JP2023524802A - コロナウイルス感染の治療または予防方法 - Google Patents
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Abstract
本明細書に提供するのは、コロナウイルス感染の、特に、免疫抑制を必要とする対象における治療または予防のためのボクロスポリンの使用方法である。【選択図】図１Ｂ
Description
関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年５月７日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＯＲ ＰＲＥＶＥＮＴＩＮＧ ＶＩＲＵＳ ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ」と題する米国仮出願第６３／０２１，２３９号、及び２０２０年５月８日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＯＲ ＰＲＥＶＥＮＴＩＮＧ ＶＩＲＵＳ ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ」と題する米国仮出願第６３／０２２，３５７号の優先権を主張する。これらの内容は、参照により全体として組み込まれる。
本出願は、２０２０年５月７日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＯＲ ＰＲＥＶＥＮＴＩＮＧ ＶＩＲＵＳ ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ」と題する米国仮出願第６３／０２１，２３９号、及び２０２０年５月８日に出願された「ＭＥＴＨＯＤＳ ＯＦ ＴＲＥＡＴＩＮＧ ＯＲ ＰＲＥＶＥＮＴＩＮＧ ＶＩＲＵＳ ＩＮＦＥＣＴＩＯＮ」と題する米国仮出願第６３／０２２，３５７号の優先権を主張する。これらの内容は、参照により全体として組み込まれる。
本明細書に提供するのは、ウイルス感染、特に、免疫抑制を必要とする対象におけるウイルス感染の治療または予防方法である。
ウイルス感染は、致命的な疾患につながる可能性がある。例えば、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス－２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）によって引き起こされるコロナウイルス感染症２０１９（ＣＯＶＩＤ－１９）は、心肺停止を引き起こすことに加えて、急性呼吸窮迫症候群（ＡＲＤＳ）の急速な発症につながる可能性がある。ＣＯＶＩＤ－１９の拡大は、感染力が高いこと、及び長くかつ多くの場合無症状である潜伏期間のため、阻止するのが困難である。
ある特定の人々は、ウイルスの大流行またはパンデミックの際に、感染及び死亡のリスクが大幅に増加する。例えば、多くの患者が、医学的理由（例えば、自己免疫疾患または固形臓器移植に起因する）のために、間欠的、長期または生涯にわたる免疫抑制を必要としている。これらの患者は、免疫抑制状態のため、ウイルス感染の影響を受けやすい。従って、免疫抑制を必要とする患者をその基礎疾患に関わらず健康な状態に維持することができると同時に、抗ウイルス効果を提供することができる薬物が必要とされている。提供するのは、かかるニーズを満たす実施形態である。
本明細書に提供するのは、対象におけるウイルス感染の治療または予防方法であり、該方法は、該対象に対して、ボクロスポリン、例えば、治療有効量のボクロスポリンを投与することを含む。該提供する実施形態のいくつかでは、該対象は、免疫抑制を必要としている。該提供する実施形態のいくつかでは、該ウイルス感染は、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）またはＣｙｐＡ関連経路の阻害によって改善される。
該提供する実施形態のいくつかでは、本明細書に提供するのは、免疫抑制を必要とする対象におけるウイルス感染の治療または予防方法であり、該方法は、該対象に対して、治療有効量のボクロスポリンを投与することを含み、該ウイルス感染は、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）またはＣｙｐＡ関連経路の阻害によって改善される。
該提供する実施形態のいくつかでは、該ウイルス感染は、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅのメンバーであるウイルスによって引き起こされる。
該提供する実施形態のいくつかでは、該ウイルスは、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、デルタコロナウイルス、またはガンマコロナウイルスである。
該提供する実施形態のいくつかでは、該ウイルスは、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、または重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である。
該提供する実施形態のいくつかでは、該ウイルスは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
該提供する実施形態のいくつかでは、該ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
該提供する実施形態のいくつかでは、該治療有効量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約２ｍｇ／ｋｇ／日である。
該提供する実施形態のいくつかでは、該治療有効量は、約７．９ｍｇ ＢＩＤ、約１５．８ｍｇ ＢＩＤ、約２３．７ｍｇ ＢＩＤ、約３１．６ｍｇ ＢＩＤ、約３９．５ｍｇ ＢＩＤ、約４７．４ｍｇ ＢＩＤ、または約５５．３ｍｇ ＢＩＤである。
該提供する実施形態のいくつかでは、該治療有効量は、約７．９ｍｇ ＱＤ、約１５．８ｍｇ ＱＤ、約２３．７ｍｇ ＱＤ、約３１．６ｍｇ ＱＤ、約３９．５ｍｇ ＱＤ、約４７．４ｍｇ ＱＤ、約５５．３ｍｇ ＱＤ、約６３．２ｍｇ ＱＤ、約７１．１ｍｇ ＱＤ、約７９．０ｍｇ ＱＤ、約８６．９ｍｇ ＱＤ、約９４．８ｍｇ ＱＤ、約１０２．７ｍｇ ＱＤ、または約１１０．６ｍｇ ＱＤである。
該提供する実施形態のいくつかでは、該治療有効量は、約０．０５μＭ～約１０μＭ、約０．１μＭ～約５μＭ、約０．２μＭ～約２．５μＭ、約０．３μＭ～約１．０μＭ、約０．４μＭ～約０．９μＭ、約０．５μＭ～約０．８μＭ、約０．１μＭ～約０．５μＭ、もしくは約０．２μＭ～約０．４μＭ、または約０．０５、約０．１、約０．１５、約０．２、約０．２５、約０．３、約０．３５、約０．４、約０．４５、約０．５、約０．５５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約６．０、約７．０、約８．０、約９．０、もしくは約１０．０μＭもしくはそれ未満の濃度と同等であるか、またはそれを達成することができる。
該提供する実施形態のいくつかでは、該方法は、さらに、該対象の腎機能を監視することを含む。
該提供する実施形態のいくつかでは、該対象の腎機能を監視することは、以下を含む：
（ａ）異なる日の少なくとも第一の時点及び第二の時点で該対象の推算糸球体ろ過量（ｅＧＦＲ）を評価すること、ならびに
（ｂ）（ｉ）該対象のｅＧＦＲが該第一及び第二の時点の間に目標％を超えて所定の値未満に低下した場合、ボクロスポリンの該対象に対する１日投与量を減少させるか、または投与を停止すること、
（ｉｉ）該対象のｅＧＦＲが該第一及び第二の時点の間に目標％より少なく低下した場合、該対象に対して同じ１日投与量のボクロスポリンの投与を継続すること。
（ａ）異なる日の少なくとも第一の時点及び第二の時点で該対象の推算糸球体ろ過量（ｅＧＦＲ）を評価すること、ならびに
（ｂ）（ｉ）該対象のｅＧＦＲが該第一及び第二の時点の間に目標％を超えて所定の値未満に低下した場合、ボクロスポリンの該対象に対する１日投与量を減少させるか、または投与を停止すること、
（ｉｉ）該対象のｅＧＦＲが該第一及び第二の時点の間に目標％より少なく低下した場合、該対象に対して同じ１日投与量のボクロスポリンの投与を継続すること。
該提供する実施形態のいくつかでは、該所定の値は、約５０～約９０ｍｌ／分／１．７３ｍ２である。
該提供する実施形態のいくつかでは、該所定の値は、約６０ｍｌ／分／１．７３ｍ２である。
該提供する実施形態のいくつかでは、該目標％は、約２０％～約４５％である。
該提供する実施形態のいくつかでは、該目標％は、約２０％である。
該提供する実施形態のいくつかでは、該対象は、自己免疫疾患または移植片拒絶反応に関連する状態を有する。
該提供する実施形態のいくつかでは、該対象は、移植片拒絶反応に関連する状態を有する。
該提供する実施形態のいくつかでは、該状態は、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚、腸、または角膜の移植片拒絶反応に関連する。
該提供する実施形態のいくつかでは、該状態は、腎移植拒絶反応に関連する。
該提供する実施形態のいくつかでは、該対象は、自己免疫疾患を有する。
該提供する実施形態のいくつかでは、該治療有効量のボクロスポリンは、治療有効量のミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／または治療有効量のコルチコステロイドを投与することなく投与される。
該提供する実施形態のいくつかでは、該方法は、さらに、治療有効量のミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／またはコルチコステロイドを投与することを含む。
該提供する実施形態のいくつかでは、ボクロスポリンは、腸内投与（例えば、経口投与、舌下投与、もしくは直腸投与）または非経口投与（例えば、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注入、もしくは吸入／吹送）によって投与される。
該提供する実施形態のいくつかでは、ボクロスポリンは、腸内投与（例えば、経口投与、舌下投与、または直腸投与）によって投与される。
該提供する実施形態のいくつかでは、ボクロスポリンは、経口投与によって投与される。
該提供する実施形態のいくつかでは、ボクロスポリンは、非経口投与（例えば、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注入、または吸入／吹送）によって投与される。
該提供する実施形態のいくつかでは、ボクロスポリンは、吸入または吹送によって投与される。
該提供する実施形態のいくつかでは、ボクロスポリンは、エアロゾルの形態で投与される。
該提供する実施形態のいくつかでは、ボクロスポリンは、医薬組成物で投与される。該提供する実施形態のいくつかでは、該医薬組成物は、１つ以上の医薬的に許容される賦形剤を含む。該提供する実施形態のいくつかでは、該医薬的に許容される賦形剤は、独立して、アルコール、Ｄ－α－トコフェロール（ビタミンＥ）、ポリエチレングリコールスクシネート（ＴＰＧＳ）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリソルベート４０（Ｔｗｅｅｎ４０）、中鎖トリグリセリド、ゼラチン、ソルビトール、グリセリン、黄色酸化鉄、赤色酸化鉄、二酸化チタン、及び水を含む１つ以上から選択される。
本明細書に提供するのは、対象におけるウイルス感染の治療または予防方法である。いくつかの態様では、該方法は、該対象に対して、ボクロスポリン、例えば、治療有効量のボクロスポリンを投与することを含む。該提供する実施形態のいくつかでは、該対象は、免疫抑制を必要としている。
ウイルス感染は、特に感染リスクの高い集団では、致命的な結果につながる可能性がある。２０１９年１２月から２０２１年１月の間に、新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）の原因病原体である重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）は、世界中で９千万人以上の感染を引き起こした。ＣＯＶＩＤ－１９のより深刻な経過は、固形臓器移植レシピエントに通常存在する併存疾患と相関がある（Ｚｈｏｕ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．Ｍａｒ ２８ ２０２０；３９５（１０２２９）：１０５４－１０６２、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ．Ｆｅｂ １５ ２０２０；３９５（１０２２３）：４９７－５０６、Ｇｕａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｒｅｓｐｉｒ Ｊ．Ｍａｙ ２０２０；５５（５）ｄｏｉ：１０．１１８３／１３９９３００３．００５４７－２０２０）。さらに、最初の報告では、後者は、ＣＯＶＩＤ－１９関連死のリスクが高いものであることが示された（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ．Ａｕｇ ２０２０；５８４（７８２１）：４３０－４３６）。特に、これらの対象は、多くの場合、医学的理由（例えば、自己免疫疾患または固形臓器移植によるもの）で断続的、長期または生涯にわたる免疫抑制を必要とし、感染のリスク及びウイルス感染の間の死亡のリスクが大幅に高くなる。
移植レシピエントに免疫抑制療法を処方する際には、拒絶反応の予防及び感染の制御との間のバランスを見出す必要がある。例えば、腎移植レシピエント（ＫＴＲ）は、高齢、併存疾患及び／または持続的免疫抑制のために、より深刻なＣＯＶＩＤ－１９の経過のリスクが高くなる。一部では、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）に感染したＫＴＲの免疫抑制を下げることが推奨される。ＫＴＲにおいて、より深刻なＣＯＶＩＤ－１９の経過に対する免疫抑制の寄与効果及び最適な治療法が必要である。様々な報告により、免疫抑制が重度のＣＯＶＩＤ－１９疾患または死亡のリスクを増加させないことが分かった（Ｌｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｍａｙ ２０２０；３９（５）：４９６－４９７、Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｅｕｒ Ｕｒｏｌ．Ｊｕｎ ２０２０；７７（６）：７４２－７４７、Ｇｕｉｌｌｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｊｕｌ ２０２０；２０（７）：１８７５－１８７８、Ｍｏｎｔａｇｕｄ－Ｍａｒｒａｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｍ Ｊ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｏｃｔ ２０２０；２０（１０）：２９５８－２９５９）。しかしながら、免疫抑制状態のＣＯＶＩＤ－１９患者では、死亡率の増加が観察されている。ＫＴＲにおけるワクチンの有効性は不明であるため、対象、特に免疫抑制を必要とする対象を治療する方法が非常に必要とされている。一般に、ＣＯＶＩＤ－１９は三相性の経過を示す。すなわち、軽度のインフルエンザ様の症状から始まり、ウイルス複製及び肺炎の第二段階が続き、その症例のごく一部では、例えば、サイトカインストームによる、生命を脅かす疾患の第三段階が続く（Ｓｉｄｄｉｑｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ．Ｍａｙ ２０２０）。抗ウイルス薬の投与は、疾患の初期段階では最も効果的であることが期待される一方、免疫抑制剤（例えば、ステロイド、トシリズマブ）は、炎症を軽減するための疾患後期の治療選択肢と見なされ得る。免疫抑制療法は、理想的には拒絶反応を予防し、抗ウイルス特性を有し、（過剰な）炎症を軽減し得る一方で、重篤な疾患の経過を予防するために効果的な抗ウイルス反応を同時に開始する。ある特定の勧告は、免疫抑制を完全に停止するわけではないが低下させると述べており、一部では、インビトロで観察された利点に基づいて、ステロイドとＣＮＩが推奨される。
ほとんどの移植センターにおける免疫抑制療法の現在の標準は、タクロリムス（ＴＡＣ）またはシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）のいずれかのカルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）、ミコフェノール酸（ＭＰＡ／ＭＰＳ）等の代謝拮抗剤、及びほとんどの場合、持続的ステロイドからなる。エベロリムス（ＥＶＬ）等のｍＴＯＲ阻害剤が、ＭＰＡの代わりに、またはＣＮＩの代わりに処方される場合もある。ＣＯＶＩＤ－１９の経過に対する免疫抑制の正確な影響はよく分かっていない。該疾患の初期には、（過剰な）免疫抑制が適切な抗ウイルス反応を妨げる可能性があるが、その後のいくらかの免疫抑制は、病的な免疫の過剰活性化を予防する可能性があり、疾患の重症度が低くなる。その結果、一部では、拒絶反応のリスクと疾患の重症度に応じて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染したＫＴＲの免疫抑制を完全に放棄するのではなく、軽減することが推奨される。
カルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）は、ＫＴＲの基本的な免疫抑制剤であり、一部では、ＲＮＡウイルスに対する抗ウイルス活性を有することが報告されている。ＭＰＡに加えて、ＣＮＩ及びＥＶＬ等のｍＴＯＲ阻害剤は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ及び中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ－）ＣｏＶ等のヒトコロナウイルスに対して抗ウイルス活性を示すことが報告されている。シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）は、インフルエンザ（Ｍａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｖｉｒａｌ Ｒｅｓ．２０１６；１３３：６２－７２）、Ｃ型肝炎（Ｉｓｈｉｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．２００６；８０（９）：４５１０－４５２０）、ＨＩＶ（Ｂｒａａｔｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．１９９６；７０（８）：５１７０－５１７６）、ノロウイルス（Ｄａｎｇ ｅｔ ａｌ，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ ２０１７；６１（１１）：１－１７）及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ（ｄｅ Ｗｉｌｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ．２０１１；９２：２５４２－２５４８、Ｐｆｅｆｆｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，ＰＬｏＳ Ｐａｔｈｏｇ ２０１１；７（１０）：１－１５）を含めた多種多様なＲＮＡウイルスに対して抗ウイルス効果を有することがインビトロで示されている。理論に拘束されるものではないが、ＣｓＡの抗ウイルス作用には、カルシニューリン依存性及びシクロフィリン依存性の機序が関与している可能性がある。ＳＡＲＳ－ＣｏＶの場合、該ウイルスのＮｓｐ１タンパク質は、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）と相互作用して、活性化Ｔ細胞の核因子（ＮＦＡＴ）によるサイトカイン放出をカルシニューリン依存的に増強する（Ｐｆｅｆｆｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．，２０１１）。しかしながら、ＣｓＡ及びウイルス複製に対するその影響のすべてのインビトロモデルは、ヒトで安全と考えられる用量をはるかに超える用量でのみ有効である可能性があることを示している。
