CN115856046B - 一种基于钙钛矿纳米材料的光电化学生物传感器检测alp的应用 - Google Patents
一种基于钙钛矿纳米材料的光电化学生物传感器检测alp的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种基于钙钛矿纳米材料的光电化学生物传感器ALP的应用,包括以下步骤:S1、在光照条件下通过电化学工作站检测ALP的光电信号强度,以光电流强度为纵坐标,ALP的浓度为横坐标,建立标准曲线;S2、血清中ALP的检测:加入血清与底物Na3SPO3进行孵育,得到血清孵育溶液,将血清孵育溶液滴加在基于CsPbBr3纳米材料的光电化学生物传感器的修饰电极,测得光电流强度,将光电流强度代入到S1构建的标准曲线,即得血清中ALP的浓度。本发明利用ALP对Na3SPO3的特异性催化产生H2S,CsPbBr3由于离子性能与H2S快速反应产生PbS增强光电流,对ALP的浓度进行高灵敏检测。
Description
技术领域
本发明涉及生物传感器电极领域,特别是一种基于钙钛矿纳米材料的光电化学生物传感器检测ALP的应用。
背景技术
碱性磷酸酯酶(ALP,alkaline phosphatase)是一种广泛分布在体内的外分泌酶,在基因表达、生物分子运输和代谢等诸多生理过程中发挥着重要作用。ALP可以催化各种生物分子或其他小分子去磷酸化,比如催化去除核酸和多肽中磷酸基团。通常,正常的成年人血清中ALP浓度约为40 ~ 140 U/L,儿童和孕妇的血清ALP含量可达500 U/L,血清中ALP浓度的异常与许多疾病相关,比如肝肾功能障碍、骨病、乳腺癌、肝癌等。同时由于ALP来源广,可催化底物多,稳定性良好,催化效率高,特异性强,常常作为生物传感器中的信号转化部分,将其他生物标志物的浓度转化为对应ALP产生的光学或者电信号。因此,开发一种简单高效、灵敏可靠的ALP的检测方法用以临床诊断或者构建生物传感器十分必要。目前常见的ALP检测策略主要有荧光法、比色法、电化学法、化学发光法和光电化学法等,其中光电化学法(PEC)由于激发光源和检测信号的分离,兼具了光学方法的低检测限和电化学方法的高灵敏度,同时操作简单、设备便宜,受到了广泛的研究。
光电化学生物传感器的性能主要取决于光电活性物质。光吸收强、光电转化效率高的光电活性物质钙钛矿材料近年来收获了广大学者的研究兴趣,但由于钙钛矿材料本身的离子特性和不稳定性,钙钛矿材料在水溶液中光电信号非常不稳定,影响光电传感器对目标物待测物检测准确性,这对钙钛矿材料在光电传感器中应用带来较大挑战。往往需要对钙钛矿材料进行保护修饰,从而造成了光学性能和光电性能的损失。比如用CsPbBr3纳米材料检测ALP的生物传感器中,需要对CsPbBr3进行修饰保护,通过ALP催化底物AAP生成AA,通过AA与CsPbBr3表面的修饰物反应,产生荧光或电流信号的变化,该方法合成复杂、成本较高,不能完全发挥出CsPbBr3纳米成本低廉、光电转换效率高等优点。因此,很有必要开发一种简单的钙钛矿修饰传感器的应用,构建性能稳定的光电化学生物传感器。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是,针对现有技术不足,提供一种基于钙钛矿纳米材料的光电化学生物传感器检测ALP的应用,将ALP的活性转换为光电流信号变化,对ALP的浓度进行高灵敏检测。
为解决上述技术问题,本发明所采用的技术方案是:一种基于钙钛矿纳米材料的光电化学生物传感器检测ALP的应用,包括以下步骤:
S1、将不同浓度ALP溶液与底物Na3SPO3进行孵育,得到ALP孵育溶液,将ALP孵育溶液滴加在基于CsPbBr3纳米材料的光电化学生物传感器的修饰电极上反应,得到反应后的修饰电极,在PBS缓冲溶液中设置偏电压和输出电流,将反应后的修饰电极作为工作电极,在光照条件下通过电化学工作站检测ALP的光电信号强度,以光电流强度为纵坐标,ALP的浓度为横坐标,建立标准曲线;
S2、血清中ALP的检测:加入血清与底物Na3SPO3进行孵育,得到血清孵育溶液,将血清孵育溶液滴加在基于CsPbBr3纳米材料的光电化学生物传感器的修饰电极,测得光电流强度,将光电流强度代入到S1构建的标准曲线,即得血清中ALP的浓度。
