CN115851875A - 小rna文库测序过程中去除接头自连产物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明为小RNA文库测序过程中去除接头自连产物的方法，公开了一种去除测序文库构建过程中的接头自连产物的方法。具体而言，提供了一种利用DNA‑RNA‑DNA:cDNA杂合链和DNA:cDNA双链来选择性切割的方法，所述方法包括混合DNA内切酶和所述DNA‑RNA‑DNA:cDNA杂合链和DNA:cDNA双链的步骤：其中，DNA‑RNA‑DNA:cDNA杂合链中的酶切位点位于RNA:cDNA配对区，DNA:cDNA双链中的酶切位点位于DNA:cDNA配对区；DNA内切酶可以识别DNA:cDNA双链中的酶切位点并进行切割；任选地，所述DNA‑RNA‑DNA:cDNA杂合链产生于RNA测序文库的构建过程中；任选地，所述DNA为RNA测序文库构建过程中使用的5’接头和3’接头。

Description

小RNA文库测序过程中去除接头自连产物的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别是基因测序领域。具体地，本发明涉及去除测序文库构建过程中的接头自连产物的方法。更具体地，本发明涉及利用内切酶去除测序文库构建过程中的接头自连产物的方法，基于小RNA样本构建测序文库的方法，构建小RNA测序文库的试剂盒和确定小RNA分子的序列信息的方法。

背景技术

小RNA是生物体内的一大类调控分子，包括miRNA、siRNA、piRNA、snRNA、snoRNA、srRNA等，它们在生物体内发挥着重要的调控作用。近些年已有一些研究成功地将小RNA的谱系作为特定疾病诊断的标志物。未来小RNA的检测将会在疾病的早期诊断、分型和个体化检测治疗中得到广泛地应用。常用的小RNA定量检测技术包括深度测序技术、芯片技术和qRT-PCR技术。后两者需要合成特异性探针，因此只能检测已知种类的小RNA。高通量测序技术因其具有通量高、灵敏度高、无需任何预先的序列信息以及二级结构信息、可以发现新的小RNA分子等优点在小RNA研究领域得到广泛应用。对于小RNA深度测序的文库构建方法主要是两步接头连接反转录法。该方法适用于包括打断的长转录本RNA在内的任何适合连接反应的RNA深度测序文库的构建，例如小RNA测序、CLIP测序、RIP测序、GRO测序等。

小RNA测序由于技术上的限制，现有小RNA或RNA片段的文库构建方法仍较难对微量样品(低于100ng总RNA或1ng小RNA)中的小RNA进行检测。小RNA或RNA片段的文库构建的步骤首先需要在小RNA 3’端连接上3’接头序列，接着在小RNA或RNA片段的5’端连接上5’接头序列。这部分产物经过反转录和PCR扩增就能获得用于深度测序的文库。在连接反应过程中，过量的5’接头和3’接头间会发生连接反应，产生无用的副产物。对于起始量非常低的小RNA或RNA片段的进行连接反应，5’和3’接头间连接产生的副产物占绝大多数，严重阻碍文库的后续PCR扩增。

在目前已有的解决方案中，Trilink公司的CleanTag技术利用在5’接头和3’接头的末端加上特殊修饰，使得接头自连产物无法被逆转录酶有效延伸而去除接头自连污染，而中国科学院上海生命科学研究所的吴立刚等通过Cas9酶切割接头自连产物的方法来去除接头污染，对应测序方法为CAS-seq。这些方法中，CleanTag技术成本高且只能部分去除污染，而CAS-seq技术由于利用了Cas9酶，可能会存在脱靶效应，切割小RNA插入片段，而且成本高，实验操作复杂。

因此，如何简单高效的去除5’和3’接头间连接产生的副产物是实现微量小RNA或RNA片段建库的关键。

发明内容

具体地，本发明通过如下各项技术方案解决现有技术中存在的上述技术问题。

1.一种针对含DNA样本的样本处理方法，所述DNA样本中包含DNA-RNA-DNA:cDNA杂合链和DNA:cDNA双链，

所述方法包括在所述DNA样本中加入DNA内切酶，所述DNA内切酶能够有效切割含有其识别位点序列的双链DNA，而对含有所述识别位点序列的RNA:cDNA杂合链具有低活性，

所述DNA-RNA-DNA:cDNA杂合链的RNA:cDNA配对区含有所述识别位点序列，所述DNA:cDNA双链的DNA:cDNA配对区含有所述识别位点序列，

可选地，所述DNA-RNA-DNA:cDNA杂合链产生于RNA测序文库的构建过程中；

可选地，DNA:cDNA双链中的DNA为RNA测序文库构建过程中使用的5’端接头和3’端接头形成的自连产物。

2.一种去除RNA测序文库构建时产生的5’接头和3’接头自连产物的方法，或构建RNA测序文库的方法，其包括以下步骤：

(1)在样本RNA分子的3’末端连接所述3’端接头；

(2)在所述连接有3’端接头的样本RNA分子的5’末端连接所述5’端接头；

(3)利用延伸引物，基于所述连接有3’端接头和5’端接头的样本RNA分子，利用延伸酶获得延伸产物；

(4)使用DNA内切酶对所述延伸产物进行酶切处理，去除体系中的所述接头自连产物；

(5)进行PCR扩增，所得扩增产物即为测序文库。

其中，所述5’端接头和所述3’端接头均含有所述DNA内切酶的识别位点的部分序列，在形成所述自连产物时，在所述5’端接头和所述3’端接头的连接处形成完整的识别位点序列；

可选地，所述样本RNA分子为小RNA分子；优选地，所述小RNA分子的长度为15-200nt；

可选地，所述样本RNA分子的含量为≥50pg；优选地，所述样本RNA分子的量为50pg-20ng。

3.根据项1或2所述的方法，其中，所述DNA内切酶对于含有其识别位点序列的RNA:cDNA杂合链的切割效率为对于相应DNA:cDNA双链的切割效率的至多1/10，至多1/100，至多1/1000，至多1/10000，所述DNA:cDNA双链含有相同序列的cDNA以及与其互补的DNA；优选的，所述DNA内切酶对于含有其识别位点序列的RNA:cDNA杂合链无活性，或无能够检测到的活性。

