CN115856298A

CN115856298A - 一种梅毒螺旋体重组抗原及其制备方法

Info

Publication number: CN115856298A
Application number: CN202211283535.5A
Authority: CN
Inventors: 赵钢; 李子洋; 孙艳丹
Original assignee: Changzhou Juxin Biotechnology Co ltd; Henan Yikai Chuangtuo Technology Co ltd; Suzhou Century Coordinate Biotechnology Co ltd
Current assignee: Changzhou Juxin Biotechnology Co ltd; Henan Yikai Chuangtuo Technology Co ltd; Suzhou Century Coordinate Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-10-20
Filing date: 2022-10-20
Publication date: 2023-03-28

Abstract

本发明公开一种梅毒螺旋体重组抗原及其制备方法，属于梅毒螺旋体的抗体检测技术领域。为了解决梅毒抗体检测中的灵敏度低，特异性低的技术问题。本发明提供一种梅毒螺旋体重组抗原，所述重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，以及一种梅毒螺旋体的抗体检测试剂盒，述试剂盒包括梅毒螺旋体重组抗原。本发明的梅毒螺旋体重组蛋白抗原可以特异性的识别梅毒螺旋体的血清种的抗体，同时由于拥有4个不同蛋白的片段，极大的提高其灵敏度和特异性，是梅毒螺旋体抗体的最佳候选抗原。

Description

一种梅毒螺旋体重组抗原及其制备方法

技术领域

本发明属于梅毒螺旋体的抗体检测技术领域，具体涉及一种梅毒螺旋体重组抗原及其制备方法。

背景技术

梅毒螺旋体是梅毒的病原体，因其透明，不易着色，故又称苍白螺旋体。梅毒是一种广泛流行的性病，在中国发病率又有所回升。梅毒螺旋体只能感染人类，分获得性梅毒与胎传梅毒。获得性梅毒主要通过性接触传染；胎传梅毒由梅毒螺旋体通过胎盘，从脐带血循环传给胎儿，可引起胎儿全身感染。螺旋体在胎儿内脏及组织中大量繁殖，可引起胎儿死亡或流产。

梅毒潜伏期长、病情进展缓慢、病灶中梅毒螺旋体的分离阳性率低,故检测梅毒螺旋体特异性抗体的血清学试验成为临床上梅毒实验室诊断的常用方法。最有临床应用前景的梅毒螺旋体抗原目前以单一重组表达抗原的血清抗体检测方法已有不少研究报道,但单一抗原的灵敏度和特异性较低。

发明内容

本发明的目的是为了解决梅毒抗体检测中的灵敏度低，特异性低的技术问题。

本发明提供一种梅毒螺旋体重组抗原，所述重组抗原的氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

本发明提供编码上述的梅毒螺旋体重组抗原的基因。

本发明提供一种梅毒螺旋体的抗体检测试剂盒，所述试剂盒包括上述的梅毒螺旋体重组抗原或者上述的编码基因。

进一步地限定，所述试剂盒还包括包被液：预包被板、酶标抗体、标准品、显色剂、终止液、洗涤液和样本稀释液。

进一步地限定，包被液：PH9.6碳酸盐缓冲液，50ml、预包被板：96孔聚苯乙烯板、酶标抗体：HRPG标记的小鼠抗IgG抗体，1mg、标准品：梅毒螺旋体重组抗原对应多克隆抗体，1mg、ELISA缓冲液：2％ BSA(牛血清白蛋白)，0.1％tween20(吐温20)，PBS溶液，200ml、显色剂：TMB底物，1.5ml、终止液：1mol硫酸，1.5ml、洗涤液：2％ BSA(牛血清白蛋白)，0.1％tween20(吐温20)，0.1XPBS溶液，300ml、样本稀释液：0.1XPBS溶液，100ml。

本发明提供一种上述的梅毒螺旋体重组抗原的制备方法，所述制备方法的具体步骤如下：将SEQ ID NO.2所示的基因序列与线性化的pET-15b质粒连接获得重组载体，将重组载体转入BL21感受态中获得菌液，利用诱导剂诱导，获得表达蛋白。

进一步地限定，扩增SEQ ID NO.2所示的基因序列的引物序列为F5‘TACAAATGGTGCGCGCGA3’，反向R 5‘CGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGT3’。

