CN115867305A - 治疗或预防冠状病毒感染的方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了使用伏环孢素治疗或预防冠状病毒感染特别是需要免疫抑制的受试者中的冠状病毒感染的方法。

Description

治疗或预防冠状病毒感染的方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年5月7日提交的名称为“治疗或预防病毒感染的方法”的美国临时申请第63/021,239号和2020年5月8日提交的名称为“治疗或预防病毒感染的方法”的美国临时申请第63/022,357号的优先权，将其内容通过引用完整并入本文。

技术领域

本文提供了治疗或预防病毒感染特别是需要免疫抑制的受试者中的病毒感染的方法。

背景技术

病毒感染会导致致命的疾病。例如，由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的冠状病毒病-2019(COVID-19)除了引起心肺窘迫外，还可导致急性呼吸窘迫综合征(ARDS)的快速发作。由于高传播性和漫长且通常无症状的潜伏期，COVID-19的传播难以控制。

在病毒爆发或大流行期间，某些人感染和死亡的风险大幅增加。例如，出于医学原因(例如，由于自身免疫性疾病或实体器官移植)，许多患者需要间歇性、长期甚至终身免疫抑制。由于他们的免疫受损状态，这些患者更容易受到病毒感染。正因为如此，需要一种药物，可以使需要免疫抑制的患者保持健康状态(尽管他们有潜在健康状况)，并同时提供抗病毒作用。提供了满足这种需要的实施方案。

发明内容

本文提供了治疗或预防受试者中的病毒感染的方法，包括向受试者施用伏环孢素，例如治疗有效量的伏环孢素。在一些任何提供的实施方案中，受试者需要免疫抑制。在一些任何提供的实施方案中，通过抑制亲环素A(CypA)或CypA相关途径来改善病毒感染。

在一些任何提供的实施方案中，本文提供了治疗或预防需要免疫抑制的受试者中的病毒感染的方法，包括向受试者施用治疗有效量的伏环孢素，其中通过抑制亲环素A(CypA)或CypA相关途径来改善病毒感染。

在一些任何提供的实施方案中，病毒感染是由冠状病毒科成员的病毒引起的。

在一些任何提供的实施方案中，病毒是α冠状病毒、β冠状病毒、δ冠状病毒或γ冠状病毒。

在一些任何提供的实施方案中，病毒是人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、人冠状病毒229E(HCoV-229E)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)或严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。

在一些任何提供的实施方案中，病毒是MERS-CoV、SARS-CoV或SARS-CoV-2。

在一些任何提供的实施方案中，病毒是SARS-CoV-2。

在一些任何提供的实施方案中，治疗有效量为约0.1mg/kg/天至约2mg/kg/天。

在一些任何提供的实施方案中，治疗有效量为约7.9mg BID、约15.8mg BID、约23.7mg BID、约31.6mg BID、约39.5mg BID、约47.4mg BID或约55.3mg BID。

在一些任何提供的实施方案中，治疗有效量为约7.9mg QD、约15.8mg QD、约23.7mg QD、约31.6mg QD、约39.5mg QD、约47.4mg QD、约55.3mg QD、约63.2mg QD、约71.1mg QD、约79.0mg QD、约86.9mg QD、约94.8mg QD、约102.7mg QD或约110.6mg QD。

在一些任何提供的实施方案中，治疗有效量等于或可实现以下浓度：约0.05μM和约10μM之间、约0.1μM和约5μM之间、约0.2μM和约2.5μM之间、约0.3μM和约1.0μM之间、约0.4μM和约0.9μM之间、约0.5μM和约0.8μM之间、约0.1μM和约0.5μM之间、或约0.2μM和约0.4μM之间、或约0.05、约0.1、约0.15、约0.2、约0.25、约0.3、约0.35、约0.4、约0.45、约0.5、约0.55、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约6.0、约7.0、约8.0、约9.0或约10.0μM或更低。

在一些任何提供的实施方案中，方法还包括监测受试者的肾功能。

在一些任何提供的实施方案中，监测受试者的肾功能包括：

(a)在不同日期的至少第一时间点和第二时间点评估受试者的估算肾小球滤过率(eGFR)；和

(b)(i)如果受试者的eGFR在第一和第二时间点之间下降超过目标％至预定值以下，则减少每日剂量或停止向受试者施用伏环孢素；

(ii)如果受试者的eGFR在第一和第二时间点之间下降少于目标％，则继续向受试者施用相同的每日剂量的伏环孢素。

在一些任何提供的实施方案中，预定值是约50至约90ml/min/1.73m²。

在一些任何提供的实施方案中，预定值是约60ml/min/1.73m²。

在一些任何提供的实施方案中，目标％为约20％至约45％。

在一些任何提供的实施方案中，目标％为约20％。

在一些任何提供的实施方案中，受试者患有自身免疫性疾病或与移植排斥相关的病症。

在一些任何提供的实施方案中，受试者患有与移植排斥相关的病症。

在一些任何提供的实施方案中，病症与心脏、肺、肝脏、肾脏、胰腺、皮肤、肠或角膜移植排斥相关。

在一些任何提供的实施方案中，病症与肾移植排斥相关。

在一些任何提供的实施方案中，受试者患有自身免疫性疾病。

在一些任何提供的实施方案中，施用治疗有效量的伏环孢素而不施用治疗有效量的霉酚酸吗啉乙酯(MMF)和/或治疗有效量的皮质类固醇。

在一些任何提供的实施方案中，方法还包括施用治疗有效量的霉酚酸吗啉乙酯(MMF)和/或皮质类固醇。

在一些任何提供的实施方案中，通过肠内施用(例如，口服施用、舌下施用或直肠施用)或肠胃外施用(例如，静脉内注射、肌内注射、皮下注射、静脉内输注或吸入/吹入)施用伏环孢素。

在一些任何提供的实施方案中，通过肠内施用(例如，口服施用、舌下施用或直肠施用)施用伏环孢素。

在一些任何提供的实施方案中，通过口服施用来施用伏环孢素。

在一些任何提供的实施方案中，通过肠胃外施用(例如，静脉内注射、肌内注射、皮下注射、静脉内输注或吸入/吹入)施用伏环孢素。

在一些任何提供的实施方案中，通过吸入或吹入施用伏环孢素。

在一些任何提供的实施方案中，以气溶胶的形式施用伏环孢素。

在一些任何提供的实施方案中，以药物组合物形式施用伏环孢素。在一些任何提供的实施方案中，药物组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。在一些任何提供的实施方案中，药学上可接受的赋形剂独立地选自以下中的一种或多种，包括：醇、D-α-生育酚(维生素E)聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、聚山梨酯20(吐温20)、聚山梨酯40(吐温40)、中链甘油三酯、明胶、山梨糖醇、甘油、氧化铁黄、氧化铁红、二氧化钛和水。

附图说明

图1A显示了细胞病变效应(CPE)减少测定设置。

图1B显示了伏环孢素在SARS-CoV-2CPE减少测定中的作用。

图1C显示了在伏环孢素和他克莫司的抗SARS-CoV-2作用之间的比较。

图2A显示了伏环孢素在用Vero E6细胞的SARS-CoV-2病毒载量减少测定中的作用。

图2B显示了伏环孢素在用Calu细胞的SARS-CoV-2病毒载量减少测定中的作用。

图2C显示了伏环孢素对SARS-CoV-2感染的Vero E6细胞的作用。在这些图下方的数字指示测试化合物(伏环孢素)的浓度。荧光信号(绿色荧光)指示病毒NSP4染色(20倍物镜)。不同条件下的曝光时间相同

图3显示了肾移植受者中伏环孢素和他克莫司的血谷水平。

图4显示了评价伏环孢素在SARS-CoV-2阳性肾移植患者中的抗病毒作用的研究方案。

图5A-5E显示了各种免疫抑制药物对SARS-CoV-2复制的抑制及其对未感染细胞(细胞毒性)和感染细胞(抗病毒作用)的细胞活力的作用。伏环孢素(图5A)、环孢素A(图5B)、依维莫司(图5C)、他克莫司(图5D)、霉酚酸(mycophenolate)(图5E)。

图6A-6D显示了环孢素A(CsA)、他克莫司(TAC)和伏环孢素(VCS)处理对人Calu-3细胞产生感染性SARS-CoV-2后代的影响。使用玻璃(图6A和图6C)或塑料实验室器皿(图6B和图6D)进行实验。使用由溶解在DMSO中的纯粉末制备的储备溶液，在不同浓度的VCS、CsA和TAC存在下，用SARS-CoV-2感染细胞。通过使用在24h p.i收获的上清液对Vero E6细胞的噬斑测定法来确定在感染细胞培养基中的病毒载量。通过比色活力测定法，平行地测量用相同范围的化合物浓度处理的未感染Calu-3细胞的活力(图6C；n＝12；图6D；n＝3)。显示了平均值±SD，并且通过单向ANOVA评估了每个浓度和溶剂对照之间的差异的统计显著性。*,p<0.1；**，p<0.01；***，p<0.001；****，p<0.0001。

图7A-7E显示了在用SARS-CoV-2感染的Vero E6细胞的CPE减少测定法中各种化合物对细胞活力的作用。通过CPE减少测定法，确定通过各种药物在Vero E6细胞中的SARS-CoV-2复制(彩色符号和曲线)。对于每种药物，测试了药物制剂的两倍连续稀释。VCS(图7A)、环孢素A/Neoral(图7B)、TAC/Prograf(图7C)、EVL/Certican(图7D)和MMF/Cellcept(图7E)。在用化合物预孵育后，用SARS-CoV-2感染细胞并在含有所述药物的培养基中保持3天，然后用比色测定测量细胞活力。使用模拟感染的化合物处理的细胞(灰色实线)平行地评价药物的细胞毒性。数据点代表两个独立实验的均值±SD。通过非线性回归分析确定CC₅₀和EC₅₀，并且将回归曲线绘制在图中(实线)。

图8A-8B显示了在用VCS药物制剂(图8A)或安慰剂(图8B)处理的Vero E6细胞中SARS-CoV-2复制的抑制，如通过CPE减少测定法所确定的。

图9显示了VCS粉末(3.2μM)、VCS药物制剂(3.2μM)、安慰剂制剂含量(对应于3.2μMVCS)和50％乙醇(阳性对照)在噬斑测定中的杀病毒活性。

图10A-10D显示了在具有由纯化合物粉末制备的储备溶液的CPE减少测定法中各种免疫抑制化合物对SARS-CoV-2复制的抑制。VCS(图10A)、CsA(图10B)、TAC(图10C)和MPA(图10D)。

具体实施方式

本文提供了治疗或预防受试者中的病毒感染的方法。在一些方面，方法涉及向受试者施用伏环孢素，比如治疗有效量的伏环孢素。在一些任何提供的实施方案中，受试者需要免疫抑制。