本发明利用ALP对Na3SPO3的特异性催化产生H2S,CsPbBr3由于离子性能与H2S快速反应产生PbS起到增强光电流的作用,以此将ALP的活性转换为光电流信号变化,得以对ALP的浓度进行高灵敏检测。该光电化学生物传感器检测ALP时,具有选择性好、灵敏度高、检测限低、检测范围宽等优点。改善了现有的CsPbBr3光电化学生物传感器检测ALP的方法中,光电传感电极复杂的合成修饰过程,充分发挥CsPbBr3光电活性材料简便廉价的合成过程、光电转换效率高的优点。
在本发明的一个优选的实施例中,S1和S2中孵育的温度均为30-40℃,孵育的时间均为1~10小时;优选地,S1和S2中孵育的温度为35-38℃,孵育的时间为6~10小时。随着孵育时间的增加,光电流也增加,孵育时间为6~10小时,测得的光电流较理想。
在本发明的一个优选的实施例中,S1和S2中底物Na3SPO3的浓度为10 ~ 80 mmol/L;优选地,S1和S2中底物Na3SPO3的浓度为50 ~ 80 mmol/L。随着Na3SPO3浓度的增加,光电流也增加,Na3SPO3浓度为50 ~ 80 mmol/L时,测得的光电流较理想。
在本发明的一个优选的实施例中,将孵育后的反应溶液滴加在基于CsPbBr3纳米材料的光电化学生物传感器上反应的时间为3-10分钟;优选地,将孵育后的反应溶液滴加在基于CsPbBr3纳米材料的光电化学生物传感器上反应的时间为5-10分钟。随着反应时间的增加,光电流也增加,将孵育后的反应溶液滴加在基于CsPbBr3纳米材料的光电化学生物传感器上反应的时间为5-10分钟时,测得的光电流较理想。
在本发明的一个优选的实施例中,S1和S2中偏电压为-0.4~-0.1 V,输出电流为10~20A;优选地,S1和S2中偏电压为-0.4~-0.3 V,输出电流为10~15A。随着偏电压的增加,光电流也增加,偏电压为-0.4~-0.3 V时,测得的光电流较理想。
在本发明的一个优选的实施例中,S2中血清的体积为50~200μL;优选地,S2中血清的体积为100~200μL。
在本发明的一个优选的实施例中,S1和S2中滴加的孵育后的反应溶液的体积为10-30μL。
S1和S2中所使用的PEC光源均为500 W Xe灯。
所述的PEC检测条件为0.05-0.2 mol/L PBS (pH=6.5-7.5)缓冲液作为电解质溶液。
所述底物Na3SPO3为Na3SPO3的缓冲溶液,在Tris-HCl(pH=8)缓冲溶液中,加入Na3SPO3超声混合均匀,其体积质量比为2 mL:0.04 g,Tris-HCl(pH=8)缓冲溶液的浓度为8-12mM。
Ag/AgCl电极为参比电极,铂丝电极为辅助电极。
一种基于钙钛矿纳米材料检测ALP的光电生物传感器的制备方法,具体包括如下步骤:
步骤一、将Cs2CO3分散在十八烯(ODE)溶液中,转移到三颈烧瓶内,加入油酸(OA),对反应体系抽真空,并且进行加热,氮气保护下得到Cs-OA溶液。
步骤二、将PbBr2分散在ODE溶液中,转移到三颈烧瓶内,加入OA和油胺,对反应体系抽真空,并且进行加热,氮气保护升温到特定温度,加入步骤一中制备的Cs-OA溶液,冰浴冷却后,再离心洗涤纯化得到CsPbBr3纳米晶。
步骤三、将步骤二得到的CsPbBr3纳米晶分散在甲苯中,取CsPbBr3甲苯溶液滴加在玻碳电极上,通风橱下进行干燥,得到CsPbBr3纳米材料修饰的电极。
优选的,步骤一中Cs2CO3的质量为0.3~0.5 g,ODE体积为10~20 mL,OA体积为0.5-3mL。所述加热的温度为120 ~ 150 °C,加热时间为2 ~ 4小时。
步骤一中,所述加热反应通过抽真空提供无氧和负压环境,保护和加速反应。
优选的,步骤二中PbBr2的质量为0.05-0.3 g,ODE体积为5-30 mL,OA体积为0.5-5mL,Cs-OA体积为0.5-5mL。所述温度120 ~ 140 °C,加热时间为1 ~ 4小时。
所述洗涤具体是用甲苯和乙酸乙酯的混合溶液,甲苯和乙酸乙酯的体积比为1:1,使用的体积为5 ~ 10 mL。