进一步地限定，SEQ ID NO.2所示的基因序列与线性化的pET-15b质粒连接的酶切位点是EcoRI和HindIII。

进一步地限定，诱导剂为IPTG。

本发明提供上述的重组抗原、上述的基因或上述的试剂盒在制备梅毒疫苗免疫后的抗体检测试剂盒、野生动物梅毒疫情监测试剂盒、药物筛选试剂盒和疫苗研究评价试剂盒中的应用。

有益效果：本发明的梅毒螺旋体重组蛋白区别于其他单一蛋白序列，融合了梅毒螺旋体的4段基础蛋白的片段，串联在了一起。该重组抗原可以特异性的识别梅毒螺旋体的血清种的抗体，同时由于拥有4个不同蛋白的片段，极大的提高其灵敏度和特异性，是梅毒螺旋体抗体的最佳候选抗原。

附图说明

图1为SDS-PAGE检测目标蛋白结果图；

图2为pET-15b质粒载体图；

具体实施方式

实施例1.梅毒螺旋体重组抗原的制备方法

该发明采用基因克隆技术将所需的基因片段(上海朗晶生物科技有限公司合成)转入pET-15b质粒载体中再导入BL21(D3)菌株中，利用IPTG为诱导剂，促使细菌大量表达目标蛋白，在经过金属镍螯合亲和层析介质进行纯化。

TpNl7蛋白120-156:ELYELIDSNSVRYMGAPGAGKPSKEMAPFYVLKKTKK(SEQ ID NO.5)；

TpN47蛋白123-185:

MVRASASFQDLGEDGEIKFEAVEGAVALADRASSFMVDSEEYKITNVKVHGMKFVPVAVPHE(SEQ IDNO.6)；

TpN47蛋白332-368:YRLTLIANGYRDVVADVRFLPKYEGNIDIGLKGKVLT(SEQ ID NO.7)；

FLaA蛋白190-221:FVGFRIRTSPSERVDDFYVFFDQFKALANMHI(SEQ ID NO.8)。

一、载体的构建的方法：

合成SEQ ID NO.1所述的氨基酸序列，基因序列为SEQ ID NO.2，所述基因模板由专业的基因合成公司合成相应的DNA片段。再利用引物正向F 5‘TACAAATGGTGCGCGCGA3’(SEQ ID NO.9)，反向R 5‘CGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGT3’(SEQ ID NO.10)，PCR扩增条件95℃，5min，(98℃，30s，55℃，30s，72℃，30s)X35个循环，72℃，5min，进行扩增，得到足够进行质粒链接的用量；

将SEQ ID NO.2所述的基因序列(扩增后的片段)与线性化的pET-15b质粒(序列如SEQ ID NO.3所示，载体图如图2所示)连接，先分别对pET-15b质粒和SEQ ID NO.1所述的基因序列扩增后的片段进行酶切，酶切位点是EcoRI和HindIII，酶切条件为37℃，孵育2小时，酶切完成后，将酶切后的线性化pET-15b质粒和SEQ ID NO.1所述的基因序列扩增后的片段回收，进行连接，连接的条件为加入连接酶ligase，16℃，孵育半小时，获得重组载体(序列如SEQ ID NO.4所示)；

鉴定的结果：通过对重组后的载体进行测序，测序结果显示整个载体序列与改造后的序列吻合。

二、获得重组蛋白

1.将步骤一种获得的重组载体转入到BL21(D3)菌株中获得重组大肠杆菌，诱导获得重组蛋白的具体方法：

2.平衡液：20mM PB，50mM Tris-HCl，500mM NaCl，5％咪唑，pH 7.4；

洗涤液：20mM PB，50mM Tris-HCl，500mM NaCl，10％咪唑，pH 7.4；

洗脱液：20mM PB，50mM Tris-HCl，500mM NaCl，25％咪唑，pH 7.4；

将重组大肠杆菌培养，1(甘油菌)：100体积加LB培养基接种，37℃摇床(200pm)过夜培养1：10体积加LB培养基继续扩增，37℃摇床(200pm)培养1h，加入1mM的IPTG诱导2h，30℃，3000g离心回收细菌，然后加入平衡液到回收的细菌中并裂解，3000g离心，取上清，用平衡液平衡含有HIS标签亲和的树脂柱子，反复冲洗2次，将含有样品的缓冲液加入到已经平衡好的树脂柱子中，上样完毕后，继续用平衡缓淋洗至基线，此时目标蛋白(梅毒螺旋体特异性多位点重组蛋白)以被树脂柱吸附用10倍的洗涤液进行洗涤，重复三次，用于除去杂质蛋白，再用3倍洗脱液进行洗脱，将被树脂柱吸附的目标蛋白(梅毒螺旋体特异性多位点重组蛋白)洗脱下来，并回收。