病毒感染会导致致命的后果，尤其是在弱势群体中。在2019年12月至2021年1月期间，严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-Co V-2)是冠状病毒病-2019(COVID-19)的病原体，已导致全球超过9000万例感染。更严重的COVID-19病程与实体器官移植受者中普遍存在的合并症有关(Zhou等人，Lancet.2020年3月28日；395(10229):1054-1062；Huang等人，Lancet.2020年2月15日；395(10223):497-506；Guan等人，Eur Respir J.2020年5月；55(5)doi:10.1183/13993003.00547-2020)。而且，初步报告显示，后者的COVID-19相关死亡风险增加(Williamson等人，Nature.2020年8月；584(7821):430-436)。具体而言，由于医学原因(例如，由于自身免疫性疾病或实体器官移植)，这些受试者经常需要间歇性、长期甚至终生的免疫抑制，并且感染和在病毒感染期间死亡的风险大幅增加。

在为移植受者制定免疫抑制方案时，需要在预防排斥和控制感染之间找到平衡。例如，肾移植受者(KTR)由于他们年龄较大、合并症和/或维持免疫抑制，其罹患更严重的COVID-19病程的风险增加。一些人建议降低在患有严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)感染的KTR中的免疫抑制。在KTR中，对更严重的COVID-19病程的免疫抑制以及最佳治疗的归因效应是需要的。不同的报告表明，免疫抑制未造成严重COVID-19疾病或死亡的风险增加(Li等人，J Heart Lung Transplant.2020年5月；39(5):496-497；Zhang等人，EurUrol.2020年6月；77(6):742-747；Guillen等人，Am J Transplant.2020年7月；20(7):1875-1878；Montagud-Marrahi等人，Am J Transplant.2020年10月；20(10):2958-2959)。然而，已观察到免疫受损的COVID-19患者的死亡率增加。由于疫苗在KTR中的功效不确定，因此治疗受试者特别是需要免疫抑制的受试者的方法是迫切需要的。一般而言，COVID-19表现出三阶段过程：从轻微的流感样症状开始，然后是病毒复制和肺炎的第二阶段，在一小部分病例中，随后是例如由于细胞因子风暴所致的威胁生命的疾病的第三阶段(Siddiqi等人，J Heart Lung Transplant.2020年5月)。预期抗病毒药物治疗在疾病的最早阶段最有效，而免疫抑制剂(例如类固醇、托珠单抗)可以视为疾病后期减轻炎症的治疗选项。免疫抑制方案可以理想地防止排斥，具有抗病毒特性并减轻(过度)炎症，同时仍能产生有效的抗病毒反应以同时预防严重的病程。某些推荐陈述降低但不完全停止免疫抑制，一些推荐基于体外观察到的优势与CNI一起使用类固醇。

在大多数移植中心的免疫抑制疗法的当前标准包括钙调神经磷酸酶抑制剂(CNI)、或他克莫司(TAC)或环孢素A(CsA)、抗代谢药物比如霉酚酸(MPA/MPS)和最常见的维持类固醇。可以按处方使用mTOR抑制剂比如依维莫司(EVL)替代MPA或代替CNI。人们对于免疫抑制对COVID-19病程的确切影响知之甚少。在疾病早期，(过度)免疫抑制可能会阻止适当的抗病毒反应，而稍后一些免疫抑制可能会防止病理性免疫过度激活，从而使疾病不太严重。因而，一些人推荐在感染SARS-CoV-2的KTR中减少但不完全放弃免疫抑制，这取决于排斥风险和疾病严重程度。

钙调神经磷酸酶抑制剂(CNI)是KTR中的基石免疫抑制剂，据报道其中一些具有抗RNA病毒的抗病毒活性。据报道，除MPA外，CNI和mTOR抑制剂(比如EVL)对人冠状病毒(比如SARS-CoV和中东呼吸综合征(MERS-)CoV)具有抗病毒活性。已显示环孢素A(CsA)在体外对多种RNA病毒具有抗病毒作用，所述病毒包括流感病毒(Ma等人，Antiviral Res.2016；133:62–72)、丙型肝炎病毒(Ishii等人，J Virol.2006；80(9):4510-4520)、HIV(Braaten等人，JVirol.1996；70(8):5170–5176)、诺如病毒(Dang等人，Antimicrobial Agents andChemotherapy 2017；61(11):1-17)和SARS-CoV(de Wilde等人，J Gen Virol.2011；92:2542–2548；Pfefferle等人，PLoS Pathog 2011；7(10):1-15)。不受理论束缚，CsA的抗病毒作用可涉及钙调神经磷酸酶依赖性和亲环素依赖性机制。在SARS-CoV的情况下，病毒Nsp1蛋白与亲环素A(CypA)相互作用，从而以钙调神经磷酸酶依赖性方式增强活化T细胞核因子(NFAT)驱动的细胞因子释放(Pfefferle等人，2011)。然而，CsA的所有体外模型及其对病毒复制的作用表明，它只有在远远超过人类认为安全的剂量下才有可能有效。

伏环孢素(VCS；也称为LX214或ISA247)是一种新的钙调神经磷酸酶抑制剂(CNI)，在结构上类似于CsA，不同之处是在分子的氨基酸1残基上的官能团的新修饰，这增强了它与钙调神经磷酸酶的结合，并赋予更好的代谢稳定性。已在银屑病、肾器官移植中进行了伏环孢素的研究，最近它被FDA批准与背景免疫抑制疗法联合用于治疗活动性狼疮肾炎。观察表明，VCS在治疗水平上比其类别中的其他免疫抑制剂更有效且毒性更小。而且，证明了VCS以CypA依赖性方式抑制诺如病毒复制，并且比CsA更有效。这种变化改变了伏环孢素与钙调神经磷酸酶的结合，并且与CsA相比在体外和体内都显示出结合亲和力提高了5倍(Kuglstatter等人，Acta Cryst.2011；D67:119-23)。通过使代谢离开氨基酸-1(CsA的主要代谢位点)，这种修饰还改变了伏环孢素的代谢特征。改变的代谢特征导致更快的代谢物消除，从而导致与CsA相比更低的代谢物暴露。与CsA相比，伏环孢素的效力增加和代谢物暴露减少的组合导致了更好的PK/PD关系、更低剂量的施用以及与CsA相比可能改善的安全性。伏环孢素具有如下所示并且在美国专利第7,332,472号中公开的结构，将所述专利通过引用完整并入本文。

与CsA类似，伏环孢素还结合CypA(Kuglstatter等人，Acta Cryst.2011；D67:119-23)。正因为如此，本文公开的方法可以使需要免疫抑制的患者保持健康状态(尽管他们有潜在健康状况)，并同时提供抗病毒作用。

所提供的实施方案基于如本文所述的观察，基于CNI、他克莫司、环孢素A和伏环孢素(VCS)以及在KTR中常用的其他免疫抑制剂在基于细胞的测定中对SARS-CoV-2复制的作用的比较。由于疫苗在KTR等免疫受损受试者中的效能不确定，并且有效(抗病毒)治疗选项有限，因此寻找替代解决方案对于保护这些受试者至关重要。如本文所示，CNI比其他类别的免疫抑制剂对SARS-CoV-2复制(在细胞培养中)显示出更有效的抑制作用。引人注目的是，VCS显示出比TAC低8倍浓度的抗病毒活性。可以将使SARS-CoV-2病毒载量降低的VCS浓度与KTR中可达到的人类可耐受剂量相关联。VCS在低微摩尔浓度下降低了人Calu-3细胞中的病毒后代产量，并且比环孢素A和他克莫司更有效。本文所述的观察证明了亲环素依赖性CNI特别是VCS的潜在益处。本文所述的结果表明，VCS对SARS-CoV-2复制具有强的抑制活性，即使在低浓度下也是如此，并且证明了VCS在治疗受试者特别是对于需要免疫抑制的受试者中的病毒感染(比如COVID-19)中的效用。伏环孢素还提供了这样的优势，即，它具有对钙调神经磷酸酶更高的亲和力和更低的肾毒性。伏环孢素还可以比血液中更高的浓度分布到肺等器官中，并且在红细胞中发现更高的浓度。因而，在特定器官或细胞中的较高浓度可能导致病毒抑制。因此，结果支持VCS在治疗病毒感染中的效用(特别是在有感染SARS-CoV-2风险或已感染SARS-CoV-2的KTR中)。

另外，本文所述的结果显示了出乎意料的观察。在免疫抑制化合物制剂中的药物赋形剂在基于细胞的测定中显示出抗病毒作用。出乎意料的是，结果并不是由于可以破坏病毒包膜的表面活性剂的杀病毒作用所致。为了避免在所述抗病毒测定中由赋形剂引起的干扰，各种免疫抑制化合物的高纯度粉末表明，改善药物制剂中活性化合物的溶解度和生物利用度的赋形剂也影响基于细胞的测定中的结果。由于伏环孢素的亲脂性并基于本文所述的结果，使用玻璃实验室器皿(其将VCS与塑料材料的结合最小化)评估了VCS和其他化合物的作用。结果表明，VCS在感染的Calu-3细胞中以剂量依赖性方式减少SARS-CoV-2感染性后代的产生，并且比CsA和TAC以及其他类别的免疫抑制剂(比如EVL和MPA)更有效。

I.治疗方法

本文提供了治疗或预防受试者中的病毒感染的方法，包括向受试者施用伏环孢素。还提供了伏环孢素在治疗或预防受试者中的病毒感染的用途。在一些方面，所提供的方法或用途包括采用治疗有效量的伏环孢素。在一些方面，受试者需要免疫抑制。在一些方面，通过抑制亲环素A(CypA)或CypA相关途径来改善病毒感染。

在一些实施方案中，提供了治疗或预防在有需要的受试者中的病毒感染的方法，包括向受试者施用治疗有效量的伏环孢素，其中通过抑制亲环素A(CypA)或CypA相关途径来改善病毒感染。在一些实施方案中，受试者需要免疫抑制。在一些实施方案中，通过抑制亲环素A(CypA)来改善病毒感染。在一些实施方案中，通过抑制CypA相关途径来改善病毒感染。

在一些方面，在提供的组合物、方法和用途中采用伏环孢素(也称为LX214或ISA247)、其治疗有效量和/或包含伏环孢素的组合物。用途包括伏环孢素或包含它的组合物在这样的方法(比如治疗方法)和治疗(例如治疗方案)中的用途，以及伏环孢素或包含它的组合物在制备药物中的用途，以便实施这样的治疗方法和治疗。还提供了用于治疗或预防病毒感染、减少病毒复制、改善与病毒感染相关的症状或降低疾病严重程度或死亡率的伏环孢素或包含它的组合物。在一些方面，这样的用途包括进行如本文所述的方法或治疗，比如任何治疗方法或治疗方案。在一些任何提供的实施方案中，伏环孢素或包含它的组合物作为单一疗法施用，例如，而不施用一种或多种另外的剂。在一些任何提供的实施方案中，施用伏环孢素或包含它的组合物，而不施用MMF和/或皮质类固醇。在一些任何提供的实施方案中，施用伏环孢素或包含它的组合物，而不施用治疗有效量的MMF和/或治疗有效量的皮质类固醇。