优选的,步骤三中甲苯的体积是2-10 mL,修饰所用的CsPbBr3甲苯溶液的体积是0.5-10μL,玻碳电极的直径是3-8mm,时间是1-3分钟。
步骤二中,离心洗涤纯化得到CsPbBr3纳米晶具体包括:
将上述反应溶液12000 rpm离心5分钟,弃掉上清液,将沉淀重新分散在甲苯和乙酸乙酯的混合液中,再12000 rpm离心5分钟,弃掉上清液,最后将沉淀分散再甲苯中,得到CsPbBr3纳米材料的甲苯溶液,冷藏备用;
所述甲苯和乙酸乙酯的混合液使用量为8 mL,其中甲苯和乙酸乙酯的体积比为1:1;最后CsPbBr3分散在甲苯的体积为5 mL。
在该条件下制备的CsPbBr3甲苯溶液具有较好表面张力和挥发性,能在电极上快速形成均匀的CsPbBr3膜,低于此浓度的溶液成膜稳定性较差,容易被水溶液侵蚀;高于此浓度的溶液修饰的电极光电响应增强并不明显。
CsPbBr3纳米材料具有优异的光电活性,同时具有离子交换等化学性质,能快速与溶液中的H2S反应,实现化学信号到电信号的转化,其制备方法简单,成本低廉。采用该传感器应用于光电化学检测ALP的生物传感器时,具有选择性好、灵敏度高、检测限低,且检测范围宽等优点。本方法通过简单滴涂适当浓度的热注入法合成的CsPbBr3甲苯溶液,得到均匀厚度的CsPbBr3层,具有较好的稳定性;同时通过表面Pb缺陷与S2-生成PbS,在对其进行定量检测的同时,也进一步保护了CsPbBr3层。
与现有技术相比,本发明所具有的有益效果为:
(1)本发明通过热注入法合成的配体丰富的高浓度CsPbBr3纳米材料修饰电极,具有光电转化效率高、灵敏度高,通过其离子特性能快速检测溶液中的ALP。
(2)本发明首次提出了用CsPbBr3和PbS相互作用,提高了可见光利用率,加快光生电子空穴的分离转移,在水溶液体系中实现了光电检测ALP。
(3)本发明构建的光电化学生物传感器用碱性磷酸酶的检测,灵敏度高、选择性好,线性范围为50~1000 U/L,检测限为42.1U/L。
(4)光电生物传感器的制备方法操作简单,成本低廉,快速方便,可规模化生产。
附图说明
图1为本发明光电化学生物传感器CsPbBr3纳米晶生成PbS的示意图。
图2为本发明光电化学生物传感器检测ALP过程光电流变化的原理示意图。
图3为本发明光电化学生物传感器检测ALP过程电子转移示意图。
图4为本发明中CsPbBr3纳米晶和CsPbBr3/PbS的扫描和透射电镜图。
图5为本发明中PEC偏电压、孵育时间、ALP催化底物Na3SPO3的浓度、电极反应时间优化图。
图6为本发明光电化学生物传感器检测ALP的标准线性曲线图、选择性和稳定性图。
图1表示ALP催化底物Na3SPO3生成的H2S与CsPbBr3纳米晶的Pb缺陷结合生成PbS。
图2中曲线a为GCE/CsPbBr3的光电流曲线,曲线b为GCE/CsPbBr3/PbS的光电流曲线,GCE/CsPbBr3/PbS形成异质结加速光生电子空穴的分离和转移,造成光电流的增大,从而实现对ALP的浓度检测。
图4中,A、B图分别是CsPbBr3和CsPbBr3/PbS的扫描电子显微镜(SEM)图,可以看出CsPbBr3/PbS表面更为粗糙、结晶性更高,表明了H2S和CsPbBr3反应产生的微观形貌的改变。C、D图是CsPbBr3和CsPbBr3/PbS的透射电子显微镜(TEM)图,可以看到CsPbBr3是粒径约为20~50 nm的块状微粒,CsPbBr3/PbS则是无定形包裹的微粒。
图5是对实验的条件选择偏电压、孵育时间、底物浓度、反应时间的优化,通过对PEC光电响应的比较,得到优选的反应条件为-0.3V偏电压、孵育时间为8小时、底物浓度为50mM、电极反应时间为5分钟。
图6中A、B是实施例2中制得的PEC传感电极对0~1000 U/L ALP的检测光电流值和对应的标准曲线,在此浓度区间本传感器对ALP具有很好的线性关系;图6中C是不同干扰物对检测的影响,由图可知实施例2中制得的传感器有很好的抗干扰性;图6中D是实施例2中制得的电极在400s的光源连续启停20次下的光电流表现,表明传感器具有很好的稳定性。
具体实施方式
为了便于理解本发明,下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明作更全面、细致地描述,但本发明的保护范围并不限于以下具体的实施例。