ボクロスポリン（ＶＣＳ、別名ＬＸ２１４またはＩＳＡ２４７）は、新規なカルシニューリン阻害剤（ＣＮＩ）であり、構造的には、該分子のアミノ酸－１残基における官能基の新規な修飾以外はＣｓＡと類似しており、該修飾が、カルシニューリンへの結合を高め、良好な代謝的安定性を付与する。ボクロスポリンは、乾癬、腎臓移植で試験されており、最近になって、基礎免疫抑制療法と組み合わせた活動性ループス腎炎の治療に対してＦＤＡに認可された。観察によると、ＶＣＳは、同クラスの他の免疫抑制剤よりも治療レベルで強力かつ毒性が低いことが示されている。さらに、ＶＣＳは、ＣｙｐＡ依存的にかつＣｓＡより効果的にノロウイルスの複製を阻害することが示された。この変更により、ボクロスポリンのカルシニューリンへの結合が変化し、インビトロ及びインビボの両方で結合親和性がＣｓＡと比較して最大５倍増加することが示されている（Ｋｕｇｌｓｔａｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．２０１１；Ｄ６７：１１９－２３）。この修飾は、ＣｓＡの主要な代謝部位であるアミノ酸－１から代謝をシフトすることにより、ボクロスポリンの代謝プロファイルも変更した。該代謝プロファイルの変更により、ＣｓＡと比較して代謝産物の排せつが速くなり、代謝産物の暴露が少なくなる。ＣｓＡと比較して、ボクロスポリンの効力が高いこと及び代謝産物の暴露が少ないことの組み合わせが、ＣｓＡと比較して良好なＰＫ／ＰＤ関係、投与量の減少、及び安全性プロファイルの潜在的な改善につながっている。ボクロスポリンは、以下に示す構造を有するとともに、参照により全体として本明細書に組み込まれる米国特許第７，３３２，４７２号に開示されている。
ＣｓＡと同様に、ボクロスポリンもまたＣｙｐＡに結合する（Ｋｕｇｌｓｔａｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔ．２０１１；Ｄ６７：１１９－２３）。従って、本明細書に開示する方法は、免疫抑制を必要とする患者をその基礎疾患に関わらず健康な状態に維持すると同時に、抗ウイルス効果を提供することができる。
該提供する実施形態は、細胞ベースのアッセイにおいて、ＣＮＩ、すなわち、タクロリムス、シクロスポリンＡ、及びボクロスポリン（ＶＣＳ）、ならびにＫＴＲで一般に使用される他の免疫抑制剤が、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製に与える影響の比較を基にした、本明細書に記載の観察に基づいている。ＫＴＲのような免疫抑制状態の対象に対するワクチンの有効性は不確実であり、効果的な（抗ウイルス）治療の選択肢は限られているため、これらの対象を保護するために代替の解決策を見つけることが重要である。本明細書で実証されるように、ＣＮＩは、他のクラスの免疫抑制剤よりも強力なＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製の阻害効果を（細胞培養において）示した。特筆すべきことに、ＶＣＳは、ＴＡＣよりも８倍低い濃度で抗ウイルス活性を示した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス量を減少させたＶＣＳの濃度は、ＫＴＲで達成可能なヒトの耐量と相関する可能性がある。ＶＣＳは、低マイクロモル濃度でヒトＣａｌｕ－３細胞においてウイルス後代産生を減少させ、シクロスポリンＡ及びタクロリムスよりも効果的に減少させた。本明細書に記載する観察により、シクロフィリン依存性ＣＮＩ、特にＶＣＳの潜在的な利点が実証される。本明細書に記載する結果により、ＶＣＳが、低濃度であってもＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に対して強力な阻害活性を発揮することが示され、対象において、特に、免疫抑制を必要とする対象に対して、ＣＯＶＩＤ－１９等のウイルス感染の治療におけるＶＣＳの有用性が実証される。ボクロスポリンは、カルシニューリンとの親和性がより高く、腎毒性がより低いという利点ももたらす。ボクロスポリンはまた、肺等の臓器に血中よりも高濃度で分布する可能性があるとともに、赤血球に高濃度が含まれる。その結果、特定の臓器または細胞での高濃度により、ウイルスが抑制され得る。従って、これらの結果により、特に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のリスクがある、またはこれに感染したＫＴＲにおけるウイルス感染の治療におけるＶＣＳの有用性が支持される。
さらに、本明細書に記載の結果は、予想外の観察を示している。これらの免疫抑制化合物の調製における医薬品賦形剤が、細胞ベースのアッセイにおいて抗ウイルス効果を示した。意外にも、これらの結果は、ウイルスエンベロープを損傷し得る界面活性剤の殺ウイルス効果によるものではなかった。本記載の抗ウイルスアッセイにおいて、賦形剤によって引き起こされる干渉を回避するための様々な免疫抑制化合物の高純度の粉末により、医薬製剤中の活性化合物の溶解性及びバイオアベイラビリティを改善する賦形剤もまた、細胞ベースのアッセイの結果に影響を与えることが実証された。ボクロスポリンの親油性に起因して、かつ本明細書に記載の結果に基づいて、ＶＣＳ及びその他の化合物の効果をガラス製実験器具（プラスチック材料へのＶＣＳの結合を最小限に抑える）を使用して評価した。これらの結果により、感染したＣａｌｕ－３細胞においてＶＣＳが用量依存的、かつＣｓＡ及びＴＡＣ、ならびに他のクラスの免疫抑制剤、例えば、ＥＶＬ及びＭＰＡよりも効果的にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染性の後代の産生を減少させることが実証された。
Ｉ．治療方法
本明細書に提供するのは、対象におけるウイルス感染の治療または予防方法であり、該方法は、該対象に対して、ボクロスポリンを投与することを含む。同様に提供するのは、対象におけるウイルス感染の治療または予防におけるボクロスポリンの使用である。いくつかの態様では、該提供する方法または使用は、治療有効量のボクロスポリンを使用することを含む。いくつかの態様では、該対象は、免疫抑制を必要としている。いくつかの態様では、該ウイルス感染は、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）またはＣｙｐＡ関連経路の阻害によって改善される。
本明細書に提供するのは、対象におけるウイルス感染の治療または予防方法であり、該方法は、該対象に対して、ボクロスポリンを投与することを含む。同様に提供するのは、対象におけるウイルス感染の治療または予防におけるボクロスポリンの使用である。いくつかの態様では、該提供する方法または使用は、治療有効量のボクロスポリンを使用することを含む。いくつかの態様では、該対象は、免疫抑制を必要としている。いくつかの態様では、該ウイルス感染は、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）またはＣｙｐＡ関連経路の阻害によって改善される。
いくつかの実施形態では、提供するのは、ウイルス感染の治療または予防を必要とする対象におけるその治療または予防方法であり、該方法は、該対象に対して、治療有効量のボクロスポリンを投与することを含み、該ウイルス感染は、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）またはＣｙｐＡ関連経路の阻害によって改善される。いくつかの実施形態では、該対象は、免疫抑制を必要としている。いくつかの実施形態では、該ウイルス感染は、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）の阻害によって改善される。いくつかの実施形態では、該ウイルス感染は、ＣｙｐＡ関連経路の阻害によって改善される。
いくつかの態様では、ボクロスポリン（別名ＬＸ２１４またはＩＳＡ２４７）、その治療有効量、及び／またはボクロスポリンを含む組成物が、該提供する組成物、方法及び使用において使用される。使用としては、ボクロスポリンまたはそれを含む組成物のかかる方法、例えば治療法、及び治療、例えば、治療計画における使用、ならびにかかる治療法及び治療を行うための薬剤の調製におけるボクロスポリンまたはそれを含む組成物の使用が挙げられる。同様に提供するのは、ウイルス感染の治療または予防、ウイルス複製の低減、ウイルス感染に関連する症状の改善、または疾患の重症度もしくは死亡率の低減に使用するためのボクロスポリンまたはそれを含む組成物である。いくつかの態様では、かかる使用には、本明細書に記載の方法または治療、例えば、任意の治療法または治療計画を行うことが含まれる。該提供する実施形態のいくつかでは、ボクロスポリンまたはそれを含む組成物は、単剤療法として、例えば、１つ以上のさらなる薬剤を投与することなく投与される。該提供する実施形態のいくつかでは、ボクロスポリンまたはそれを含む組成物は、ＭＭＦ及び／またはコルチコステロイドを投与することなく投与される。該提供する実施形態のいくつかでは、ボクロスポリンまたはそれを含む組成物は、治療有効量のＭＭＦ及び／または治療有効量のコルチコステロイドを投与することなく投与される。
いくつかの実施形態では、該方法または使用は、ウイルス感染（ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）またはウイルス感染（ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を治療するためのものである。いくつかの実施形態では、該方法または使用は、ウイルス感染（ｖｉｒｕｓ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）またはウイルス感染（ｖｉｒａｌ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）を予防するためのものである。いくつかの実施形態では、該方法は、該ウイルス感染を治療することを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、該ウイルス感染を予防することを含む。
いくつかの実施形態では、該ウイルス感染は、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅ（例えば、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、デルタコロナウイルス、もしくはガンマコロナウイルス）、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ（例えば、インフルエンザウイルス）、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、フラビウイルスもしくはヘパシウイルス）、またはＣａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅ（例えば、ノロウイルス）のメンバーであるウイルスによって引き起こされる。
いくつかの実施形態では、該ウイルス感染は、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅのメンバーであるウイルスによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、該ウイルスは、アルファコロナウイルス（例えば、ＨＣｏＶ－２２９ＥもしくはＨＣｏＶ－ＮＬ６３）、ベータコロナウイルス（例えば、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、もしくはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）、デルタコロナウイルス、またはガンマコロナウイルスである。
いくつかの実施形態では、該ウイルスは、アルファコロナウイルスである。いくつかの実施形態では、該ウイルスは、ＨＣｏＶ－２２９ＥまたはＨＣｏＶ－ＮＬ６３である。いくつかの実施形態では、該ウイルスは、ＨＣｏＶ－２２９Ｅである。いくつかの実施形態では、該ウイルスは、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３である。
いくつかの実施形態では、該ウイルスは、ベータコロナウイルスである。いくつかの実施形態では、該ウイルスは、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、該ウイルスは、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。いくつかの実施形態では、該ウイルスは、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３である。いくつかの実施形態では、該ウイルスは、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１である。いくつかの実施形態では、該ウイルスは、ＨＭＥＲＳ－ＣｏＶである。いくつかの実施形態では、該ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶである。いくつかの実施形態では、該ウイルスは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である。
いくつかの実施形態では、該ウイルスは、デルタコロナウイルスである。いくつかの実施形態では、該ウイルスは、ガンマコロナウイルスである。
いくつかの実施形態では、該ウイルス感染は、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅのメンバーであるウイルス（例えば、インフルエンザウイルス）によって引き起こされる。
いくつかの実施形態では、該ウイルス感染は、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅのメンバーであるウイルスによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、該ウイルスは、フラビウイルスである。いくつかの実施形態では、該ウイルスは、ヘパシウイルスである。いくつかの実施形態では、該ウイルスは、ヘパシウイルスＣである。
いくつかの実施形態では、該ウイルス感染は、Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｉｄａｅのメンバーであるウイルスによって引き起こされる。いくつかの実施形態では、該ウイルスは、ノロウイルスである。
ＩＩ．投与量
本明細書に提供する方法及び使用のいくつかの実施形態では、ボクロスポリンは、１日４回、１日３回、１日２回、または１日１回投与される。いくつかの実施形態では、ボクロスポリンは、１日４回投与される。いくつかの実施形態では、ボクロスポリンは、１日３回投与される。いくつかの実施形態では、ボクロスポリンは、１日２回投与される。いくつかの実施形態では、ボクロスポリンは、１日１回投与される。
本明細書に提供する方法及び使用のいくつかの実施形態では、ボクロスポリンは、１日４回、１日３回、１日２回、または１日１回投与される。いくつかの実施形態では、ボクロスポリンは、１日４回投与される。いくつかの実施形態では、ボクロスポリンは、１日３回投与される。いくつかの実施形態では、ボクロスポリンは、１日２回投与される。いくつかの実施形態では、ボクロスポリンは、１日１回投与される。
いくつかの実施形態では、ボクロスポリンの１日投与量は、約１ｍｇ～約２５０ｍｇ、約５ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１００ｍｇ～約２５０ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２５０ｍｇ、約２００ｍｇ～約２５０ｍｇ、１ｍｇ～約２００ｍｇ、約５ｍｇ～約２００ｍｇ、約１０ｍｇ～約２００ｍｇ、約５０ｍｇ～約２００ｍｇ、約１００ｍｇ～約２００ｍｇ、約１５０ｍｇ～約２００ｍｇ、約１ｍｇ～約１５０ｍｇ、約５ｍｇ～約１５０ｍｇ、約１０ｍｇ～約１５０ｍｇ、約５０ｍｇ～約１５０ｍｇ、約１００ｍｇ～約１５０ｍｇ、約１ｍｇ～約１００ｍｇ、約５ｍｇ～約１００ｍｇ、約１０ｍｇ～約１００ｍｇ、約５０ｍｇ～約１００ｍｇ、約１ｍｇ～約５０ｍｇ、約５ｍｇ～約５０ｍｇ、または約１０ｍｇ～約５０ｍｇである。いくつかの実施形態では、ボクロスポリンの１日投与量は、約１ｍｇ、約５ｍｇ、約１０ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約４０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７０ｍｇ、約８０ｍｇ、約９０ｍｇ、約１００ｍｇ、約１１０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１３０ｍｇ、約１４０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１６０ｍｇ、約１７０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約１９０ｍｇ、約２００ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２２０ｍｇ、約２３０ｍｇ、約２４０ｍｇ、または約２５０ｍｇである。いくつかの実施形態では、ボクロスポリンの１日投与量は、少なくとも約１ｍｇ、少なくとも約５ｍｇ、少なくとも約１０ｍｇ、少なくとも約２０ｍｇ、少なくとも約３０ｍｇ、少なくとも約４０ｍｇ、少なくとも約５０ｍｇ、少なくとも約６０ｍｇ、少なくとも約７０ｍｇ、少なくとも約８０ｍｇ、少なくとも約９０ｍｇ、少なくとも約１００ｍｇ、少なくとも約１１０ｍｇ、少なくとも約１２０ｍｇ、少なくとも約１３０ｍｇ、少なくとも約１４０ｍｇ、少なくとも約１５０ｍｇ、少なくとも約１６０ｍｇ、少なくとも約１７０ｍｇ、少なくとも約１８０ｍｇ、少なくとも約１９０ｍｇ、または少なくとも約２００ｍｇである。
いくつかの実施形態では、ボクロスポリンの投与量は、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約２ｍｇ／ｋｇ／日、約０．５ｍｇ／ｋｇ／日～約２ｍｇ／ｋｇ／日、約１ｍｇ／ｋｇ／日～約２ｍｇ／ｋｇ／日、約１．５ｍｇ／ｋｇ／日～約２ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約１．５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．５ｍｇ／ｋｇ／日～約１．５ｍｇ／ｋｇ／日、約１ｍｇ／ｋｇ／日～約１．５ｍｇ／ｋｇ／日、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約１．０ｍｇ／ｋｇ／日、約０．５ｍｇ／ｋｇ／日～約１．０ｍｇ／ｋｇ／日、または約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約０．５ｍｇ／ｋｇ／日である。いくつかの実施形態では、ボクロスポリンの投与量は、約０．１、約０．２、約０．３、約０．４、約０．５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．１、約１．２、約１．３、約１．４、約１．５、約１．６、約１．７、約１．８、約１．９、または約２．０ｍｇ／ｋｇ／日である。いくつかの実施形態では、ボクロスポリンの投与量は、少なくとも約０．１、少なくとも約０．２、少なくとも約０．３、少なくとも約０．４、少なくとも約０．５、少なくとも約０．６、少なくとも約０．７、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、少なくとも約１．０、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３、少なくとも約１．４、少なくとも約１．５、少なくとも約１．６、少なくとも約１．７、少なくとも約１．８、少なくとも約１．９、または少なくとも約２．０ｍｇ／ｋｇ／日である。