在一些实施方案中，方法或用途用于治疗病毒感染或病毒性感染。在一些实施方案中，方法或用途用于预防病毒感染或病毒性感染。在一些实施方案中，方法包括治疗病毒感染。在一些实施方案中，方法包括预防病毒感染。

在一些实施方案中，病毒感染是由以下病毒引起：冠状病毒科(例如，α冠状病毒、β冠状病毒、δ冠状病毒或γ冠状病毒)、正粘病毒科(例如，流感病毒)、黄病毒科(例如，黄病毒或肝炎病毒)或杯状病毒科(例如，诺如病毒)的成员。

在一些实施方案中，病毒感染是由冠状病毒科成员的病毒引起的。在一些实施方案中，病毒是α冠状病毒(例如，HCoV-229E或HCoV-NL63)、β冠状病毒(例如，HCoV-OC43、HCoV-HKU1、MERS-CoV、SARS-CoV或SARS-CoV-2)、δ冠状病毒或γ冠状病毒。

在一些实施方案中，病毒是α冠状病毒。在一些实施方案中，病毒是HCoV-229E或HCoV-NL63。在一些实施方案中，病毒是HCoV-229E。在一些实施方案中，病毒是HCoV-NL63。

在一些实施方案中，病毒是β冠状病毒。在一些实施方案中，病毒是HCoV-OC43、HCoV-HKU1、MERS-CoV、SARS-CoV或SARS-CoV-2。在一些实施方案中，病毒是MERS-CoV、SARS-CoV或SARS-CoV-2。在一些实施方案中，病毒是HCoV-OC43。在一些实施方案中，病毒是HCoV-HKU1。在一些实施方案中，病毒是HMERS-CoV。在一些实施方案中，病毒是SARS-CoV。在一些实施方案中，病毒是SARS-CoV-2。

在一些实施方案中，病毒是δ冠状病毒。在一些实施方案中，病毒是γ冠状病毒。

在一些实施方案中，病毒感染是由正粘病毒科(例如，流感病毒)成员的病毒引起的。

在一些实施方案中，病毒感染是由黄病毒科成员的病毒引起的。在一些实施方案中，病毒是黄病毒。在一些实施方案中，病毒是肝炎病毒。在一些实施方案中，病毒是丙型肝炎病毒。

在一些实施方案中，病毒感染是由杯状病毒科成员的病毒引起的。在一些实施方案中，病毒是诺如病毒。

II.剂量

在本文提供的方法和用途的一些实施方案中，施用伏环孢素每日四次、每日三次、每日两次或每日一次。在一些实施方案中，施用伏环孢素每日四次。在一些实施方案中，施用伏环孢素每日三次。在一些实施方案中，施用伏环孢素每日二次。在一些实施方案中，施用伏环孢素每日一次。

在一些实施方案中，伏环孢素的日剂量为约1mg至约250mg、约5mg至约250mg、约10mg至约250mg、约50mg至约250mg、约100mg至约250mg、约150mg至约250mg、约200mg至约250mg、1mg至约200mg、约5mg至约200mg、约10mg至约200mg、约50mg至约200mg、约100mg至约200mg、约150mg至约200mg、约1mg至约150mg、约5mg至约150mg、约10mg至约150mg、约50mg至约150mg、约100mg至约150mg、约1mg至约100mg、约5mg至约100mg、约10mg至约100mg、约50mg至约100mg、约1mg至约50mg、约5mg至约50mg或约10mg至约50mg。在一些实施方案中，伏环孢素的日剂量为约1mg、约5mg、约10mg、约20mg、约30mg、约40mg、约50mg、约60mg、约70mg、约80mg、约90mg、约100mg、约110mg、约120mg、约130mg、约140mg、约150mg、约160mg、约170mg、约180mg、约190mg、约200mg、约210mg、约220mg、约230mg、约240mg或约250mg。在一些实施方案中，伏环孢素的日剂量为至少约1mg、至少约5mg、至少约10mg、至少约20mg、至少约30mg、至少约40mg、至少约50mg、至少约60mg、至少约70mg、至少约80mg、至少约90mg、至少约100mg、至少约110mg、至少约120mg、至少约130mg、至少约140mg、至少约150mg、至少约160mg、至少约170mg、至少约180mg、至少约190mg或至少约200mg。

在一些实施方案中，伏环孢素的剂量为约0.1mg/kg/天至约2mg/kg/天、约0.5mg/kg/天至约2mg/kg/天、约1mg/kg/天至约2mg/kg/天、约1.5mg/kg/天至约2mg/kg/天、约0.1mg/kg/天至约1.5mg/kg/天、约0.5mg/kg/天至约1.5mg/天kg/天、约1mg/kg/天至约1.5mg/kg/天、约0.1mg/kg/天至约1.0mg/kg/天、约0.5mg/kg/天至约1.0mg/kg/天或约0.1mg/kg/天至约0.5mg/kg/天。在一些实施方案中，伏环孢素的剂量为约0.1、约0.2、约0.3、约0.4、约0.5、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.1、约1.2、约1.3、约1.4、约1.5、约1.6、约1.7、约1.8、约1.9或约2.0mg/kg/天。在一些实施方案中，伏环孢素的剂量为至少约0.1、至少约0.2、至少约0.3、至少约0.4、至少约0.5、至少约0.6、至少约0.7、至少约0.8、至少约0.9、至少约1.0、至少约1.1、至少约1.2、至少约1.3、至少约1.4、至少约1.5、至少约1.6、至少约1.7、至少约1.8、至少约1.9或至少约2.0mg/kg/天。

在一些实施方案中，适合的剂量以约7.9mg的增量增加。在一些实施方案中，伏环孢素的剂量为约7.9mg QD、约15.8mg QD、约23.7mg QD、约31.6mg QD、约39.5mg QD、约47.4mg QD、约55.3mg QD、约63.2mg QD、约71.1mg QD、约79.0mg QD、约86.9mg QD、约94.8mg QD、约102.7mg QD或约110.6mg QD。在一些实施方案中，伏环孢素的剂量为约7.9mgBID、约15.8mg BID、约23.7mg BID、约31.6mg BID、约39.5mg BID、约47.4mg BID或约55.3BID。

在一些实施方案中，血谷水平为约25至约60ng/mL。在一些实施方案中，血谷水平为约25、约30、约35、约40、约45、约50、约55或约60ng/mL。

在一些实施方案中，治疗有效量是等于、可外推至、可实现或能实现约0.05μM至约10μM、约0.1μM至约5μM、约0.2μM至约2.5μM、约0.3μM至约1.0μM、约0.4μM至约0.9μM、约0.5μM至约0.8μM、约0.1μM至约0.5μM、或约0.2μM至约0.4μM浓度的C_max的量。在一些实施方案中，治疗有效量是等于、可外推至、可实现或能实现约0.05、约0.1、约0.15、约0.2、约0.25、约0.3、约0.35、约0.4、约0.45、约0.5、约0.55、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约6.0、约7.0、约8.0、约9.0或约10.0μM或更低浓度的C_max的量。在一些实施方案中，治疗有效量是等于、可外推至、可实现或能实现约0.2μM浓度的C_max的量。在一些实施方案中，治疗有效量是等于、可外推至、可实现或能实现约0.3μM浓度的C_max的量。在一些实施方案中，治疗有效量是等于、可外推至、可实现或能实现约0.4μM浓度的C_max的量。在一些实施方案中，治疗有效量是等于、可外推至、可实现或能实现约0.5μM浓度的C_max的量。

A.剂量调整

在本文公开的方法和用途的一些实施方案中，方法或治疗还包括或涉及监测受试者的肾功能。在本文公开的方法的一些实施方案中，方法还包括监测受试者的肾功能。用于评估剂量减少可取性的一个关键参数是使用CKD-EP1公式或其他适当方法的估算肾小球滤过率(eGFR)。eGFR下降是治疗期间可发生的负面副作用。如果下降太严重，则应改变剂量。

在一些实施方案中，监测受试者的肾功能包括：

(a)在不同日期的至少第一时间点和第二时间点评估受试者的估算肾小球滤过率(eGFR)；和

(b)(i)如果受试者的eGFR在第一和第二时间点之间下降超过目标％至预定值以下，则减少每日剂量或停止向受试者施用伏环孢素；

(ii)如果受试者的eGFR在第一和第二时间点之间下降少于目标％，则继续向受试者施用相同的每日剂量的伏环孢素。

在一些实施方案中，第一时间点是在治疗开始之前、在治疗开始时或在治疗期间。在一些实施方案中，第一时间点是在伏环孢素的任何施用之前的治疗的第一天。

在一些实施方案中，预定值是约50至约90ml/min/1.73m²。在一些实施方案中，预定值是约50、约55、约60、约65、约70、约75、约80、约85或约90ml/min/1.73m²。

在一些实施方案中，目标％为约20％至约45％。在一些实施方案中，目标％为约20％、约25％、约30％、约35％、约40％或约45％。

B.施用途径

在本文公开的方法和用途的一些实施方案中，可以任何适合的形式并且通过任何适合的途径施用伏环孢素，所述途径将提供用于治疗或预防病毒感染的足够水平的伏环孢素，例如通过肠内施用(例如，口服施用、舌下施用或直肠施用)或肠胃外施用(例如，静脉内注射、肌内注射、皮下注射、静脉内输注或吸入/吹入)。

在一些实施方案中，通过肠内施用来施用伏环孢素。肠内施用的示例性途径包括但不限于口服施用、舌下施用和直肠施用(例如，通过直肠)。在一些实施方案中，肠内施用包括口服施用。在一些实施方案中，肠内施用包括舌下施用。在一些实施方案中，肠内施用包括直肠施用。

在一些实施方案中，通过肠胃外施用来施用伏环孢素。肠胃外施用的示例性途径包括但不限于静脉内注射、肌内注射、皮下注射、静脉内输注和吸入/吹入。在一些实施方案中，肠胃外施用包括静脉内注射。在一些实施方案中，肠胃外施用包括肌内注射。在一些实施方案中，肠胃外施用包括皮下注射。在一些实施方案中，肠胃外施用包括静脉内输注。在一些实施方案中，肠胃外施用包括吸入/吹入。

在一些实施方案中，通过吸入或吹入施用伏环孢素。用于吸入和/或吹入的示例性类型的制剂包括但不限于用于吸入器或吹入器的喷雾剂、气溶胶、细雾剂、胶囊、粉末或药筒以及用于雾化的溶液/混悬剂。在一些实施方案中，以气溶胶、喷雾剂、细雾剂或粉末的形式施用伏环孢素。在一些实施方案中，以气溶胶的形式施用伏环孢素。用于通过吸入或吹入施用的各种类型的装置的实例包括但不限于雾化器、计量吸入器(MDI)和干粉吸入器。

C.组合

在本文提供的方法和用途的一些实施方案中，方法或治疗还涉及施用治疗有效量的霉酚酸吗啉乙酯(MMF)和/或皮质类固醇。在本文公开的方法的一些实施方案中，方法还包括施用治疗有效量的MMF和/或皮质类固醇。在一些实施方案中，方法包括施用治疗有效量的MMF。在一些实施方案中，方法包括施用治疗有效量的皮质类固醇。