4.根据项2或3所述的方法，其中，步骤(1)的连接反应使用截断型T4RNA连接酶2作为连接酶。

5.根据项1-4中任一项所述的方法，其中，所述3’端接头和所述5’端接头分别带有所述DNA内切酶的识别位点序列30％以上，优选40％以上，更优选50％的序列，且在形成所述自连产物时，在所述5’端接头和所述3’端接头的连接处形成完整的识别位点序列。

6.根据项2-5中任一项所述的方法，其中，步骤(3)中使用的延伸酶是逆转录酶或Bst聚合酶。

7.根据项1-6中任一项所述的方法，其中，所述DNA内切酶是双链DNA内切酶；优选地，所述DNA内切酶选自下组：AatII，BamHI，BsaBI，BsrFI，DraI，HphI，NdeI，PauI，PvuII，SwaI，Acc65I，BanI，BsaHI，BsrGI，DraIII，Hpy188I，NgoMI，RsaI，TaqI，AccI，BanII，BsaI，BsrI，DrdI，Hpy188III，NheI，RsrII，TfiI，AciI，BbsI，BsaJi，BssHI，BssHII，EaeI，Hpy99I，NlaIII，SacI，TliI，AclI，BbvCI，BsaWI，BssKI，EagI，HpyCH4III，NlaIV，SacII，TseI，AcuI，BbvI，BsaXI，BssSI，EarI，HpyCH4IV，NotI，SalI，Tsp45I，AfeI，BccI，BseRI，BstAPI，EciI，HpyCH4V，NruI，SapI，Tsp509I，AflII，BceAI，BseYI，BstBI，EcoNI，KasI，NsiI，Sau3AI，TspRI，AflIII，BcgI，BsgI，BstEII，EcoO109I，KpnI，NspI，Sau96I，Tth111I，AgeI，BciVI，BsiEI，BstF5I，EcoRI，MboI，PacI，SbfI，XbaI，AhdI，BclI，BsiHKAI，BstNI，EcoRV，MboII，PaeR7I，ScaI，XcmI，AleI，BfaI，BsiWI，BstUI，FatI，MfeI，PciI，ScrFI，XhoI，AluI，BfrBI，BsiI，BstXI，FauI，MluI，PflFI，SexAI，XmaI，AlwI，BfuAI，BsmAI，BstYI，Fnu4HI，MlyI，PflMI，SfaNI，XmnI，AlwNI，BfuCI，BsmBI，BstZ17I，FseI，MmeI，PhoI，SfcI，ZraI，ApaI，BglI，BsmFI，Bsu36I，FspI，MnlI，PleI，SfoI，ApaLI，BglII，BsmI，BtgI，HaeII，MscI，PmeI，SgrAI，Nb.BbvCI，ApeKI，BlpI，BsoBI，BtgZI，HaeIII，MseI，PmlI，SmaI，Nt.BbvCI，ApoI，Bme1580I，Bsp1286I，BtsI，HgaI，MsiI，PpuMI，SmlI，Nb.BsmI，AscI，BmgBI，BspCNI，Cac8I，HhaI，MspA1I，PshAI，SnaBI，Nt.BstNBI，AseI，BmrI，BspDI，ClaI，HincII，MspI，PsiI，SpeI，AsiSI，BmtI，BspEI，CspCI，HindIII，MwoI，PspGI，SphI，AvaI，BpmI，BspHI，CviAII，HinfI，NaeI，PspOMI，SspI，AvaII，Bpu10I，BspMI，DdeI，HinP1I，NarI，PspXI，StuI，AvrII，BpuEI，BsrBI，DpnI，HpaI，NciI，PstI，StyD4I，BaeI，BsaAI，BsrDI，DpnII，HpaII，NcoI，PvuI，或StyI，

优选地，所述双链DNA内切酶不是AvaII，AvrII，BanI，HaeIII，HinfI，TaqI或别的在某些条件下可以切割DNA/RNA杂合链的酶。

8.一种用于构建小RNA测序文库的试剂盒，其包括：

RNA 3’末端连接模块，其包含3’端接头且用于将所述3’端接头连接在RNA的3’末端；

RNA 5’末端连接模块，其包含5’端接头且用于将所述5’端接头连接在RNA的5’末端；

延伸模块，其包含延伸酶且用于对连接有所述3’端接头和5’端接头的RNA分子进行延伸；

酶切模块，包含DNA内切酶且用于去除所述延伸模块的产物内的接头自连产物；

扩增模块，包含DNA扩增所需的酶且用于对所述酶切模块的产物进行扩增，得到所述测序文库，

优选地，延伸模块和酶切模块可以整合为一个模块。

9.根据项8所述的试剂盒，其中，所述RNA 3’末端连接模块包括连接酶，优选地所述连接酶为截断型T4 RNA连接酶2或其点突变体；和/或所述RNA 5’末端连接模块包括连接酶，优选地所述连接酶为T4 RNA连接酶1。

10.根据项8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述延伸模块中包含MMLV逆转录酶和/或Taq酶。