いくつかの実施形態では、適切な投与量は、約７．９ｍｇ単位である。いくつかの実施形態では、該ボクロスポリンの投与量は、約７．９ｍｇ ＱＤ、約１５．８ｍｇ ＱＤ、約２３．７ｍｇ ＱＤ、約３１．６ｍｇ ＱＤ、約３９．５ｍｇ ＱＤ、約４７．４ｍｇ ＱＤ、約５５．３ｍｇ ＱＤ、約６３．２ｍｇ ＱＤ、約７１．１ｍｇ ＱＤ、約７９．０ｍｇ ＱＤ、約８６．９ｍｇ ＱＤ、約９４．８ｍｇ ＱＤ、約１０２．７ｍｇ ＱＤ、または約１１０．６ｍｇ ＱＤである。いくつかの実施形態では、該ボクロスポリンの投与量は、約７．９ｍｇ ＢＩＤ、約１５．８ｍｇ ＢＩＤ、約２３．７ｍｇ ＢＩＤ、約３１．６ｍｇ ＢＩＤ、約３９．５ｍｇ ＢＩＤ、約４７．４ｍｇ ＢＩＤ、または約５５．３ＢＩＤである。
いくつかの実施形態では、該血中トラフレベルは、約２５～約６０ｎｇ／ｍＬである。いくつかの実施形態では、該血中トラフレベルは、約２５、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約５５、または約６０ｎｇ／ｍＬである。
いくつかの実施形態では、該治療有効量は、約０．０５μＭ～約１０μＭ、約０．１μＭ～約５μＭ、約０．２μＭ～約２．５μＭ、約０．３μＭ～約１．０μＭ、約０．４μＭ～約０．９μＭ、約０．５μＭ～約０．８μＭ、約０．１μＭ～約０．５μＭ、または約０．２μＭ～約０．４μＭの濃度と同等であるか、それであると推定することができるか、それを達成することができるか、またはそのＣｍａｘとして達成され得る量である。いくつかの実施形態では、該治療有効量は、約０．０５、約０．１、約０．１５、約０．２、約０．２５、約０．３、約０．３５、約０．４、約０．４５、約０．５、約０．５５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約６．０、約７．０、約８．０、約９．０、または約１０．０μＭまたはそれ未満の濃度と同等であるか、それであると推定することができるか、それを達成することができるか、またはそのＣｍａｘとして達成され得る量である。いくつかの実施形態では、該治療有効量は、約０．２μＭの濃度と同等であるか、それであると推定することができるか、それを達成することができるか、またはそのＣｍａｘとして達成され得る量である。いくつかの実施形態では、該治療有効量は、約０．３μＭの濃度と同等であるか、それであると推定することができるか、それを達成することができるか、またはそのＣｍａｘとして達成され得る量である。いくつかの実施形態では、該治療有効量は、約０．４μＭの濃度と同等であるか、それであると推定することができるか、それを達成することができるか、またはそのＣｍａｘとして達成され得る量である。いくつかの実施形態では、該治療有効量は、約０．５μＭの濃度と同等であるか、それであると推定することができるか、それを達成することができるか、またはそのＣｍａｘとして達成され得る量である。
Ａ．投与量の調整
本明細書に開示する方法及び使用のいくつかの実施形態では、該方法または治療は、さらに、当該対象の腎機能を監視することを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）または含む（ｉｎｖｏｌｖｅｓ）。本明細書に開示する方法のいくつかの実施形態では、該方法は、さらに、当該対象の腎機能を監視することを含む。投与量の低減の望ましさを評価するために使用される１つの重要なパラメータは、ＣＫＤ－ＥＰ１式または他の適切な方法を使用した推算糸球体ろ過量（ｅＧＦＲ）である。ｅＧＦＲの減少は、治療中に発生する可能性があるマイナスの副作用である。減少が極端すぎる場合は、投与量を変更するべきである。
本明細書に開示する方法及び使用のいくつかの実施形態では、該方法または治療は、さらに、当該対象の腎機能を監視することを含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）または含む（ｉｎｖｏｌｖｅｓ）。本明細書に開示する方法のいくつかの実施形態では、該方法は、さらに、当該対象の腎機能を監視することを含む。投与量の低減の望ましさを評価するために使用される１つの重要なパラメータは、ＣＫＤ－ＥＰ１式または他の適切な方法を使用した推算糸球体ろ過量（ｅＧＦＲ）である。ｅＧＦＲの減少は、治療中に発生する可能性があるマイナスの副作用である。減少が極端すぎる場合は、投与量を変更するべきである。
いくつかの実施形態では、該対象の腎機能を監視することは、以下を含む：
（ａ）異なる日の少なくとも第一の時点及び第二の時点で該対象の推算糸球体ろ過量（ｅＧＦＲ）を評価すること、ならびに
（ｂ）（ｉ）該対象のｅＧＦＲが該第一及び第二の時点の間に目標％を超えて所定の値未満に低下した場合、ボクロスポリンの該対象に対する１日投与量を減少させるか、または投与を停止すること、
（ｉｉ）該対象のｅＧＦＲが該第一及び第二の時点の間に目標％より少なく低下した場合、該対象に対して同じ１日投与量のボクロスポリンの投与を継続すること。
（ａ）異なる日の少なくとも第一の時点及び第二の時点で該対象の推算糸球体ろ過量（ｅＧＦＲ）を評価すること、ならびに
（ｂ）（ｉ）該対象のｅＧＦＲが該第一及び第二の時点の間に目標％を超えて所定の値未満に低下した場合、ボクロスポリンの該対象に対する１日投与量を減少させるか、または投与を停止すること、
（ｉｉ）該対象のｅＧＦＲが該第一及び第二の時点の間に目標％より少なく低下した場合、該対象に対して同じ１日投与量のボクロスポリンの投与を継続すること。
いくつかの実施形態では、該第一の時点は、治療の開始前、治療の開始時、または治療中である。いくつかの実施形態では、該第一の時点は、ボクロスポリンのいずれかの投与前の治療の初日である。
いくつかの実施形態では、該所定の値は、約５０～約９０ｍｌ／分／１．７３ｍ２である。いくつかの実施形態では、該所定の値は、約５０、約５５、約６０、約６５、約７０、約７５、約８０、約８５、または約９０ｍｌ／分／１．７３ｍ２である。
いくつかの実施形態では、該目標％は、約２０％～約４５％である。いくつかの実施形態では、該目標％は、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％、約４０％、または約４５％である。
Ｂ．投与経路
本明細書に開示する方法及び使用のいくつかの実施形態では、ボクロスポリンは、ウイルス感染を治療または予防するために十分なボクロスポリンのレベルを提供する任意の適切な形態で、任意の適切な経路、例えば、腸内投与（例えば、経口投与、舌下投与、もしくは直腸投与）または非経口投与（例えば、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注入、もしくは吸入／吹送）によって投与され得る。
本明細書に開示する方法及び使用のいくつかの実施形態では、ボクロスポリンは、ウイルス感染を治療または予防するために十分なボクロスポリンのレベルを提供する任意の適切な形態で、任意の適切な経路、例えば、腸内投与（例えば、経口投与、舌下投与、もしくは直腸投与）または非経口投与（例えば、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注入、もしくは吸入／吹送）によって投与され得る。
いくつかの実施形態では、ボクロスポリンは、腸内投与によって投与される。腸内投与の例示的な経路としては、経口投与、舌下投与、及び直腸投与（例えば、直腸を介する）が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該腸内投与は、経口投与を含む。いくつかの実施形態では、該腸内投与は、舌下投与を含む。いくつかの実施形態では、該腸内投与は、直腸投与を含む。
いくつかの実施形態では、ボクロスポリンは、非経口投与によって投与される。非経口投与の例示的な経路としては、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注入、及び吸入／吹送が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、該非経口投与は、静脈内注射を含む。いくつかの実施形態では、該非経口投与は、筋肉内注射を含む。いくつかの実施形態では、該非経口投与は、皮下注射を含む。いくつかの実施形態では、該非経口投与は、静脈内注入を含む。いくつかの実施形態では、該非経口投与は、吸入／吹送を含む。
いくつかの実施形態では、ボクロスポリンは、吸入または吹送によって投与される。吸入及び／または吹送のための調製物の例示的な種類としては、吸入器または吹送器で使用するためのスプレー、エアロゾル、ミスト、カプセル、粉末、またはカートリッジ、及び噴霧用の溶液／懸濁液が挙げられるがこれらに限定されない。いくつかの実施形態では、ボクロスポリンは、エアロゾル、スプレー、ミスト、または粉末の形態で投与される。いくつかの実施形態では、ボクロスポリンは、エアロゾルの形態で投与される。吸入または吹送による投与のための様々な種類の装置の例としては、ネブライザー、定量吸入器（ＭＤＩ）、及び乾燥粉末吸入器が挙げられるがこれらに限定されない。
Ｃ．併用
本明細書に提供する方法及び使用のいくつかの実施形態では、該方法または治療はまた、治療有効量のミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／またはコルチコステロイドを投与することも含む。本明細書に開示する方法のいくつかの実施形態では、該方法はまた、治療有効量のＭＭＦ及び／またはコルチコステロイドを投与することも含む。いくつかの実施形態では、該方法は、治療有効量のＭＭＦを投与することを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、治療有効量のコルチコステロイドを投与することを含む。
本明細書に提供する方法及び使用のいくつかの実施形態では、該方法または治療はまた、治療有効量のミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／またはコルチコステロイドを投与することも含む。本明細書に開示する方法のいくつかの実施形態では、該方法はまた、治療有効量のＭＭＦ及び／またはコルチコステロイドを投与することも含む。いくつかの実施形態では、該方法は、治療有効量のＭＭＦを投与することを含む。いくつかの実施形態では、該方法は、治療有効量のコルチコステロイドを投与することを含む。
いくつかの実施形態では、該方法は、ボクロスポリンを、治療有効量のＭＭＦ及び／または治療有効量のコルチコステロイドなしで投与することを含む。
本明細書に提供する方法及び使用のいくつかの実施形態では、該方法または治療はまた、治療有効量のさらなる抗ウイルス剤を投与することも含む。いくつかの実施形態では、該方法はまた、治療有効量のさらなる抗ウイルス剤を投与することを含む。いくつかの実施形態では、該さらなる抗ウイルス剤は、レムデシビル、ロピナビル／リトナビル、ＩＦＮ－α、ロピナビル、リトナビル、ペンシクロビル、ガリデシビル、ジスルフィラム、ダルナビル、コビシスタット、ＡＳＣ０９Ｆ、ジスルフィラム、ナファモスタット、グリフィスシン、アリスポリビル、クロロキン、ヒドロキシクロロキン、ニタゾキサニド、バロキサビルマルボキシル、オセルタミビル、ザナミビル、ペラミビル、アマンタジン、リマンタジン、ファビピラビル、ラニナミビル、リバビリン、ウミフェノビル、またはそれらの任意の組み合わせである。いくつかの実施形態では、該抗ウイルス剤は、クロロキンである。いくつかの実施形態では、該抗ウイルス剤は、ヒドロキシクロロキンである。いくつかの実施形態では、該抗ウイルス剤は、レムデシビルである。
ＩＩＩ．組成物
本明細書に提供する方法及び使用のいくつかの実施形態では、該方法または治療は、ボクロスポリンを含む組成物、例えば、医薬組成物または治療組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、ボクロスポリンを含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、該組成物は、ボクロスポリン及びそのＺアイソフォームの異性体混合物を含む。いくつかの実施形態では、該異性体混合物は、ボクロスポリンを少なくとも約９９重量％、約９８重量％、約９７重量％、約９６重量％、約９５重量％、約９４重量％、約９３重量％、約９２重量％、約９１重量％、約９０重量％、約８０重量％、約７０重量％、約６０重量％、約５０重量％、約４０重量％、約３０重量％、約２０重量％、または約１０重量％含む。いくつかの実施形態では、該異性体混合物は、ボクロスポリンを少なくとも９５重量％含む。
本明細書に提供する方法及び使用のいくつかの実施形態では、該方法または治療は、ボクロスポリンを含む組成物、例えば、医薬組成物または治療組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法は、ボクロスポリンを含む組成物を投与することを含む。いくつかの実施形態では、該組成物は、ボクロスポリン及びそのＺアイソフォームの異性体混合物を含む。いくつかの実施形態では、該異性体混合物は、ボクロスポリンを少なくとも約９９重量％、約９８重量％、約９７重量％、約９６重量％、約９５重量％、約９４重量％、約９３重量％、約９２重量％、約９１重量％、約９０重量％、約８０重量％、約７０重量％、約６０重量％、約５０重量％、約４０重量％、約３０重量％、約２０重量％、または約１０重量％含む。いくつかの実施形態では、該異性体混合物は、ボクロスポリンを少なくとも９５重量％含む。
該提供する方法及び使用のいくつかの実施形態では、該ボクロスポリンを含む組成物は、ボクロスポリンを含む医薬製剤であるか、またはそれを含む。いくつかの実施形態では、該ボクロスポリンを含む医薬組成物は、１つ以上の医薬的に許容される賦形剤、緩衝剤、担体及び／または媒体を含む。
いくつかの実施形態では、該組成物は、企図される投与の型に適した従来の医薬担体及び賦形剤を含む。
いくつかの実施形態では、該ボクロスポリンを含む組成物は、医薬的に許容される緩衝剤、例えば、医薬的に許容される担体または媒体を含む緩衝剤中で製剤化され得る。一般に、該医薬的に許容される担体または媒体、例えば、該医薬的に許容される緩衝剤に含まれるものは、当技術分野で知られている任意のものであり得る。Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎ，Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，Ｐａ．，１９ｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ（１９９５）は、１つ以上の治療用化合物の医薬的送達に適した組成物及び製剤を記載している。医薬的に許容される組成物は、一般に、動物及びヒトでの使用に対して一般に認められた薬局方に従って作成される規制当局または他の機関の承認を考慮して調製される。
医薬組成物は、化合物とともに投与される担体、例えば、希釈剤、アジュバント、賦形剤、または媒体を含むことができる。適切な医薬担体の例は、“Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ”ｂｙ Ｅ．Ｗ．Ｍａｒｔｉｎに記載されている。かかる組成物は、治療有効量の化合物を一般に精製された形態で、適量の担体とともに含み、当該患者に対する適切な投与のための形態が提供される。かかる医薬担体は、滅菌液、例えば、水及び、石油、動物、植物または合成起源のものを含めた油であり得る。当該医薬組成物が静脈内投与される場合、水が通常の担体である。生理食塩水ならびにデキストロース及びグリセロール水溶液もまた、特に注射剤のための液体担体として使用され得る。組成物は、必要に応じて、少量の湿潤剤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。通常、該化合物を含む組成物は、当技術分野で周知の技術及び手順を使用して医薬組成物に製剤化される（例えば、Ａｎｓｅｌ Ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｔｏ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｄｏｓａｇｅ Ｆｏｒｍｓ，Ｆｏｕｒｔｈ Ｅｄｉｔｉｏｎ，１９８５，１２６参照）。一般に、該製剤化方法は、投与経路の関数である。
いくつかの実施形態では、医薬的に許容される賦形剤、緩衝剤、担体及び／または媒体は、アルコール、Ｄ－α－トコフェロール（ビタミンＥ）、ポリエチレングリコールスクシネート（ＴＰＧＳ）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリソルベート４０（Ｔｗｅｅｎ４０）、中鎖トリグリセリド、ゼラチン、ソルビトール、グリセリン、黄色酸化鉄、赤色酸化鉄、二酸化チタン、及び水の中の１つ以上を含む。様々なボクロスポリン混合物の製剤は、米国特許第７，０６０，６７２号、第７，４２９，５６２号、及び第７，８２９，５３３号にも記載されている。
ＩＶ．患者集団
いくつかの実施形態では、本明細書に提供する方法及び使用に従って治療される対象としては、ウイルス感染のリスクがあるか、またはウイルス感染した対象が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する方法及び使用に従って治療される対象としては、免疫抑制を必要とする対象が挙げられる。いくつかの態様では、該対象は、免疫抑制を必要としており、ウイルス感染のリスクがあるか、またはウイルス感染している。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する方法及び使用に従って治療される対象としては、例えば、移植片拒絶反応のリスクのために免疫抑制を必要とする対象が挙げられる。いくつかの態様では、該対象は、移植、例えば、臓器移植、組織移植または細胞移植の候補であり、かつ該対象は、免疫抑制を必要としている。
いくつかの実施形態では、本明細書に提供する方法及び使用に従って治療される対象としては、ウイルス感染のリスクがあるか、またはウイルス感染した対象が挙げられる。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する方法及び使用に従って治療される対象としては、免疫抑制を必要とする対象が挙げられる。いくつかの態様では、該対象は、免疫抑制を必要としており、ウイルス感染のリスクがあるか、またはウイルス感染している。いくつかの実施形態では、本明細書に提供する方法及び使用に従って治療される対象としては、例えば、移植片拒絶反応のリスクのために免疫抑制を必要とする対象が挙げられる。いくつかの態様では、該対象は、移植、例えば、臓器移植、組織移植または細胞移植の候補であり、かつ該対象は、免疫抑制を必要としている。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示する方法に関与する該対象は、自己免疫疾患を有するか、または移植片拒絶反応に関連する状態を有する。該提供する実施形態のいくつかでは、該対象は、腎移植レシピエント（ＫＴＲ）である。
いくつかの実施形態では、該対象は、移植片拒絶反応に関連する状態を有する。いくつかの実施形態では、該状態は、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚、腸、または角膜の移植片拒絶反応に関連する。いくつかの実施形態では、該状態は、心臓移植拒絶反応に関連する。いくつかの実施形態では、該状態は、肺移植拒絶反応に関連する。いくつかの実施形態では、該状態は、肝臓の拒絶反応に関連する。いくつかの実施形態では、該状態は、腎移植拒絶反応に関連する。いくつかの実施形態では、該状態は、膵臓移植拒絶反応に関連する。いくつかの実施形態では、該状態は、皮膚移植拒絶反応に関連する。いくつかの実施形態では、該状態は、腸移植拒絶反応に関連する。いくつかの実施形態では、該状態は、角膜移植拒絶反応に関連する。
いくつかの実施形態では、該対象は、自己免疫疾患を有する。自己免疫疾患の例としては、自己免疫性血液疾患（例えば、溶血性貧血、再生不良性貧血、赤芽球癆及び特発性血小板減少症を含む）、全身性エリテマトーデス、ループス腎炎、多発性軟骨炎、硬化症、ウェゲナー肉芽腫症、皮膚筋炎、慢性活動性肝炎、重症筋無力症、乾癬、スティーブン・ジョンソン症候群、特発性スプルー、（自己免疫性）炎症性腸疾患（例えば、潰瘍性大腸炎及びクローン病を含む）、内分泌性眼障害、グレーブス病、サルコイドーシス、多発性硬化症、原発性胆汁性肝硬変、若年性糖尿病（Ｉ型糖尿病）、ブドウ膜炎（前部及び後部）、乾性角結膜炎及び春季カタル、間質性肺線維症、乾癬性関節炎、糸球体腎炎（例えば、特発性ネフローゼ症候群または微小変化型ネフローゼを含むネフローゼ症候群を伴う及び伴わない）ならびに若年性皮膚筋炎が挙げられるがこれらに限定されない。