在一些实施方案中，方法包括施用伏环孢素，而不施用治疗有效量的MMF和/或治疗有效量的皮质类固醇。

在本文提供的方法和用途的一些实施方案中，方法或治疗还涉及施用治疗有效量的另外的抗病毒剂。在一些实施方案中，方法还包括施用治疗有效量的另外的抗病毒剂。在一些实施方案中，另外的抗病毒剂是瑞德西韦、洛匹那韦/利托那韦、IFN-α、洛匹那韦、利托那韦、喷昔洛韦、加利司韦、双硫仑、地瑞那韦、考比司他、ASC09F、双硫仑、萘莫司他、格瑞弗森、阿拉泊韦、氯喹、羟氯喹、硝唑尼特、巴洛沙韦玛波西酯、奥司他韦、扎那米韦、帕拉米韦、金刚烷胺、金刚乙胺、法匹拉韦、拉尼米韦、利巴韦林、乌米诺韦或它们的任何组合。在一些实施方案中，抗病毒剂是氯喹。在一些实施方案中，抗病毒剂是羟氯喹。在一些实施方案中，抗病毒剂是瑞德西韦。

III.组合物

在本文提供的方法和用途的一些实施方案中，方法或治疗涉及施用包含伏环孢素的组合物，比如药物组合物或治疗组合物。在一些实施方案中，本文公开的方法包括施用包含伏环孢素的组合物。在一些实施方案中，组合物包含伏环孢素及其Z-同工型的异构体混合物。在一些实施方案中，异构体混合物包含按重量计至少约99％、约98％、约97％、约96％、约95％、约94％、约93％、约92％、约91％、约90％、约80％、约70％、约60％、约50％、约40％、约30％、约20％或约10％的伏环孢素。在一些实施方案中，异构体混合物包含按重量计至少95％的伏环孢素。

在提供的方法和用途的一些实施方案中，包含伏环孢素的组合物是或包含包含伏环孢素的药物制剂。在一些实施方案中，包含伏环孢素的药物组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂、缓冲剂、载体和/或媒介物。

在一些实施方案中，组合物含有适用于所考虑的施用类型的常规药物载体和赋形剂。

在一些实施方案中，可以将包含伏环孢素的组合物配制在药学上可接受的缓冲液(比如含有药学上可接受的载体或媒介物的缓冲液)中。通常，药学上可接受的载体或媒介物，比如存在于药学上可接受的缓冲液中的那些，可以是本领域已知的任何一种。Remington’s Pharmaceutical Sciences,by E.W.Martin,Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,第19版(1995)，描述了适用于一种或多种治疗化合物的药物递送的组合物和制剂。通常根据监管机构或其他机构的批准按照用于动物和人的公认的药典来制备药学上可接受的组合物。

药物组合物可包括与所述化合物一起施用的载体，比如稀释剂、佐剂、赋形剂或媒介物。适合的药物载体的实例描述于E.W.Martin的“Remington’s PharmaceuticalSciences”中。这样的组合物将含有通常为纯化形式的治疗有效量的化合物以及适量的载体，以便提供对患者正确施用的形式。这样的药物载体可以是无菌液体，比如水和油，包括石油、动物、植物或合成来源的那些。当药物组合物经静脉内施用时，水是典型的载体。也可以采用盐水溶液和葡萄糖水溶液和甘油溶液作为液体载体，特别是用于注射溶液。如果需要，组合物还可以含有少量润湿剂或乳化剂，或pH缓冲剂。通常，使用本领域熟知的技术和程序将含有所述化合物的组合物配制成药物组合物(参见例如，Ansel Introduction toPharmaceutical Dosage Forms，第四版，1985,126)。通常，配制方式是施用途径的根据。

在一些实施方案中，药学上可接受的赋形剂、缓冲剂、载体和/或媒介物是包括以下中的一种或多种：醇、D-α-生育酚(维生素E)聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、聚山梨酯20(吐温20)、聚山梨酯40(吐温40)、中链甘油三酯、明胶、山梨糖醇、甘油、氧化铁黄、氧化铁红、二氧化钛和水。在美国专利第7,060,672；7,429,562和7,829,533号中也描述了伏环孢素混合物的各种制剂。

IV.患者群体

在一些实施方案中，将要根据本文提供的方法和用途进行治疗的受试者包括有病毒感染风险或已患有病毒感染的受试者。在一些实施方案中，将要根据本文提供的方法和用途进行治疗的受试者包括需要免疫抑制的受试者。在一些方面，受试者需要免疫抑制并且有病毒感染的风险或已患有病毒感染。在一些实施方案中，将要根据本文提供的方法和用途进行治疗的受试者包括需要免疫抑制(例如，由于移植排斥的风险所致)的受试者。在一些方面，受试者是移植(比如器官移植、组织移植或细胞移植)的候选者，并且受试者需要免疫抑制。

在一些实施方案中，在本文公开的方法中涉及的受试者患有自身免疫性疾病或与移植排斥相关的病症。在一些任何提供的实施方案中，受试者是肾移植受者(KTR)。

在一些实施方案中，受试者患有与移植排斥相关的病症。在一些实施方案中，病症与心脏、肺、肝脏、肾脏、胰腺、皮肤、肠或角膜移植排斥相关。在一些实施方案中，病症与心脏移植排斥相关。在一些实施方案中，病症与肺移植排斥相关。在一些实施方案中，病症与肝脏排斥相关。在一些实施方案中，病症与肾移植排斥相关。在一些实施方案中，病症与胰腺移植排斥相关。在一些实施方案中，病症与皮肤移植排斥相关。在一些实施方案中，病症与肠移植排斥相关。在一些实施方案中，病症与角膜移植排斥相关。

在一些实施方案中，受试者患有自身免疫性疾病。自身免疫性疾病的实例包括但不限于自身免疫性血液病(包括例如溶血性贫血、再生障碍性贫血、纯红细胞性贫血和特发性血小板减少症)、系统性红斑狼疮、狼疮性肾炎、多软骨炎、硬皮病(sclerodoma)、韦格纳肉芽肿病、皮肌炎、慢性活动性肝炎、重症肌无力、银屑病、史蒂文-约翰逊综合征、特发性脂肪泻、(自身免疫性)炎性肠病(包括例如溃疡性结肠炎和克罗恩病)、内分泌性眼病、格雷夫斯病、结节病、多发性硬化、原发性胆汁性肝硬化、青少年糖尿病(I型糖尿病)、葡萄膜炎(前部和后部)、干燥性角结膜炎和春季角结膜炎、间质性肺纤维化、银屑病关节炎、肾小球肾炎(伴有或不伴有肾病综合征，例如包括特发性肾病综合征或微小病变肾病)和幼年型皮肌炎。

V.定义

如本文和所附权利要求中使用的，除非上下文另外明确指示，单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数形式。

如本文使用的，除非另有说明，当与剂量或量结合使用时，术语“约”和“大约”表示在指定剂量或量的10％之内、5％之内、4％之内、3％之内、2％之内、1％之内或0.5％之内。

如本文使用的，“治疗有效量”指示对病症产生期望的药理学和/或生理学作用的量。就完全或部分预防病症或其症状而言，所述作用可以是预防性的，并且/或者就部分或完全治愈病症和/或可归因于所述病症的副作用而言，所述作用可以是治疗性的。

如本文使用的，“治疗(treat)”、“治疗(treating)”或“治疗(treatment)”是指获得有益或期望的结果(包括临床结果)的方法。有益的或期望的结果包括但不限于以下一项或多项：减少由疾病或疾患引起的一种或多种症状、降低疾病或疾患的程度、稳定疾病或疾患(例如，防止或延迟疾病或疾患的恶化)、延迟疾病或疾患的发生或复发、延迟或减缓疾病或疾患的进展、改善疾病或疾患状态、提供疾病或疾患的缓解(无论部分还是全部)、减少治疗疾病或疾患所需的一种或多种其他药物的剂量、增强用于治疗疾病或病症的另一种药物的作用、延缓疾病或疾患的进展、提高生活质量和/或延长患者的生存期。“治疗”还包括疾病或疾患的病理结果的减轻。本公开的方法涵盖这些治疗方面中的任何一个或多个。

术语“受试者”是指动物，包括但不限于灵长类动物(例如，人)、猴、母牛、猪、绵羊、山羊、马、狗、猫、兔、大鼠或小鼠。例如，在提及诸如人的哺乳动物受试者时，术语“受试者”和“患者”在本文中可互换使用。

VI.示例性实施方案

其中提供的实施方案为：

1.一种治疗或预防受试者中的病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的伏环孢素。

2.如实施方案2所述的方法，其中所述受试者需要免疫抑制。

3.如实施方案1或2所述的方法，其中通过抑制亲环素A(CypA)或CypA相关途径来改善所述病毒感染。

4.一种治疗或预防需要免疫抑制的受试者中的病毒感染的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的伏环孢素，其中通过抑制亲环素A(CypA)或CypA相关途径来改善所述病毒感染。

5.一种包含伏环孢素的组合物，其用于治疗或预防受试者中的病毒感染，其中所述组合物包含治疗有效量的伏环孢素并且被施用于所述受试者。

6.一种如实施方案5所述使用的组合物，其中所述受试者需要免疫抑制。

7.一种如实施方案5或6所述使用的组合物，其中通过抑制亲环素A(CypA)或CypA相关途径来改善所述病毒感染。

8.一种包含伏环孢素的组合物，其用于治疗或预防需要免疫抑制的受试者中的病毒感染，其中所述组合物包含治疗有效量的伏环孢素并且被施用于所述受试者，并且其中通过抑制亲环素A(CypA)或CypA相关途径来改善所述病毒感染。

9.伏环孢素在治疗或预防受试者中的病毒感染中的用途，其中所述受试者被施用治疗有效量的伏环孢素。

10.伏环孢素在制造用于治疗或预防受试者中的病毒感染的药剂中的用途，其中所述药剂包含治疗有效量的伏环孢素并且被施用于所述受试者。

11.如实施方案9或10所述的用途，其中所述受试者需要免疫抑制。

12.如实施方案9-11中任一项所述的用途，其中通过抑制亲环素A(CypA)或CypA相关途径来改善所述病毒感染。

13.伏环孢素在治疗或预防需要免疫抑制的受试者中的病毒感染中的用途，其中所述受试者被施用治疗有效量的伏环孢素；并且其中通过抑制亲环素A(CypA)或CypA相关途径来改善所述病毒感染。

14.伏环孢素在制造用于治疗或预防需要免疫抑制的受试者中的病毒感染的药剂中的用途，其中所述药剂包含治疗有效量的伏环孢素并且被施用于所述受试者；并且其中通过抑制亲环素A(CypA)或CypA相关途径来改善所述病毒感染。

15.如实施方案1-14中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述病毒感染是由冠状病毒科成员的病毒引起的。

16.如实施方案15所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述病毒是α冠状病毒、β冠状病毒、δ冠状病毒或γ冠状病毒。