11.根据项8-10中任一项所述的方法，其中，所述DNA内切酶是双链DNA内切酶；优选地，所述DNA内切酶选自下组：AatII，BamHI，BsaBI，BsrFI，DraI，HphI，NdeI，PauI，PvuII，SwaI，Acc65I，BanI，BsaHI，BsrGI，DraIII，Hpy188I，NgoMI，RsaI，TaqI，AccI，BanII，BsaI，BsrI，DrdI，Hpy188III，NheI，RsrII，TfiI，AciI，BbsI，BsaJi，BssHI，BssHII，EaeI，Hpy99I，NlaIII，SacI，TliI，AclI，BbvCI，BsaWI，BssKI，EagI，HpyCH4III，NlaIV，SacII，TseI，AcuI，BbvI，BsaXI，BssSI，EarI，HpyCH4IV，NotI，SalI，Tsp45I，AfeI，BccI，BseRI，BstAPI，EciI，HpyCH4V，NruI，SapI，Tsp509I，AflII，BceAI，BseYI，BstBI，EcoNI，KasI，NsiI，Sau3AI，TspRI，AflIII，BcgI，BsgI，BstEII，EcoO109I，KpnI，NspI，Sau96I，Tth111I，AgeI，BciVI，BsiEI，BstF5I，EcoRI，MboI，PacI，SbfI，XbaI，AhdI，BclI，BsiHKAI，BstNI，EcoRV，MboII，PaeR7I，ScaI，XcmI，AleI，BfaI，BsiWI，BstUI，FatI，MfeI，PciI，ScrFI，XhoI，AluI，BfrBI，BsiI，BstXI，FauI，MluI，PflFI，SexAI，XmaI，AlwI，BfuAI，BsmAI，BstYI，Fnu4HI，MlyI，PflMI，SfaNI，XmnI，AlwNI，BfuCI，BsmBI，BstZ17I，FseI，MmeI，PhoI，SfcI，ZraI，ApaI，BglI，BsmFI，Bsu36I，FspI，MnlI，PleI，SfoI，ApaLI，BglII，BsmI，BtgI，HaeII，MscI，PmeI，SgrAI，Nb.BbvCI，ApeKI，BlpI，BsoBI，BtgZI，HaeIII，MseI，PmlI，SmaI，Nt.BbvCI，ApoI，Bme1580I，Bsp1286I，BtsI，HgaI，MsiI，PpuMI，SmlI，Nb.BsmI，AscI，BmgBI，BspCNI，Cac8I，HhaI，MspA1I，PshAI，SnaBI，Nt.BstNBI，AseI，BmrI，BspDI，ClaI，HincII，MspI，PsiI，SpeI，AsiSI，BmtI，BspEI，CspCI，HindIII，MwoI，PspGI，SphI，AvaI，BpmI，BspHI，CviAII，HinfI，NaeI，PspOMI，SspI，AvaII，Bpu10I，BspMI，DdeI，HinP1I，NarI，PspXI，StuI，AvrII，BpuEI，BsrBI，DpnI，HpaI，NciI，PstI，StyD4I，BaeI，BsaAI，BsrDI，DpnII，HpaII，NcoI，PvuI，或StyI，

优选地，所述双链DNA内切酶不是AvaII，AvrII，BanI，HaeIII，HinfI，TaqI或别的在某些条件下可以切割DNA/RNA杂合链的酶。

12.根据项1-7中任一项所述的方法或根据项8-11中任一项所述的试剂盒在构建RNA测序文库中的用途；

优选地，所述RNA测序文库选自下组：血浆小RNA测序文库，CLIP文库，RIP文库，MeRIP文库和GRO文库。

13.一种确定小RNA分子的序列信息的方法，其包括：

基于小RNA分子样本，通过根据项2所述的方法构建测序文库；对所述测序文库进行测序，以获得测序结果；以及基于所述测序结果，确定小RNA分子的序列信息。

14.一种确定小RNA分子的序列信息的系统，其包括：

根据项8-11中任一项所述的试剂盒；

测序装置，其用于对通过所述试剂盒对样本构建的所述测序文库进行测序，获得所述样本的测序结果；和

分析装置，对所述测序结果进行分析，以获得小RNA分子的序列信息。

附图说明

本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：

图1显示了根据本发明一个实施例的去除测序文库构建过程中的接头自连产物的方法和小RNA建库方法的流程示意图；

图2显示了根据本发明的一个实施例构建的小RNA文库的片段大小质检图。其中接头自连长度为144nt，投入量为0.5ng小RNA。

发明详述

除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同含义。

如果不同的DNA片段之间、DNA片段与RNA片段之间的核苷酸序列能够互补且可以复性而形成新的双螺旋结构，则这种按照互补碱基配对而使不完全互补的两条多核苷酸链相互结合的过程称为“分子杂交”或“分子杂合”。所得到的多核苷酸双链称为杂交链或杂合链。本发明中的杂合链为DNA-RNA-DNA:cDNA杂合链，其中包含RNA:cDNA配对区。本发明中的DNA:cDNA双链是指一条DNA单链与一条cDNA单链按照互补碱基配对而形成的多核苷酸双链。在一个实施方案中，所述DNA-RNA-DNA:cDNA杂合链产生于RNA测序文库的构建过程中。在一个实施方案中，所述DNA:cDNA双链的DNA为RNA测序文库构建过程中使用的5’端接头和3’端接头形成的自连产物。

“核酸内切酶”是指可水解核酸分子链内部的磷酸二酯键而生成寡核苷酸的酶，可分为分解DNA的DNA内切酶和分解RNA的RNA内切酶。DNA内切酶包括“DNA限制性内切酶”，后者也简称为限制性内切酶或限制酶，是指识别特定的核苷酸序列，并在每条核酸链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类活性蛋白质。限制性内切酶分布极广，几乎在所有细菌的属、种中都发现至少一种限制性核酸内切酶。常见的DNA内切酶包括但不限于如下表所列的DNA内切酶：

表I.常见的DNA内切酶

它们每一种都能识别一段特定的序列并以特定的方式在此段序列中将DNA序列切开。DNA内切酶能够识别、且在此进行切割的此段特定序列也称为“识别位点”或“酶切位点”。只要DNA序列上存在某种DNA内切酶的识别位点，就可以使用所述酶对该DNA序列进行切割从而进行各种分子生物学操作。