Ｖ．定義
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に別途明示のない限り、複数形を含む。
本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用される、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈に別途明示のない限り、複数形を含む。
本明細書で使用される場合、特に明記しない限り、「約」及び「およそ」という用語は、用量または量に関連して使用される場合、指定された用量または量の１０％以内、５％以内、４％以内、３％以内、２％以内、１％以内、または０．５％以内の用量または量を企図する。
本明細書で使用される、「治療有効量」は、当該状態に対して所望の薬理学的及び／または生理学的効果をもたらす量を示す。該効果は、状態もしくはその症状を完全にもしくは部分的に予防するという点において予防的である場合、及び／または該状態及び／または該状態に起因する副作用の部分的もしくは完全な治癒という点において治療的である場合がある。
「治療する」、「治療すること」、及び「治療」という用語は、有益なまたは所望の臨床結果を含めた結果を得るためのアプローチを指す。有益なまたは所望の結果としては、以下のうちの１つ以上が挙げられるがこれらに限定されない：疾患もしくは障害に起因する１つ以上の症状を低減すること、疾患もしくは障害の程度を低減すること、疾患もしくは障害を安定させること（例えば、疾患もしくは障害の悪化を予防するもしくは遅延させること）、疾患もしくは障害の発症もしくは再発を遅延させること、疾患もしくは障害の進行を遅延させるもしくは減速すること、疾患もしくは障害の状態を改善すること、疾患もしくは障害の寛解（部分的もしくは完全な）を提供すること、疾患もしくは障害の治療に必要な１つ以上の他の薬剤の用量を低減すること、疾患もしくは障害の治療に使用される別の薬剤の効果を高めること、疾患もしくは障害の進行を遅延させること、生活の質を向上させること、及び／または患者の生存期間を延長させること。同様に「治療」に包含されるのは、疾患または障害の病理学的帰結の軽減である。本開示の方法は、これらの治療の態様の任意の１つ以上を企図する。
「対象」という用語は、霊長類（例えば、ヒト）、サル、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、またはマウスを含むがこれらに限定されない動物を指す。「対象」及び「患者」という用語は、本明細書では、例えば、ヒト等の哺乳類対象を参照して同義で使用される。
ＶＩ．例示的な実施形態
該提供する実施形態は、以下のものである。
１．対象におけるウイルス感染の治療または予防方法であって、前記対象に対して、治療有効量のボクロスポリンを投与することを含む、前記方法。
該提供する実施形態は、以下のものである。
１．対象におけるウイルス感染の治療または予防方法であって、前記対象に対して、治療有効量のボクロスポリンを投与することを含む、前記方法。
２．前記対象が、免疫抑制を必要としている、実施形態２に記載の方法。
３．前記ウイルス感染が、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）またはＣｙｐＡ関連経路の阻害によって改善される、実施形態１または２に記載の方法。
４．免疫抑制を必要とする対象におけるウイルス感染の治療または予防方法であって、前記対象に対して、治療有効量のボクロスポリンを投与することを含む前記方法であり、前記ウイルス感染が、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）またはＣｙｐＡ関連経路の阻害によって改善される、前記方法。
５．対象におけるウイルス感染の治療または予防での使用のためのボクロスポリンを含む組成物であって、治療有効量のボクロスポリン含む前記組成物であり、前記対象に対して投与される、前記組成物。
６．前記対象が、免疫抑制を必要としている、実施形態５に記載の使用のための組成物。
７．前記ウイルス感染が、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）またはＣｙｐＡ関連経路の阻害によって改善される、実施形態５または６に記載の使用のための組成物。
８．免疫抑制を必要とする対象におけるウイルス感染の治療または予防での使用のためのボクロスポリンを含む組成物であって、治療有効量のボクロスポリンを含む前記組成物であり、前記対象に対して投与される前記組成物であり、前記ウイルス感染が、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）またはＣｙｐＡ関連経路の阻害によって改善される、前記組成物。
９．対象におけるウイルス感染の治療または予防におけるボクロスポリンの使用であって、前記対象が、治療有効量のボクロスポリンを投与される、前記使用。
１０．対象におけるウイルス感染の治療または予防のための薬剤の製造におけるボクロスポリンの使用であって、前記薬剤が、治療有効量のボクロスポリンを含み、前記対象に対して投与される、前記使用。
１１．前記対象が、免疫抑制を必要としている、実施形態９または１０に記載の使用。
１２．前記ウイルス感染が、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）またはＣｙｐＡ関連経路の阻害によって改善される、実施形態９～１１のいずれかに記載の使用。
１３．免疫抑制を必要とする対象におけるウイルス感染の治療または予防におけるボクロスポリンの使用であって、前記対象が、治療有効量のボクロスポリンを投与される前記使用であり、前記ウイルス感染が、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）またはＣｙｐＡ関連経路の阻害によって改善される、前記使用。
１４．免疫抑制を必要とする対象におけるウイルス感染の治療または予防のための薬剤の製造におけるボクロスポリンの使用であって、前記薬剤が、治療有効量のボクロスポリンを含み、前記対象に対して投与される前記使用であり、前記ウイルス感染が、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）またはＣｙｐＡ関連経路の阻害によって改善される、前記使用。
１５．前記ウイルス感染が、コロナウイルス科のメンバーであるウイルスによって引き起こされる、実施形態１～１４のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
１６．前記ウイルスが、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、デルタコロナウイルス、またはガンマコロナウイルスである、実施形態１５に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
１７．前記ウイルスが、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、または重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である、実施形態１５または１６に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
１８．前記ウイルスが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、実施形態１５～１７のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
１９．前記ウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、実施形態１５～１８のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
２０．前記治療有効量が、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約２ｍｇ／ｋｇ／日である、実施形態１～１９のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
２１．前記治療有効量が、約７．９ｍｇ ＢＩＤ、約１５．８ｍｇ ＢＩＤ、約２３．７ｍｇ ＢＩＤ、約３１．６ｍｇ ＢＩＤ、約３９．５ｍｇ ＢＩＤ、約４７．４ｍｇ ＢＩＤ、または約５５．３ＢＩＤである、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
２２．前記治療有効量が、約７．９ｍｇ ＱＤ、約１５．８ｍｇ ＱＤ、約２３．７ｍｇ ＱＤ、約３１．６ｍｇ ＱＤ、約３９．５ｍｇ ＱＤ、約４７．４ｍｇ ＱＤ、約５５．３ｍｇ ＱＤ、約６３．２ｍｇ ＱＤ、約７１．１ｍｇ ＱＤ、約７９．０ｍｇ ＱＤ、約８６．９ｍｇ ＱＤ、約９４．８ｍｇ ＱＤ、約１０２．７ｍｇ ＱＤ、または約１１０．６ｍｇ ＱＤである、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
２３．前記治療有効量が、約０．０５μＭ～約１０μＭ、約０．１μＭ～約５μＭ、約０．２μＭ～約２．５μＭ、約０．３μＭ～約１．０μＭ、約０．４μＭ～約０．９μＭ、約０．５μＭ～約０．８μＭ、約０．１μＭ～約０．５μＭ、もしくは約０．２μＭ～約０．４μＭ、または約０．０５、約０．１、約０．１５、約０．２、約０．２５、約０．３、約０．３５、約０．４、約０．４５、約０．５、約０．５５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約６．０、約７．０、約８．０、約９．０、もしくは約１０．０μＭもしくはそれ未満の濃度と同等であるか、またはそれを達成することができる、実施形態１～２０のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
２４．前記対象の腎機能が監視される、実施形態１～２３のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
２５．前記対象の腎機能の監視が、以下を含む、実施形態２４に記載の方法、使用のための組成物、または使用：
（ａ）異なる日の少なくとも第一の時点及び第二の時点で前記対象の推算糸球体ろ過量（ｅＧＦＲ）を評価すること、ならびに
（ｂ）（ｉ）前記対象のｅＧＦＲが前記第一及び第二の時点の間に目標％を超えて所定の値未満に低下した場合、ボクロスポリンの前記対象に対する１日投与量を減少させるか、または投与を停止すること、
（ｉｉ）前記対象のｅＧＦＲが前記第一及び第二の時点の間に前記目標％より少なく低下した場合、前記対象に対して同じ１日投与量のボクロスポリンの投与を継続すること。
（ａ）異なる日の少なくとも第一の時点及び第二の時点で前記対象の推算糸球体ろ過量（ｅＧＦＲ）を評価すること、ならびに
（ｂ）（ｉ）前記対象のｅＧＦＲが前記第一及び第二の時点の間に目標％を超えて所定の値未満に低下した場合、ボクロスポリンの前記対象に対する１日投与量を減少させるか、または投与を停止すること、
（ｉｉ）前記対象のｅＧＦＲが前記第一及び第二の時点の間に前記目標％より少なく低下した場合、前記対象に対して同じ１日投与量のボクロスポリンの投与を継続すること。
２６．前記所定の値が、約５０～約９０ｍｌ／分／１．７３ｍ２である、実施形態２５に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
２７．前記所定の値が、約６０ｍｌ／分／１．７３ｍ２である、実施形態２５または２６に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
２８．前記目標％が、約２０％～約４５％である、実施形態２５～２７のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
２９．前記目標％が、約２０％である、実施形態２５～２８のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
３０．前記対象が、自己免疫疾患または移植片拒絶反応に関連する状態を有する、実施形態１～２９のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
３１．前記対象が、移植片拒絶反応に関連する状態を有する、実施形態１～３０のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
３２．前記状態が、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚、腸、または角膜の移植片拒絶反応に関連する、実施形態３０または３１に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
３３．前記状態が、腎移植拒絶反応に関連する、実施形態３０～３２のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
３４．前記対象が、自己免疫疾患を有する、実施形態３０に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
３５．前記治療有効量のボクロスポリンが、治療有効量のミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／またはコルチコステロイドを投与することなく投与される、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
３６．さらに、治療有効量のミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／または治療有効量のコルチコステロイドを投与することを含む、実施形態１～３４のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
３７．ボクロスポリンが、腸内投与、経口投与、舌下投与、または直腸投与、非経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注入、または吸入／吹送によって投与される、実施形態１～３６のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
３８．ボクロスポリンが、腸内投与、経口投与、舌下投与、または直腸投与によって投与される、実施形態３７に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
３９．ボクロスポリンが、経口投与によって投与される、実施形態３７または３８に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
４０．ボクロスポリンが、非経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注入、または吸入／吹送によって投与される、実施形態３７に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
４１．ボクロスポリンが、吸入または吹送によって投与される、実施形態３７または４０に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
４２．ボクロスポリンが、エアロゾルの形態で投与される、実施形態４１に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
４３．ボクロスポリンが、医薬組成物で投与される、実施形態１～４２のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
４４．前記医薬組成物が、１つ以上の医薬的に許容される賦形剤を含む、実施形態４３に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
４５．前記医薬的に許容される賦形剤が、独立して、アルコール、Ｄ－α－トコフェロール（ビタミンＥ）、ポリエチレングリコールスクシネート（ＴＰＧＳ）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリソルベート４０（Ｔｗｅｅｎ４０）、中鎖トリグリセリド、ゼラチン、ソルビトール、グリセリン、黄色酸化鉄、赤色酸化鉄、二酸化チタン、及び水を含む１つ以上から選択される、実施形態４４に記載の方法、使用のための組成物、または使用。
４６．前記ウイルス量が、前記対象において、ボクロスポリンの投与後に減少する、実施形態１～４５のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
４７．前記対象の生存が、ボクロスポリンの投与後に延長される、実施形態１～４６のいずれか１つに記載の方法、使用のための組成物、または使用。
ＶＩＩ．実施例
以下の実施例は、例示の目的のためにのみ含まれ、本発明の範囲を限定することを意図していない。
以下の実施例は、例示の目的のためにのみ含まれ、本発明の範囲を限定することを意図していない。
実施例１
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の細胞変性効果（ＣＰＥ）を阻害する候補化合物を調べるために、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞）を、ボクロスポリン、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、またはタクロリムスとプレインキュベートした後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させ、その後生存率を評価した。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の細胞変性効果（ＣＰＥ）を阻害する候補化合物を調べるために、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞（アフリカミドリザル腎臓上皮細胞）を、ボクロスポリン、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、またはタクロリムスとプレインキュベートした後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させ、その後生存率を評価した。
方法
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を９６ウェルのプレートで増殖させ、培地、媒体、及びボクロスポリン（０．８～１００μＭ）、ＣｓＡ（０．８～１００μＭ）またはタクロリムス（０．８～１００μＭ）のいずれかとともに６０分間プレインキュベートした。次に、細胞を示された濃度のそれぞれの化合物の存在下で６０分間、未感染のままで放置、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で感染多重度（ＭＯＩ）０．０１５にて感染させた。続いて、ウイルスを培地から除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、未処理の感染対照細胞が完全なＣＰＥを示すまで（３日間）、それぞれの化合物を含む新鮮な培地でさらにインキュベートした。インキュベーションの終わりに、細胞をＭＴＳ生存率アッセイに供し、続いて固定した後、プレートリーダーで吸光度分析を行った（図１Ａ）。細胞の生存率を、ＭＴＳアッセイを使用して評価し、化合物の細胞毒性（未感染細胞）及びウイルスの細胞毒性の両方を特定した。
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞を９６ウェルのプレートで増殖させ、培地、媒体、及びボクロスポリン（０．８～１００μＭ）、ＣｓＡ（０．８～１００μＭ）またはタクロリムス（０．８～１００μＭ）のいずれかとともに６０分間プレインキュベートした。次に、細胞を示された濃度のそれぞれの化合物の存在下で６０分間、未感染のままで放置、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２で感染多重度（ＭＯＩ）０．０１５にて感染させた。続いて、ウイルスを培地から除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、未処理の感染対照細胞が完全なＣＰＥを示すまで（３日間）、それぞれの化合物を含む新鮮な培地でさらにインキュベートした。インキュベーションの終わりに、細胞をＭＴＳ生存率アッセイに供し、続いて固定した後、プレートリーダーで吸光度分析を行った（図１Ａ）。細胞の生存率を、ＭＴＳアッセイを使用して評価し、化合物の細胞毒性（未感染細胞）及びウイルスの細胞毒性の両方を特定した。
