,J＝6.8Hz,3H),1.50(s,9H),4.35(q,J＝6.8Hz,2H),8.79(s,1H),8.80(s,1H),10.02(s,1H),10.16(s,1H).
步骤-5：3-((叔丁氧基羰基)氨基)-5-(((2,3-二氯苄基)氨基)甲基)吡啶甲酸乙酯：向3-((叔丁氧羰基)氨基)-5-甲酰基吡啶甲酸乙酯(0.200g，0.68mmol)和(2,3-二氯苯基)甲胺(0.143g，0.81mmol)于1,2-二氯乙烷(5ml)中的搅拌溶液中添加乙酸(0.05ml)。在室温下将反应混合物搅拌1小时。添加氰基硼氢化钠(0.064g，1.02mmol)和甲醇(1ml)，并且将反应混合物在室温下搅拌另外1小时。反应完成之后(通过TLC监测)，将反应混合物倒入冰冷水中(20ml)并且用乙酸乙酯(2x20ml)萃取。将合并的有机层用盐水(30ml)洗涤，并且经Na2SO4干燥。在真空下蒸发以获得粗化合物。使用柱色谱法将粗化合物纯化以获得纯化合物(0.190g，61％)。LCMS：m/z 454.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.87(t,J＝7.2Hz,3H),1.49(s,9H),3.83(s,4H),4.33(q,2H,J＝7.2Hz),7.37(t,J＝7.6Hz,1H),7.55(t,J＝6.4Hz,2H),8.32(s,1H),8.53(s,1H),10.00(s,1H).
表1中的下列化合物以类似于中间体I-III程序的方式制备：
表1
Figure BDA0003964828930000401
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Figure BDA0003964828930000411
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Figure BDA0003964828930000421
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Figure BDA0003964828930000431
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Figure BDA0003964828930000441
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Figure BDA0003964828930000451
一般库程序I
N-[(3,5-二氯苯基)甲基]-N-[(吡啶-3-基)甲基]苯甲酰胺(化合物1)的合成
Figure BDA0003964828930000452
步骤1.将苯甲酸(30mg，245μmol)和HATU(111mg，294μmol)在DMF中合并，并且在室温下搅拌10分钟。将此溶液添加到含有中间体I[(3,5-二氯苯基)甲基][(吡啶-3-基)甲基]胺盐酸盐(89.2mg，294μmol)的烧瓶中，并且然后添加N,N-二异丙基乙胺(211μL，1.22mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。使反应混合物直接经受质量定向制备型HPLC以得到N-[(3,5-二氯苯基)甲基]-N-[(吡啶-3-基)甲基]苯甲酰胺(14.9mg，16.1％)。MS ES m/z：371.0[M+H]+。
表2中的下列化合物以类似于一般库程序I的方式制备：
表2
Figure BDA0003964828930000461
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Figure BDA0003964828930000471
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Figure BDA0003964828930000481
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Figure BDA0003964828930000491
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Figure BDA0003964828930000501
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Figure BDA0003964828930000521
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Figure BDA0003964828930000531
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Figure BDA0003964828930000541
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Figure BDA0003964828930000561
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Figure BDA0003964828930000571
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Figure BDA0003964828930000581
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Figure BDA0003964828930000591
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Figure BDA0003964828930000601
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Figure BDA0003964828930000611
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Figure BDA0003964828930000621
一般程序I
N-(4-氯苄基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物138)的合成
Figure BDA0003964828930000622
步骤1N-(4-氯苄基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺的合成。将3-氟苯甲酸(30mg，214μmol)和HATU(97.3mg，256μmol)在DMF中合并，并在室温下搅拌10分钟。然后将此溶液添加到含有[(4-氯苯基)甲基][(吡啶-3-基)甲基]胺(59.5mg，256μmol)的烧瓶中，并且然后添加N,N-二异丙基乙胺(185μL，1.07mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。使反应混合物直接经受质量定向制备型HPLC以获得N-[(4-氯苯基)甲基]-3-氟-N-[(吡啶-3-基)甲基]苯甲酰胺(46.9mg，60％)。MS ES m/z：355.1[M+H]+。
表3中的下列化合物以类似于上文所描述的一般程序I的方式制备：
表3
Figure BDA0003964828930000631
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Figure BDA0003964828930000641
一般程序II
5-({[(2,4-二氯苯基)甲基]氨基}甲基)吡啶-2-羧酸甲酯(化合物142)的合成。
Figure BDA0003964828930000651
步骤1.将5-({N-[(2,4-二氯苯基)甲基]-1-(3-氟苯基)甲酰胺基}甲基)吡啶-2-羧酸甲酯(化合物141，64mg，143umol)溶解于5:1THF:MeOH(500uL)中。添加1N NaOH(1.43mL)水溶液，并将反应在室温下搅拌4小时。将反应用1N HCl酸化到pH～3，并萃取4x5mL CH2Cl2。将有机层合并，并且进行浓缩以得到呈白色固体的5-({N-[(2,4-二氯苯基)甲基]-1-(3-氟苯基)甲酰胺基}甲基)吡啶-2-羧酸(56mg，82％产率)。MS ES m/z：433.0[M+H]+。
表4中的下列化合物以类似于上文所描述的一般程序II的方式制备：
表4
Figure BDA0003964828930000652
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Figure BDA0003964828930000661
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Figure BDA0003964828930000671
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Figure BDA0003964828930000681
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Figure BDA0003964828930000691
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Figure BDA0003964828930000701
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Figure BDA0003964828930000711
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Figure BDA0003964828930000721
一般程序III