“基因测序”是指通过一定的技术分析手段分析DNA或者RNA片段中的碱基序列的排列方式，从而为生物学和医学的研究发现提供支持。

“测序文库”是指用于基因测序的某物种或样本中全部DNA或RNA随机片段的集合。

DNA(即，脱氧核糖核酸)是指生物细胞内携带有合成RNA和蛋白质所必需的遗传信息的一种核酸，是生物体发育和正常运作必不可少的生物大分子。DNA是由脱氧核糖核苷酸组成的大分子聚合物。脱氧核糖核苷酸由碱基、脱氧核糖和磷酸构成。其中碱基有4种，分别是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和胸腺嘧啶(T)。RNA(即，核糖核酸)是指生物细胞、部分病毒、类病毒内的遗传信息载体。RNA是由核糖核苷酸组成的大分子聚合物。核糖核苷酸由碱基、核糖和磷酸构成。其中碱基有4种，分别是腺嘌呤(A)、鸟嘌呤(G)、胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。

DNA或RNA的5’端是指DNA或RNA单链带有游离5’-羟基或其磷酸酯的末端。DNA或RNA的3’端DNA或RNA单链带有游离3’-羟基或其磷酸酯的末端。cDNA在本发明中指在体外经过逆转录后与RNA互补的DNA链。

小RNA在本发明中指长度为15-300nt，优选15-200nt，更优选20-200nt的RNA分子，其包括：(1)微RNA(即，miRNA)，它是指一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，是发夹结构的约70-90个碱基大小的单链RNA前体经过Dicer酶加工后生成。其在细胞内具有多种重要的调节作用。每个miRNA可以有多个靶基因，而几个miRNAs也可以调节同一个基因；(2)小干扰RNA(即，siRNA，有时也称作短干扰RNA或沉默RNA)，它是指一类长度约20-25个核苷酸的双链RNA，它主要参与RNA干扰现象，以带有专一性的方式调节基因的表达；(3)与piwi相互作用的RNA(即，piRNA)，它是指一类长度约29-30个核苷酸的小型RNA分子。它主要存在于哺乳动物的生殖细胞和干细胞中，通过与Piwi亚家族蛋白结合形成piRNA复合物(piRC)来调控基因沉默途径；(4)核小RNA(即，snRNA)，它是指真核生物转录后加工过程中RNA剪接体的主要成分，参与mRNA前体的加工过程；(5)核仁小RNA(即，snoRNA)，它是指由内含子编码，分布于真核生物细胞核仁的小分子非编码RNA，具有保守的结构元件。已证明反义snoRNA指导rRNA核糖甲基化；(6)小核糖体RNA(即，srRNA)，它是指主要分布在rDNA的编码区并和正义链相匹配的小型核糖体RNA。已发现srRNA可以和AGO蛋白特异性结合，而且其表达谱和糖尿病存在相关性。

获得小RNA样本，所述小RNA样本可用于建立RNA测序文库。本发明的小RNA可使用Qubit microRNA测定试剂盒、用Qubit 4.0荧光定量仪来进行定量。本发明的小RNA样本的量可为≥50pg，优选为50pg-20ng。

将小RNA样本与3’端DNA接头连接是指将3’端DNA接头连接在小RNA样本分子的3’端。本发明的3’端DNA接头是指任何能够与RNA分子的3’末端连接的短的核酸序列。在一个实施方案中，该接头为通过截断型的T4 RNA连接酶2或其点突变体与RNA分子的3’末端连接的短的核酸序列。所述酶只能够将腺苷化的单链DNA或RNA接头连接到RNA分子的3’末端，从而避免了小RNA分子间的自连。在一个实施方案中，该接头在5’端具有腺苷化修饰，且在3’端具有双脱氧修饰，从而防止了连接反应中接头的自连。在一个实施方案中，该接头的5’端带有本发明的DNA内切酶的识别位点的部分序列，优选识别位点的至少30％、优选至少40％，更优选50％(一半)的序列。所述接头的序列可为例如，5’-rAPP-CGCAAGTCGGAGGCCAAG-3’ddC。在一个实施方案中，所述连接可在包含如下的反应体系中进行：小RNA分子样本，3’端DNA接头，截断型T4 RNA连接酶2。在一个实施方案中，所述反应体系还包含连接酶反应缓冲液，PEG8000和RNA酶抑制剂。在一个实施方案中，小RNA分子样本经过热变性处理(例如70℃反应2分钟)。在一个实施方案中，所述连接可在如下反应条件下进行：16℃过夜或者25℃反应2小时或者37℃反应30分钟。

将连接有3’端DNA接头的小RNA分子与5’端DNA接头连接是指将5’端DNA接头连接在连接有3’端DNA接头的小RNA样本分子的5’端。本发明的5’端DNA接头是指任何能够与小RNA样本分子的5’末端连接的短的核酸序列，优选为通过T4 RNA连接酶1与RNA分子的5’末端连接的短的核酸序列。在一个实施方案中，该接头的3’端带有本发明的DNA内切酶的识别位点的部分序列，优选识别位点的至少30％、优选至少40％，更优选50％(另一半)的序列。所述接头的序列可为例如，5’-GCTACGATCCGACTTNNNNGCG-3’。在一个实施方案中，所述连接可在包含如下的反应体系中进行：连接有3’端DNA接头的小RNA样本分子，5’端DNA接头，T4RNA连接酶1。在一个实施方案中，所述反应体系还包含连接酶反应缓冲液和PEG8000。在一个实施方案中，所述连接可在如下反应条件下进行：16℃过夜或者25℃反应2小时。

延伸反应在本发明中是指以上步的连接产物为模板，利用根据3’端DNA接头已知序列设计的延伸引物进行延伸，获得延伸产物的过程。所述延伸引物是根据本发明的3’端DNA接头的已知序列设计的序列，其可为例如5’-TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCG-3’(其中以粗体表示的序列为3’端DNA接头序列的反向互补序列)。在一个实施方案中，所述延伸可在包含如下的反应体系中进行：上步得到的连接产物，延伸引物、逆转录酶和DNA聚合酶。在一个实施方案中，所述反应体系还包含延伸反应缓冲液。在一个实施方案中，所述连接可在如下反应条件下进行：42℃反应30分钟。