通过SDS-PAGE胶对目标蛋白(分子量：20Kda)进行检测。检测结果如图1所示：结果表明，目标蛋白条带质量符合(20Kda)，条带单一，基本无其他杂带，所得蛋白纯度可达(99％)。

实施例2.梅毒螺旋体重组抗原的应用

梅毒螺旋体特异性多位点重组蛋白，包含了梅毒螺旋体的3个重要抗原决定基片段，该系列片段有效的的激活机体并释放相应的抗体，因此可以有针对性作为检测血液中的形成的梅毒螺旋体抗体的原料，可用在ELISA，胶体金，免疫荧光等方面检测用抗原，专门检测梅毒螺旋体抗体用，同时可作为制备相关抗体(小鼠，兔子等)的原料使用。

实施例3.检测梅毒螺旋体抗体试剂盒

一、试剂盒的制备：

包被液(瓶)：PH9.6碳酸盐缓冲液，50ml；

预包被板底物(管)：梅毒螺旋体重组抗原(冻干粉)，经过滤，纯化后的蛋白，1mg；

预包被板：96孔聚苯乙烯板；

酶标抗体(管)：HRPG标记的小鼠抗IgG抗体，1mg；

标准品(管)：梅毒螺旋体重组抗原对应多克隆抗体，1mg；

ELISA缓冲液(瓶)：2％ BSA(牛血清白蛋白)，0.1％tween20(吐温20)，PBS溶液，200ml；

显色剂(管)：TMB底物，1.5ml；

终止液(管)：1mol硫酸，1.5ml；

洗涤液(瓶)：2％ BSA(牛血清白蛋白)，0.1％tween20(吐温20)，0.1XPBS溶液，300ml

样本稀释液(瓶)：0.1XPBS溶液，100ml。

二、检测操作步骤

(1)将试剂盒所有组份恢复至室温。

(2)加入样品稀释液，50μL/孔；加入阳性、阴性对照各2孔，50μL/孔；加入待检血清，50μL/孔；记录加样顺序；置密封盒中或封口袋中；室温作用2小时。

(3)用洗涤液洗3次，300μL/孔，每次洗液在孔中停留2min后拍干。

(4)加入酶标试剂，100μL/孔；室温作用30分钟；

(5)用洗涤液洗3次，300μL/孔，每次洗液在孔中停留2min后拍干。

(6)加入显色液显色，100μL/孔，室温避光显色10min；

(7)加入终止液，100μL/孔；10min内测定OD450值；

(8)结果判定：判定结果是大于阴性最高值即可。

检测结果如表1所示:OD450测算值，阴性是通过检测确定的，每次检测都不一样，基本都是0-0.3之间。阳性就是大于阴性的最高值就可以，基本先通过目测观察，阳性一般都有蓝色，阴性就是无色透明。

表1

	显色结果	定性检测
			阳性样本1	2.61	阳性
阳性样本2	1.59	阳性
			阳性样本3	1.82	阳性
阴性样本1	0.20	阴性
			阴性样本2	0.15	阴性
阴性样本3	0.14	阴性
			PBS缓冲液	0.20	阴性
PBS缓冲液	0.19	阴性
			PBS缓冲液	0.19	阴性

结果显示梅毒螺旋体特异性多位点重组蛋白，可以作为梅毒螺旋体的特异性抗体的检测用底物进行使用。效果数据是灵敏度高和特异性强：目前，市场上的ELISA相关检测灵敏度为93％，特异性为95％左右，由于其抗原未经过筛选，包含大量非抗原表位蛋白序列，导致其会发生大量的非特异性抗体连接，从而导致一定量的误差。本产品由于采用特异性基因片段，也是具有特异性抗原表位的蛋白序列，只针对梅毒病毒的产生的特异性抗体进行筛查。由于去除了非特异性片段，既将非特异性的抗体连接的可能性排除在外，所述抗原只与和相关的识别本序列的抗原表位的特异性抗体相结合，从而提高检测灵敏度和特异性，可以达到100％检测率，特异性达到98％，提高了准确率，减少误检率。