除非另有定义,下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解的含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的,并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明,本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例1
本实施提供了一种钙钛矿纳米材料的制备方法,其包括以下步骤:
(1)油酸铯前驱液的合成:通过碳酸铯(Cs2CO3)与油酸在十八烯(ODE)高温反应得到油酸铯(Cs-OA)。称取0.407 g Cs2CO3分散在15 mL 十八烯中,加入1.5 mL 油酸,用真空抽滤机抽离反应体系中的空气,同时加热至120 °C反应1小时,观察到固体粉末完全溶解后,在氮气氛围下加热至150 °C得到澄清的油酸铯,冷却至室温密封保存。
(2)CsPbBr3的合成:通过将加热的Cs-OA快速注入配体修饰的PbBr2 十八烯溶液得到CsPbBr3纳米晶。称取0.138 g 溴化铅(PbBr2)分散在10 mL十八烯中,加入1 mL 油酸,再加入1 mL油胺,超声10分钟分散均匀,然后抽离体系中的空气并通入氮气,磁力搅拌下加入至120 °C反应至固体粉末完全溶解,保温半小时后升温至140 °C,同时将步骤(1)中制备的Cs-OA溶液加热至完全澄清,吸取1 mL Cs-OA 快速注入140 °C的PbBr2溶液中,立马关闭加热并转移到冰水浴中。等溶液从土黄变成荧光绿后,将反应液加热至室温,并通过12000rpm离心5分钟,弃去上清液,再将沉淀分散在8 mL 甲苯和乙酸乙酯的等体积混合液中,再次12000 rpm离心5分钟,除去多余的配体和ODE溶剂,沉淀分散在5 mL甲苯中,放置在4 °C冰箱备用。
(3)CsPbBr3修饰电极的制备:取CsPbBr3的甲苯溶液5 μL,滴在玻碳电极表面,放置在通风橱下,干燥2分钟得到CsPbBr3修饰电极。
实施例2
采用实施例1得到的CsPbBr3修饰电极用于光电化学检测血清中的碱性磷酸酶(ALP),以下是ALP检测方法,其步骤包括:
(1)催化底物Na3SPO3溶液的制备:在2 mL 10 mM Tris-HCl(pH=8)缓冲溶液中,加入0.04 g Na3SPO3超声混合均匀,得到50 mM Na3SPO3 的Tris-HCl溶液。
(2)不同浓度的ALP孵育:取100 μL浓度为50 U/L,100 U/L,200 U/L,300 U/L,400U/L,600 U/L,800 U/L,1000 U/L的ALP溶液,分别与100 μL的Na3SPO3 的Tris-HCl溶液混合均匀,37℃水浴孵育8小时。
(3)生物传感器构建:取20 μL上述反应后的溶液滴加在实施例1所述的CsPbBr3修饰电极上,室温下反应5分钟后,用二次水冲洗电极表面。
(4)PEC检测:以0.1 mol/L PBS(pH=7.2)为电解液,设置偏电压为-0.4 V,光源的输出电流为15.0 A,将反应后的修饰电极作为工作电极,在光照条件下测各电极的I-T时间电流曲线,得到各电极的稳定光电流与对于ALP的浓度作标准曲线,得到检测的ALP浓度的标准曲线。
(5)正常人血清中ALP测试:取正常人的血清100 μL和100 μL 50 mM 的Na3SPO3Tris-HCl溶液混合均匀,37℃水浴孵育8小时,用I-T测得其光电流,与标准曲线对比,计算得到血清中ALP浓度。
实施例3
本实施例与实施例2的不同在于设置的偏电压分别为+0.1 V、0V、-0.1 V、-0.2V、-0.3V、-0.4V。如图5(A)所示,随着偏电压的增加,光电流也增加,偏电压为-0.4~-0.3 V时,测得的光电流较理想。
实施例4
本实施例与实施例2的不同在于设置的水浴孵育分别为0.5小时、1小时、2小时、4小时、6小时、8小时、10小时。如图5(B)所示,随着孵育时间的增加,光电流也增加,孵育时间为6~10小时,测得的光电流较理想。
实施例5