5-({N-[(2,4-二氯苯基)甲基]-1-(3-氟苯基)甲酰胺基}甲基)吡啶-2-甲酰胺(化合物143)的合成。
Figure BDA0003964828930000722
步骤1.将5-({N-[(2,4-二氯苯基)甲基]-1-(3-氟苯基)甲酰胺}甲基)吡啶-2-羧酸(化合物142，15mg，34umol)、NH4(7M于MeOH中；10uL，69umol)和Et3N(14uL，69umol)在无水DCE(1.5mL)中合并。添加DMC(6mg，35umol)，并且将反应在室温下搅拌4小时。将反应用1mLH2O淬灭，并且将有机层分离并浓缩至干燥。使用Biotage通过反相色谱法纯化(Sfar C1812g，90％ H2O/10％ CH3CN和0.1％甲酸至10％H2O/90％ CH3CN和0.1％甲酸)。将期望级分合并，并且进行浓缩以得到5-({N-[(2,4-二氯苯基)甲基]-1-(3-氟苯基)甲酰胺基}甲基)吡啶-2-甲酰胺(8.9mg，60％产率)。MS ES m/z：432.1[M+H]+。
表5中的下列化合物以类似于上文所描述的一般程序III的方式制备：
表5
Figure BDA0003964828930000731
一般程序IV
5-({N-[(2,4-二氯苯基)甲基]-1-(3-氟苯基)甲酰胺基}甲基)-N-甲基吡啶-2-甲酰胺(化合物144)的合成。
Figure BDA0003964828930000732
步骤1.将5-({N-[(2,4-二氯苯基)甲基]-1-(3-氟苯基)甲酰胺}甲基)吡啶-2-羧酸(化合物142，15mg，35umol)、甲胺HCl(4.7mg，69umol)和Et3N(14uL，103umol)在DCE(1.5mL)中合并。添加DMC(6mg，35umol)，并且将反应在室温下搅拌4小时。将反应用1mL H2O淬灭，并且将有机层分离并浓缩至干燥。使用Biotage通过反相色谱法纯化(Sfar C18 12g，90％ H2O/10％ CH3CN和0.1％甲酸至10％ H2O/90％ CH3CN和0.1％甲酸)。将期望级分合并，并且进行浓缩以得到5-({N-[(2,4-二氯苯基)甲基]-1-(3-氟苯基)甲酰胺基}甲基)-N-甲基吡啶-2-甲酰胺(12.5mg，81％产率)。MS ES m/z：446.1[M+H]+。
一般程序V
N-(2,4-二氯苄基)-3-氟-N-((6-(羟甲基)吡啶-3-基)甲基)苯甲酰胺(化合物145)的合成。
Figure BDA0003964828930000741
步骤1.在0℃下在N2下将5-({N-[(2,4-二氯苯基)甲基]-1-(3-氟苯基)甲酰胺基}甲基)吡啶-2-羧酸甲酯(化合物141，48.7mg，109umol)于无水THF中的溶液逐滴添加到LAH(4.13uL，218umol)于THF中的2M溶液中。将反应在0℃下搅拌，并且经90分钟缓慢升温至室温。将反应用1mL水淬灭，用5mL Et2O和另外1mL水稀释。将反应在室温下搅拌10分钟。将有机层分离并浓缩至干燥。通过质量定向制备型纯化进行纯化以得到N-(2,4-二氯苄基)-3-氟-N-((6-(羟甲基)吡啶-3-基)甲基)苯甲酰胺(2.12mg，4.2％产率)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ＝8.21(br s,1H),7.69(br s,1H),7.56(br s,2H),7.49-7.34(m,5H),7.29(brd,J＝8.3Hz,3H),5.37(br s,1H),4.59(br s,3H),4.52(s,4H),3.29(br s,5H),0.94(t,J＝7.1Hz,1H).MS：(ES，m/z)：419.0[M+H]+。
一般程序VI
N-[(6-氨基吡啶-3-基)甲基]-N-[(2,4-二氯苯基)甲基]-3-氟苯甲酰胺(化合物146)的合成。
Figure BDA0003964828930000751
N-[5-({[(2,4-二氯苯基)甲基]氨基}甲基)吡啶-2-基]氨基甲酸叔丁酯的合成
Figure BDA0003964828930000752
步骤1.将2,4-二氯苯甲醛(194mg，1.11mmol)与(5-(氨基甲基)吡啶-2-基)氨基甲酸叔丁酯(250mg，1.11mmol)和10uL乙酸在DCE(20mL)中合并。最后添加NaBH(OAc)3(587mg，2.77mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。将反应用盐水(15mL)淬灭。将有机层分离，经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。使用Biotage通过反相色谱法纯化(Snap Ultra 30g，10％ CH3CN/90％H2O和0.1％甲酸至90％ CH3CN/10％ H2O和0.1％甲酸梯度)。将期望的级分合并并且冻干以得到N-[5-({[(2,4-二氯苯基)甲基]氨基}甲基)吡啶-2-基]氨基甲酸叔丁酯(159.6mg，38％产率)。
Figure BDA0003964828930000753
步骤2.将N-[5-({[(2,4-二氯苯基)甲基]氨基}甲基)吡啶-2-基]氨基甲酸叔丁酯(159.6mg，415umol)、3-氟苯甲酸(64mg，456umol)、Et3N(115uL，830umol)和HATU(146mg，456umol)在DMA(4mL)中合并。将反应在室温下搅拌过夜。将反应用5mL H2O稀释，并用3x8mLEtOAc萃取。将有机层合并，并且进行浓缩。将残余物溶于EtOAc(2mL)和5当量HCl(4M于1,4-二噁烷)中，并且在室温下搅拌1小时。将反应浓缩至干燥。使用Biotage通过正相柱色谱法纯化(ZIP Sphere 10g，10％ EtOAc/庚烷至100％ EtOAc)。将期望级分合并，并且进行浓缩以得到呈白色固体的N-[(6-氨基吡啶-3-基)甲基]-N-[(2,4-二氯苯基)甲基]-3-氟苯甲酰胺(32.1mg，17％产率)。MS ES m/z：404.0[M+H]+。
表6中的下列化合物以类似于上文所描述的一般程序VI的方式制备：
表6
Figure BDA0003964828930000761
N-((6-乙酰氨基吡啶-3-基)甲基)-N-(2-氯-3-甲氧基苄基)-3-氟苯甲酰胺(化合物213)的制备
Figure BDA0003964828930000762
/>
步骤1：N-((6-乙酰氨基吡啶-3-基)甲基)-N-(2-氯-3-甲氧基苄基)-3-氟苯甲酰胺。向1-(吡啶-3-基)乙-1-胺(0.1g，239umol)于CH2Cl2(2ml)中的搅拌溶液中添加Et3N(20uL，263umol)，然后添加乙酰氯(7uL，263umol)。将反应混合物在室温下搅拌8小时。反应完成后，将反应混合物用水(3mL)洗涤。去除有机层，用盐水(3ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗化合物通过柱色谱法纯化以获得标题化合物(0.085g，77％)。MS m/z460.8[M+1]+。
表7中的下列化合物以类似于上文所描述的程序的方式制备：
表7
Figure BDA0003964828930000771
一般程序VII
(R)-N-(2,4-二氯苄基)-3-氯-N-(1-(吡啶-3-基)乙基)苯甲酰胺(化合物153)和(S)-N-(2,4-二氯苄基)-3-氯-N-(1-(吡啶-3-基)乙基)苯甲酰胺(化合物154)的制备。
Figure BDA0003964828930000772
步骤1：N-(2,4-二氯苄基)-1-(吡啶-3-基)乙-1-胺的合成。向1-(吡啶-3-基)乙-1-胺(1g，8.18mmol)于DMF(5ml)中的搅拌溶液中添加碳酸钾(2.26g，16.4mmol)。在室温下添加含1-(溴甲基)-2,4-二氯苯(2.55g，10.6mmol)的DMF(5ml)。将反应混合物加热至55℃，持续2小时。反应完成之后，将反应混合物在乙酸乙酯(50ml)中稀释，并且用冷水(3x50ml)洗涤。将有机层用盐水(50ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗化合物通过柱色谱法纯化以获得标题化合物(0.6g，26％)。MS m/z 281.46[M+1]+。
步骤2：N-(2,4-二氯苄基)-3-氟-N-(1-(吡啶-3-基)乙基)苯甲酰胺的合成。
在氮气气氛下向N-(2,4-二氯苄基)-1-(吡啶-3-基)乙-1-胺(0.6g，2.13mmol)于DCM(6ml)中的搅拌混合物中添加Et3N(0.54g，5.33mmol)。在室温下逐滴添加3-氟苯甲酰氯(0.51g，3.20mmol)，并且将反应混合物在室温下搅拌45分钟。反应完成之后，将反应混合物用冷水(12ml)淬灭并且用DCM(2x20ml)萃取。将合并的有机层用盐水(20ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗化合物通过combi快速色谱法纯化以获得呈外消旋混合物的标题化合物(0.2g，23％)。MS：外消旋m/z 404.4[M+H]+。手性制备型HPLC：岛津(Shimadzu)LC-20AP和UV检测器；柱：CHIRALPAK IB-N(250*21)mm，5u；流动相A：0.1％ DEA/己烷，流动相B：0.1％ DEA/丙-2-醇；等度梯度85:15(A:B)，柱流量：18毫升/分钟。FR-1(异构体1)：RT＝18.98；FR-2(异构体2)：RT＝25.87。
异构体1任意指定为(R)-N-(2,4-二氯苄基)-3-氯-N-(1-(吡啶-3-基)乙基)苯甲酰胺(化合物153)LCMS：m/z 404.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.58(d,J＝6.8Hz,3H),4.26(bs,1H),4.59(d,J＝16.8Hz,1H),5.15(bs,1H),7.34-7.73(m,9H),8.45(d,J＝4.0Hz,2H).