酶切处理在本发明是指使用DNA内切酶对延伸产物进行切割的过程。酶切的反应条件因使用的不同DNA内切酶而变化，通常为20-60℃，优选28-50℃，更优选37-42℃。在一个实施方案中，使用的DNA内切酶是PauI，采用的酶切条件为将待切割序列与酶在37℃温育30分钟。

二链合成是指利用二链合成引物，基于本发明的酶切产物模板，合成二链合成产物。所述二链合成引物是根据本发明的5’端DNA接头序列已知序列设计的序列，其可为例如5’-CAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3’(其中以粗体表示的序列为5’端DNA接头序列的5’序列)。在一个实施方案中，所述二链合成可在包含如下的反应体系中进行：酶切产物，二链合成引物和DNA聚合酶。在一个实施方案中，所述反应体系还包含DNA聚合酶缓冲液。在一个实施方案中，所述连接可在如下反应条件下进行：98℃2分钟、60℃30秒和72℃5分钟。

第二代高通量测序是指采用微珠或高密度芯片一边合成一边测序的技术，其优点是测序通量高，可一次获得数G数据。

本发明中的扩增或PCR扩增是指：将含有所需扩增分析序列的靶DNA双链在高温处理一段时间形成两个寡聚核苷酸单链(解链)，加入一对根据已知DNA序列由人工合成的与所扩增的DNA两端邻近序列互补的寡聚核苷酸片段作为扩增引物，即正向和反向引物。引物在较低温度与两个DNA单链接触一段时间以分别互补结合(退火)，并在较高温度和DNA聚合酶的作用下，以靶DNA单链为模板，以4种单核苷酸(dNTPs)为原料，按5’到3’方向延伸一段时间，从而合成新的DNA双链(延伸)。然后又开始再一次的解链-退火-延伸的循环，从而将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍或更多(即，扩增产物)。在一个实施方案中，本发明的扩增是利用PCR引物，基于本发明的二链合成得到的产物，合成PCR反应产物。PCR引物是根据本发明的延伸引物和二链合成引物的已知序列设计的序列，在一个实施方案中，所述正反向引物中可存在一定个数的随机碱基用于在高通量测序中区分不同的样本。所述正反向引物分别可为：例如正向引物5’-GCATGGCGACCTTATCAGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG-3’(其中以粗体表示的序列为延伸引物的5’序列)和反向引物5’-Pho-CTCTCAGTACGTCAGCAGTTNNNNNNNNNNCAACTCCTTGGCTCACAGAAC-3’(其中以粗体表示的序列为二链合成引物的5’序列)，其中10个随机碱基用于在高通量测序中区分不同的样本。在一个实施方案中，所述PCR扩增可在包含如下的反应体系中进行：二链合成得到的产物，正向引物，反向引物和DNA聚合酶。在一个实施方案中，所述DNA聚合酶是高保真DNA聚合酶。在一个实施方案中，所述反应体系还包含DNA聚合酶缓冲液和dNTPs。在一个实施方案中，所述连接可在如下反应条件下进行：98℃2分钟；然后是98℃15秒、60℃30秒和72℃30秒的15-30个、优选15-20个、更优选15-18个循环；然后72℃反应5分钟。在一个实施方案中，用磁珠法对PCR产物进行纯化。

为了解决上述现有技术中存在的技术问题，本发明的目的，在于提出一种去除测序文库构建过程中的接头自连产物的方法。该方法通过利用DNA内切酶的底物选择性，可以特异性切割接头自连产物，从而实现了简单高效的对微量样本的小RNA或RNA片段进行建库。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

根据本发明的一个方面，提供了一种去除测序文库构建过程中的接头自连产物的方法，所述方法包括：将DNA内切酶和所述DNA-RNA-DNA:cDNA杂合链和DNA:cDNA双链混合的步骤：其中，DNA-RNA-DNA:cDNA杂合链中的酶切位点位于RNA:cDNA配对区，DNA:cDNA双链中的酶切位点位于DNA:cDNA配对区；DNA内切酶可以识别DNA:cDNA双链中的酶切位点并进行切割。

在一个实施方案中，所述DNA内切酶能够有效切割含有其识别位点序列的双链DNA，而对含有所述识别位点序列的RNA:cDNA杂合链具有低活性。在一个实施方案中，所述DNA-RNA-DNA:cDNA杂合链产生于测序文库的构建过程中。在一个实施方案中，所述DNA:cDNA双链的DNA为RNA测序文库构建过程中使用的5’端接头和3’端接头形成的自连产物。在一个实施方案中，所述5’端接头和所述3’端接头均含有所述识别位点的部分序列，在形成所述接头自连产物时，在所述5’端接头和所述3’端接头的连接处形成完整的识别位点序列。在一个实施方案中，所述测序文库为RNA测序文库。在一个实施方案中，所述3’端接头和所述5’端接头分别带有所述核酸内切酶的识别位点序列的30％以上，优选40％以上，更优选50％的序列，且在形成所述自连产物时，在所述5’端接头和所述3’端接头的连接处形成完整的识别位点序列。在一个实施方案中，所述DNA内切酶可选自表I所列的DNA内切酶。