結果
タクロリムスは、感染細胞をウイルス誘発性細胞変性効果から保護しなかった。これは、最大２５μＭの投与量を使用した後、化合物関連の細胞毒性が観察されたことで明らかであった。代替的に、ＣｓＡの保護効果は１．６～１２μＭで生じ、その後、この化合物は細胞毒性を有した。感染細胞を０．８μＭのボクロスポリンで処理すると、モック感染対象と同じレベルの細胞生存率でウイルス防御がもたらされた。
タクロリムスは、感染細胞をウイルス誘発性細胞変性効果から保護しなかった。これは、最大２５μＭの投与量を使用した後、化合物関連の細胞毒性が観察されたことで明らかであった。代替的に、ＣｓＡの保護効果は１．６～１２μＭで生じ、その後、この化合物は細胞毒性を有した。感染細胞を０．８μＭのボクロスポリンで処理すると、モック感染対象と同じレベルの細胞生存率でウイルス防御がもたらされた。
図１Ｂに示す通り、ボクロスポリンは、２μＭ未満の濃度では未感染細胞に対して毒性を示さず、バッチ４のボクロスポリンは最大１０μＭの濃度で未感染細胞に対して毒性を示さなかった。一方、ボクロスポリンのすべての試験バッチは、感染細胞の生存率の増加によって示されるように、０．０１μＭ～１μＭの濃度で、用量依存的にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＣＰＥの阻害を促進した。ボクロスポリンのすべてのバッチで、０．８μＭでの処理が、未感染細胞で見られるレベルまで細胞の生存率を維持するのに効果的であった。
図１Ｃに示す通り、ボクロスポリンは、タクロリムス（ＥＣ５０約２５μＭ）と比較して、はるかに低い濃度（ＥＣ５０約０．４μＭ）でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を阻害することができた。さらに、タクロリムス処理は、２５μＭを超える濃度で化合物関連の細胞毒性を引き起こした（データは示さず）。これらの結果は、ボクロスポリンが、試験した細胞の生存率に影響を与えない濃度範囲で、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対してインビトロで阻害を示したことを示している。
実施例２
インビトロでボクロスポリンがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に与える影響を調べるために、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞またはＣａｌｕ細胞（ヒト気管支気道上皮細胞）をボクロスポリンとプレインキュベートした後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させ、その後採取し、プラークアッセイによってウイルス量を測定した。
インビトロでボクロスポリンがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に与える影響を調べるために、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞またはＣａｌｕ細胞（ヒト気管支気道上皮細胞）をボクロスポリンとプレインキュベートした後、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させ、その後採取し、プラークアッセイによってウイルス量を測定した。
方法
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞及びＣａｌｕを９６ウェルのプレートで増殖させ、０．０１μＭ～１０．００μＭのボクロスポリンとともに６０分間プレインキュベートした。次に、細胞を示された濃度のボクロスポリンの存在下、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でＭＯＩ１にて６０分間感染させた。続いて、ウイルスを培地から除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、示された濃度のボクロスポリンを含む新鮮な培地でさらに１６時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに培地を採取し、プラークアッセイによってウイルス量を測定した。感染の量を説明するために、それぞれの細胞を蛍光顕微鏡で可視化されるウイルスＮＳＰ４の染色にも供した。
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞及びＣａｌｕを９６ウェルのプレートで増殖させ、０．０１μＭ～１０．００μＭのボクロスポリンとともに６０分間プレインキュベートした。次に、細胞を示された濃度のボクロスポリンの存在下、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２でＭＯＩ１にて６０分間感染させた。続いて、ウイルスを培地から除去し、細胞をＰＢＳで洗浄し、示された濃度のボクロスポリンを含む新鮮な培地でさらに１６時間インキュベートした。インキュベーションの終わりに培地を採取し、プラークアッセイによってウイルス量を測定した。感染の量を説明するために、それぞれの細胞を蛍光顕微鏡で可視化されるウイルスＮＳＰ４の染色にも供した。
結果
図２Ａ～２Ｃに示す通り、ボクロスポリンは、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞及びＣａｌｕ細胞においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス量を用量依存的に阻害した。バッチ２のボクロスポリンは、Ｅ６細胞においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス量を０．０１から１．００μＭまで用量依存的に阻害し、濃度が１．００μＭを超えると、ウイルス力価は検出限界まで低下した（図２Ａ）。同様に、バッチ３のボクロスポリンは、Ｅ６細胞及びヒトＣａｌｕ細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス量を、それぞれ、０．０１から４．００μＭまで用量依存的に阻害した（図２Ｂ）。図２Ｃに示す通り、ボクロスポリンは、ウイルスＮＳＰ４の蛍光染色の減少によって反映されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞の量を用量依存的に減少させた。
図２Ａ～２Ｃに示す通り、ボクロスポリンは、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞及びＣａｌｕ細胞においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス量を用量依存的に阻害した。バッチ２のボクロスポリンは、Ｅ６細胞においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス量を０．０１から１．００μＭまで用量依存的に阻害し、濃度が１．００μＭを超えると、ウイルス力価は検出限界まで低下した（図２Ａ）。同様に、バッチ３のボクロスポリンは、Ｅ６細胞及びヒトＣａｌｕ細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のウイルス量を、それぞれ、０．０１から４．００μＭまで用量依存的に阻害した（図２Ｂ）。図２Ｃに示す通り、ボクロスポリンは、ウイルスＮＳＰ４の蛍光染色の減少によって反映されるように、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞の量を用量依存的に減少させた。
実施例３
腎移植患者の拒絶反応を予防するためのボクロスポリン処理の有効性及び安全性プロファイルを評価するために、新規腎移植患者にボクロスポリンまたはタクロリムスを投与し、拒絶反応及びその他の有害転帰について評価した。
腎移植患者の拒絶反応を予防するためのボクロスポリン処理の有効性及び安全性プロファイルを評価するために、新規腎移植患者にボクロスポリンまたはタクロリムスを投与し、拒絶反応及びその他の有害転帰について評価した。
方法
新規腎移植レシピエントを、６か月間、第２ｂ相、多施設、ランダム化、非盲検試験に登録した。新規腎移植レシピエントに、高用量ボクロスポリン（０．８ｍｇ／ｋｇ）、中用量ボクロスポリン（０．６ｍｇ／ｋｇ）、低用量ボクロスポリン（０．４ｍｇ／ｋｇ）、または標準用量のタクロリムス（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を１日２回（ＢＩＤ）投与した。さらに、すべての被験者は、ダクリズマブまたはバシリキシマブの静脈内投与（製品ラベルに従って投与）による誘導免疫抑制を受け、試験中にＭＭＦ及びコルチコステロイドによる併用治療を受けた。ボクロスポリンまたはタクロリムスの血中トラフレベルを１８０日間にわたって測定した。有害反応を記録し、バンフ分類に基づいて腎移植片拒絶反応を評価した。３か月及び６か月の時点で、有害反応を分析した。移植片の生存率及び患者の生存率も６か月の時点で記録した。
新規腎移植レシピエントを、６か月間、第２ｂ相、多施設、ランダム化、非盲検試験に登録した。新規腎移植レシピエントに、高用量ボクロスポリン（０．８ｍｇ／ｋｇ）、中用量ボクロスポリン（０．６ｍｇ／ｋｇ）、低用量ボクロスポリン（０．４ｍｇ／ｋｇ）、または標準用量のタクロリムス（０．０５ｍｇ／ｋｇ）を１日２回（ＢＩＤ）投与した。さらに、すべての被験者は、ダクリズマブまたはバシリキシマブの静脈内投与（製品ラベルに従って投与）による誘導免疫抑制を受け、試験中にＭＭＦ及びコルチコステロイドによる併用治療を受けた。ボクロスポリンまたはタクロリムスの血中トラフレベルを１８０日間にわたって測定した。有害反応を記録し、バンフ分類に基づいて腎移植片拒絶反応を評価した。３か月及び６か月の時点で、有害反応を分析した。移植片の生存率及び患者の生存率も６か月の時点で記録した。
結果
図３に示す通り、低用量、中用量、及び高用量群に関するボクロスポリンの血中トラフレベル（Ｃ０）は、０～３か月では、それぞれ、２０～３０ｎｇ／ｍＬ、３５～５０ｎｇ／ｍＬ、及び６０～８５ｎｇ／ｍＬであり、３～６か月では、同様に１１～２０ｎｇ／ｍＬ、２１～３０ｎｇ／ｍＬ及び３１～４０ｎｇ／ｍＬであった。比較すると、タクロリムスの標準用量の血中トラフレベルは、０～３か月で７～２０ｎｇ／ｍＬであり、０～６か月では５～１５ｎｇ／ｍＬである。
図３に示す通り、低用量、中用量、及び高用量群に関するボクロスポリンの血中トラフレベル（Ｃ０）は、０～３か月では、それぞれ、２０～３０ｎｇ／ｍＬ、３５～５０ｎｇ／ｍＬ、及び６０～８５ｎｇ／ｍＬであり、３～６か月では、同様に１１～２０ｎｇ／ｍＬ、２１～３０ｎｇ／ｍＬ及び３１～４０ｎｇ／ｍＬであった。比較すると、タクロリムスの標準用量の血中トラフレベルは、０～３か月で７～２０ｎｇ／ｍＬであり、０～６か月では５～１５ｎｇ／ｍＬである。
ボクロスポリン投与の臨床的影響は、移植片の拒絶率によって評価した。表１に示す通り、中用量のボクロスポリン群（０．６ｍｇ／ｋｇ ＢＩＤ）は、生検で証明される急性拒絶反応（ＢＰＡＲ）によって示されるように、標準用量のタクロリムス群と比較して同様の拒絶率を示した。低用量、中用量、及び高用量のボクロスポリン群に関する移植後の糖尿病の新規発症（ＮＯＤＡＴ）の発生率は、タクロリムスの標準用量群の１６．４％に対して、それぞれ、１．６％、５．７％、及び１７．７％であった。低用量、中用量、及び高用量のボクロスポリン群に関するＮａｎｋｉｖｅｌｌ ｅＧＦＲ（腎機能の指標）は、タクロリムス標準用量群の６９ｍＬ／分に対して、それぞれ、７１、７２、及び６８ｍＬ／分であった。この６か月間の試験では、ＶＣＳが急性拒絶反応の予防においてＴＡＣと同程度の効果があり、低用量群及び中用量群で同様の腎機能を有すること、及びＮＯＤＡＴの発生率の低下と関連している可能性があることが示された。
実施例４
薬物動態データを、活動性ループス腎炎患者の試験から収集した。様々な用量に対するトラフ濃度を表２に示す。ＰＫにより、トラフ濃度に対する用量の直線性が実証されるため、進行中の臨床試験では治療薬モニタリングの使用の必要はない。
薬物動態データを、活動性ループス腎炎患者の試験から収集した。様々な用量に対するトラフ濃度を表２に示す。ＰＫにより、トラフ濃度に対する用量の直線性が実証されるため、進行中の臨床試験では治療薬モニタリングの使用の必要はない。
実施例５
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性腎移植患者におけるボクロスポリンの抗ウイルス効果を評価するために、軽度から中等度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２症状を示す腎移植レシピエントを試験に登録し、プレドニゾン及びタクロリムスの併用療法の効果を評価する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性腎移植患者におけるボクロスポリンの抗ウイルス効果を評価するために、軽度から中等度のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２症状を示す腎移植レシピエントを試験に登録し、プレドニゾン及びタクロリムスの併用療法の効果を評価する。
方法
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性腎移植患者を、ボクロスポリン処理のための非盲検、単一施設、探査的試験に登録する。試験への登録前または登録時に、被験者の標準的な免疫抑制療法を、最新の当該施設のガイドライン（ＣＯＶＩＤ陽性移植患者のためのＬＵＭＣ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｃｅｎｔｅｒの治療ガイドライン）に従って、プレドニゾン及びタクロリムスによる二剤療法に減じた。１日目の前に、ＣＯＶＩＤ－１９感染が疑われる腎移植レシピエントにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２診断検査を施し、本試験について伝える。ＣＯＶＩＤ－１９感染が確認され、同意後、被験者を試験群にランダム化し、それに応じて１日目の試験手順を行う。具体的には、被験者３０人中１５人が試験期間中プレドニゾン及びタクロリムスの治療を受け続け、残りの１５人の被験者をタクロリムスからボクロスポリンに切り替える。ボクロスポリンを、最大１年の治療期間、６カプセル（各７．９ｍｇ）ＢＩＤとして投与する（図４）。ボクロスポリンのトラフレベルが２５～６０ｎｇ／ｍＬに維持され、タクロリムスのトラフレベルが３～７ｎｇ／ｍｌに維持されるように、試験中に安全性薬物モニタリングを行う。トラフレベルがこれらのレベル内にない場合は、用量の調節を行う。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２陽性腎移植患者を、ボクロスポリン処理のための非盲検、単一施設、探査的試験に登録する。試験への登録前または登録時に、被験者の標準的な免疫抑制療法を、最新の当該施設のガイドライン（ＣＯＶＩＤ陽性移植患者のためのＬＵＭＣ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ Ｃｅｎｔｅｒの治療ガイドライン）に従って、プレドニゾン及びタクロリムスによる二剤療法に減じた。１日目の前に、ＣＯＶＩＤ－１９感染が疑われる腎移植レシピエントにＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２診断検査を施し、本試験について伝える。ＣＯＶＩＤ－１９感染が確認され、同意後、被験者を試験群にランダム化し、それに応じて１日目の試験手順を行う。具体的には、被験者３０人中１５人が試験期間中プレドニゾン及びタクロリムスの治療を受け続け、残りの１５人の被験者をタクロリムスからボクロスポリンに切り替える。ボクロスポリンを、最大１年の治療期間、６カプセル（各７．９ｍｇ）ＢＩＤとして投与する（図４）。ボクロスポリンのトラフレベルが２５～６０ｎｇ／ｍＬに維持され、タクロリムスのトラフレベルが３～７ｎｇ／ｍｌに維持されるように、試験中に安全性薬物モニタリングを行う。トラフレベルがこれらのレベル内にない場合は、用量の調節を行う。
２日目から１４日目まで、被験者は毎日在宅モニタリングを受け、１６日目から２８日目までは、被験者は１日おきに在宅モニタリングを受ける。在宅モニタリングは、ビデオコンサルティングを介して行われ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２による細胞変性効果（ＣＰＥ）のリードアウトとして、体温、血圧、脈拍、体重、呼吸数及び酸素飽和度の自己測定を含む。さらに、被験者は、ウイルス量の評価のために、朝一番の咽頭スワブを採取する。
被験者にはまた、４日目（来院２）、７日目（来院３）、１４日目（来院４）及び２８日目（来院５／試験終了／早期終了来院）の４回の来院も予定されている（図４）。朝一番の咽頭スワブも来院中に回収する。２８日目以降、被験者は延長された安全性のフォローアップを継続し、４２日目、９０日目、１８０日目、２７０日目、及び３６０日目に評価を持続するために来院する。５回目の来院後、最大１年間ボクロスポリンを継続することを選択した被験者には、治験薬が投与される。
結果
プレドニゾン及びタクロリムスの治療を受けた被験者と、プレドニゾン及びボクロスポリンの治療を受けた被験者のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス力価及び細胞変性効果を比較する。ボクロスポリン群の被験者は、タクロリムス群と比較して、ウイルス量が効果的に減少し、重症ＣＰＥが少ないと予想される。
プレドニゾン及びタクロリムスの治療を受けた被験者と、プレドニゾン及びボクロスポリンの治療を受けた被験者のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルス力価及び細胞変性効果を比較する。ボクロスポリン群の被験者は、タクロリムス群と比較して、ウイルス量が効果的に減少し、重症ＣＰＥが少ないと予想される。
プレドニゾン及びタクロリムスの治療を受けた被験者と、プレドニゾン及びボクロスポリンの治療を受けた被験者の移植片拒絶反応、移植後の糖尿病の新たな発症、及び他の副作用も比較する。ボクロスポリン群の被験者は、タクロリムス群と比較した場合、移植片拒絶反応、糖尿病及び副作用の発生率が同等またはそれ以下であると予想される。
実施例６
ボクロスポリン（Ａｕｒｉｎｉａ）、シクロスポリン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、タクロリムス（Ａｓｔｅｌｌａｓ）、ミコフェノール酸（Ｒｏｃｈｅ）、及びエベロリムス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）の原液を、ＤＭＳＯにこれらの薬物の医薬製剤を溶解することによって調製した（従って、図５Ａ～５Ｅの濃度は推定濃度である）。９６ウェルの細胞培養プレート内のＶｅｒｏ Ｅ６細胞（約２０，０００細胞／ウェル）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させ（感染多重度０．０１５）、続いて免疫抑制剤の連続希釈を含む１５０μｌの培地中でインキュベーションを行った。感染後３日目にウイルスが誘発する細胞死をＭＴＳアッセイで定量し、４９５ｎｍの吸光度を測定した。非感染細胞の生存率を並行して評価し、薬物の細胞毒性を特定した。各薬物について、２つの独立した実験（４連）を行った。ウイルスが誘発する細胞死を５０％阻害する濃度として定義される５０％有効濃度（ＥＣ５０）、及び未感染細胞の生存率を未処理の対照細胞の生存率の５０％まで減少させる濃度である５０％細胞毒性濃度（ＣＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ８．０による非線形回帰を使用して特定した。図５Ａ～５Ｅに示す通り、ボクロスポリン（図５Ａ）、シクロスポリン（図５Ｂ）、タクロリムス（図５Ｄ）及びミコフェノール酸（図５Ｅ）のみが、それぞれ、ＥＣ５０値０．２７、３．２、１２及び３．１μＭでウイルスが誘発する細胞死を阻害した。