蛋白序列(SEQ ID NO.1)

MVRASASFQDLGEDGEIKFEAVEGAVALADRASSFMVDSEEYKITNVKVHGMKFVPVAVPHEGGGGGSSSSGELYELIDSNSVRYMGAPGAGKPSKEMAPFYVLKKTKKGGGGGSSSSGYRLTLIANGYRDVVADVRFLPKYEGNIDIGLKGKVLTGGGGGSSSSGFVGFRIRTSPSERVDDFYVFFDQFKALANMHI；

(SEQ ID NO.2):

ATGGTGCGCGCGAGCGCGAGCTTTCAGGATCTGGGCGAAGATGGCGAAATTAAATTTGAAGCGGTGGAAGGCGCGGTGGCGCTGGCGGATCGCGCGAGCAGCTTTATGGTGGATAGCGAAGAATATAAAATTACCAACGTGAAAGTGCATGGCATGAAATTTGTGCCGGTGGCGGTGCCGCATGAAGGCGGCGGCGGCGGCAGCAGCAGCAGCGGCGAACTGTATGAACTGATTGATAGCAACAGCGTGCGCTATATGGGCGCGCCGGGCGCGGGCAAACCGAGCAAAGAAATGGCGCCGTTTTATGTGCTGAAAAAAACCAAAAAAGGCGGCGGCGGCGGCAGCAGCAGCAGCGGCTATCGCCTGACCCTGATTGCGAACGGCTATCGCGATGTGGTGGCGGATGTGCGCTTTCTGCCGAAATATGAAGGCAACATTGATATTGGCCTGAAAGGCAAAGTGCTGACCGGCGGCGGCGGCGGCAGCAGCAGCAGCGGCTTTGTGGGCTTTCGCATTCGCACCAGCCCGAGCGAACGCGTGGATGATTTTTATGTGTTTTTTGATCAGTTTAAAGCGCTGGCGAACATGCATATT；

pET-21(a)质粒载体序列(SEQ ID NO.3)：

TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGGGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTAGCATGACTGGTGGACAGCAAATGGGTCGCGGATCCGAATTCGAGCTCCGTCGACAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT；