根据本发明的另一方面，提供了一种去除RNA测序文库构建时产生的5’和3’接头自连产物的方法，或构建RNA测序文库的方法，其包括以下步骤：

(1)在RNA分子的3’末端连接3’端DNA接头；

(2)在连接有3’端接头的RNA分子的5’末端连接5’端DNA接头；

(3)利用延伸引物，基于所述连接有3’端接头和5’端接头的RNA分子，利用延伸酶获得延伸产物；

(4)使用DNA内切酶对延伸产物进行酶切处理，去除体系中的接头自连产物；

(5)利用根据所述接头的序列涉及引物进行PCR扩增，所得扩增产物即为测序文库。

在一个实施方案中，所述3’端接头和5’端接头各自包含所述核酸内切酶的识别位点的部分序列，例如识别位点序列的30％以上，优选40％以上，更优选50％的序列，且在形成所述接头自连产物时，在所述5’端接头和所述3’端接头的连接处形成完整的识别位点序列。在一个实施方案中，所述RNA分子的量为≥50pg。在一个实施方案中，所述RNA分子的量为50pg-20ng。在一个实施方案中，所述RNA分子为小RNA分子。在一个实施方案中，所述小RNA分子的长度为15-200nt。在一个实施方案中，所述DNA内切酶对于含有其识别位点序列的RNA:cDNA杂合链的切割效率为对于相应DNA:cDNA双链的切割效率的至多1/10，至多1/100，至多1/1000，至多1/10000，所述DNA:cDNA双链含有相同序列的cDNA以及与其互补的DNA；优选的，所述DNA内切酶对于含有其识别位点序列的RNA:cDNA杂合链无活性，或无能够检测到的活性。在一个实施方案中，步骤(1)的连接反应使用截断型T4 RNA连接酶2作为连接酶。在一个实施方案中，步骤(3)中使用延伸酶是逆转录酶或Bst聚合酶。在一个实施方案中，步骤(4)中使用的DNA内切酶是双链DNA内切酶。在一个实施方案中，所述DNA内切酶可选自表I所列的DNA内切酶。在一个实施方案中，所述DNA内切酶不是AvaII，AvrII，BanI，HaeIII，HinfI，TaqI或别的在某些条件下可以切割DNA/RNA杂合链的酶。

利用根据本发明实施例的去除测序文库构建时产生的5’和3’接头自连副产物的方法，能够有效地构建微量样本中的小RNA分子的测序文库，特别是能够有效地构建血浆样本、单细胞样本等微量样本的小RNA测序文库。特别的，本发明所提出的建库流程可选择使用一管式反应流程，进一步减少了建库投入量，并减少由于纯化过程带来的测序结果偏差。

根据本发明的另一方面，提供了一种构建小RNA测序文库的试剂盒。根据本发明的实施例，该试剂盒包括：RNA 3’末端连接模块，所述连接模块包含3’端接头且用于将3’端接头连接在RNA的3’末端；RNA 5’末端连接模块，所述连接模块包含5’端接头且用于将5’端接头连接在连接有所述3’端接头的RNA的5’末端；延伸模块，所述延伸模块包含延伸酶且用于对连接有所述3’端接头和5’端接头的RNA分子进行延伸；酶切模块，所述酶切模块包含DNA内切酶且用于去除所述延伸模块的产物中的接头自连产物。扩增模块，所述扩增模块包含DNA扩增所需的酶且用于对酶切产物进行扩增，得到最终文库。在一个实施方案中，延伸模块和酶切模块可整合为一个模块，即延伸+酶切模块。

在一个实施方案中，所述RNA 3’末端连接模块包括连接酶，优选地所述连接酶为截断型T4 RNA连接酶2或其点突变体。在一个实施方案中，所述RNA 5’末端连接模块包括连接酶，优选地所述连接酶为T4 RNA连接酶1。在一个实施方案中，所述延伸酶为MMLV逆转录酶和/或Taq酶。在一个实施方案中，所述DNA内切酶是是双链DNA内切酶。在一个实施方案中，所述DNA内切酶可选自表I所列的DNA内切酶。在一个实施方案中，所述DNA内切酶不是AvaII，AvrII，BanI，HaeIII，HinfI，TaqI或别的在某些条件下可以切割DNA/RNA杂合链的酶。

利用根据本发明实施例用于构建小RNA分子的测序文库的试剂盒，能够利用微量小RNA样本进行测序文库的构建，样品损失少，序列信息保持完整，且能应用于血浆提取的小RNA样本和单细胞中的小RNA样本的文库构建。

所述小RNA样本可以从任何途径获得，样本的来源包括但不限于生物体、器官、组织、细胞和细胞器等。

根据本发明的另一方面，提供了根据本发明所述的方法或根据本发明所述的试剂盒在构建RNA测序文库中的用途。在一个实施方案中，所述RNA测序文库选自下组：血浆小RNA测序文库、CLIP文库、RIP文库、MeRIP文库和GRO文库。

根据本发明的又一方面，提供了一种确定小RNA分子的序列信息的方法，根据本发明的实施例，该方法包括：基于小RNA样本，根据本发明所述的方法构建测序文库；对所述测序文库进行测序，以获得测序结果；以及基于所述测序结果，确定小RNA分子的序列信息。

根据本发明的又一方面，提供了一种确定小RNA分子序列信息的系统。根据本发明实施例，该系统其包括：测序文库构建装置，所述测序文库构建装置为本发明所述的试剂盒；测序装置，所述测序装置用于对通过所述试剂盒对所述样本构建的测序文库进行测序，获得所述样本的测序结果；和分析装置，对所述样本的测序结果进行分析，以便获得所述小RNA分子的序列信息。

采用根据本发明实施例的确定小RNA分子的序列信息的系统，能够灵敏、准确、高效地确定微量样本中的小RNA的序列信息。

本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。

实施例

下面详细描述本发明的实施例，所述实施例的示例在附图中示出。本领域的技术人员将会理解，下面通过参考附图描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。实施例中未注明具体技术条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或者仪器未注明生产厂商者，都是可以通过商业市场购买获得的常规产品，例如NEB等公司。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种去除RNA文库构建过程中的接头自连的方法和一种构建小RNA文库的方法。参考图1，根据本发明的实施例，该方法可以包括以下步骤：

1.用于建库的小RNA样本首先用Qubit 4.0来进行定量，使用Qubit microRNA测定试剂盒来进行定量。对于建库的小RNA部分可用50pg-20ng作为起始量。