异构体2任意指定为(S)-N-(2,4-二氯苄基)-3-氯-N-(1-(吡啶-3-基)乙基)苯甲酰胺(化合物154)LCMS：m/z 404.3[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.58(d,J＝6.8Hz,3H),4.27(bs,1H),4.59(d,J＝16.8Hz,1H),5.15(bs,1H),7.33-7.72(m,9H),8.46(d,J＝4.0Hz,2H).
一般程序VIII
(R)-N-(1-(2,4-二氯苯基)丙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物157)和(S)-N-(1-(2,4-二氯苯基)丙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基苯基)苯甲酰胺(化合物158)的制备。
Figure BDA0003964828930000781
步骤1.1-(2,4-二氯苯基)-N-(吡啶-3-基甲基)丙-1-胺的合成。将1-(2,4-二氯苯基)丙-1-酮(0.500g，2.46mmol)、吡啶-3-基甲胺(0.32g，2.95mmol)和乙酸(0.5ml)于MeOH(5ml)中的混合物在室温下搅拌2小时。添加氰基硼氢化钠(0.23g，3.69mmol)和DCE(0.5ml)，并且将反应混合物在室温下搅拌16小时。将反应混合物通过硅藻土过滤。将滤液在减压下浓缩以得到呈油的标题化合物(0.730g，粗)。LCMS：m/z 295.2[M+H]+。
步骤2.N-(1-(2,4-二氯苯基)丙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺的合成。在氮气气氛下向1-(2,4-二氯苯基)-N-(吡啶-3-基甲基)丙-1-胺(0.73g，2.47mmol)于无水DCM(7.6ml)中的溶液中添加3-氟苯甲酰氯(0.47g，2.96mmol)。在0℃下逐滴添加三乙胺(0.38g，3.71mmol)。将所得反应混合物置于室温下并且搅拌另外4小时。反应完成之后，缓慢添加水(30ml)，并将反应混合物用DCM(2x100ml)萃取。将合并的有机层用盐水(20ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗化合物通过Combi-快速色谱法(RP Gold柱)通过使用乙腈和含0.1％甲酸的水纯化以得到呈固体的纯标题化合物(0.160g，15.53％)。手性制备型HPLC：沃特世(Water's)PSFC-200和UV检测器；柱：CHIRALCEL OX-H(250*21)mm，5u；流动相A：液态CO2，流动相B：0.1％ DEA/甲醇；等度梯度82:18(A:B)，柱流量：80毫升/分钟(100巴)。FR-1(异构体1)：RT＝5.58；FR-2(异构体2)：RT＝7.97。
异构体1任意指定为(R)-N-(1-(2,4-二氯苯基)丙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物157)LCMS：m/z 417.27[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.80(t,J＝6.8Hz,3H),2.07 -2.15(m,1H),2.21-2.23(m,1H),4.44-4.55(m,2H),5.35(bs,1H),7.13-7.16(m,1H),7.20–7.27(m,3H),7.35(d,J＝7.2Hz,2H),7.43-7.50(m,2H),7.62(d,J＝8.8Hz,1H),8.14(s,1H),8.32(d,J＝4.0Hz,1H).
异构体2任意指定为(S)-N-(1-(2,4-二氯苯基)丙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物158)LCMS：m/z 417.30[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.80(t,J＝6.4Hz,3H),2.07 -2.15(m,1H),2.21-2.23(m,1H),4.43-4.55(m,2H),5.35(bs,1H),7.13-7.16(m,1H),7.20–7.27(m,3H),7.35(d,J＝8.0Hz,2H),7.43-7.50(m,2H),7.62(d,J＝8.8Hz,1H),8.14(s,1H),8.32(d,J＝4.4Hz,1H).
一般程序IX
(R)-N-(1-(2,4-二氯苯基)-2-甲基丙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物159)和(S)-N-(1-(2,4-二氯苯基)-2-甲基丙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物160)的制备。
Figure BDA0003964828930000801
步骤1.2,4-二氯-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺的合成。在0℃下向2,4-二氯苯甲酸(10g，52.35mmol)于干燥DMF(100ml)中的搅拌溶液中添加N,O-二甲基盐酸羟胺(6.12g，62.74mmol)，然后添加HATU(29.0g，76.4mmol)。将反应混合物在0℃下搅拌1小时。在0℃下逐滴添加DIPEA(20.3g，157mmol)，并且将所得反应混合物在室温下搅拌4小时。反应完成之后，缓慢添加水(250ml)，并将反应用乙酸乙酯(2x100ml)萃取。将合并的有机层用盐水(200ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗化合物通过柱色谱法纯化以得到呈油的标题化合物(8.0g，65％)。LCMS：m/z 234.1[M+H]+。
步骤2.1-(2,4-二氯苯基)-2-甲基丙-1-酮的合成。在氮气气氛下将2,4-二氯-N-甲氧基-N-甲基苯甲酰胺(0.47g，2.01mmol)于干燥THF(5ml)中的溶液冷却至0℃。在0℃下逐滴添加含异丙基溴化镁(5ml，5.04mmol)的THF。将所得反应混合物置于室温下并且在60℃下加热8小时。反应完成之后，缓慢添加饱和氯化铵溶液(5ml)，并将反应混合物用乙酸乙酯(2x25ml)萃取。将合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗化合物通过柱色谱法纯化以得到呈油的标题化合物(0.04g，9％)。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.065(d,J＝6.8Hz,6H),3.25-3.35(m,1H),7.55(dd,J＝8.4Hz,1.6Hz,1H),7.67(d,J＝8.4Hz,1H),7.75(d,J＝1.6Hz,1H).
步骤3.1-(2,4-二氯苯基)-2-甲基-N-(吡啶-3-基甲基)丙-1-胺的合成。将1-(2,4-二氯苯基)-2-甲基丙-1-酮(1g，4.6mmol)、吡啶-3-基甲胺(2g，18.5mmol)和乙酸(1ml)于DCE(10ml)中的混合物在室温下搅拌2小时。添加氰基硼氢化钠(0.43g，6.84mmol)和甲醇(1ml)，并且将反应混合物在60℃下加热24小时。反应完成后，将反应混合物通过硅藻土过滤并且将滤液在减压下浓缩。将粗化合物通过Combi快速柱色谱法(RP-Gold柱)使用乙腈和含0.1％甲酸的水纯化以得到呈固体的纯标题化合物(0.260g，18％)。LCMS：m/z 309.2[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.75(d,J＝6.8Hz,3H),0.95(d,J＝6.8Hz 3H),1.79-1.84(m,1H),3.28-3.31(m,1H),3.57(d,J＝14Hz,1H),3.73-3.74(m,1H),7.30-7.33(m,1H),7.48(d,J＝7.2Hz,1H),7.55(s,1H),7.65-7.69(m,2H),8.44(s,2H).