重组载体的序列(SEQ ID NO.4)：

TGGCGAATGGGACGCGCCCTGTAGCGGCGCATTAAGCGCGGCGGGTGTGGTGGTTACGCGCAGCGTGACCGCTACACTTGCCAGCGCCCTAGCGCCCGCTCCTTTCGCTTTCTTCCCTTCCTTTCTCGCCACGTTCGCCGGCTTTCCCCGTCAAGCTCTAAATCGGGGGCTCCCTTTAGGGTTCCGATTTAGTGCTTTACGGCACCTCGACCCCAAAAAACTTGATTAGGGTGATGGTTCACGTAGTGGGCCATCGCCCTGATAGACGGTTTTTCGCCCTTTGACGTTGGAGTCCACGTTCTTTAATAGTGGACTCTTGTTCCAAACTGGAACAACACTCAACCCTATCTCGGTCTATTCTTTTGATTTATAAGGGATTTTGCCGATTTCGGCCTATTGGTTAAAAAATGAGCTGATTTAACAAAAATTTAACGCGAATTTTAACAAAATATTAACGTTTACAATTTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTATTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGTCCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCTGATGCGGTATTTTCTCCTTACGCATCTGTGCGGTATTTCACACCGCATATATGGTGCACTCTCAGTACAATCTGCTCTGATGCCGCATAGTTAAGCCAGTATACACTCCGCTATCGCTACGTGACTGGGTCATGGCTGCGCCCCGACACCCGCCAACACCCGCTGACGCGCCCTGACGGGCTTGTCTGCTCCCGGCATCCGCTTACAGACAAGCTGTGACCGTCTCCGGGAGCTGCATGTGTCAGAGGTTTTCACCGTCATCACCGAAACGCGCGAGGCAGCTGCGGTAAAGCTCATCAGCGTGGTCGTGAAGCGATTCACAGATGTCTGCCTGTTCATCCGCGTCCAGCTCGTTGAGTTTCTCCAGAAGCGTTAATGTCTGGCTTCTGATAAAGCGGGCCATGTTAAGGGCGGTTTTTTCCTGTTTGGTCACTGATGCCTCCGTGTAAGGGGGATTTCTGTTCATGGGGGTAATGATACCGATGAAACGAGAGAGGATGCTCACGATACGGGTTACTGATGATGAACATGCCCGGTTACTGGAACGTTGTGAGGGTAAACAACTGGCGGTATGGATGCGGCGGGACCAGAGAAAAATCACTCAGGGTCAATGCCAGCGCTTCGTTAATACAGATGTAGGTGTTCCACAGGGTAGCCAGCAGCATCCTGCGATGCAGATCCGGAACATAATGGTGCAGGGCGCTGACTTCCGCGTTTCCAGACTTTACGAAACACGGAAACCGAAGACCATTCATGTTGTTGCTCAGGTCGCAGACGTTTTGCAGCAGCAGTCGCTTCACGTTCGCTCGCGTATCGGTGATTCATTCTGCTAACCAGTAAGGCAACCCCGCCAGCCTAGCCGGGTCCTCAACGACAGGAGCACGATCATGCGCACCCGTGGGGCCGCCATGCCGGCGATAATGGCCTGCTTCTCGCCGAAACGTTTGGTGGCGGGACCAGTGACGAAGGCTTGAGCGAGGGCGTGCAAGATTCCGAATACCGCAAGCGACAGGCCGATCATCGTCGCGCTCCAGCGAAAGCGGTCCTCGCCGAAAATGACCCAGAGCGCTGCCGGCACCTGTCCTACGAGTTGCATGATAAAGAAGACAGTCATAAGTGCGGCGACGATAGTCATGCCCCGCGCCCACCGGAAGGAGCTGACTGGGTTGAAGGCTCTCAAGGGCATCGGTCGAGATCCCGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTTACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCCAGGGTGGTTTTTCTTTTCACCAGTGAGACGGGCAACAGCTGATTGCCCTTCACCGCCTGGCCCTGAGAGAGTTGCAGCAAGCGGTCCACGCTGGTTTGCCCCAGCAGGCGAAAATCCTGTTTGATGGTGGTTAACGGCGGGATATAACATGAGCTGTCTTCGGTATCGTCGTATCCCACTACCGAGATATCCGCACCAACGCGCAGCCCGGACTCGGTAATGGCGCGCATTGCGCCCAGCGCCATCTGATCGTTGGCAACCAGCATCGCAGTGGGAACGATGCCCTCATTCAGCATTTGCATGGTTTGTTGAAAACCGGACATGGCACTCCAGTCGCCTTCCCGTTCCGCTATCGGCTGAATTTGATTGCGAGTGAGATATTTATGCCAGCCAGCCAGACGCAGACGCGCCGAGACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACAGCGCGATTTGCTGGTGACCCAATGCGACCAGATGCTCCACGCCCAGTCGCGTACCGTCTTCATGGGAGAAAATAATACTGTTGATGGGTGTCTGGTCAGAGACATCAAGAAATAACGCCGGAACATTAGTGCAGGCAGCTTCCACAGCAATGGCATCCTGGTCATCCAGCGGATAGTTAATGATCAGCCCACTGACGCGTTGCGCGAGAAGATTGTGCACCGCCGCTTTACAGGCTTCGACGCCGCTTCGTTCTACCATCGACACCACCACGCTGGCACCCAGTTGATCGGCGCGAGATTTAATCGCCGCGACAATTTGCGACGGCGCGTGCAGGGCCAGACTGGAGGTGGCAACGCCAATCAGCAACGACTGTTTGCCCGCCAGTTGTTGTGCCACGCGGTTGGGAATGTAATTCAGCTCCGCCATCGCCGCTTCCACTTTTTCCCGCGTTTTCGCAGAAACGTGGCTGGCCTGGTTCACCACGCGGGAAACGGTCTGATAAGAGACACCGGCATACTCTGCGACATCGTATAACGTTACTGGTTTCACATTCACCACCCTGAATTGACTCTCTTCCGGGCGCTATCATGCCATACCGCGAAAGGTTTTGCGCCATTCGATGGTGTCCGGGATCTCGACGCTCTCCCTTATGCGACTCCTGCATTAGGAAGCAGCCCAGTAGTAGGTTGAGGCCGTTGAGCACCGCCGCCGCAAGGAATGGTGCATGCAAGGAGATGGCGCCCAACAGTCCCCCGGCCACGGGGCCTGCCACCATACCCACGCCGAAACAAGCGCTCATGAGCCCGAAGTGGCGAGCCCGATCTTCCCCATCGGTGATGTCGGCGATATAGGCGCCAGCAACCGCACCTGTGGCGCCGGTGATGCCGGCCACGATGCGTCCGGCGTAGAGGATCGAGATCTCGATCCCGCGAAATTAATACGACTCACTATAGGGGAATTGTGAGCGGATAACAATTCCCCTCTAGAAATAATTTTGTTTAACTTTAAGAAGGAGATATACATACCTACAAATGGTGCGCGCGAGCGCGAGCTTT CAGGATCTGGGCGAAGATGGCGAAATTAAATTTGAAGCGGTGGAAGGCGCGGTGGCGCTGGCGGATCGCGCGAGCA GCTTTATGGTGGATAGCGAAGAATATAAAATTACCAACGTGAAAGTGCATGGCATGAAATTTGTGCCGGTGGCGGT GCCGCATGAAGGCGGCGGCGGCGGCAGCAGCAGCAGCGGCGAACTGTATGAACTGATTGATAGCAACAGCGTGCGC TATATGGGCGCGCCGGGCGCGGGCAAACCGAGCAAAGAAATGGCGCCGTTTTATGTGCTGAAAAAAACCAAAAAAG GCGGCGGCGGCGGCAGCAGCAGCAGCGGCTATCGCCTGACCCTGATTGCGAACGGCTATCGCGATGTGGTGGCGGA TGTGCGCTTTCTGCCGAAATATGAAGGCAACATTGATATTGGCCTGAAAGGCAAAGTGCTGACCGGCGGCGGCGGC GGCAGCAGCAGCAGCGGCTTTGTGGGCTTTCGCATTCGCACCAGCCCGAGCGAACGCGTGGATGATTTTTATGTGT TTTTTGATCAGTTTAAAGCGCTGGCGAACATGCATATTCACCACCACCACCACCACTGAGATCCGGCTGCTAACAAAGCCCGAAAGGAAGCTGAGTTGGCTGCTGCCACCGCTGAGCAATAACTAGCATAACCCCTTGGGGCCTCTAAACGGGTCTTGAGGGGTTTTTTGCTGAAAGGAGGAACTATATCCGGAT。