17.如实施方案15或16所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述病毒是人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、人冠状病毒229E(HCoV-229E)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)或严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。

18.如实施方案15-17中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述病毒是MERS-CoV、SARS-CoV或SARS-CoV-2。

19.如实施方案15-18中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述病毒是SARS-CoV-2。

20.如实施方案1-19中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述治疗有效量为约0.1mg/kg/天至约2mg/kg/天。

21.如实施方案1-20中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述治疗有效量为约7.9mg BID、约15.8mg BID、约23.7mg BID、约31.6mg BID、约39.5mg BID、约47.4mg BID或约55.3BID。

22.如实施方案1-20中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述治疗有效量为约7.9mg QD、约15.8mg QD、约23.7mg QD、约31.6mg QD、约39.5mg QD、约47.4mg QD、约55.3mg QD、约63.2mg QD、约71.1mg QD、约79.0mg QD、约86.9mg QD、约94.8mg QD、约102.7mg QD或约110.6mg QD。

23.如实施方案1-20中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述治疗有效量等于或可实现以下浓度：约0.05μM和约10μM之间、约0.1μM和约5μM之间、约0.2μM和约2.5μM之间、约0.3μM和约1.0μM之间、约0.4μM和约0.9μM之间、约0.5μM和约0.8μM之间、约0.1μM和约0.5μM之间、或约0.2μM和约0.4μM之间、或约0.05、约0.1、约0.15、约0.2、约0.25、约0.3、约0.35、约0.4、约0.45、约0.5、约0.55、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约6.0、约7.0、约8.0、约9.0或约10.0μM或更低。

24.如实施方案1-23中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，其中监测所述受试者的肾功能。

25.如实施方案24所述的方法、使用的组合物或用途，其中监测所述受试者的肾功能包括：

(a)在不同日期的至少第一时间点和第二时间点评估受试者的估算肾小球滤过率(eGFR)；和

(b)(i)如果受试者的eGFR在第一和第二时间点之间下降超过目标％至预定值以下，则减少每日剂量或停止向受试者施用伏环孢素；

(ii)如果受试者的eGFR在第一和第二时间点之间下降少于目标％，则继续向受试者施用相同的每日剂量的伏环孢素。

26.如实施方案25所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述预定值为约50至约90ml/min/1.73m2。

27.如实施方案25或26所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述预定值为约60ml/min/1.73m2。

28.如实施方案25-27中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述目标％为约20％至约45％。

29.如实施方案25-28中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述目标％为约20％。

30.如实施方案1-29中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述受试者患有自身免疫性疾病或与移植排斥相关的病症。

31.如实施方案1-30中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述受试者患有与移植排斥相关的病症。

32.如实施方案30或31所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述病症与心脏、肺、肝脏、肾脏、胰腺、皮肤、肠或角膜移植排斥相关。

33.如实施方案30-32中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述病症与肾移植排斥相关。

34.如实施方案30所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述受试者患有自身免疫性疾病。

35.如实施方案1-34中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，其中施用治疗有效量的伏环孢素而不施用治疗有效量的霉酚酸吗啉乙酯(MMF)和/或皮质类固醇。36.如实施方案1-34中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，还包括施用治疗有效量的霉酚酸吗啉乙酯(MMF)和/或治疗有效量的皮质类固醇。

37.如实施方案1-36中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，其中通过肠内施用、口服施用、舌下施用或直肠施用、肠胃外施用、静脉内注射、肌内注射、皮下注射、静脉内输注或吸入/吹入来施用伏环孢素。

38.如实施方案37所述的方法、使用的组合物或用途，其中通过肠内施用、口服施用、舌下施用或直肠施用来施用伏环孢素。

39.如实施方案37或38所述的方法、使用的组合物或用途，其中通过口服施用来施用伏环孢素。

40.如实施方案37所述的方法、使用的组合物或用途，其中通过肠胃外施用、静脉内注射、肌内注射、皮下注射、静脉内输注或吸入/吹入来施用伏环孢素。

41.如实施方案37或40所述的方法、使用的组合物或用途，其中通过吸入或吹入来施用伏环孢素。

42.如实施方案41所述的方法、使用的组合物或用途，其中以气溶胶的形式施用伏环孢素。

43.如实施方案1-42中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，其中以药物组合物的形式施用伏环孢素。

44.如实施方案43所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。

45.如实施方案44所述的方法、使用的组合物或用途，其中所述药学上可接受的赋形剂独立地选自以下中的一种或多种，包括：醇、D-α-生育酚(维生素E)聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、聚山梨酯20(吐温20)、聚山梨酯40(吐温40)、中链甘油三酯、明胶、山梨糖醇、甘油、氧化铁黄、氧化铁红、二氧化钛和水。

46.如实施方案1-45中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，其中受试者中的病毒载量在施用伏环孢素后降低。

47.如实施方案1-46中任一项所述的方法、使用的组合物或用途，其中受试者的生存期在施用伏环孢素后延长。

VII.实施例

下面的实施例仅仅是为了说明的目的而被包括在内，并非意在限制本发明的范围。

实施例1

为了研究抑制SARS-CoV-2的细胞病变效应(CPE)的候选化合物，在感染SARS-CoV-2之前，将Vero E6细胞(非洲绿猴肾上皮细胞)与伏环孢素、环孢素A(CsA)或他克莫司预孵育，随后评估活力。

方法

使Vero E6细胞在96孔板中生长，并与培养基、载体以及伏环孢素(0.8-100μM)、CsA(0.8-100μM)或他克莫司(0.8-100μM)预孵育60分钟。然后在指定浓度的相应化合物存在下，所述细胞未感染或以感染复数(MOI)0.015使所述细胞感染SARS-CoV-2持续60分钟。随后，从培养基中除去病毒，用PBS洗涤细胞并进一步用具有相应化合物的新鲜培养基孵育，直到未处理的感染的对照细胞显示出完全CPE时为止(3天)。在孵育结束时，对细胞进行MTS活力测定，随后在酶标仪中进行吸光度分析之前将其固定(图1A)。使用MTS测定法评估细胞的活力，以确定化合物的细胞毒性(未感染细胞)和病毒的细胞毒性。

结果

他克莫司不能保护感染细胞免受病毒诱导的细胞病变效应，这在使用高达25μM的剂量时是明显的，之后观察到与化合物相关的细胞毒性。或者，CsA的保护作用发生在1.6-12μM之间，之后该化合物具有细胞毒性。用0.8μM伏环孢素处理感染细胞提供了与模拟感染的对照相同的细胞活力水平的病毒保护。

如图1B中所示，伏环孢素在浓度低于2μM时显示对未感染细胞没有毒性，而第4批伏环孢素在浓度高达10μM时显示对未感染细胞没有毒性。另一方面，所有测试批次的伏环孢素在0.01μM至1μM浓度下均以剂量依赖性方式促进SARS-CoV-2的CPE的抑制，如感染细胞活力的增加所示。对于所有批次的伏环孢素，0.8μM处理可有效地将细胞活力保持在对未感染细胞观察到的水平。

如图1C所示，与他克莫司(EC₅₀约25μM)相比，伏环孢素能够以低得多的浓度(EC₅₀约0.4μM)抑制SARS-CoV-2。另外，在浓度高于25μM时，他克莫司处理导致化合物相关的细胞毒性(数据未显示)。这些结果表明，伏环孢素在不影响测试细胞的活力的浓度范围内对SARS-CoV-2表现出体外抑制作用。

实施例2

为了研究伏环孢素在体外对SARS-CoV-2的作用，在感染SARS-CoV-2之前，将VeroE6细胞或Calu细胞(人支气管气道上皮细胞)与伏环孢素预孵育，随后收获，通过噬斑测定确定病毒载量。

方法

使Vero E6细胞和Calu在96孔板中生长，并与0.01μM至10.00μM的伏环孢素预孵育60分钟。然后在指定浓度的伏环孢素存在下，以MOI 1使细胞感染SARS-CoV-2持续60分钟。随后，从培养基中除去病毒，用PBS洗涤细胞，并进一步用具有指定浓度伏环孢素的新鲜培养基孵育16小时。在孵育结束时，收获培养基，通过噬斑测定确定病毒载量。为了展示感染量，还对相应细胞进行了病毒NSP4的染色，如通过荧光显微镜检查可视化。

结果

如图2A-2C所示，伏环孢素在Vero E6细胞和Calu细胞中以剂量依赖性方式抑制SARS-CoV-2病毒载量。第2批伏环孢素在E6细胞中以0.01至1.00μM的剂量依赖性方式抑制SARS-CoV-2病毒载量，并且随着浓度增加至1.00μM以上，病毒滴度降低至检测限(图2A)。类似地，第3批伏环孢素以0.01至4.00μM的剂量依赖性方式分别在E6和人Calu细胞中抑制SARS-CoV-2病毒载量(图2B)。如图2C所示，伏环孢素以剂量依赖性方式减少SARS-CoV-2感染细胞的量，正如在病毒NSP4的荧光染色方面的减少所反映的。

实施例3

为了评价伏环孢素治疗对于预防肾移植患者排斥的有效性和安全性，向从头肾移植患者施用伏环孢素或他克莫司，并评估了排斥和其他不良结局。

方法

从头肾移植受者被纳入一项为期6个月、2b期、多中心、随机、开放标签的研究。从头肾移植受者以每天两次(BID)接受施用高剂量伏环孢素(0.8mg/kg)、中等剂量伏环孢素(0.6mg/kg)、低剂量伏环孢素(0.4mg/kg)或标准剂量的他克莫司(0.05mg/kg)。另外，所有受试者均接受静脉内达利珠单抗或巴利昔单抗(根据产品标签给药)的诱导免疫抑制，并在研究期间接受MMF和皮质类固醇的伴随治疗。在180天的过程中测量了伏环孢素或他克莫司的血谷水平。记录不良反应并基于Banff分类评估肾移植排斥。在第3个月和第6个月的时间点，分析不良反应。还记录了在第6个月的时间点的移植物存活率和患者存活率。

结果

如图3所示，对于低剂量组、中等剂量组和高剂量组，伏环孢素的血谷水平(C₀)在第0-3个月分别为20-30ng/mL、35-50ng/mL和60-85ng/mL；并且相应地在第3-6个月为11-20ng/mL、21-30ng/mL和31-40ng/mL。相比之下，对于他克莫司标准剂量，血谷水平在第0-3个月为7-20ng/mL；并且在第0-6个月为5-15ng/mL。

通过移植物排斥率评估伏环孢素施用的临床影响。如表1所示，正如活检证实的急性排斥(BPAR)所示，与标准剂量他克莫司组相比，中等剂量伏环孢素组(0.6mg/kg BID)显示出相似的排斥率。低剂量、中等剂量和高剂量伏环孢素组移植后新发糖尿病(NODAT)的发生率分别为1.6％、5.7％和17.7％，相比较的他克莫司标准剂量组为16.4％。低剂量、中等剂量和高剂量伏环孢素组的Nankivell eGFR(肾功能指标)分别为：71、72和68mL/min，相比较的他克莫司标准剂量组为69mL/min。这项为期6个月的研究表明，VCS在预防急性排斥方面与TAC一样有效，其中在低剂量和中等剂量组中的肾功能相似，并且可能与降低的NODAT发生率相关。