步骤4.N-(1-(2,4-二氯苯基)-2-甲基丙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺的合成。将1-(2,4-二氯苯基)-2-甲基-N-(吡啶-3-基甲基)丙-1-胺(0.26g，0.84mmol)于DCM(2.6ml)中的溶液冷却至0℃。在氮气气氛下添加3-氟苯甲酰氯(0.198g，1.25mmol)，随后在0℃下逐滴添加三乙胺(0.35g，3.43mmol)。将所得反应混合物置于室温下并且搅拌另外4小时。反应完成之后，缓慢添加水(5ml)，并将反应混合物用乙酸乙酯(2x15ml)萃取。将合并的有机层用盐水(15ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗化合物通过Combi快速柱色谱法(RP Gold柱)使用乙腈和含0.1％甲酸的水纯化以得到呈固体的纯标题化合物(0.040g，11％)。手性制备型HPLC：岛津LC-20AP和UV检测器；CHIRALPAK IH 250*21mm，5u；流动相A：0.1％ DEA/己烷，流动相B：0.1％ DEA/丙-2-醇:甲醇(50:50)；等度梯度90:10(A:B)，柱流量：18毫升/分钟(100巴)。FR-1(异构体1)：RT＝10.71；FR-2(异构体2)：RT＝17.03。
异构体1任意指定为(R)-N-(1-(2,4-二氯苯基)-2-甲基丙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物159)LCMS：m/z 431.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.81(d,J＝6.4Hz,3H),1.20(d,J＝6.4Hz,3H),2.80-2.86(m,1H),4.55-4.65(m,2H),5.55(bs,1H),7.10-7.19(m,3H),7.23-7.29(m,3H),7.43-7.48(m,1H),7.53(s,1H),7.77(d,J＝8.4Hz,1H),8.03(bs,1H),8.30(d,J＝3.6Hz,1H).
异构体2任意指定为(S)-N-(1-(2,4-二氯苯基)-2-甲基丙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物160)LCMS：m/z 431.4[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ0.81(d,J＝6.4Hz,3H),1.20(d,J＝6.4Hz,3H),2.80-2.86(m,1H),4.55-4.65(m,2H),5.55(bs,1H),7.10-7.19(m,3H),7.23-7.29(m,3H),7.43-7.48(m,1H),7.53(s,1H),7.77(d,J＝8.4Hz,1H),8.03(bs,1H),8.30(d,J＝3.6Hz,1H).
一般程序X
(R)-N-(1-(2,4-二氯苯基)-2-羟乙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物161)和(S)-N-(1-(2,4-二氯苯基)-2-羟乙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物162)的制备。
Figure BDA0003964828930000821
步骤1.2-溴-2-(2,4-二氯苯基)乙酸甲酯的合成。向2-(2,4-二氯苯基)乙酸甲酯(0.5g，2.28mmol)于四氯化碳(5ml)中的搅拌溶液中添加N-溴代琥珀酰亚胺(0.41g，2.28mmol)和AIBN(0.074g，0.45mmol)。将反应混合物在90℃下加热4小时。反应完成之后，将溶剂蒸发并将粗产物通过柱色谱纯化以得到标题化合物(0.6g，88％)。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.83(s,3H),5.88(s,1H),7.34(d,J＝8.8Hz,1H),7.44(s,1H),7.76(d,J＝8.4Hz,1H).
步骤2.2-(2,4-二氯苯基)-2-((吡啶-3-基甲基)氨基)乙酸甲酯的合成。在氮气气氛下向2-溴-2-(2,4-二氯苯基)乙酸甲酯(0.4g，1.34mmol)于无水乙腈(4ml)中的溶液中添加三乙胺(0.26ml，1.85mmol)和3-吡啶甲基胺(0.116mg，1.07mmol)。将所得反应混合物置于室温下并搅拌5小时。反应完成之后，缓慢添加水(15ml)，并将反应混合物用乙酸乙酯(3x10ml)萃取。将合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗化合物通过combi-快速色谱法纯化以得到呈胶状物的标题化合物(0.280g，64％)。LCMS：m/z 325.2[M++1]。1H NMR(400MHz,CDCl3):δ3.74(s,3H),3.82(s,2H),4.86(s,1H),7.28-7.30(bs,2H),7.39(d,J＝8.0Hz,1H),7.45(s,1H),7.71(d,J＝6.8Hz,1H),8.56(s,2H).
步骤3.2-(2,4-二氯苯基)-2-(3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺基)乙酸甲酯的合成。将2-(2,4-二氯苯基)-2-((吡啶-3-基甲基)氨基)乙酸甲酯(0.28g，0.86mmol)、三乙胺(0.66ml，2.06mmol)、DMAP(0.02g，0.16mmol)和DCM(3ml)在室温下在氮气气氛下搅拌5分钟。向反应混合物中逐滴添加3-氟苯甲酰氯(0.204g，1.28mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时。反应完成之后，将反应混合物倒入饱和碳酸氢钠(10ml)溶液中，并用二氯甲烷(3x10ml)萃取。将合并的有机层用盐水(10ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗化合物通过柱色谱法纯化以得到呈胶状物的标题化合物(0.23g，59％)。LCMS：m/z 447.3[M+H]+。
步骤4.N-(1-(2,4-二氯苯基)-2-羟乙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺的合成。在0℃下向2-(2,4-二氯苯基)-2-(3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺)乙酸甲酯(0.17g，0.39mmol)于甲醇(6ml)中的溶液中分批添加硼氢化钠(0.298g，7.9mmol)。将所得反应混合物置于室温下并且搅拌另外16小时。反应完成之后，缓慢添加饱和氯化铵溶液(50ml)，并将反应混合物用二氯甲烷(2x30ml)萃取。将合并的有机层用盐水(20ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗产物通过柱色谱法纯化以得到呈胶状物的标题化合物(0.12g，75％)。手性制备型HPLC：沃特世PSFC-200和UV检测器；柱：CHIRALPAK IH(250*21)mm，5u；流动相A：液态CO2，流动相B：0.1％DEA/IPA:ACN(50:50)；等度梯度80:20(A:B)，柱流量：80毫升/分钟(100巴)。FR-1(异构体1)：RT＝4.51分钟；FR-2(异构体2)：RT＝9.80分钟。
异构体1任意指定为(R)-N-(1-(2,4-二氯苯基)-2-羟乙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物161)LCMS：m/z 419.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.92-3.97(m,1H),4.07-4.11(m,1H),4.49(d,J＝16.4Hz,1H),4.62-4.66(m,1H),5.10(br s,1H),5.40(br s,1H),7.15-7.18(m,1H),7.25-7.47(m,7H),7.62(d,J＝8.4Hz,1H),8.20(s,1H),8.32(d,J＝4.0Hz,1H).
异构体2任意指定为(S)-N-(1-(2,4-二氯苯基)-2-羟乙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物162)LCMS：m/z 419.1[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ3.92-3.98(m,1H),4.08-4.10(m,1H),4.49(d,J＝16.0Hz,1H),4.62-4.66(m,1H),5.11(br s,1H),5.40(br s,1H),7.15-7.18(m,1H),7.22-7.47(m,7H),7.62(d,J＝8.0Hz,1H),8.20(s,1H),8.32(d,J＝4.4Hz,1H).