2.将小RNA分子与3’端DNA接头连接。

2-1将小RNA分子样本与3’端DNA接头混合，70℃反应2分钟，然后使用连接酶在连接反应体系中进行连接。

2-2 3’端DNA接头的序列是5’-rAPP-CGCAAGTCGGAGGCCAAG-3’ddC，该接头序列的5’端具有腺苷化修饰，3’端具有双脱氧修饰，防止了连接反应中接头的自连。同时在接头的5’端具有PauI酶的一半识别序列，用于后续的接头自连去除过程。

2-3该连接反应的连接酶是截断型的T4 RNA连接酶2以及其各种点突变体，该酶只能够将腺苷化的单链DNA或RNA接头连接到RNA分子的3’末端，从而避免了小RNA分子间的自连。

2-4连接反应体系包括：2-1得到的热变性产物，3’端DNA接头，截断型T4 RNA连接酶2，连接酶反应缓冲液，PEG8000和RNA酶抑制剂。

2-5反应条件为16℃过夜或者25℃反应2小时或者37℃反应30分钟。

3.将连接有3’端接头的小RNA分子与5’端DNA接头连接。

3-1将连接有3’端接头的小RNA分子样本与5’端DNA接头混合，70℃反应2分钟，然后在连接反应体系中进行连接。

3-2 5’端DNA接头序列为5’-GCTACGATCCGACTTNNNNGCG-3’，该接头的3’端带有PauI酶的另一半识别序列，用于后续的接头自连去除过程。

3-3该连接反应体系包括：2-5得到的连接产物，5’端DNA接头，PEG8000，连接酶缓冲液和T4 RNA连接酶1。

3-4反应条件为16℃过夜或者25℃反应2小时。

4.延伸反应。

4-1以3-4得到的连接产物为模板，利用根据3’端DNA接头已知序列设计的延伸引物进行延伸，获得延伸产物。

4-2延伸引物序列为：5’-TTGTCTTCCTAAGACCGCTTGGCCTCCGACTTGCG-3’

4-3延伸反应体系包括：3-4得到的连接产物，延伸引物，延伸反应缓冲液，逆转录酶和DNA聚合酶。

4-4反应条件：42℃反应30分钟。

5.酶切处理。

5-1对4-4得到的延伸产物进行酶切处理，去除接头自连。

5-2使用的DNA内切酶为PauI。

5-3反应条件为37℃反应30分钟。

6.二链合成反应。

6-1以5-3得到的酶切处理后的产物为模板，利用根据延伸得到的产物已知序列设计的二链合成引物合成二链合成产物。

6-2二链合成引物序列为：5’-CAACTCCTTGGCTCACAGAACGACATGGCTACGATCCGACTT-3’

6-3反应体系包括：酶切后产物，二链合成引物，DNA聚合酶缓冲液和DNA聚合酶

6-4反应条件为：98℃变性2分钟；60℃，30秒；72℃反应5分钟。

7.PCR扩增。

7-1以6-4得到的二链合成产物为模板，利用根据延伸引物和二链合成引物已知序列设计的正反向引物，进行PCR扩增，所述正反向引物中可引入一定个数的随机碱基用于在高通量测序中区分不同的样本。

7-2合成正向和反向PCR引物

正向引物序列：

5’-GCATGGCGACCTTATCAGNNNNNNNNNNTTGTCTTCCTAAGACCGCTTGG-3’

反向引物序列：

5’-Pho-CTCTCAGTACGTCAGCAGTTNNNNNNNNNNCAACTCCTTGGCTCACAGAAC-3’

其中的10个随机碱基用于在高通量测序中区分不同的样本。

7-3反应体系包括：6-4得到的二链合成产物，正反向PCR引物，高保真DNA聚合酶，DNA聚合酶缓冲液。

7-4反应条件：98℃变性2分钟；98℃15秒，60℃30秒，72℃30秒。该过程循环反应15-18个循环。然后72℃反应5分钟。

8.磁珠法进行PCR产物纯化，得到目的产物，回收得到文库。

以上内容是结合具体的实施方式对本发明所做的进一步详细说明，不能认定本发明的具体实施只局限于这些说明。本领域的技术人员可以理解：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。

序列表

<110> 杭州诺辉健康科技有限公司

<120> 小RNA文库测序过程中去除接头自连产物的方法

<130> C21P0234

<140> 202111126861.0

<141> 2021-09-26

<160> 6

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

cgcaagtcgg aggccaag 18

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

gctacgatcc gacttnnnng cg 22

<210> 3

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ttgtcttcct aagaccgctt ggcctccgac ttgcg 35

<210> 4

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

caactccttg gctcacagaa cgacatggct acgatccgac tt 42

<210> 5

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcatggcgac cttatcagnn nnnnnnnntt gtcttcctaa gaccgcttgg 50

<210> 6

<211> 51

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

ctctcagtac gtcagcagtt nnnnnnnnnn caactccttg gctcacagaa c 51

Claims (14)

1.一种针对含DNA样本的样本处理方法，所述DNA样本中包含DNA-RNA-DNA:cDNA杂合链和DNA:cDNA双链，

所述方法包括在所述DNA样本中加入DNA内切酶，所述DNA内切酶能够有效切割含有其识别位点序列的双链DNA，而对含有所述识别位点序列的RNA:cDNA杂合链具有低活性，

所述DNA-RNA-DNA:cDNA杂合链的RNA:cDNA配对区含有所述识别位点序列，所述DNA:cDNA双链的DNA:cDNA配对区含有所述识别位点序列，

可选地，所述DNA-RNA-DNA:cDNA杂合链产生于RNA测序文库的构建过程中；

可选地，DNA:cDNA双链中的DNA为RNA测序文库构建过程中使用的5’端接头和3’端接头形成的自连产物。

2.一种去除RNA测序文库构建时产生的5’接头和3’接头自连产物的方法，或构建RNA测序文库的方法，其包括以下步骤：

(1)在样本RNA分子的3’末端连接所述3’端接头；

(2)在所述连接有3’端接头的样本RNA分子的5’末端连接所述5’端接头；

(3)利用延伸引物，基于所述连接有3’端接头和5’端接头的样本RNA分子，利用延伸酶获得延伸产物；

(4)使用DNA内切酶对所述延伸产物进行酶切处理，去除体系中的所述接头自连产物；

(5)进行PCR扩增，所得扩增产物即为测序文库。

其中，所述5’端接头和所述3’端接头均含有所述DNA内切酶的识别位点的部分序列，在形成所述自连产物时，在所述5’端接头和所述3’端接头的连接处形成完整的识别位点序列；