表1：在伏环孢素或他克莫司治疗下移植后6个月急性排斥的发生率

实施例4

从一项对活动性狼疮肾炎患者的研究收集药代动力学数据。各种剂量的谷浓度见表2。PK证明剂量与谷浓度的线性关系，因此正在进行的临床试验不需要使用治疗药物监测。

表2.剂量谷浓度

剂量	谷浓度
		39.5mg po BID	32.7ng/mL
23.7mg po BID	21.1ng/mL
		7.9mg po BID	7.3ng/mL

实施例5

为了评价伏环孢素在SARS-CoV-2阳性肾移植患者中的抗病毒作用，将显示出轻度至中度SARS-CoV-2症状的肾移植受者纳入一项评估泼尼松和他克莫司联合治疗效果的研究。

方法

将SARS-CoV-2阳性肾移植患者纳入一项关于伏环孢素治疗的开放标签、单中心、探索性研究。根据当前的当地指南(针对COVID阳性移植患者的LUMC移植中心治疗指南)，在进入研究之前或之时，将受试者的标准免疫抑制治疗降低为泼尼松和他克莫司的双重治疗。在第1天之前，疑似COVID-19感染的肾移植受者接受SARS-CoV-2诊断测试并对该研究知情同意。一旦证实COVID-19感染，在知情同意后，受试者将被随机分配到研究组中，并相应地执行第1天的研究程序。具体地说，在研究期间，30名受试者中有15名仍在接受泼尼松和他克莫司治疗，而其他15名受试者从他克莫司切换为伏环孢素。以6粒胶囊(每粒7.9mg)BID给予伏环孢素，治疗期长达1年(图4)。在研究期间进行安全药物监测，以确保伏环孢素谷浓度维持在25-60ng/mL之间，他克莫司谷浓度维持在3-7ng/mL之间。如果谷水平不在这些水平之内，则进行剂量调整。

第2-14天，受试者每天进行家庭监测；第16-28天，他们每隔一天接受一次家庭监测。通过视频咨询进行家庭监测，包括体温、血压、脉搏、体重、呼吸频率和氧饱和度的自我测量，作为SARS-CoV-2的细胞病变效应(CPE)的读出。另外，受试者正在收集第一天早晨的咽喉拭子以评估病毒载量。

受试者还被排定在第4天(第2次访问)、第7天(第3次访问)、第14天(第4次访问)和第28天(第5次访问/研究结束/早期终止访问)进行4次临床访问(图4)。在访问期间还收集了第一天早晨的咽喉拭子。在第28天之后，继续延长受试者的安全性随访，在第42、90、180、270和360天进行访问以维持评估。研究药物分配给那些选择在第5次访问之后继续使用伏环孢素长达1年的受试者。

结果

对于接受泼尼松和他克莫司治疗的受试者与接受泼尼松和伏环孢素治疗的受试者，比较了他们的SARS-CoV-2病毒滴度以及细胞病变效应。预期伏环孢素组的受试者与他克莫司组相比具有更有效的病毒载量降低，并且CPE不太严重。

还比较了接受强的松和他克莫司治疗的受试者和接受强的松和伏环孢素治疗的受试者的移植排斥、移植后新发糖尿病和其他副作用。预期在与他克莫司组比较时，伏环孢素组的受试者具有相当或更低的移植排斥、糖尿病和副作用发生率。

实施例6

通过将这些药物的药物制剂溶解在DMSO中制备伏环孢素(Aurinia)、环孢素(Novartis)、他克莫司(Astellas)、霉酚酸(Roche)和依维莫司(Novartis)储备溶液(因此在图5A-5E中的浓度是估计浓度)。用SARS-CoV-2(感染复数0.015)感染96孔细胞培养板中的Vero E6细胞(约20,000个细胞/孔)，然后在具有连续稀释的免疫抑制剂的150μl培养基中孵育。在感染后三天通过MTS测定将病毒诱导的细胞死亡定量，并在495nm处测量吸收。平行地评估非感染细胞的活力以确定药物细胞毒性。对每种药物进行了两次独立实验(一式四份)。使用GraphPad Prism v8.0的非线性回归来确定50％有效浓度(EC₅₀)，定义为抑制50％的病毒诱导的细胞死亡的浓度，以及50％细胞毒性浓度(CC₅₀)，将未感染细胞的活力降低到未处理的对照细胞的活力50％的浓度。如图5A-5E所示，仅伏环孢素(图5A)、环孢素(图5B)、他克莫司(图5D)和霉酚酸(图5E)抑制病毒诱导的细胞死亡，其中EC₅₀值分别为0.27、3.2、12和3.1μM。

他克莫司(图5D)和环孢素(图5B)的EC₅₀浓度在体内相应浓度下可能是有毒的。然而，如图5A所示，与他克莫司和环孢素相比，伏环孢素维持细胞活力并抑制SARS-CoV-2病毒复制的浓度分别低大约40倍和10倍。伏环孢素的EC₅₀在移植患者中观察到的C_max范围内。

实施例7：VCS、CsA和TAC对Calu-3细胞中SARS-CoV-2复制的抑制

使用基于细胞的测定法，进行CPE减少测定和病毒产量减少测定，以评价三种钙调磷酸酶抑制剂环孢素A(CsA)、他克莫司(TAC)和伏环孢素(VCS)以及在肾移植受者(KTR)中常用的其他免疫抑制剂对SARS-CoV-2复制的作用。

方法

病毒和细胞系

在2020年3月从莱顿大学医学中心(LUMC)的鼻咽样本中分离SARS-CoV-2/Leiden-0002(GenBank MT510999)。用已在Vero E6细胞中传代两次的病毒原液进行感染。如前所述培养Vero E6细胞和Calu-3 2B4细胞(Tseng等人，J Virol.2005年8月；79(15):9470-9)，在本文中称为Calu-3细胞(Salgado-Benvindo等人，Antimicrob Agents Chemother.2020年7月22日；64(8)doi:10.1128/AAC.00900-20)。在具有25mM HEPES(Lonza)、2％ FCS、2mM L-谷氨酰胺和抗生素(EMEM-2％ FCS)的Eagle最低必需培养基(EMEM；Lonza)中进行感染。所有关于感染性SARS-CoV-2的实验都在LUMC的3级生物安全设施中进行。

免疫抑制化合物

通过将伏环孢素(VCS；Lupkynis^TM)、环孢素A(CsA；

Novartis)、他克莫司(TAC；/>

Astellas)、霉酚酸吗啉乙酯(MMF；/>

Roche)或依维莫司(EVL；/>

Novartis)的药物制剂溶解在二甲亚砜(DMSO)中制备这些药物的储备溶液。获得安慰剂胶囊和纯VCS粉末、他克莫司(PHR1809)、环孢素A(30024)和霉酚酸(M5255)。瑞德西韦(RDV；HY-104077)在所有实验中用作对照。将所有化合物溶解在DMSO中，并且将一次性使用的等分试样在-20℃下储存。

通过验证的LC-MS/MS测量环孢素A、他克莫司和伏环孢素的浓度

通过将样品稀释在甲醇中，随后在空白全血中稀释，通过LC-MS/MS进行CsA和TAC的定量，如前所述(Zwart等人，Br J Clin Pharmacol.2018年12月；84(12):2889-2902)。在分析之前，将样品稀释在甲醇中，然后用全血稀释至VCS的校准线0-15-600μg/L之内。将人全血加入10或20μl样品中，最终体积为200μl，并且加入200μl的0.1M硫酸锌和500μl内标溶液(32μg/L的VCS D4的乙腈溶液)。然后将样品以2000rpm涡旋5min，并以13000rpm离心5min，并将20μl注入LC-MS/MS系统。根据EMA生物分析方法验证指南(EMEA/CHMP/EWP/192217/2009-生物分析方法验证指南(2011))验证所述方法。

细胞病变效应(CPE)减少测定

通常如上所述进行Vero E6细胞中的CPE减少测定，不同之处在于细胞与测试化合物的预孵育持续30分钟。将板在37℃孵育三天，并使用比色测定确定细胞活力，测量在495nm处的吸收。确定每种化合物的EC₅₀和CC₅₀，并使用非线性回归分析所得数据。对于每种化合物，至少完成了两个独立的实验(每个实验一式四份)。

病毒产量减少测定

将Calu-3细胞接种在100μl培养基中的96孔板中(每孔3x10⁴个细胞)。第二天，将细胞与CsA、TAC或VCS的2倍连续稀释液预孵育60min，浓度从25μM开始，RDV从10μM开始。随后，在具有化合物的50μl培养基中，用SARS-CoV-2(MOI为1，在Vero E6细胞上确定的滴度)感染细胞。在37℃孵育1h之后，用PBS洗涤细胞三次，并加入100μl具有化合物的培养基。在感染后24小时(h p.i.)从孔中收获培养基。通过对Vero E6细胞进行噬斑测定，对从感染的Calu-3细胞释放的病毒后代进行分析。在向收获的培养基中加入9体积的甲醇之后，通过验证的LC-MS/MS测量VCS浓度。如CPE减少测定所述，使用以相同方式处理的模拟感染的细胞，平行地进行细胞毒性测定。

玻璃瓶中的病毒产量减少

用冰醋酸处理高硼硅玻璃试剂瓶(50-ml)以去除可能的洗涤剂残留物，随后用无水乙醇洗涤两次。在使用前，将所述瓶子干燥和UV消毒。使用无菌玻璃培养管、玻璃50-μl注射器和玻璃巴斯德吸管在EMEM-2％FCS中制备三倍浓缩的化合物溶液。将1ml的每种化合物稀释液转移到三个不同的试剂瓶中(一式三份)。用SARS-CoV-2/Leiden-002以MOI 1感染培养瓶中生长的Calu-3细胞的融合单层。在37℃下孵育1h之后，用温PBS洗涤细胞三次，胰蛋白酶消化并重悬在EMEM-2％FCS中。将2ml这种细胞悬液(约10⁶个细胞)添加到含有1ml在培养基中的3x浓缩化合物溶液的每个试剂瓶中。在37℃孵育24h之后，收集培养基并通过对Vero E6细胞的噬斑测定确定感染性病毒滴度。

在玻璃培养管中的化合物细胞毒性的确定

将Calu-3细胞胰蛋白酶消化，将1ml的EMEM-2％FCS中的1.5x10⁵个细胞分装到玻璃培养管中。使用玻璃实验室器皿，在EMEM-2％FCS培养基中制备以150μM浓度(3x终浓度)开始的VCS、TAC和CsA的两倍稀释液，并将0.5ml添加到相应的具有细胞的试管中(每个浓度三个试管)。在孵育24h之后，如上所述确定细胞活力。