一般程序XI
(R)-N-(1-(4-氨基甲酰基-2-氯苯基)乙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物163)和(S)-N-(1-(4-氨基甲酰基-2-氯苯基)乙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物164)的制备。
Figure BDA0003964828930000841
步骤1.1-(4-溴-2-氯苯基)乙-1-胺的合成。向1-(4-溴-2-氯苯基)乙-1-酮(10g，42.82mmol)于甲醇(200ml)中的搅拌溶液中添加分子筛(20g)，随后添加盐酸羟胺(8.93g，128.48mmol)。将反应混合物在室温下搅拌16小时。反应完成后，将反应混合物通过硅藻土过滤并且将滤液蒸发至干燥。将粗固体用含10％乙酸乙酯的己烷(20ml)研磨，随后用正戊烷(20mL)研磨并且倾析以获得1-(4-溴-2-氯苯基)乙-1-酮肟(10g)。LCMS：m/z 249.7[M+H]+。
将1-(4-溴-2-氯苯基)乙-1-酮肟(10g，40.24mmol)溶解于EtOH:AcOH(1:1，200ml)中，并在室温下分批添加锌粉(21.05g，322mmol)(注意：放热反应)。将反应在室温下搅拌18小时。反应完成后，将反应混合物通过硅藻土过滤并且将滤液蒸发至干燥。用碳酸氢钠溶液中和粗残余物以将pH调节至8。将产物用EtOAc(3x100ml)萃取。将合并的有机层经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗化合物用正戊烷(2x50ml)研磨并倾析以获得标题化合物(5.05g，50％，2个步骤)。LCMS：m/z 235.8[M+H]+。
步骤2.1-(4-溴-2-氯苯基)-N-(吡啶-3-基甲基)乙-1-胺的合成。向1-(4-溴-2-氯苯基)乙-1-胺(5.0g，21.32mmol)于DMF(50ml)中的搅拌混合物中添加碳酸钾(8.84g，64.0mmol)。在室温下添加3-(氯甲基)吡啶HCl(4.54g，27.7mmol)。将反应混合物加热至60℃，持续16小时。反应完成之后，将反应混合物用冷水150ml淬灭并且用乙酸乙酯(3x50ml)萃取。将合并的有机层用冷水(2x50ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗化合物通过RP Gold柱色谱法使用乙腈和含0.1％甲酸的水纯化以得到纯标题化合物(3.5g，50％)。LCMS：m/z 326.0[M+H]+。
步骤3.N-(1-(4-溴-2-氯苯基)乙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺的合成。在室温下在氮气气氛下向1-(4-溴-2-氯苯基)-N-(吡啶-3-基甲基)乙-1-胺(3.5g，10.7mmol)于DCM(35ml)中的搅拌混合物中添加Et3N(2.72g，26.9mmol)。将反应混合物冷却到0℃，并逐滴添加3-氟苯甲酰氯(2.55g，16.1mmol)。将反应混合物在15℃下搅拌1小时。反应完成之后，将反应混合物用碳酸氢钠溶液(35ml)淬灭并且用DCM(2x35ml)萃取。将合并的有机层用水(2x50ml)洗涤，随后用盐水(50ml)洗涤，经Na2SO4干燥，过滤并在减压下浓缩。将粗化合物通过Combi快速柱色谱法纯化以得到标题化合物(3.0g，62％)。LCMS：m/z 447.0[M+H]+。
步骤4.3-氯-4-(1-(3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺基)乙基)苯甲酸甲酯的合成。在氢化器中，在室温下向N-(1-(4-溴-2-氯苯基)乙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(1g，2.23mmol)于MeOH(20ml)中的搅拌混合物中添加乙酸钠(0.531g，6.48mmol)、乙酸钯(0.050g，0.23mmol)和Pd(dppf)Cl2(0.163g，0.23mmol)。施加一氧化碳(g)压力(125psi)，并且将氢化器加热至70℃，持续16小时。反应完成之后，将反应混合物通过硅藻土过滤并且将滤液浓缩。将粗化合物通过Combi快速柱色谱法纯化以得到标题化合物(0.625g，65％)。LCMS：m/z 427.0[M+H]+。
步骤5.N-(1-(4-氨基甲酰基-2-氯苯基)乙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺。在-78℃下将3-氯-4-(1-(3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰氨基)乙基)苯甲酸甲酯(0.625g，1.46mmol)于MeOH(12.5ml)中的搅拌溶液用氨气吹扫15-30分钟。将反应混合物在室温下搅拌16小时。反应完成之后，将反应混合物浓缩。将粗化合物通过RP Gold柱色谱法使用乙腈和含0.1％甲酸的水纯化以得到纯标题化合物(0.160g，26％)。手性制备型HPLC：沃特世PSFC-200和UV检测器；柱：CHIRALPAK IB-N(250*21)mm，5u；流动相A：液态CO2，流动相B：0.1％ DEA/IPA:ACN(50:50)；等度梯度78:22(A:B)，柱流量：80毫升/分钟(100巴)。FR-1(异构体1)：RT＝5.93分钟；FR-2(异构体2)：RT＝6.28分钟。
异构体1任意指定为(R)-N-(1-(4-氨基甲酰基-2-氯苯基)乙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物163)LCMS：m/z 412.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.64(d,J＝7.2Hz,3H),4.49-4.59(m,2H),5.50(bs,1H),7.17-7.29(m,4H),7.44-7.50(m,2H),7.67(d,J＝8.0Hz,1H),7.80-7.83(m,2H),8.23(bs,1H),8.33(d,J＝4.0Hz,1H).
异构体2任意指定为(S)-N-(1-(4-氨基甲酰基-2-氯苯基)乙基)-3-氟-N-(吡啶-3-基甲基)苯甲酰胺(化合物164)LCMS：m/z 412.0[M+H]+。1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ1.64(d,J＝7.2Hz,3H),4.49-4.58(m,2H),5.50(bs,1H),7.17-7.28(m,4H),7.45-7.50(m,2H),7.67(d,J＝8.0Hz,1H),7.80-7.83(m,2H),8.23(bs,1H),8.33(d,J＝4.0Hz,1H).