Claims

1.一种梅毒螺旋体重组抗原，其特征在于，所述重组抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.编码权利要求1所述的梅毒螺旋体重组抗原的基因。

3.一种梅毒螺旋体的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的梅毒螺旋体重组抗原或者权利要求2所述的编码基因。

4.根据权利要求3所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括包被液、预包被板、酶标抗体、标准品、显色剂、终止液、洗涤液和样本稀释液。

5.根据权利要求4所述的抗体检测试剂盒，其特征在于，包被液：PH9.6碳酸盐缓冲液；预包被板：96孔聚苯乙烯板；酶标抗体：HRPG标记的小鼠抗IgG抗体；标准品：梅毒螺旋体重组抗原对应多克隆抗体；ELISA缓冲液：2％BSA，0.1％tween20，PBS溶液；显色剂：TMB底物；终止液：1mol硫酸，1.5ml；洗涤液：2％BSA，0.1％tween20，0.1XPBS溶液；样本稀释液：0.1×PBS溶液。

6.一种权利要求1所述的梅毒螺旋体重组抗原的制备方法，其特征在于，所述制备方法的具体步骤如下：将SEQ ID NO.2所示的基因序列与线性化的pET-15b质粒连接获得重组载体，将重组载体转入BL21感受态中获得菌液，利用诱导剂诱导，获得表达蛋白。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，扩增SEQ ID NO.2所示的基因序列的引物序列为TACAAATGGTGCGCGCGA和CGGATCTCAGTGGTGGTGGTGGT。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，SEQ ID NO.2所示的基因序列与线性化的pET-15b质粒连接的酶切位点是EcoRI和HindIII。

9.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，诱导剂为IPTG。

10.权利要求1所述的重组抗原、权利要求2所述的基因或权利要求3或4所述的试剂盒在制备梅毒疫苗免疫后的抗体检测试剂盒、野生动物梅毒疫情监测试剂盒、药物筛选试剂盒和疫苗研究评价试剂盒中的应用。