结果

为了评价VCS、CsA和TAC对SARS-CoV-2复制的作用，使用显示对SARS-CoV-2允许的人肺上皮细胞(Calu-3)进行病毒载量减少测定。由于VCS是高度亲脂的，并且可以与塑料结合，这可能会降低使用塑料实验室器皿进行的测定法中的生物利用度，因此在使用塑料实验室器皿的标准的基于细胞的测定法与使用玻璃管、容器和移液器的定制测定法中比较了VCS的作用。包括RDV作为抑制SARS-CoV-2复制的阳性对照。

图6A-6D显示了环孢素A、他克莫司和伏环孢素对感染之后感染性SARS-CoV-2后代的产生(图6A和图6B)和模拟感染之后Calu-3细胞的活力的影响(图6C和图6D)。如图6A和图6C显示了来源于使用玻璃实验室器皿进行的实验的数据，而图6B和图6D显示了来自使用塑料实验室器皿的结果。玻璃中的Calu-3细胞保持活力并支持SARS-CoV-2复制，因为在24hp.i.在培养基中测量到1.7x10⁶个PFU/ml的滴度(图6A)。用10μM瑞德西韦处理感染细胞抑制了病毒复制，导致感染性后代滴度刚好高于噬斑测定的检测限(数据未显示)。用3.2μM伏环孢素处理细胞引起SARS-CoV-2感染性后代滴度降低超过1.5个对数，而当使用相同浓度的环孢素A或他克莫司时，观察到降低约0.5个对数(图6A)。然而，用3.2μM伏环孢素或环孢素A处理也引起细胞毒性作用，因为细胞活力下降至约75％(图6C)。总之，这些结果证明了伏环孢素的有效抗病毒活性，其可以是部分地由细胞毒性介导的。

观察结果与之前的报告一致，即CsA抑制在HuH7.5和Calu-3细胞中的SARS-CoV-2复制，但在Vero细胞中并非如此(Dittmar等人，bioRxiv.2020:2020.06.19.161042)。然而，与TAC抑制Vero E6细胞中的SARS-CoV-2复制的观察相反，EC₅₀为约15μM，先前的报告发现TAC在任何这些细胞系中都没有活性，这可以归因于使用不同的Vero细胞亚克隆。

在使用塑料材料的实验中，当用VCS处理细胞时，观察到感染性后代滴度的剂量依赖性降低，导致在6.4μM时降低超过1个对数(图6B)。CsA处理在25μM时导致相似的减少，但在6.4μM时抑制比VCS少。然而，在12.5μM或以上的浓度时，CsA显示出显著的细胞毒性，而VCS则不然(图6D)。TAC没有表现出太多的细胞毒性，但需要25μM的浓度才能将感染性病毒后代滴度降低超过1个对数。在用玻璃而不是塑料实验室器皿进行的实验中，VCS具有更强的作用，这可能是由于化合物与塑料的结合丧失所致。在具有或没有细胞的玻璃容器中，在用各种溶液孵育之后，测量游离VCS的浓度。在没有细胞的玻璃容器中，在37℃下孵育24h之后，未观察到溶液中化合物的显著损失(表3)。当浓度为0.2至3.2μM的VCS溶液与Calu-3细胞一起在玻璃瓶中孵育时，观察到VCS浓度约75％的降低，表明所述化合物已被细胞结合或吸收。还测量了在用标准塑料实验室器皿进行的实验中在用25μM VCS处理24h之后感染细胞的培养基中的VCS浓度，检测到的伏环孢素浓度低至0.68μM。

表3：通过LC-MS/MS测量的来自仅使用玻璃实验室器皿的实验的样品中的VCS浓度

*低于LC/MS-MS的检测限：百分比表示在24h测量的(真实)浓度与施用给细胞的制备溶液的浓度(在0h孵育时间)的比率；％rem：剩余％

即使考虑到由于细胞结合或摄取而减少了75％，这些结果表明90％的VCS由于塑料结合而损失。分别在玻璃和塑料中3.2和25μM的VCS对病毒滴度的降低相似，证实了当使用塑料时，VCS的生物可利用量可能为最初添加量的约10％。VCS与塑料的结合可引起溶液中的化合物损失>80％。因而，使用塑料实验室器皿从纯VCS粉末制备的储备溶液可能低估该化合物在抗病毒测定中的功效。由于VCS是高度亲脂的化合物，在塑料表面和疏水性药物之间的相互作用可能具有负面影响，因此VCS的抗病毒作用可能比在使用塑料的测定中观察到的更大。结果表明，在包括使用塑料的抗病毒测定中，由于塑料结合导致的化合物损失和药物制剂中赋形剂的干扰使EC₅₀值的确定复杂化。

使用玻璃实验室器皿，结果证明，VCS在感染的Calu-3细胞中以剂量依赖性方式减少SARS-CoV-2感染性后代的产生，并且比CsA和TAC更有效。结果表明，亲环素依赖性CNI比其他类别的免疫抑制剂(比如EVL和MPA)更有效地抑制细胞培养中的SARS-CoV-2复制。VCS以比TAC低8倍的浓度抑制SARS-CoV-2复制。抑制SARS-CoV-2复制所需的TAC浓度在人体中可能是不耐受或有毒的浓度(对于TAC，0.2μM的EC₅₀等于160ng/ml)，而没有考虑到在流通中的游离部分大为总浓度的约十分之一。对于CsA和VCS，0.2μM分别对应于241和243ng/ml的浓度。值得注意的是，VCS可以比血液中更高的浓度分布到肺等器官中，并且在红细胞中发现更高的浓度。因而，在特定器官或细胞中的较高浓度可以抑制所述病毒。因此，所述结果支持VCS作为CNI用于治疗的效用，所述治疗也可以在人类安全的浓度下抑制SARS-CoV-2复制。由于VCS被认为在预防KTR中的排斥方面具有与TAC相当的功效，因此VCS将用于治疗COVID-19患者。本文描述的结果证明，在移植医学中常用的免疫抑制剂中，亲环素依赖性CNI，尤其是VCS，对于需要免疫抑制的受试者(例如，有SARS-CoV-2感染风险的KTR)是有益的。

实施例8：免疫抑制剂的药物制剂对SARS-CoV-2复制的抑制

使用通常用于治疗肾移植受者的药物的药物制剂进行实验，以评价响应于SARS-CoV-2感染的细胞活力。鉴于实施例7的发现，通过使用含有例如溶剂和赋形剂的药物制剂，可以避免疑似与溶解度或塑料结合有关的问题。

方法

如上所述，在使用Vero E6细胞的CPE减少测定中评价了VCS、CsA、TAC、EVL和MMF的药物制剂(包括赋形剂、助溶剂和其他组分)。瑞德西韦(RDV；HY-104077)在所有实验中用作对照。在预孵育和感染SARS-CoV-2后，将细胞在含有药物的培养基中保持3天。如上所述，平行地进行模拟感染细胞的测定，以评估测试制剂的细胞毒性。对于VCS，通过LC-MS/MS证实在6.4μM下溶解储备溶液时达到所述浓度(数据未显示)。

结果

图7A-7E显示了各种药物制剂对感染细胞和模拟感染细胞中的细胞活力的作用。CNI VCS、CsA和TAC抑制了病毒诱导的细胞死亡，其中EC50值在亚微摩尔至低微摩尔范围内(图7A-7C)。EVL(图7D)在测试浓度下显示没有抑制作用。前药MMF(图7E)被包括在比较中，但预期不会抑制病毒复制，因为它在测定期间可能不会被代谢成其活性形式霉酚酸(mycophenolate)(也称为霉酚酸(mycophenolic acid)；MPA)(Ransom,Ther DrugMonit.1995；17(6):681-4)(Ritter和Pirofski,Transp Infect Dis.2009；11(4):290-7以及Neyts等人，Antimicrob Agents Chemother.1998；42(2):216-22)。因而，MMF的明显抗病毒作用可归因于药物制剂中存在的赋形剂。

VCS、CsA和TAC的EC50值分别为0.22±0.01μM、4.3±0.6μM和10±1μM。除VCS外，没有一种化合物显示细胞毒性，因此它们的CC50值高于100μM。虽然VCS表现出更高的细胞毒性，其中CC50为约4μM，但其EC50也比其他测试化合物低18-45倍。这些结果证明，与其他测试的化合物相比，VCS在抑制病毒介导的细胞死亡方面具有优越的效果。

实施例9：VCS药物制剂对SARS-CoV-2复制的影响

进行测定以评估VCS胶囊和安慰剂胶囊的内容物的抗病毒作用，例如，确定Lupkyna^TM(VCS药物制剂)中的一种或多种赋形剂是否有助于VCS的作用，例如，约0.22μM的低EC₅₀，如实施例8所示(图7A)。

方法

如上所述进行CPE减少测定。将感染SARS-CoV-2的Vero E6细胞暴露于VCS或安慰剂，以比较每者的抗病毒(感染细胞)和细胞毒性(模拟感染细胞)作用。通过LC-MS/MS分析证实安慰剂胶囊中不存在VCS(数据未显示)。

结果

图8A-8B比较了VCS药物制剂和安慰剂对细胞活力的影响。令人惊讶的是，VCS制剂(图8A)和安慰剂(图8B)均以相似的剂量依赖性方式抑制SARS-CoV-2复制。这些结果表明，在所述实验条件下，VCS药物制剂中的一种或多种赋形剂可以介导抗病毒活性。

实施例10：VCS制剂的杀病毒作用的评估

进一步评估了安慰剂胶囊的潜在杀病毒活性。

方法

为了确定化合物或制剂的杀病毒潜力，将SARS-CoV-2病毒体(5x10⁴个PFU)与以下溶液之一在37℃孵育2小时：培养基、由纯粉末制备的VCS溶液(3.2μM)、VCS胶囊的溶解内容物(3.2μM)、安慰剂胶囊或吐温溶液(存在于胶囊中，对应于3.2μM VCS)。PBS用作阴性对照，50％乙醇用作杀病毒活性的阳性对照。将测试化合物与SARS-CoV-2病毒原液一起孵育两个小时。通过对Vero E6细胞的噬斑测定确定剩余的感染性病毒滴度，正如例如描述于Salgado-Benvindo等人，Antimicrob Agents Chemother.2020年7月22日；64(8)doi:10.1128/AAC.00900-20。

结果

如图9所示，仅对照处理(50％乙醇)使感染性SARS-CoV-2的量降低到检测限以下(<100PFU/ml)。其他处理均未显著影响病毒的剩余感染性。

结果表明，在所述实验条件下，药物产品赋形剂没有杀病毒作用。结果表明，赋形剂的存在可能通过一种未表征的机制干扰CPE减少测定的读出。

实施例11：免疫抑制化合物从高纯度粉末制备及其在CPE减少测定中的活性

评估了药物组合物中赋形剂对VCS和其他免疫抑制化合物的作用的影响。

方法

如上所述，使用溶解在DMSO中的免疫抑制药物的高纯度粉末进行CPE减少测定。由每种化合物的纯粉末制备测试储备溶液。在Neoral(CsA微乳剂)的情况下，评估了CsA粉末，其为KTR治疗中最常用的CsA衍生物。