表8中的下列化合物以类似于上文所描述的一般程序VII-XI的方式制备：
表8
Figure BDA0003964828930000861
/>
Figure BDA0003964828930000871
2-(4-((N-(2,4-二氯苄基)-3,5-二氟苯甲酰胺基)甲基)-1H-吡唑-1-基)乙酸(化合物165)的合成。
Figure BDA0003964828930000872
步骤1.将1H-吡唑-4-甲醛(1g，10.4mmol)和1-(2,4-二氯苯基)甲胺(2.00g，11.4mmol)在DCM(25mL)中合并，并且在室温下搅拌，然后添加三乙酰氧基硼氢化钠(3.30g，15.6mmol)。将混合物在氮气气氛下搅拌过夜。将反应用饱和NaHCO3溶液淬灭，并且将产物用DCM萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残余物通过反相色谱法(Biotage 60g C18柱；5-50％ CH3CN/H2O和0.1％甲酸梯度)纯化，以得到N-((1H-吡唑-4-基)甲基)-1-(2,4-二氯苯基)甲胺。ES m/z 256.0[M+H]+。
Figure BDA0003964828930000881
步骤2.将N-((1H-吡唑-4-基)甲基)-1-(2,4-二氯苯基)甲胺(925mg，3.6mmol)和3,5-二氟苯甲酸(573mg，3.6mmol)、Et3N(1.00mL，7.2mmol)和HATU(1.64g，4.32mmol)在DMF(25mL)中合并，并且在室温下搅拌过夜。将反应用饱和NaHCO3溶液淬灭，并且将产物用DCM萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残余物通过反相色谱法(Biotage60g C18柱；5-50％ CH3CN/H2O和0.1％甲酸梯度)纯化，以得到N-((1H-吡唑-4-基)甲基)-N-(2,4-二氯苄基)-3,5-二氟苯甲酰胺。ES m/z 396.0[M+H]+。
Figure BDA0003964828930000882
步骤3.将N-((1H-吡唑-4-基)甲基)-N-(2,4-二氯苄基)-3,5-二氟苯甲酰胺(461mg，1.1mmol)和K2CO3(322mg，2.2mmol)在DMF(15mL)中合并。15分钟后，添加2-溴乙酸乙酯(183mg，1.1mmol)。将反应在室温下搅拌过夜。将反应用饱和盐水溶液猝灭，并且将产物用DCM萃取。将合并的有机萃取物经Na2SO4干燥，过滤并浓缩。将残余物通过反相色谱法(Biotage 60g C18柱；5-50％ CH3CN/H2O和0.1％甲酸梯度)纯化，以得到2-(4-((N-(2,4-二氯苄基)-3,5-二氟苯甲酰胺)甲基)-1H-吡唑-1-基)乙酸乙酯。ES m/z482.1[M+H]+。
Figure BDA0003964828930000891
步骤4.将40mg酯(1当量)、2当量1M NaOH、2-(4-((N-(2,4-二氯苄基)-3,5-二氟苯甲酰胺)甲基)-1H-吡唑-1-基)乙酸乙酯(40mg，0.083mmol)溶解于MeOH(1mL)中，并且添加1M NaOH水溶液(166uL，0.166mmol)。将反应在室温下搅拌6小时。将残余物通过反相色谱法(Biotage 60g C18柱；5-50％ CH3CN/H2O和0.1％甲酸梯度)纯化，以得到2-(4-((N-(2,4-二氯苄基)-3,5-二氟苯甲酰胺基)甲基)-1H-吡唑-1-基)乙酸。ES m/z 455.0[M+H]+。
表9中的下列化合物以类似于上文所描述的方法和程序的方式制备：
表9
Figure BDA0003964828930000892
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Figure BDA0003964828930000901
/>
Figure BDA0003964828930000911
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Figure BDA0003964828930000921
/>
Figure BDA0003964828930000931
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Figure BDA0003964828930000941
/>
Figure BDA0003964828930000951
/>
Figure BDA0003964828930000961
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Figure BDA0003964828930000971
/>
Figure BDA0003964828930000981
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Figure BDA0003964828930000991
/>
Figure BDA0003964828930001001
生物化学测定
1.使肿瘤细胞中的TREX1沉默
在感测胞质DNA和随后的I型IFN产生后，cGAS/STING途径的激活可以在肿瘤细胞和先天性免疫细胞两者，特别是树突状细胞中发生。为了评估TREX1是否通过一种充分描述的在通过STING激动剂激活I型IFN后会经历免疫介导的排斥的冷同基因型肿瘤模型来阻止I型IFN的产生，使用CRISPR在B16F10肿瘤细胞中将TREX1敲低(图1A)。通过肿瘤细胞的DNA转染积累胞质DNA使得相对于亲本肿瘤细胞，TREX1敲除B16F10细胞的IFNβ产生增加约5倍，这表明TREX1减弱B16F10肿瘤细胞中cGAS/STING途径的激活(图1B)。
2.TREX1胜任型和缺陷型B16F10肿瘤细胞在体内的生长
评估了TREX1胜任型和缺陷型B16F10肿瘤细胞在体内的生长。将C57BL/6J小鼠在右胁腹皮下接种300,000个亲本或TREX1敲除的B16F10肿瘤细胞。每周收集体重两次，并且每周进行肿瘤测量两到三次，在肿瘤变得可测量时开始并且在研究的剩余持续时间内持续。与亲本B16F10肿瘤相比，TREX1被沉默的肿瘤呈现显著更小的体积(图2)。
在研究终止后的第19天采集肿瘤，并且消化成单细胞悬浮液以使得能够进行肿瘤浸润的免疫群体的流式细胞术定量。发现TREX1敲除B16F10肿瘤表现出总体免疫细胞的显著增加，这反映肿瘤浸润CD4和CD8 T细胞以及浆细胞样树突状细胞(pDC)数量的增加(图3)。已知pDC在诱导抗原特异性抗肿瘤免疫应答中起核心作用，而已知T细胞是小鼠和人类中抗肿瘤功效的主要效应物。因此，缺乏TREX1的肿瘤的免疫浸润的深刻变化表明对后者肿瘤生长的抑制至少部分是免疫介导的。
TREX1生物化学测定
通过荧光测定评估化合物效力，所述荧光测定测量在相对链上具有荧光团-淬灭剂对的定制dsDNA底物的降解。dsDNA的降解会释放游离荧光团以产生荧光信号。具体地，将7.5μL的含在N端带His-Tev标签的全长人TREX1(在大肠杆菌(E.coli)中表达并在内部纯化)的反应缓冲液(50mM Tris(pH 7.4)、150mM NaCl、2mM DTT、0.1mg/mL BSA，0.01％(v/v)吐温-20和100mM MgCl2)添加到已经含有DMSO中的不同浓度的化合物(150nL)作为10点剂量应答的384孔Black ProxiPlate Plus(珀金埃尔默(Perkin Elmer))中。向其中添加7.5μL的含dsDNA底物(链A：5'TEX615/GCT AGG CAG 3'；链B：5'CTG CCT AGC/IAbRQSp(集成DNA技术(Integrated DNA Technologies)))的反应缓冲液。最终浓度为具有1.0％ DMSO(v/v)的反应缓冲液中的150pM TREX1、60nM dsDNA底物。在室温下25分钟之后，通过添加5μL终止缓冲液(与反应缓冲液加200mM EDTA相同)来将反应淬灭。淬灭反应中的最终浓度为20μL体积中的112.5pM TREX1、45nM DNA和50mM EDTA。在室温下温育5分钟后，在激光源Envision(珀金埃尔默)中对板进行读取，在用570nm光激发后测量615nm处的荧光。通过使用非线性最小二乘四参数拟合和Genedata或GraphPad Prism(GraphPad软件公司(GraphPadSoftware,Inc.))将在615nm下测得的荧光相对于用终止缓冲液预淬灭的对照孔(100％抑制)和无抑制剂(0％抑制)对照的比率进行比较来计算IC50值。
TREX2生物化学测定
通过荧光测定评估化合物效力，所述荧光测定测量在相对链上具有荧光团-淬灭剂对的定制dsDNA底物的降解。dsDNA的降解会释放游离荧光团以产生荧光信号。具体地，将7.5μL的含在N端带His-Tev标签的人TREX2(残基M44-A279，在大肠杆菌中表达并在内部纯化)的反应缓冲液(50mM Tris(pH 7.4)，150mM NaCl，2mM DTT，0.1mg/mL BSA，0.01％(v/v)吐温-20和100mM MgCl2)添加到已经含有DMSO中的不同浓度的化合物(150nL)作为10点剂量应答的384孔Black ProxiPlate Plus(珀金埃尔默)中。向其中添加7.5μL的含dsDNA底物(链A：5'TEX615/GCT AGG CAG 3'；链B：5'CTG CCT AGC/IAbRQSp(IDT)的反应缓冲液。最终浓度为具有1.0％ DMSO(v/v)的反应缓冲液中的2.5nM TREX2、60nM dsDNA底物。在室温下25分钟之后，通过添加5μL终止缓冲液(与反应缓冲液加200mM EDTA相同)来将反应淬灭。淬灭反应混合物中的最终浓度为20μL体积中的1.875pM TREX2、45nM DNA和50mM EDTA。在室温下温育5分钟后，在激光源Envision(珀金埃尔默)中对板进行读取，在用570nm光激发后测量615nm处的荧光。通过使用非线性最小二乘四参数拟合和Genedata或GraphPad Prism(GraphPad软件公司(GraphPad Software,Inc.))将在615nm下测得的荧光相对于用终止缓冲液预淬灭的对照孔(100％抑制)和无抑制剂(0％抑制)对照的比率进行比较来计算IC50值。