ボクロスポリン（Ａｕｒｉｎｉａ）、シクロスポリン（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、タクロリムス（Ａｓｔｅｌｌａｓ）、ミコフェノール酸（Ｒｏｃｈｅ）、及びエベロリムス（Ｎｏｖａｒｔｉｓ）の原液を、ＤＭＳＯにこれらの薬物の医薬製剤を溶解することによって調製した（従って、図５Ａ～５Ｅの濃度は推定濃度である）。９６ウェルの細胞培養プレート内のＶｅｒｏ Ｅ６細胞（約２０，０００細胞／ウェル）に、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を感染させ（感染多重度０．０１５）、続いて免疫抑制剤の連続希釈を含む１５０μｌの培地中でインキュベーションを行った。感染後３日目にウイルスが誘発する細胞死をＭＴＳアッセイで定量し、４９５ｎｍの吸光度を測定した。非感染細胞の生存率を並行して評価し、薬物の細胞毒性を特定した。各薬物について、２つの独立した実験（４連）を行った。ウイルスが誘発する細胞死を５０％阻害する濃度として定義される５０％有効濃度（ＥＣ５０）、及び未感染細胞の生存率を未処理の対照細胞の生存率の５０％まで減少させる濃度である５０％細胞毒性濃度（ＣＣ５０）を、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ ｖ８．０による非線形回帰を使用して特定した。図５Ａ～５Ｅに示す通り、ボクロスポリン（図５Ａ）、シクロスポリン（図５Ｂ）、タクロリムス（図５Ｄ）及びミコフェノール酸（図５Ｅ）のみが、それぞれ、ＥＣ５０値０．２７、３．２、１２及び３．１μＭでウイルスが誘発する細胞死を阻害した。
タクロリムス（図５Ｄ）及びシクロスポリン（図５Ｂ）のＥＣ５０濃度は、インビボで対応する濃度でおそらく毒性がある。しかしながら、図５Ａに示す通り、ボクロスポリンは細胞生存率を維持し、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスの複製をタクロリムス及びシクロスポリンよりそれぞれ約４０倍及び１０倍低い濃度で阻害した。ボクロスポリンのＥＣ５０は、移植患者で観察されたＣｍａｘの範囲内である。
実施例７：ＶＣＳ、ＣｓＡ及びＴＡＣによるＣａｌｕ－３細胞におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製の阻害
ＣＰＥ減少アッセイ及びウイルス産生減少アッセイを行い、３つのカルシニューリン阻害剤であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、タクロリムス（ＴＡＣ）、及びボクロスポリン（ＶＣＳ）ならびに腎移植レシピエント（ＫＴＲ）で一般に使用されるその他の免疫抑制剤がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に与える影響を細胞ベースのアッセイを使用して評価した。
ＣＰＥ減少アッセイ及びウイルス産生減少アッセイを行い、３つのカルシニューリン阻害剤であるシクロスポリンＡ（ＣｓＡ）、タクロリムス（ＴＡＣ）、及びボクロスポリン（ＶＣＳ）ならびに腎移植レシピエント（ＫＴＲ）で一般に使用されるその他の免疫抑制剤がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に与える影響を細胞ベースのアッセイを使用して評価した。
方法
ウイルス及び細胞株
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／Ｌｅｉｄｅｎ－０００２（ＧｅｎＢａｎｋ ＭＴ５１０９９９）を、２０２０年３月にＬｅｉｄｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＬＵＭＣ）にて鼻咽頭サンプルから単離した。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞で２回継代したウイルスストックを用いて感染を行った。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞及び本明細書ではＣａｌｕ－３細胞と呼ばれるＣａｌｕ－３ ２Ｂ４細胞（Ｔｓｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．Ａｕｇ ２００５；７９（１５）：９４７０－９）を、以前に記載された通りに培養した（Ｓａｌｇａｄｏ－Ｂｅｎｖｉｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｊｕｌ ２２ ２０２０；６４（８）ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＡＣ．００９００－２０）。感染を、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｌｏｎｚａ）、２％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、及び抗生物質（ＥＭＥＭ－２％ＦＣＳ）を含むイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ、Ｌｏｎｚａ）で行った。感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を使用したすべての実験は、ＬＵＭＣのバイオセーフティレベル３の施設で実施した。
ウイルス及び細胞株
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／Ｌｅｉｄｅｎ－０００２（ＧｅｎＢａｎｋ ＭＴ５１０９９９）を、２０２０年３月にＬｅｉｄｅｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｅｎｔｅｒ（ＬＵＭＣ）にて鼻咽頭サンプルから単離した。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞で２回継代したウイルスストックを用いて感染を行った。Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞及び本明細書ではＣａｌｕ－３細胞と呼ばれるＣａｌｕ－３ ２Ｂ４細胞（Ｔｓｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｖｉｒｏｌ．Ａｕｇ ２００５；７９（１５）：９４７０－９）を、以前に記載された通りに培養した（Ｓａｌｇａｄｏ－Ｂｅｎｖｉｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．Ｊｕｌ ２２ ２０２０；６４（８）ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＡＣ．００９００－２０）。感染を、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｌｏｎｚａ）、２％ＦＣＳ、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、及び抗生物質（ＥＭＥＭ－２％ＦＣＳ）を含むイーグル最小必須培地（ＥＭＥＭ、Ｌｏｎｚａ）で行った。感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を使用したすべての実験は、ＬＵＭＣのバイオセーフティレベル３の施設で実施した。
免疫抑制化合物
ボクロスポリン（ＶＣＳ、Ｌｕｐｋｙｎｉｓ（商標））、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ、Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、タクロリムス（ＴＡＣ、Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）、Ａｓｔｅｌｌａｓ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ、ＣｅｌｌＣｅｐｔ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）またはエベロリムス（ＥＶＬ、Ｃｅｒｔｉｃａｎ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）の原液は、これら薬物の医薬製剤をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解することによって調製した。プラセボカプセル及び純粋なＶＣＳ粉末、タクロリムス（ＰＨＲ１８０９）、シクロスポリンＡ（３００２４）及びミコフェノール酸（Ｍ５２５５）を得た。レムデシビル（ＲＤＶ、ＨＹ－１０４０７７）を、すべての実験で対照として使用した。すべての化合物をＤＭＳＯに溶解し、単回使用のアリコートを－２０℃で保存した。
ボクロスポリン（ＶＣＳ、Ｌｕｐｋｙｎｉｓ（商標））、シクロスポリンＡ（ＣｓＡ、Ｎｅｏｒａｌ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）、タクロリムス（ＴＡＣ、Ｐｒｏｇｒａｆ（登録商標）、Ａｓｔｅｌｌａｓ）、ミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ、ＣｅｌｌＣｅｐｔ（登録商標）、Ｒｏｃｈｅ）またはエベロリムス（ＥＶＬ、Ｃｅｒｔｉｃａｎ（登録商標）、Ｎｏｖａｒｔｉｓ）の原液は、これら薬物の医薬製剤をジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）に溶解することによって調製した。プラセボカプセル及び純粋なＶＣＳ粉末、タクロリムス（ＰＨＲ１８０９）、シクロスポリンＡ（３００２４）及びミコフェノール酸（Ｍ５２５５）を得た。レムデシビル（ＲＤＶ、ＨＹ－１０４０７７）を、すべての実験で対照として使用した。すべての化合物をＤＭＳＯに溶解し、単回使用のアリコートを－２０℃で保存した。
検証済みのＬＣ－ＭＳ／ＭＳによるシクロスポリンＡ、タクロリムス及びボクロスポリン濃度の測定
ＣｓＡ及びＴＡＣの定量化は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって以前に記載された通りに（Ｚｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｄｅｃ ２０１８；８４（１２）：２８８９－２９０２）、サンプルをメタノールに続いてブランク全血で希釈して行った。分析前に、０－１５－６００μｇ／ＬのＶＣＳの検量線内に含まれるように、サンプルをメタノールに続いて全血で希釈した。ヒト全血を１０または２０μｌのサンプルに最終体積２００μｌになるまで添加し、２００μｌの０．１Ｍ硫酸亜鉛及び５００μｌの内部標準溶液（３２μｇ／ＬのＶＣＳ Ｄ４を含むアセトニトリル）を添加した。次に、サンプルを２０００ｒｐｍで５分間ボルテックスし、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、２０μｌをＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。この方法は、ＥＭＡ生物学的分析法検証ガイドライン（ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ／ＥＷＰ／１９２２１７／２００９－Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｏｎ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ（２０１１））に従って検証された。
ＣｓＡ及びＴＡＣの定量化は、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって以前に記載された通りに（Ｚｗａｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｂｒ Ｊ Ｃｌｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｄｅｃ ２０１８；８４（１２）：２８８９－２９０２）、サンプルをメタノールに続いてブランク全血で希釈して行った。分析前に、０－１５－６００μｇ／ＬのＶＣＳの検量線内に含まれるように、サンプルをメタノールに続いて全血で希釈した。ヒト全血を１０または２０μｌのサンプルに最終体積２００μｌになるまで添加し、２００μｌの０．１Ｍ硫酸亜鉛及び５００μｌの内部標準溶液（３２μｇ／ＬのＶＣＳ Ｄ４を含むアセトニトリル）を添加した。次に、サンプルを２０００ｒｐｍで５分間ボルテックスし、１３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、２０μｌをＬＣ－ＭＳ／ＭＳシステムに注入した。この方法は、ＥＭＡ生物学的分析法検証ガイドライン（ＥＭＥＡ／ＣＨＭＰ／ＥＷＰ／１９２２１７／２００９－Ｇｕｉｄｅｌｉｎｅ ｏｎ ｂｉｏａｎａｌｙｔｉｃａｌ ｍｅｔｈｏｄ ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ（２０１１））に従って検証された。
細胞変性効果（ＣＰＥ）減少アッセイ
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞でのＣＰＥ減少アッセイを、試験化合物との細胞のプレインキュベーションを３０分間継続したこと以外、概して上記の通りに行った。プレートを３７℃で３日間インキュベートし、４９５ｎｍの吸光度を測定する比色アッセイを用いて細胞生存率を特定した。各化合物のＥＣ５０及びＣＣ５０を特定し、得られたデータを、非線形回帰を使用して分析した。各化合物について、少なくとも２つの独立した実験（各４連）を完了した。
Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞でのＣＰＥ減少アッセイを、試験化合物との細胞のプレインキュベーションを３０分間継続したこと以外、概して上記の通りに行った。プレートを３７℃で３日間インキュベートし、４９５ｎｍの吸光度を測定する比色アッセイを用いて細胞生存率を特定した。各化合物のＥＣ５０及びＣＣ５０を特定し、得られたデータを、非線形回帰を使用して分析した。各化合物について、少なくとも２つの独立した実験（各４連）を完了した。
ウイルス産生減少アッセイ
Ｃａｌｕ－３細胞を９６ウェルのプレート（１ウェルあたり３×１０４細胞）にて、１００μｌの培地に播種した。翌日、細胞を、濃度２５μＭから開始するＣｓＡ、ＴＡＣまたはＶＣＳ及び１０μＭから開始するＲＤＶの２倍連続希釈とともに６０分間プレインキュベートした。続いて細胞を、化合物を含む５０μｌの培地中、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＯＩ１、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞で特定された力価に基づく）で感染させた。３７℃で１時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、化合物を含む１００μｌの培地を添加した。感染後２４時間（ｈ ｐ．ｉ．）でウェルから培地を採取した。感染したＣａｌｕ－３細胞から放出されたウイルスの後代の分析は、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞でのプラークアッセイによって行った。ＶＣＳ濃度を、採取した培地に９倍量のメタノールを添加した後、検証済みのＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定した。ＣＰＥ減少アッセイについて記載した通り、同じ方法で処理したモック感染細胞を用いた細胞毒性アッセイを並行して行った。
Ｃａｌｕ－３細胞を９６ウェルのプレート（１ウェルあたり３×１０４細胞）にて、１００μｌの培地に播種した。翌日、細胞を、濃度２５μＭから開始するＣｓＡ、ＴＡＣまたはＶＣＳ及び１０μＭから開始するＲＤＶの２倍連続希釈とともに６０分間プレインキュベートした。続いて細胞を、化合物を含む５０μｌの培地中、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（ＭＯＩ１、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞で特定された力価に基づく）で感染させた。３７℃で１時間のインキュベーション後、細胞をＰＢＳで３回洗浄し、化合物を含む１００μｌの培地を添加した。感染後２４時間（ｈ ｐ．ｉ．）でウェルから培地を採取した。感染したＣａｌｕ－３細胞から放出されたウイルスの後代の分析は、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞でのプラークアッセイによって行った。ＶＣＳ濃度を、採取した培地に９倍量のメタノールを添加した後、検証済みのＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって測定した。ＣＰＥ減少アッセイについて記載した通り、同じ方法で処理したモック感染細胞を用いた細胞毒性アッセイを並行して行った。
ガラスボトルでのウイルス産生の減少
ホウケイ酸ガラス製試薬ボトル（５０ｍｌ）を氷酢酸で処理して残留洗剤を除去した後、無水エタノールで２回洗浄した。使用前にボトルを乾燥し、ＵＶ滅菌した。滅菌ガラス培養管、ガラス製５０μｌシリンジ及びガラス製パスツールピペットを使用して、３倍濃縮化合物溶液をＥＭＥＭ－２％ＦＣＳで調製した。各化合物希釈液１ｍｌを３つの異なる試薬ボトルに移した（３連）。培養フラスコで増殖させたコンフルエントな単層Ｃａｌｕ－３細胞を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／Ｌｅｉｄｅｎ－００２でＭＯＩ１にて感染させた。３７℃で１時間のインキュベーション後、細胞を温ＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン処理し、ＥＭＥＭ－２％ＦＣＳに再懸濁した。この細胞懸濁液２ｍｌ（約１０６細胞）を、３倍濃縮化合物の培地溶液１ｍｌを含む各試薬ボトルに添加した。３７℃で２４時間のインキュベーション後、培地を回収し、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞でのプラークアッセイによって感染性ウイルス力価を特定した。
ホウケイ酸ガラス製試薬ボトル（５０ｍｌ）を氷酢酸で処理して残留洗剤を除去した後、無水エタノールで２回洗浄した。使用前にボトルを乾燥し、ＵＶ滅菌した。滅菌ガラス培養管、ガラス製５０μｌシリンジ及びガラス製パスツールピペットを使用して、３倍濃縮化合物溶液をＥＭＥＭ－２％ＦＣＳで調製した。各化合物希釈液１ｍｌを３つの異なる試薬ボトルに移した（３連）。培養フラスコで増殖させたコンフルエントな単層Ｃａｌｕ－３細胞を、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２／Ｌｅｉｄｅｎ－００２でＭＯＩ１にて感染させた。３７℃で１時間のインキュベーション後、細胞を温ＰＢＳで３回洗浄し、トリプシン処理し、ＥＭＥＭ－２％ＦＣＳに再懸濁した。この細胞懸濁液２ｍｌ（約１０６細胞）を、３倍濃縮化合物の培地溶液１ｍｌを含む各試薬ボトルに添加した。３７℃で２４時間のインキュベーション後、培地を回収し、Ｖｅｒｏ Ｅ６細胞でのプラークアッセイによって感染性ウイルス力価を特定した。
ガラス培養管での化合物の細胞毒性の特定
Ｃａｌｕ－３細胞をトリプシン処理し、１．５ｘ１０５細胞を含む１ｍｌのＥＭＥＭ－２％ＦＣＳを、ガラス培養管に分けた。１５０μＭ濃度（最終濃度の３倍）から開始するＶＣＳ、ＴＡＣ、及びＣｓＡの２倍希釈液を、ガラス製実験器具を使用してＥＭＥＭ－２％ＦＣＳ培地で調製し、対応する細胞を含む管に０．５ｍｌを添加した（１濃度あたり３管）。２４時間のインキュベーション後、細胞生存率を上記の通りに特定した。