本实施例与实施例2的不同在于设置的Na3SPO3浓度分别为5mM、10mM、20mM、40mM、50mM、80mM。如图5(C)所示,随着Na3SPO3浓度的增加,光电流也增加,Na3SPO3浓度为50 ~ 80mmol/L时,测得的光电流较理想。
实施例6
本实施例与实施例2的不同在于取20 μL上述孵育后的溶液滴加在所述的CsPbBr3修饰电极上,室温下反应的时间分别为1min、2min、3min、5min、10min。如图5(D)所示,随着反应时间的增加,光电流也增加,将孵育后的反应溶液滴加在基于CsPbBr3纳米材料的光电化学生物传感器上反应的时间为5-10分钟时,测得的光电流较理想。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已,并不用于限制本发明,对于本领域的技术人员来说,本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内,所作的任何修改、等同替换、改进等,均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (12)
1.一种基于钙钛矿纳米材料的光电化学生物传感器检测ALP的应用,其特征在于包括以下步骤:
S1、将不同浓度ALP溶液与底物Na3SPO3进行孵育,得到ALP孵育溶液,将ALP孵育溶液滴加在基于CsPbBr3纳米材料的光电化学生物传感器的修饰电极上反应,得到反应后的修饰电极,在PBS缓冲溶液中设置偏电压和输出电流,将反应后的修饰电极作为工作电极,在光照条件下通过电化学工作站检测ALP的光电信号强度,以光电流强度为纵坐标,ALP的浓度为横坐标,建立标准曲线;
S2、血清中ALP的检测:加入血清与底物Na3SPO3进行孵育,得到血清孵育溶液,将血清孵育溶液滴加在基于CsPbBr3纳米材料的光电化学生物传感器的修饰电极,测得光电流强度,将光电流强度代入到S1构建的标准曲线,即得血清中ALP的浓度。
2.根据权利要求1所述的基于钙钛矿纳米材料的光电化学生物传感器检测ALP的应用,其特征在于,S1和S2中孵育的温度均为30-40℃,孵育的时间均为1~10小时。
3.根据权利要求1所述的基于钙钛矿纳米材料的光电化学生物传感器检测ALP的应用,其特征在于, S1和S2中孵育的温度为35-38℃,孵育的时间为6~10小时。
4.根据权利要求1所述的基于钙钛矿纳米材料的光电化学生物传感器检测ALP的应用,其特征在于,S1和S2中底物Na3SPO3的浓度为10 ~ 80 mmol/L。
5.根据权利要求1所述的基于钙钛矿纳米材料的光电化学生物传感器检测ALP的应用,其特征在于,S1和S2中底物Na3SPO3的浓度为50 ~ 80 mmol/L。
6.根据权利要求1所述的基于钙钛矿纳米材料的光电化学生物传感器检测ALP的应用,其特征在于,将孵育后的反应溶液滴加在基于CsPbBr3纳米材料的光电化学生物传感器上反应的时间为3-10分钟。
7.根据权利要求1所述的基于钙钛矿纳米材料的光电化学生物传感器检测ALP的应用,其特征在于,将孵育后的反应溶液滴加在基于CsPbBr3纳米材料的光电化学生物传感器上反应的时间为5-10分钟。
8.根据权利要求1所述的基于钙钛矿纳米材料的光电化学生物传感器检测ALP的应用,其特征在于,S1和S2中偏电压为-0.4~-0.1 V,输出电流为10~20A。
9.根据权利要求1所述的基于钙钛矿纳米材料的光电化学生物传感器检测ALP的应用,其特征在于, S1和S2中偏电压为-0.4~-0.3 V,输出电流为10~15A。
10.根据权利要求1所述的基于钙钛矿纳米材料的光电化学生物传感器检测ALP的应用,其特征在于,S2中血清的体积为50~200μL。
11.根据权利要求1所述的基于钙钛矿纳米材料的光电化学生物传感器检测ALP的应用,其特征在于,S2中血清的体积为100~200μL。
12.根据权利要求1所述的基于钙钛矿纳米材料的光电化学生物传感器检测ALP的应用,其特征在于,S1和S2中滴加的孵育后的反应溶液的体积为10-30μL。
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