结果在表10中示出。TREX1 EC50：A＝<0.1μM；B＝0.1至1μM；C＝1至10μM；D＝>10μM。TREX2 EC50：A＝<1μM；B＝1至10μM；C＝10至100μM；D＝>100μM。
表10
Figure BDA0003964828930001021
/>
Figure BDA0003964828930001031
/>
Figure BDA0003964828930001041
/>
Figure BDA0003964828930001051
/>
Figure BDA0003964828930001061
/>
Figure BDA0003964828930001071
/>
Figure BDA0003964828930001081
尽管已描述了多个实施例，但显而易见的是，可以更改基本实例以便提供利用本发明的化合物和方法的其它实施例。因此，应理解，本发明的范围应由所附权利要求而不是由已通过举例表示的具体实施例限定。
本申请中引用的所有参考文献(包含文献参考、授权专利、公布的专利申请和共同未决的专利申请)的内容通过引用整体明确并入本文。除非另有定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语均与本领域的普通技术人员通常已知的含义一致。

Claims (55)

1.一种化合物，其具有式I：
Figure FDA0003964828920000011
或其药学上可接受的盐，其中
R1为卤基、羟基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基或卤代(C1-C4)烷氧基；
R2为氢、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、-(C1-C4)烷基ORa、-C(O)Rb、-C(O)ORb、-C(O)NRbRc、-C(O)NRbRc、5至7元杂芳基或4至7元杂环基，其中所述杂芳基和杂环基各自任选地被选自R6的1至3个基团取代；
R3为卤基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷氧基、-NRbRc或CN；
R4为卤基、羟基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷氧基、CN、-NRbRc、-C(O)Rb、-C(O)ORb、-C(O)NRbRc、-SRb、-C(O)NRbRc、-S(O)2Rb、-S(O)Rb、-NRbC(O)Rc、-NRbC(O)ORc、-NRbC(S)ORc和-NRbC(O)NcRd；
环A为含氮5至7元杂芳基；
R5为卤基、羟基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷氧基、氧基、-(C1-C4)烷基ORd、-(C1-C4)烷基C(O)Rd、-(C1-C4)烷基C(O)ORe、-(C1-C4)烷基C(O)NRdRe、-C(O)Rd、-C(O)ORd、-C(O)NRdRe、-C(O)NRdSO2(C1-C4)烷基、CN、
-NRdRe、-C(O)NRdSO3H、-NRdC(O)Re、-NRdC(O)ORe、-NRdC(S)ORe、-NRdC(O)NeRf、
-NRdC(S)NReRfc、-NRdS(O)2NReRf、-C(S)Rd、-S(O)2Rd、-S(O)Rd、-C(S)ORd、-C(S)NRdRe、
-NRdC(S)Re、-SRd、-(C1-C4)烷基C(O)NRdRe、-(C1-C4)烷基C(O)NRdSO2(C1-C4)烷基、
-(C1-C4)烷基NRdRe、-(C1-C4)烷基C(O)NRdSO3H、-(C1-C4)烷基NRdC(O)Re、-(C1-C4)烷基NRdC(O)ORe、-(C1-C4)烷基NRdC(S)ORe、-(C1-C4)烷基NRdC(O)NeRf、-(C1-C4)烷基NRdC(S)NReRf、-(C1-C4)烷基NRdS(O)2NReRf、-(C1-C4)烷基C(S)Rd、-(C1-C4)烷基S(O)2Rd、-(C1-C4)烷基S(O)Rd、-(C1-C4)烷基C(S)ORd、-(C1-C4)烷基C(S)NRdRe、-(C1-C4)烷基NRdbC(S)Re、-(C1-C4)烷基SRd、5至7元杂芳基或4至7元杂环基，其中所述杂芳基和杂环基各自任选地被选自R7的1至3个基团取代；
Ra、Rb、Rc、Rd、Re和Rf各自独立地为氢、(C1-C4)烷基或卤代(C1-C4)烷基；
R6和R7各自独立地为卤基、羟基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷氧基、CN或氧基；
m和n各自独立地为0、1、2或3；并且
p为0或1。
2.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中
R2为氢、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、-(C1-C4)烷基ORa、5至7元杂芳基或4至7元杂环基，其中所述杂芳基和杂环基各自任选地被选自R6的1至3个基团取代；
R3为卤基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基或CN；并且
m和n各自独立地为0、1或2。
3.根据权利要求1所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3为卤基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基或卤代(C1-C4)烷氧基。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3为卤基或卤代(C1-C4)烷基。
5.根据权利要求1至3中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3为氟、氯、甲基、甲氧基或CF3。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R3为氟、氯或CF3。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式II：
Figure FDA0003964828920000021
或其药学上可接受的盐。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R2为氢或(C1-C4)烷基。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式III：
Figure FDA0003964828920000031
或其药学上可接受的盐。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R4为卤基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基或卤代(C1-C4)烷氧基或CN。
11.根据权利要求10所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R4为氯、甲基或甲氧基。
12.根据权利要求1至10中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R4为卤基。
13.根据权利要求12所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R4为氯。
14.根据权利要求1和3至13中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中m为0、1或2。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中m为0或1。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式IV：
Figure FDA0003964828920000032
或其药学上可接受的盐。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中环A为吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基或吡唑基。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中环A为吡啶基。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的化合物，其中所述化合物具有式V：
Figure FDA0003964828920000041