Ｃａｌｕ－３細胞をトリプシン処理し、１．５ｘ１０５細胞を含む１ｍｌのＥＭＥＭ－２％ＦＣＳを、ガラス培養管に分けた。１５０μＭ濃度（最終濃度の３倍）から開始するＶＣＳ、ＴＡＣ、及びＣｓＡの２倍希釈液を、ガラス製実験器具を使用してＥＭＥＭ－２％ＦＣＳ培地で調製し、対応する細胞を含む管に０．５ｍｌを添加した（１濃度あたり３管）。２４時間のインキュベーション後、細胞生存率を上記の通りに特定した。
結果
ＶＣＳ、ＣｓＡ、及びＴＡＣがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に与える影響を評価するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して寛容であることが示されているヒト肺上皮細胞（Ｃａｌｕ－３）を使用して、ウイルス量減少アッセイを行った。ＶＣＳは親油性が高く、プラスチックに結合する可能性があり、プラスチック製実験器具を使用したアッセイではバイオアベイラビリティが低下する可能性があるため、プラスチック製実験器具を使用した標準的な細胞ベースのアッセイならびに、ガラス管、容器及びピペットを使用したカスタムアッセイで、ＶＣＳの効果を比較した。ＲＤＶを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻害するための陽性対照として含めた。
ＶＣＳ、ＣｓＡ、及びＴＡＣがＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製に与える影響を評価するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に対して寛容であることが示されているヒト肺上皮細胞（Ｃａｌｕ－３）を使用して、ウイルス量減少アッセイを行った。ＶＣＳは親油性が高く、プラスチックに結合する可能性があり、プラスチック製実験器具を使用したアッセイではバイオアベイラビリティが低下する可能性があるため、プラスチック製実験器具を使用した標準的な細胞ベースのアッセイならびに、ガラス管、容器及びピペットを使用したカスタムアッセイで、ＶＣＳの効果を比較した。ＲＤＶを、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻害するための陽性対照として含めた。
図６Ａ～６Ｄは、シクロスポリンＡ、タクロリムス、及びボクロスポリンが感染後の感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の後代産生（図６Ａ及び図６Ｂ）ならびにモック感染後のＣａｌｕ－３細胞の生存率（図６Ｃ及び図６Ｄ）に与える影響を示す。図６Ａ及び図６Ｃは、ガラス製実験器具を使用して行った実験から得たデータを示し、図６Ｂ及び図６Ｄは、プラスチック製実験器具の使用からの結果を示す。ガラス中のＣａｌｕ－３細胞は、生存を維持し、感染後２４時間で、培地中で１．７×１０６ＰＦＵ／ｍｌの力価が測定されたことからＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を支援した（図６Ａ）。感染細胞を１０μＭのレムデシビルで処理すると、ウイルスの複製が阻害され、プラークアッセイの検出限界をわずかに超える感染性後代の力価となった（データは示さず）。細胞を３．２μＭのボクロスポリンで処理すると、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染性後代の力価に１．５超の対数減少がもたらされたが、同濃度のシクロスポリンＡまたはタクロリムスを使用した場合、約０．５の対数減少が観察された（図６Ａ）。しかしながら、３．２μＭのボクロスポリンまたはシクロスポリンＡでの処理により細胞毒性効果も生じ、細胞生存率が約７５％に低下した（図６Ｃ）。まとめると、これらの結果は、ボクロスポリンの強力な抗ウイルス活性を示しており、これは一部分において細胞毒性によって媒介されている可能性がある。
観察された結果は、ＣｓＡがＨｕＨ７．５及びＣａｌｕ－３細胞ではＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻害したが、Ｖｅｒｏ細胞では阻害しなかったという以前の報告と一致していた（Ｄｉｔｔｍａｒ ｅｔ ａｌ．，ｂｉｏＲｘｉｖ．２０２０：２０２０．０６．１９．１６１０４２）。しかしながら、ＴＡＣが約１５μＭのＥＣ５０でＶｅｒｏ Ｅ６細胞においてＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻害するという観察とは対照的に、以前の報告では、これらの細胞株のいずれにおいてもＴＡＣの活性が見られず、このことは、異なるＶｅｒｏ細胞のサブクローンの使用と関係している可能性がある。
プラスチック材料を使用した実験では、細胞をＶＣＳで処理すると、感染性後代の力価の用量依存的な減少が観察され、６．４μＭで１を超える対数減少に至った（図６Ｂ）。ＣｓＡ処理は２５μＭで同様の減少をもたらしたが、６．４μＭではＶＣＳよりも阻害が少なかった。しかしながら、１２．５μＭ以上の濃度では、ＣｓＡは有意な細胞毒性を示した一方、ＶＣＳは示さなかった（図６Ｄ）。ＴＡＣは多くの細胞毒性を示さなかったが、感染性ウイルス後代の力価を、１を超えて対数減少させるには２５μＭの濃度が必要であった。ＶＣＳは、プラスチック製の代わりにガラス製実験器具で行った実験でより強い効果を示したが、これは、プラスチックに結合する化合物の損失が原因である可能性がある。遊離ＶＣＳの濃度を、細胞の有無にかかわらず、ガラス容器での様々な溶液とのインキュベーション後に測定した。細胞なしで、ガラス中、３７℃で２４時間のインキュベーション後、溶液からの化合物の有意な損失は観察されなかった（表３）。０．２～３．２μＭの濃度のＶＣＳ溶液をガラスボトルでＣａｌｕ－３細胞とともにインキュベートすると、ＶＣＳ濃度の約７５％の減少が観察され、化合物が細胞に結合したまたは取り込まれたことが示された。標準的なプラスチック製実験器具で行った実験で、２５μＭのＶＣＳで２４時間処理した後の感染細胞の培地中のＶＣＳ濃度も測定したところ、ボクロスポリンの検出濃度は０．６８μＭと低かった。
細胞結合または取り込みによる７５％の減少を考慮しても、これらの結果は、ＶＣＳの９０％がプラスチック結合により失われたことを示している。ガラス及びプラスチックでそれぞれ３．２μＭ及び２５μＭのＶＣＳによるウイルス力価の同様の減少は、プラスチックを使用した場合、ＶＣＳの生体学的に利用可能な量が、最初に添加されたものの約１０％である可能性が高いことを裏付けた。ＶＣＳがプラスチックに結合すると、溶液から化合物が８０％超失われる可能性がある。その結果、プラスチック製実験器具を使用して純粋なＶＣＳ粉末から調製された原液を使用すると、抗ウイルスアッセイにおける化合物の有効性を過小評価する可能性がある。ＶＣＳは親油性の高い化合物であり、プラスチック表面と疎水性薬物との相互作用が悪影響を与える可能性があるため、ＶＣＳの抗ウイルス効果は、プラスチックを使用したアッセイで観察されるよりも大きい可能性がある。この結果は、プラスチックの結合による化合物の損失及び医薬製剤中の賦形剤の干渉により、プラスチックの使用を含む抗ウイルスアッセイにおいてＥＣ５０値の特定が困難になったことを示している。
ガラス製実験器具を使用した結果により、感染したＣａｌｕ－３細胞においてＶＣＳが用量依存的、かつＣｓＡ及びＴＡＣよりも効果的にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染性の後代の産生を減少させることが実証された。これらの結果は、シクロフィリン依存性ＣＮＩが、ＥＶＬ及びＭＰＡ等の他のクラスの免疫抑制剤よりも強力に、細胞培養におけるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製を阻害することを示している。ＶＣＳは、ＴＡＣよりも８倍低い濃度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻害した。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻害するために必要なＴＡＣ濃度は、輸送中の遊離分画が全濃度の約１０分の１であることを考慮に入れなければ、ヒトにおいて許容できないまたは毒性濃度である可能性がある（ＴＡＣでは、０．２μＭのＥＣ５０は、１６０ｎｇ／ｍｌに相当する）。ＣｓＡ及びＶＣＳの場合、０．２μＭは、それぞれ、２４１ｎｇ／ｍｌ及び２４３ｎｇ／ｍｌの濃度に相当する。特に、ＶＣＳは、肺等の臓器に血中よりも高濃度で分布する可能性があるとともに、赤血球に高濃度が含まれる。その結果、特定の臓器または細胞での高濃度により、ウイルスが抑制され得る。従って、これらの結果は、ヒトにおいて安全な濃度でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻害することもできる治療のためのＣＮＩとしてのＶＣＳの有用性を支持する。ＶＣＳは、ＫＴＲにおける拒絶反応を予防するためにＴＡＣと同等の効果があると考えられているため、ＶＣＳは、ＣＯＶＩＤ－１９患者の治療に有用である。本明細書に記載の結果は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染のリスクがある、免疫抑制を必要とする対象にとって、例えば、ＫＴＲにとって、移植医療で一般に使用される免疫抑制剤の中でもシクロフィリン依存性ＣＮＩ、特にＶＣＳの利点を実証している。
実施例８：免疫抑制剤の医薬製剤によるＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２複製の阻害
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に応答した細胞生存率を評価する実験を、腎移植レシピエントの治療に一般に使用される薬物の医薬製剤で行った。実施例７からの知見を考慮して、例えば、溶媒及び賦形剤を含む医薬製剤の使用により、溶解性またはプラスチック結合に関連する問題が回避され得ると考えられた。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染に応答した細胞生存率を評価する実験を、腎移植レシピエントの治療に一般に使用される薬物の医薬製剤で行った。実施例７からの知見を考慮して、例えば、溶媒及び賦形剤を含む医薬製剤の使用により、溶解性またはプラスチック結合に関連する問題が回避され得ると考えられた。
方法
ＶＣＳ、ＣｓＡ、ＴＡＣ、ＥＶＬ、及びＭＭＦの医薬製剤（賦形剤、共溶媒及び他の成分を含む）を、上記の通りＶｅｒｏ Ｅ６細胞を使用するＣＰＥ減少アッセイで評価した。レムデシビル（ＲＤＶ、ＨＹ－１０４０７７）を、すべての実験で対照として使用した。プレインキュベーション及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染後、細胞を、薬物を含む培地に３日間保持した。上記のようにモック感染細胞によるアッセイを並行して行い、試験製剤の細胞毒性を評価した。ＶＣＳの場合、６．４μＭで原液を溶解したときの濃度の達成を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって確認した（データは示さず）。
ＶＣＳ、ＣｓＡ、ＴＡＣ、ＥＶＬ、及びＭＭＦの医薬製剤（賦形剤、共溶媒及び他の成分を含む）を、上記の通りＶｅｒｏ Ｅ６細胞を使用するＣＰＥ減少アッセイで評価した。レムデシビル（ＲＤＶ、ＨＹ－１０４０７７）を、すべての実験で対照として使用した。プレインキュベーション及びＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の感染後、細胞を、薬物を含む培地に３日間保持した。上記のようにモック感染細胞によるアッセイを並行して行い、試験製剤の細胞毒性を評価した。ＶＣＳの場合、６．４μＭで原液を溶解したときの濃度の達成を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって確認した（データは示さず）。
結果
図７Ａ～７Ｅは、感染細胞及びモック感染細胞の細胞生存率に対する様々な医薬製剤の影響を示す。ＣＮＩであるＶＣＳ、ＣｓＡ、及びＴＡＣは、マイクロモル未満から低マイクロモル範囲のＥＣ５０値でウイルスが誘発する細胞死を阻害した（図７Ａ～７Ｃ）。ＥＶＬ（図７Ｄ）は、試験した濃度では阻害効果を示さなかった。プロドラッグであるＭＭＦ（図７Ｅ）をこの比較に含めたが、これがウイルス複製を阻害することは予想しなかった。というのは、これが、このアッセイ中にその活性型であるミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ）（別名ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ＭＰＡ）に代謝されない可能性が高いからである（Ｒａｎｓｏｍ，Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔ．１９９５；１７（６）：６８１－４）（Ｒｉｔｔｅｒ ａｎｄ Ｐｉｒｏｆｓｋｉ，Ｔｒａｎｓｐ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２００９；１（４）：２９０－７及びＮｅｙｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９８；４２（２）：２１６－２２）。従って、ＭＭＦの明らかな抗ウイルス効果は、製剤中に存在する賦形剤に起因する可能性がある。
図７Ａ～７Ｅは、感染細胞及びモック感染細胞の細胞生存率に対する様々な医薬製剤の影響を示す。ＣＮＩであるＶＣＳ、ＣｓＡ、及びＴＡＣは、マイクロモル未満から低マイクロモル範囲のＥＣ５０値でウイルスが誘発する細胞死を阻害した（図７Ａ～７Ｃ）。ＥＶＬ（図７Ｄ）は、試験した濃度では阻害効果を示さなかった。プロドラッグであるＭＭＦ（図７Ｅ）をこの比較に含めたが、これがウイルス複製を阻害することは予想しなかった。というのは、これが、このアッセイ中にその活性型であるミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌａｔｅ）（別名ミコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａｃｉｄ）、ＭＰＡ）に代謝されない可能性が高いからである（Ｒａｎｓｏｍ，Ｔｈｅｒ Ｄｒｕｇ Ｍｏｎｉｔ．１９９５；１７（６）：６８１－４）（Ｒｉｔｔｅｒ ａｎｄ Ｐｉｒｏｆｓｋｉ，Ｔｒａｎｓｐ Ｉｎｆｅｃｔ Ｄｉｓ．２００９；１（４）：２９０－７及びＮｅｙｔｓ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ．１９９８；４２（２）：２１６－２２）。従って、ＭＭＦの明らかな抗ウイルス効果は、製剤中に存在する賦形剤に起因する可能性がある。
ＶＣＳ、ＣｓＡ及びＴＡＣのＥＣ５０値は、それぞれ、０．２２±０．０１μＭ、４．３±０．６μＭ、及び１０±１μＭであった。ＶＣＳを除けば、どの化合物も細胞毒性を示さなかったため、それらのＣＣ５０値は、１００μＭよりも高かった。ＶＣＳは、ＣＣ５０が約４μＭでより高い細胞毒性を示し、そのＥＣ５０も、調べた他の化合物と比較して１８～４５分の１であった。これらの結果は、他の試験化合物と比較して、ウイルス媒介性細胞死の阻害に対するＶＣＳの優れた効果を実証する。
実施例９：ＶＣＳの医薬製剤がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製に与える影響
ＶＣＳカプセル及びプラセボカプセルの内容物の抗ウイルス効果を評価し、例えば、Ｌｕｐｋｙｎａ（商標）（ＶＣＳの医薬製剤）に含まれる１つ以上の賦形剤がＶＣＳの効果、例えば、実施例８に示す約０．２２μＭの低ＥＣ５０（図７Ａ）に寄与したかどうかを特定するためにアッセイを行った。
ＶＣＳカプセル及びプラセボカプセルの内容物の抗ウイルス効果を評価し、例えば、Ｌｕｐｋｙｎａ（商標）（ＶＣＳの医薬製剤）に含まれる１つ以上の賦形剤がＶＣＳの効果、例えば、実施例８に示す約０．２２μＭの低ＥＣ５０（図７Ａ）に寄与したかどうかを特定するためにアッセイを行った。
方法
ＣＰＥ減少アッセイを上記の通りに行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させたＶｅｒｏ Ｅ６細胞を、ＶＣＳまたはプラセボに暴露し、各々の抗ウイルス効果（感染細胞）及び細胞毒性効果（モック感染細胞）を比較した。プラセボカプセルにＶＣＳが含まれていないことは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって確認した（データは示さず）。
ＣＰＥ減少アッセイを上記の通りに行った。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２に感染させたＶｅｒｏ Ｅ６細胞を、ＶＣＳまたはプラセボに暴露し、各々の抗ウイルス効果（感染細胞）及び細胞毒性効果（モック感染細胞）を比較した。プラセボカプセルにＶＣＳが含まれていないことは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析によって確認した（データは示さず）。
結果
図８Ａ～８Ｂは、ＶＣＳの医薬製剤及びプラセボが細胞生存率に与える影響を比較している。驚くべきことに、ＶＣＳ製剤（図８Ａ）及びプラセボ（図８Ｂ）の両方が、同様の用量依存性でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻害した。これらの結果は、ＶＣＳ製剤に含まれる１つ以上の賦形剤が、本記載の実験条件下で抗ウイルス活性を媒介することができることを示した。
図８Ａ～８Ｂは、ＶＣＳの医薬製剤及びプラセボが細胞生存率に与える影響を比較している。驚くべきことに、ＶＣＳ製剤（図８Ａ）及びプラセボ（図８Ｂ）の両方が、同様の用量依存性でＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の複製を阻害した。これらの結果は、ＶＣＳ製剤に含まれる１つ以上の賦形剤が、本記載の実験条件下で抗ウイルス活性を媒介することができることを示した。
実施例１０：ＶＣＳ製剤の殺ウイルス効果の評価
プラセボカプセルの潜在的な殺ウイルス活性をさらに評価した。
プラセボカプセルの潜在的な殺ウイルス活性をさらに評価した。
方法
化合物または製剤の殺ウイルス能力を特定するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオン（５ｘ１０４ＰＦＵ）を次のいずれかの溶液とともに３７℃で２時間インキュベートした：培地、純粋な粉末から調製したＶＣＳ溶液（３．２μＭ）、溶解したＶＣＳカプセルの内容物（３．２μＭ）、プラセボカプセルまたはＴｗｅｅｎ溶液（カプセルに存在、３．２μＭのＶＣＳに対応する）。抗ウイルス活性に関しては、ＰＢＳを陰性対照として使用し、５０％エタノールを陽性対照として使用した。試験化合物をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスストックとともに２時間インキュベートした。残っている感染性ウイルスの力価は、例えば、Ｓａｌｇａｄｏ－Ｂｅｎｖｉｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｊｕｌ ２２ ２０２０；６４（８）ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＡＣ．００９００－２０に記載されているＶｅｒｏ Ｅ６細胞でのプラークアッセイで特定した。
化合物または製剤の殺ウイルス能力を特定するために、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ビリオン（５ｘ１０４ＰＦＵ）を次のいずれかの溶液とともに３７℃で２時間インキュベートした：培地、純粋な粉末から調製したＶＣＳ溶液（３．２μＭ）、溶解したＶＣＳカプセルの内容物（３．２μＭ）、プラセボカプセルまたはＴｗｅｅｎ溶液（カプセルに存在、３．２μＭのＶＣＳに対応する）。抗ウイルス活性に関しては、ＰＢＳを陰性対照として使用し、５０％エタノールを陽性対照として使用した。試験化合物をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ウイルスストックとともに２時間インキュベートした。残っている感染性ウイルスの力価は、例えば、Ｓａｌｇａｄｏ－Ｂｅｎｖｉｎｄｏ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂ Ａｇｅｎｔｓ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒ． Ｊｕｌ ２２ ２０２０；６４（８）ｄｏｉ：１０．１１２８／ＡＡＣ．００９００－２０に記載されているＶｅｒｏ Ｅ６細胞でのプラークアッセイで特定した。