结果

图10A-10D显示了在CPE减少测定中溶解的高纯度免疫抑制化合物对细胞活力的影响。如图10A所示，由纯粉末制备的VCS溶液对SARS-CoV-2感染细胞赋予的保护水平与由药物制剂制备的溶液不同(比较图8A)。然而，来自纯粉末的VCS溶液同样引起较少的细胞毒性，正如从模拟感染细胞中观察到的(比较图6C)。图10B和10D分别显示了CsA和MPA处理的细胞的相似结果。当比较图7C至图10C时，由纯粉末制备的TAC溶液抑制SARS-CoV-2，具有与药物制剂相似的功效，即EC₅₀为约15μM。

总之，这些结果表明某些药物制剂的赋形剂有助于其观察到的功效。测试各种免疫抑制化合物的高纯度粉末，以避免在所述抗病毒测定中由赋形剂引起的干扰，所述干扰导致VCS、CsA和TAC的显著更高的EC₅₀值，所述测试表明改善药物制剂中活性化合物的溶解度和生物利用度的赋形剂也会影响基于细胞的测定中的结果。然而，TAC的药物制剂似乎不含具有抗病毒作用的赋形剂。

结果表明，为了最佳活性，免疫抑制化合物可能需要确保溶解度和/或生物利用度的赋形剂。化合物制剂，例如药物制剂或溶解的高纯度粉末，可以影响测定中的结果以及在施用时所述化合物的溶解度和生物利用度。

实施例12：塑料材料在伏环孢素制剂中的作用的评估

鉴于VCS和塑料实验室器具之间的潜在相互作用，进行了实验以确定涂层塑料是否会阻止VCS结合。如上所述，VCS药物制剂中的赋形剂例如通过阻止VCS与塑料结合而会影响生物利用度，但它们的非特异性抗病毒作用还可以影响VCS的真实EC₅₀的确定。测试了涂有不同剂的塑料材料，以评估涂层是否将阻止VCS与塑料结合，以及允许在抗病毒测定中使用由纯粉末制备的VCS溶液的可能性。

方法

塑料材料涂层

塑料实验室器皿涂有三种不同的涂层剂：PBS中的100mg/ml牛血清白蛋白(BSA；Sigma)、MilliQ水中的1％聚乙二醇3350(PEG-3350；Sigma)和MilliQ水中的0.2％聚山梨酯40(吐温40；Fluka)。另外，通过在DMSO(Sigma)中用500mM VCS溶液处理塑料材料使其具有VCS。用封闭溶液充盈实验室器皿(包括所有试管、吸头和培养塑料)，并在室温下孵育2h，同时摇动以均匀涂覆表面。在用MilliQ水冲洗两次之后，使物品在室温下干燥，直到进一步用于实验时为止。在EMEM-2％ FCS中制备0.2和2μM VCS溶液，并将100μl每种VCS溶液在包被的96孔板中孵育。在37℃下孵育2h之后，通过验证的LC-MS/MS测量剩余的VCS浓度。使用相似的方法，还评估了TAC或CsA的结合。

结果

没有一种涂层处理能够减少与塑料的非特异性结合和VCS的损失(参见表4)，因为在2h孵育之后仅恢复了原始浓度的5％至7％。由于在制备稀释液期间移液器吸头和试管中的VCS损失，即使在t＝0时，也只能恢复原始储备浓度的约27％。通过用500mM的VCS处理，在塑料上的结合位点的饱和阻止了溶液中VCS的损失，但导致VCS从塑料中不受控制地浸出。这导致了高于输入溶液浓度的不可预测的浓度，例如，当2μM溶液在VCS饱和塑料板中孵育时，测量的VCS浓度>15μM。

表4.通过LC-MS/MS测量的在具有不同涂层的塑料实验室器皿中孵育的样品中的VCS浓度

Conc：浓度；％rem：剩余％。百分比表示相对于原始2μM VCS储备溶液浓度的剩余浓度。

TAC与塑料的结合是最小的(损失24％)。对于CsA，在孵育2h之后，剩余浓度为初始浓度的62％(参见表5)。

表5.通过LC-MS/MS测量的在塑料实验室器皿中孵育的样品中的TAC和CsA的浓度

百分比表示相对于原始化合物储备溶液的浓度(0.8μM)的剩余浓度。

结果表明，涂层剂未阻止VCS与塑料的非特异性结合。在一些方面，由于塑料结合导致的化合物损失和药物制剂中赋形剂的干扰使一些测定中EC₅₀值的确定复杂化。由于没有一种涂层处理可以防止与塑料的非特异性结合，因此在其他实验中使用玻璃器皿代替塑料(例如，参见表3)来规避潜在问题。

出于所有目的，将本说明书中提及的包括专利、专利申请和科学论文在内的所有出版物通过引用完整并入本文，在程度上就像将包括专利、专利申请和科学论文在内的每一单独的出版物明确地和单独地指明通过引用完整并入本文一样。

虽然出于清楚理解的目的已经通过说明和实施例较详细地描述了前述发明，但对于本领域技术人员显而易见的是，可以根据以上教导实施某些较小的变化和修改。因此，描述和实施例不应被解释为限制本发明的范围。根据本文中的描述和教导，对所述组合物和方法的各种修改将变得显而易见。可以在不脱离本公开的真实范围和精神的情况下实施这样的变化，并且这些变化预期落入本公开的范围内。

Claims (36)

1.一种治疗或预防受试者中的病毒感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的伏环孢素。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述受试者需要免疫抑制。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中通过抑制亲环素A(CypA)或CypA相关途径来改善所述病毒感染。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述病毒感染是由冠状病毒科成员的病毒引起的。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述病毒是α冠状病毒、β冠状病毒、δ冠状病毒或γ冠状病毒。

6.如权利要求3或4所述的方法，其中所述病毒是人冠状病毒OC43(HCoV-OC43)、人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)、人冠状病毒229E(HCoV-229E)、人冠状病毒NL63(HCoV-NL63)、中东呼吸综合征相关冠状病毒(MERS-CoV)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(SARS-CoV)或严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)。

7.如权利要求3-6中任一项所述的方法，其中所述病毒是MERS-CoV、SARS-CoV或SARS-CoV-2。

8.如权利要求3-7中任一项所述的方法，其中所述病毒是SARS-CoV-2。

9.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量为约0.1mg/kg/天至约2mg/kg/天。

10.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量为约7.9mg BID、约15.8mg BID、约23.7mg BID、约31.6mg BID、约39.5mg BID、约47.4mg BID或约55.3BID。

11.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量为约7.9mg QD、约15.8mg QD、约23.7mg QD、约31.6mg QD、约39.5mg QD、约47.4mg QD、约55.3mg QD、约63.2mg QD、约71.1mg QD、约79.0mg QD、约86.9mg QD、约94.8mg QD、约102.7mg QD或约110.6mg QD。

12.如权利要求1-8中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量等于或可实现以下浓度：约0.05μM和约10μM之间、约0.1μM和约5μM之间、约0.2μM和约2.5μM之间、约0.3μM和约1.0μM之间、约0.4μM和约0.9μM之间、约0.5μM和约0.8μM之间、约0.1μM和约0.5μM之间、或约0.2μM和约0.4μM之间、或约0.05、约0.1、约0.15、约0.2、约0.25、约0.3、约0.35、约0.4、约0.45、约0.5、约0.55、约0.6、约0.7、约0.8、约0.9、约1.0、约1.5、约2.0、约2.5、约3.0、约3.5、约4.0、约4.5、约5.0、约6.0、约7.0、约8.0、约9.0或约10.0μM或更低。

13.如权利要求1-12中任一项所述的方法，其中监测了所述受试者的肾功能。

14.如权利要求13所述的方法，其中监测所述受试者的肾功能包括：

(a)在不同日期的至少第一时间点和第二时间点评估受试者的估算肾小球滤过率(eGFR)；和

(b)(i)如果所述受试者的eGFR在第一和第二时间点之间下降超过目标％至预定值以下，则减少每日剂量或停止向所述受试者施用伏环孢素；

(ii)如果所述受试者的eGFR在第一和第二时间点之间下降少于所述目标％，则继续向所述受试者施用相同的每日剂量的伏环孢素。

15.如权利要求14所述的方法，其中所述预定值为约50至约90ml/min/1.73m²。

16.如权利要求14或15所述的方法，其中所述预定值为约60ml/min/1.73m²。

17.如权利要求14-16中任一项所述的方法，其中所述目标％为约20％至约45％。

18.如权利要求14-17中任一项所述的方法，其中所述目标％为约20％。

19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述受试者患有自身免疫性疾病或与移植排斥相关的病症。

20.如权利要求1-19中任一项所述的方法，其中所述受试者患有与移植排斥相关的病症。

21.如权利要求19或20所述的方法，其中所述病症与心脏、肺、肝脏、肾脏、胰腺、皮肤、肠或角膜移植排斥相关。

22.如权利要求19-21中任一项所述的方法，其中所述病症与肾移植排斥相关。

23.如权利要求19所述的方法，其中所述受试者患有自身免疫性疾病。

24.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其中施用治疗有效量的伏环孢素而不施用治疗有效量的霉酚酸吗啉乙酯(MMF)和/或治疗有效量的皮质类固醇。

25.如权利要求1-23中任一项所述的方法，其还包括施用治疗有效量的霉酚酸吗啉乙酯(MMF)和/或治疗有效量的皮质类固醇。

26.如权利要求1-25中任一项所述的方法，其中通过肠内施用、口服施用、舌下施用或直肠施用、肠胃外施用、静脉内注射、肌内注射、皮下注射、静脉内输注或吸入/吹入来施用伏环孢素。

27.如权利要求26所述的方法，其中通过肠内施用、口服施用、舌下施用或直肠施用来施用伏环孢素。

28.如权利要求25或27所述的方法，其中通过口服施用来施用伏环孢素。

29.如权利要求26所述的方法，其中通过肠胃外施用、静脉内注射、肌内注射、皮下注射、静脉内输注或吸入/吹入来施用伏环孢素。

30.如权利要求26或29所述的方法，其中通过吸入或吹入来施用伏环孢素。

31.如权利要求30所述的方法，其中以气溶胶的形式施用伏环孢素。

32.如权利要求1-31中任一项所述的方法，其中以药物组合物的形式施用伏环孢素。

33.如权利要求32所述的方法，其中所述药物组合物包含一种或多种药学上可接受的赋形剂。

34.如权利要求33所述的方法，其中所述药学上可接受的赋形剂独立地选自以下中的一种或多种，包括：醇、D-α-生育酚(维生素E)聚乙二醇琥珀酸酯(TPGS)、聚山梨酯20(吐温20)、聚山梨酯40(吐温40)、中链甘油三酯、明胶、山梨糖醇、甘油、氧化铁黄、氧化铁红、二氧化钛和水。

35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中所述受试者中的病毒载量在施用伏环孢素后降低。

36.如权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述受试者的生存期在施用伏环孢素后延长。

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