或其药学上可接受的盐。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的化合物，其中R5位于相对于环A的连接点的对位。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R5为卤基、氧基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、-C(O)ORb、-NRbRc、-C(O)NRbRc、-(C1-C4)烷基ORb、-(C1-C4)烷基C(O)Rb、-(C1-C4)烷基C(O)NRbRc、-C(O)NRbSO2(C1-C4)烷基、5至6元杂芳基，其中所述杂芳基任选地被选自R7的1至3个基团取代。
22.根据权利要求1至21中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中R5为氧基、CF3、CH3、C(O)OCH3、C(O)OH、CH2COOH、NH2、CONH2、CH2CONH2、CONHCH3、CH2OH、CH2CH2OH、CONHSO2CH3、四唑基、吡唑基、三唑基或吡唑基，其中所述吡唑基任选地被羟基取代。
23.根据权利要求1至22中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中n为0、1或2。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐，其中n为2。
25.一种药物组合物，其包括根据权利要求1至24中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐以及药学上可接受的载体。
26.一种治疗受试者的对抑制TREX1有应答的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的根据权利要求1至24中任一项所述的化合物或其药学上可接受的盐或根据权利要求25所述的组合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述疾病是癌症。
28.一种治疗受试者的对抑制TREX1有应答的疾病的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的具有式VI的化合物：
Figure FDA0003964828920000051
或其药学上可接受的盐，其中
R1a、R2a、R4a和R5a各自独立地为卤基、羟基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷氧基、CN、-NRb1Rc1、-C(O)Rb1、-C(O)ORb1、-C(O)NRb1Rc1、-SRb1、-C(O)NRb1Rc1、-S(O)2Rb1、-S(O)Rb1、-NRb1C(O)Rc1、-NRb1C(O)ORc1、-NRb1C(S)ORc1和-NRb1C(O)Nc1Rd1；
R3a为氢、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、-(C1-C4)烷基ORa、-C(O)Rb、-C(O)ORb、-C(O)NRbRc、-C(O)NRbRc、5至7元杂芳基或5至7元杂环基，其中所述杂芳基和杂环基各自任选地被选自R7a的1至3个基团取代；
环A为杂芳基；
R6a为卤基、羟基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷氧基、氧基、-(C1-C4)烷基ORd1、-(C1-C4)烷基C(O)Rd1、-(C1-C4)烷基C(O)ORe1、-(C1-C4)烷基C(O)NRd1Re1、-C(O)Rd1、-C(O)ORd1、-C(O)NRd1Re1、-C(O)NRd1SO2(C1-C4)烷基、CN、-NRd1Re1、-C(O)NRd1SO3H、-NRd1C(O)Re1、-NRd1C(O)ORe1、-NRd1C(S)ORe1、-NRd1C(O)Ne1Rf1、-NRd1C(S)NRe1Rfc1、-NRd1S(O)2NRe1Rf1、-C(S)Rd1、-S(O)2Rd1、-S(O)Rd1、-C(S)ORd1、-C(S)NRd1Re1、-NRd1C(S)Re1、-SRd1、-(C1-C4)烷基C(O)NRd1Re1、-(C1-C4)烷基C(O)NRd1SO2(C1-C4)烷基、-(C1-C4)烷基NRd1Re1、-(C1-C4)烷基C(O)NRd1SO3H、-(C1-C4)烷基NRd1C(O)Re1、-(C1-C4)烷基NRd1C(O)ORe1、-(C1-C4)烷基NRd1C(S)ORe1、-(C1-C4)烷基NRd1C(O)Ne1Rf1、-(C1-C4)烷基NRd1C(S)NRe1Rf1、-(C1-C4)烷基NRd1S(O)2NRe1Rf1、-(C1-C4)烷基C(S)Rd1、-(C1-C4)烷基S(O)2Rd1、-(C1-C4)烷基S(O)Rd1、-(C1-C4)烷基C(S)ORd1、-(C1-C4)烷基C(S)NRd1Re1、-(C1-C4)烷基NRb1C(S)Re1、-(C1-C4)烷基SRd1、5至7元杂芳基或4至7元杂环基，其中所述杂芳基和杂环基各自任选地被选自R8a的1至3个基团取代；
Ra1、Rb1、Rc1、Rd1、Re1和Rf1各自独立地为氢、(C1-C4)烷基或卤代(C1-C4)烷基；
R7a和R8a各自独立地为卤基、羟基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基、卤代(C1-C4)烷氧基、CN或氧基；并且
m1、n1和p1各自独立地为0、1、2或3。
29.根据权利要求28所述的方法，其中R3a为氢、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、-(C1-C4)烷基ORa、5至7元杂芳基或4至7元杂环基，其中所述杂芳基和杂环基各自任选地被选自R7a的1至3个基团取代；并且m1、n1和p1各自独立地为0、1或2。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中R1a为卤基。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中所述化合物具有式VII：
Figure FDA0003964828920000061
或其药学上可接受的盐。
32.根据权利要求28至30中任一项所述的方法，其中R2a为卤基、羟基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基或(C1-C4)烷氧基。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的方法，其中R2a为卤基。
34.根据权利要求28至33中任一项所述的方法，其中所述化合物具有式VIII：
Figure FDA0003964828920000062
或其药学上可接受的盐。
35.根据权利要求28至34中任一项所述的方法，其中所述化合物具有式IX：
Figure FDA0003964828920000063
或其药学上可接受的盐。
36.根据权利要求28至35中任一项所述的方法，其中R4a为卤基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、(C1-C4)烷氧基或卤代(C1-C4)烷氧基。
37.根据权利要求36所述的方法，其中R4a为氟、氯、甲基、甲氧基或CF3。
38.根据权利要求28至36中任一项所述的方法，其中R4a为卤代(C1-C4)烷基或卤基。
39.根据权利要求38所述的方法，其中R4a为氟、氯或CF3。
40.根据权利要求28至39中任一项所述的方法，其中R3a为氢或(C1-C4)烷基。
41.根据权利要求28至40中任一项所述的方法，其中所述化合物具有式X：
Figure FDA0003964828920000071
或其药学上可接受的盐。
42.根据权利要求28至41中任一项所述的方法，其中R5a为卤基或(C1-C4)烷氧基。
43.根据权利要求28至42中任一项所述的方法，其中R5a为氯、甲基或甲氧基。
44.根据权利要求28至42中任一项所述的方法，其中R5a为卤基。
45.根据权利要求44所述的方法，其中R5a为氯。
46.根据权利要求28和30至45中任一项所述的方法，其中m1为0、1或2。
47.根据权利要求28至46中任一项所述的方法，其中环A为5至7元杂芳基。
48.根据权利要求28至47中任一项所述的方法，其中环A为含氮5至7元杂芳基。
49.根据权利要求28至48中任一项所述的方法，其中环A为吡啶基、嘧啶基、哒嗪基、吡嗪基或吡唑基。
50.根据权利要求28至49中任一项所述的方法，其中环A为吡啶基。
51.根据权利要求28至50中任一项所述的方法，其中所述化合物具有式XI：
Figure FDA0003964828920000081
或其药学上可接受的盐。
52.根据权利要求28至51中任一项所述的方法，其中R6a为卤基、氧基、(C1-C4)烷基、卤代(C1-C4)烷基、-C(O)ORb1、-NRb1Rc1、-C(O)NRb1Rc1、-(C1-C4)烷基ORb1、-(C1-C4)烷基C(O)Rb1、-(C1-C4)烷基C(O)NRb1Rc1、-C(O)NRb1SO2(C1-C4)烷基、5至6元杂芳基，其中所述杂芳基任选地被选自R7a的1至3个基团取代。
53.根据权利要求28至52中任一项所述的方法，其中R6a为氧基、CF3、CH3、C(O)OCH3、C(O)OH、CH2COOH、NH2、CONH2、CH2CONH2、CONHCH3、CH2OH、CH2CH2OH、CONHSO2CH3、四唑基、吡唑基、三唑基或吡唑基，其中所述吡唑基任选地被羟基取代。
54.根据权利要求28至53中任一项所述的方法，其中n1为0、1或2。
55.根据权利要求28至54中任一项所述的方法，其中n1为0或1。
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