結果
図９に示す通り、対照処理（５０％エタノール）のみが、感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の量を検出限界未満（＜１００ＰＦＵ／ｍｌ）に減少させた。他の処理のいずれも、残っているウイルスの感染力に有意な影響を与えなかった。
図９に示す通り、対照処理（５０％エタノール）のみが、感染性ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の量を検出限界未満（＜１００ＰＦＵ／ｍｌ）に減少させた。他の処理のいずれも、残っているウイルスの感染力に有意な影響を与えなかった。
これらの結果は、本記載の実験条件下で、これら製剤の賦形剤が殺ウイルス効果を有さないことを示した。これらの結果は、特性化されていない機序を通じて、賦形剤の存在がＣＰＥ減少アッセイのリードアウトを干渉する可能性を示した。
実施例１１：高純度粉末からの免疫抑制化合物の調製及びＣＰＥ減少アッセイにおけるそれらの活性
医薬組成物に含まれる賦形剤がＶＣＳ及び他の免疫抑制化合物の効果に与える影響を評価した。
医薬組成物に含まれる賦形剤がＶＣＳ及び他の免疫抑制化合物の効果に与える影響を評価した。
方法
ＤＭＳＯに可溶化した免疫抑制薬の高純度粉末を使用して、ＣＰＥ減少アッセイを上記の通りに行った。試験原液は、各化合物の純粋な粉末から調製した。ネオーラル（ＣｓＡマイクロエマルジョン）の場合、ＫＴＲ治療で最も一般的に使用されるＣｓＡ誘導体であるＣｓＡ粉末を評価した。
ＤＭＳＯに可溶化した免疫抑制薬の高純度粉末を使用して、ＣＰＥ減少アッセイを上記の通りに行った。試験原液は、各化合物の純粋な粉末から調製した。ネオーラル（ＣｓＡマイクロエマルジョン）の場合、ＫＴＲ治療で最も一般的に使用されるＣｓＡ誘導体であるＣｓＡ粉末を評価した。
結果
図１０Ａ～１０Ｄは、ＣＰＥ減少アッセイにおいて可溶化高純度免疫抑制化合物が細胞生存率に与える影響を示す。図１０Ａに示す通り、純粋な粉末から調製したＶＣＳ溶液は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞に対して、医薬製剤から作製した溶液と同じレベルの防御を与えなかった（図８Ａと比較）。しかしながら、純粋な粉末からのＶＣＳ溶液はまた、モック感染細胞から観察される通り、細胞毒性が少なかった（図６Ｃと比較）。図１０Ｂ及び１０Ｄは、それぞれ、ＣｓＡ及びＭＰＡ処理細胞について同様の結果を示している。図７Ｃを図１０Ｃと比較した場合、純粋な粉末から調製したＴＡＣ溶液は、製剤と同様の有効性、すなわち、ＥＣ５０約１５μＭで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を阻害した。
図１０Ａ～１０Ｄは、ＣＰＥ減少アッセイにおいて可溶化高純度免疫抑制化合物が細胞生存率に与える影響を示す。図１０Ａに示す通り、純粋な粉末から調製したＶＣＳ溶液は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２感染細胞に対して、医薬製剤から作製した溶液と同じレベルの防御を与えなかった（図８Ａと比較）。しかしながら、純粋な粉末からのＶＣＳ溶液はまた、モック感染細胞から観察される通り、細胞毒性が少なかった（図６Ｃと比較）。図１０Ｂ及び１０Ｄは、それぞれ、ＣｓＡ及びＭＰＡ処理細胞について同様の結果を示している。図７Ｃを図１０Ｃと比較した場合、純粋な粉末から調製したＴＡＣ溶液は、製剤と同様の有効性、すなわち、ＥＣ５０約１５μＭで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を阻害した。
まとめると、これらの結果は、ある特定の医薬製剤の賦形剤が、観察された有効性に寄与していることを示す。この抗ウイルスアッセイにおいて、賦形剤によって引き起こされる干渉を回避するための様々な免疫抑制化合物の高純度の粉末の試験により、ＶＣＳ、ＣｓＡ及びＴＡＣに対するＥＣ５０値が実質的に高くなったことから、医薬製剤中の活性化合物の溶解性及びバイオアベイラビリティを改善する賦形剤もまた、細胞ベースのアッセイの結果に影響を与え得ることが実証された。しかしながら、ＴＡＣの医薬製剤には、抗ウイルス効果のある賦形剤が含まれているとは思われなかった。
これらの結果は、免疫抑制化合物が、最適な活性のための溶解性及び／またはバイオアベイラビリティを確保するために賦形剤を必要とする可能性があることを示している。化合物の調製物、例えば、医薬製剤または可溶化高純度粉末は、アッセイの結果ならびに投与された場合の化合物の溶解性及びバイオアベイラビリティに影響を与える可能性がある。
実施例１２：ボクロスポリン製剤におけるプラスチック材料の影響の評価
ＶＣＳとプラスチック製実験器具との間の潜在的な相互作用を考慮して、プラスチックのコーティングがＶＣＳの結合を防ぐかどうかを判断するための実験を行った。上記の通り、ＶＣＳの医薬製剤に含まれる賦形剤は、例えば、プラスチックへのＶＣＳの結合を防ぐことによってバイオアベイラビリティに影響を与える可能性があるが、それらの非特異的な抗ウイルス効果は、ＶＣＳの真のＥＣ５０の測定に影響を与える可能性もある。様々な薬剤でコートしたプラスチック材料を試験し、コーティングがＶＣＳのプラスチックへの結合を防ぎ、抗ウイルスアッセイにおいて純粋な粉末から調製したＶＣＳ溶液の使用を潜在的に可能にするかどうかを評価した。
ＶＣＳとプラスチック製実験器具との間の潜在的な相互作用を考慮して、プラスチックのコーティングがＶＣＳの結合を防ぐかどうかを判断するための実験を行った。上記の通り、ＶＣＳの医薬製剤に含まれる賦形剤は、例えば、プラスチックへのＶＣＳの結合を防ぐことによってバイオアベイラビリティに影響を与える可能性があるが、それらの非特異的な抗ウイルス効果は、ＶＣＳの真のＥＣ５０の測定に影響を与える可能性もある。様々な薬剤でコートしたプラスチック材料を試験し、コーティングがＶＣＳのプラスチックへの結合を防ぎ、抗ウイルスアッセイにおいて純粋な粉末から調製したＶＣＳ溶液の使用を潜在的に可能にするかどうかを評価した。
方法
プラスチック材料のコーティング
プラスチック製実験器具を３つの異なるコーティング剤、すなわち、１００ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）、１％ポリエチレングリコール３３５０を含むＭｉｌｌｉＱ水（ＰＥＧ－３３５０、Ｓｉｇｍａ）、及び０．２％ポリソルベート４０を含むＭｉｌｌｉＱ水（Ｔｗｅｅｎ４０、Ｆｌｕｋａ）でコートした。さらに、このプラスチック材料を５００ｍＭのＶＣＳのＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）溶液で処理することにより、ＶＣＳを施した。すべてのチューブ、チップ及び培養プラスチックを含めた実験器具をブロッキング溶液で満たし、表面を均一にコートするために揺らしながら室温で２時間インキュベートした。ＭｉｌｌｉＱ水で２回すすいだ後、これらの物品を室温で乾燥させ、その後さらに実験に使用した。０．２及び２μＭのＶＣＳ溶液をＥＭＥＭ－２％ＦＣＳで調製し、各ＶＣＳ溶液１００μｌをコートした９６ウェルのプレートでインキュベートした。３７℃で２時間のインキュベーション後、残っているＶＣＳ濃度を検証済みのＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定した。同様の方法を使用して、ＴＡＣまたはＣｓＡの結合も評価した。
プラスチック材料のコーティング
プラスチック製実験器具を３つの異なるコーティング剤、すなわち、１００ｍｇ／ｍｌのウシ血清アルブミンを含むＰＢＳ（ＢＳＡ、Ｓｉｇｍａ）、１％ポリエチレングリコール３３５０を含むＭｉｌｌｉＱ水（ＰＥＧ－３３５０、Ｓｉｇｍａ）、及び０．２％ポリソルベート４０を含むＭｉｌｌｉＱ水（Ｔｗｅｅｎ４０、Ｆｌｕｋａ）でコートした。さらに、このプラスチック材料を５００ｍＭのＶＣＳのＤＭＳＯ（Ｓｉｇｍａ）溶液で処理することにより、ＶＣＳを施した。すべてのチューブ、チップ及び培養プラスチックを含めた実験器具をブロッキング溶液で満たし、表面を均一にコートするために揺らしながら室温で２時間インキュベートした。ＭｉｌｌｉＱ水で２回すすいだ後、これらの物品を室温で乾燥させ、その後さらに実験に使用した。０．２及び２μＭのＶＣＳ溶液をＥＭＥＭ－２％ＦＣＳで調製し、各ＶＣＳ溶液１００μｌをコートした９６ウェルのプレートでインキュベートした。３７℃で２時間のインキュベーション後、残っているＶＣＳ濃度を検証済みのＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定した。同様の方法を使用して、ＴＡＣまたはＣｓＡの結合も評価した。
結果
いずれのコーティング処理でもＶＣＳのプラスチックへの非特異的結合及び損失を減らすことはできず（表４参照）、２時間のインキュベーション後に元の濃度の５～７％しか回収されなかった。ｔ＝０であっても、希釈液の調製中のピペットチップ及びチューブ内でのＶＣＳの損失のため、元のストック濃度の約２７％しか回収することができなかった。５００ｍＭのＶＣＳでの処理によるプラスチックの結合部位の飽和は、溶液からのＶＣＳの損失を防いだが、プラスチックからの制御されないＶＣＳの浸出につながった。これにより、投入した溶液の濃度よりも高い、予測不可能な濃度がもたらされ、例えば、２μＭの溶液をＶＣＳで飽和させたプラスチックプレートでインキュベートした場合、１５μＭ超のＶＣＳ濃度が測定された。
いずれのコーティング処理でもＶＣＳのプラスチックへの非特異的結合及び損失を減らすことはできず（表４参照）、２時間のインキュベーション後に元の濃度の５～７％しか回収されなかった。ｔ＝０であっても、希釈液の調製中のピペットチップ及びチューブ内でのＶＣＳの損失のため、元のストック濃度の約２７％しか回収することができなかった。５００ｍＭのＶＣＳでの処理によるプラスチックの結合部位の飽和は、溶液からのＶＣＳの損失を防いだが、プラスチックからの制御されないＶＣＳの浸出につながった。これにより、投入した溶液の濃度よりも高い、予測不可能な濃度がもたらされ、例えば、２μＭの溶液をＶＣＳで飽和させたプラスチックプレートでインキュベートした場合、１５μＭ超のＶＣＳ濃度が測定された。
プラスチックへの結合はＴＡＣで最小であった（２４％の損失）。ＣｓＡの場合、２時間のインキュベーション後、残っている濃度は初期濃度の６２％であった（表５参照）。
これらの結果は、コーティング剤がＶＣＳのプラスチックへの非特異的結合を防がないことを示した。いくつかの態様では、プラスチックの結合による化合物の損失及び医薬製剤に含まれる賦形剤の干渉により、一部のアッセイにおいてＥＣ５０値の特定が困難になった。いずれのコーティング処理もプラスチックへの非特異的結合を防がなかったため、潜在的な問題を回避するために、他の実験ではプラスチックの代わりにガラス器具を使用した（例えば、表３参照）。
本明細書で言及される特許、特許出願、及び科学論文を含めたすべての刊行物は、特許、特許出願、または科学論文を含めた各個別の刊行物が、具体的かつ個別に参照により組み込まれることが示されているのと同程度に、すべての目的のため、参照により全体として本明細書に組み込まれる。
前述の発明は、理解の明瞭化のために実例として及び例としてある程度詳しく記載されているが、当業者には、ある程度のわずかな変更及び修正が、上記の教示に照らして行われることは明らかである。従って、該説明及び例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきではない。本記載の組成物及び方法に対する様々な変更は、本明細書の記載及び教示から明らかになるであろう。かかる変形は、本開示の真の範囲及び趣旨から逸脱することなく行われ得るとともに、本開示の範囲に含まれることが意図されている。
Claims (36)
- 対象におけるウイルス感染の治療または予防方法であって、前記対象に対して、治療有効量のボクロスポリンを投与することを含む、前記方法。
- 前記対象が、免疫抑制を必要としている、請求項１に記載の方法。
- 前記ウイルス感染が、シクロフィリンＡ（ＣｙｐＡ）またはＣｙｐＡ関連経路の阻害によって改善される、請求項１または２に記載の方法。
- 前記ウイルス感染が、Ｃｏｒｏｎａｖｉｒｉｄａｅのメンバーであるウイルスによって引き起こされる、請求項１～３のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ウイルスが、アルファコロナウイルス、ベータコロナウイルス、デルタコロナウイルス、またはガンマコロナウイルスである、請求項４に記載の方法。
- 前記ウイルスが、ヒトコロナウイルスＯＣ４３（ＨＣｏＶ－ＯＣ４３）、ヒトコロナウイルスＨＫＵ１（ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１）、ヒトコロナウイルス２２９Ｅ（ＨＣｏＶ－２２９Ｅ）、ヒトコロナウイルスＮＬ６３（ＨＣｏＶ－ＮＬ６３）、中東呼吸器症候群関連コロナウイルス（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、重症急性呼吸器症候群コロナウイルス（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ）、または重症急性呼吸器症候群コロナウイルス２（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２）である、請求項３または４に記載の方法。
- 前記ウイルスが、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、またはＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項３～６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記ウイルスが、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２である、請求項３～７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記治療有効量が、約０．１ｍｇ／ｋｇ／日～約２ｍｇ／ｋｇ／日である、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記治療有効量が、約７．９ｍｇ ＢＩＤ、約１５．８ｍｇ ＢＩＤ、約２３．７ｍｇ ＢＩＤ、約３１．６ｍｇ ＢＩＤ、約３９．５ｍｇ ＢＩＤ、約４７．４ｍｇ ＢＩＤ、または約５５．３ＢＩＤである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記治療有効量が、約７．９ｍｇ ＱＤ、約１５．８ｍｇ ＱＤ、約２３．７ｍｇ ＱＤ、約３１．６ｍｇ ＱＤ、約３９．５ｍｇ ＱＤ、約４７．４ｍｇ ＱＤ、約５５．３ｍｇ ＱＤ、約６３．２ｍｇ ＱＤ、約７１．１ｍｇ ＱＤ、約７９．０ｍｇ ＱＤ、約８６．９ｍｇ ＱＤ、約９４．８ｍｇ ＱＤ、約１０２．７ｍｇ ＱＤ、または約１１０．６ｍｇ ＱＤである、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記治療有効量が、約０．０５μＭ～約１０μＭ、約０．１μＭ～約５μＭ、約０．２μＭ～約２．５μＭ、約０．３μＭ～約１．０μＭ、約０．４μＭ～約０．９μＭ、約０．５μＭ～約０．８μＭ、約０．１μＭ～約０．５μＭ、もしくは約０．２μＭ～約０．４μＭ、または約０．０５、約０．１、約０．１５、約０．２、約０．２５、約０．３、約０．３５、約０．４、約０．４５、約０．５、約０．５５、約０．６、約０．７、約０．８、約０．９、約１．０、約１．５、約２．０、約２．５、約３．０、約３．５、約４．０、約４．５、約５．０、約６．０、約７．０、約８．０、約９．０、もしくは約１０．０μＭもしくはそれ未満の濃度と同等であるか、またはそれを達成することができる、請求項１～８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記対象の腎機能が監視される、請求項１～１２のいずれか１項に記載の方法。
- 前記対象の腎機能の監視が以下を含む、請求項１３に記載の方法：
（ａ）異なる日の少なくとも第一の時点及び第二の時点で前記対象の推算糸球体ろ過量（ｅＧＦＲ）を評価すること、ならびに
（ｂ）（ｉ）前記対象のｅＧＦＲが前記第一及び第二の時点の間に目標％を超えて所定の値未満に低下した場合、ボクロスポリンの前記対象に対する１日投与量を減少させるか、または投与を停止すること、
（ｉｉ）前記対象のｅＧＦＲが前記第一及び第二の時点の間に前記目標％より少なく低下した場合、前記対象に対して同じ１日投与量のボクロスポリンの投与を継続すること。 - 前記所定の値が、約５０～約９０ｍｌ／分／１．７３ｍ２である、請求項１４に記載の方法。
- 前記所定の値が、約６０ｍｌ／分／１．７３ｍ２である、請求項１４または１５に記載の方法。
- 前記目標％が、約２０％～約４５％である、請求項１４～１６のいずれか１項に記載の方法。
- 前記目標％が、約２０％である、請求項１４～１７のいずれか１項に記載の方法。
- 前記対象が、自己免疫疾患または移植片拒絶反応に関連する状態を有する、請求項１～１８のいずれか１項に記載の方法。
- 前記対象が、移植片拒絶反応に関連する状態を有する、請求項１～１９のいずれか１項に記載の方法。
- 前記状態が、心臓、肺、肝臓、腎臓、膵臓、皮膚、腸、または角膜の移植片拒絶反応に関連する、請求項１９または２０に記載の方法。
- 前記状態が、腎移植拒絶反応に関連する、請求項１９～２１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記対象が、自己免疫疾患を有する、請求項１９に記載の方法。
- 前記治療有効量のボクロスポリンが、治療有効量のミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／または治療有効量のコルチコステロイドを投与することなく投与される、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
- さらに、治療有効量のミコフェノール酸モフェチル（ＭＭＦ）及び／または治療有効量のコルチコステロイドを投与することを含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載の方法。
- ボクロスポリンが、腸内投与、経口投与、舌下投与、または直腸投与、非経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注入、または吸入／吹送によって投与される、請求項１～２５のいずれか１項に記載の方法。
- ボクロスポリンが、腸内投与、経口投与、舌下投与、または直腸投与によって投与される、請求項２６に記載の方法。
- ボクロスポリンが、経口投与によって投与される、請求項２５または２７に記載の方法。
- ボクロスポリンが、非経口投与、静脈内注射、筋肉内注射、皮下注射、静脈内注入、または吸入／吹送によって投与される、請求項２６に記載の方法。
- ボクロスポリンが、吸入または吹送によって投与される、請求項２６または２９に記載の方法。
- ボクロスポリンが、エアロゾルの形態で投与される、請求項３０に記載の方法。
- ボクロスポリンが、医薬組成物で投与される、請求項１～３１のいずれか１項に記載の方法。
- 前記医薬組成物が、１つ以上の医薬的に許容される賦形剤を含む、請求項３２に記載の方法。
- 前記医薬的に許容される賦形剤が、独立して、アルコール、Ｄ－α－トコフェロール（ビタミンＥ）、ポリエチレングリコールスクシネート（ＴＰＧＳ）、ポリソルベート２０（Ｔｗｅｅｎ２０）、ポリソルベート４０（Ｔｗｅｅｎ４０）、中鎖トリグリセリド、ゼラチン、ソルビトール、グリセリン、黄色酸化鉄、赤色酸化鉄、二酸化チタン、及び水を含む１つ以上から選択される、請求項３３に記載の方法。
- 前記ウイルス量が、前記対象において、ボクロスポリンの投与後に減少する、請求項１～３４のいずれか１項に記載の方法。
- 前記対象の生存が、ボクロスポリンの投与後に延長される、請求項１～３５のいずれか１項に記載の方法。
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