可选地，所述样本RNA分子为小RNA分子；优选地，所述小RNA分子的长度为15-200nt；

可选地，所述样本RNA分子的含量为≥50pg；优选地，所述样本RNA分子的量为50pg-20ng。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述DNA内切酶对于含有其识别位点序列的RNA:cDNA杂合链的切割效率为对于相应DNA:cDNA双链的切割效率的至多1/10，至多1/100，至多1/1000，至多1/10000，所述DNA:cDNA双链含有相同序列的cDNA以及与其互补的DNA；优选的，所述DNA内切酶对于含有其识别位点序列的RNA:cDNA杂合链无活性，或无能够检测到的活性。

4.根据权利要求2或3所述的方法，其中，步骤(1)的连接反应使用截断型T4 RNA连接酶2作为连接酶。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中，所述3’端接头和所述5’端接头分别带有所述DNA内切酶的识别位点序列30％以上，优选40％以上，更优选50％的序列，且在形成所述自连产物时，在所述5’端接头和所述3’端接头的连接处形成完整的识别位点序列。

6.根据权利要求2-5中任一项所述的方法，其中，步骤(3)中使用的延伸酶是逆转录酶或Bst聚合酶。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中，所述DNA内切酶是双链DNA内切酶；优选地，所述DNA内切酶选自下组：AatII，BamHI，BsaBI，BsrFI，DraI，HphI，NdeI，PauI，PvuII，SwaI，Acc65I，BanI，BsaHI，BsrGI，DraIII，Hpy188I，NgoMI，RsaI，TaqI，AccI，BanII，BsaI，BsrI，DrdI，Hpy188III，NheI，RsrII，TfiI，AciI，BbsI，BsaJi，BssHI，BssHII，EaeI，Hpy99I，NlaIII，SacI，TliI，AclI，BbvCI，BsaWI，BssKI，EagI，HpyCH4III，NlaIV，SacII，TseI，AcuI，BbvI，BsaXI，BssSI，EarI，HpyCH4IV，NotI，SalI，Tsp45I，AfeI，BccI，BseRI，BstAPI，EciI，HpyCH4V，NruI，SapI，Tsp509I，AflII，BceAI，BseYI，BstBI，EcoNI，KasI，NsiI，Sau3AI，TspRI，AflIII，BcgI，BsgI，BstEII，EcoO109I，KpnI，NspI，Sau96I，Tth111I，AgeI，BciVI，BsiEI，BstF5I，EcoRI，MboI，PacI，SbfI，XbaI，AhdI，BclI，BsiHKAI，BstNI，EcoRV，MboII，PaeR7I，ScaI，XcmI，AleI，BfaI，BsiWI，BstUI，FatI，MfeI，PciI，ScrFI，XhoI，AluI，BfrBI，BsiI，BstXI，FauI，MluI，PflFI，SexAI，XmaI，AlwI，BfuAI，BsmAI，BstYI，Fnu4HI，MlyI，PflMI，SfaNI，XmnI，AlwNI，BfuCI，BsmBI，BstZ17I，FseI，MmeI，PhoI，SfcI，ZraI，ApaI，BglI，BsmFI，Bsu36I，FspI，MnlI，PleI，SfoI，ApaLI，BglII，BsmI，BtgI，HaeII，MscI，PmeI，SgrAI，Nb.BbvCI，ApeKI，BlpI，BsoBI，BtgZI，HaeIII，MseI，PmlI，SmaI，Nt.BbvCI，ApoI，Bme1580I，Bsp1286I，BtsI，HgaI，MsiI，PpuMI，SmlI，Nb.BsmI，AscI，BmgBI，BspCNI，Cac8I，HhaI，MspA1I，PshAI，SnaBI，Nt.BstNBI，AseI，BmrI，BspDI，ClaI，HincII，MspI，PsiI，SpeI，AsiSI，BmtI，BspEI，CspCI，HindIII，MwoI，PspGI，SphI，AvaI，BpmI，BspHI，CviAII，HinfI，NaeI，PspOMI，SspI，AvaII，Bpu10I，BspMI，DdeI，HinP1I，NarI，PspXI，StuI，AvrII，BpuEI，BsrBI，DpnI，HpaI，NciI，PstI，StyD4I，BaeI，BsaAI，BsrDI，DpnII，HpaII，NcoI，PvuI，或StyI，

优选地，所述双链DNA内切酶不是AvaII，AvrII，BanI，HaeIII，HinfI，TaqI或别的在某些条件下可以切割DNA/RNA杂合链的酶。

8.一种用于构建小RNA测序文库的试剂盒，其包括：

RNA 3’末端连接模块，其包含3’端接头且用于将所述3’端接头连接在RNA的3’末端；

RNA 5’末端连接模块，其包含5’端接头且用于将所述5’端接头连接在RNA的5’末端；

延伸模块，其包含延伸酶且用于对连接有所述3’端接头和5’端接头的RNA分子进行延伸；

酶切模块，包含DNA内切酶且用于去除所述延伸模块的产物内的接头自连产物；

扩增模块，包含DNA扩增所需的酶且用于对所述酶切模块的产物进行扩增，得到所述测序文库，

优选地，延伸模块和酶切模块可以整合为一个模块。

9.根据权利要求8所述的试剂盒，其中，所述RNA 3’末端连接模块包括连接酶，优选地所述连接酶为截断型T4 RNA连接酶2或其点突变体；和/或所述RNA5’末端连接模块包括连接酶，优选地所述连接酶为T4 RNA连接酶1。

10.根据权利要求8或9所述的试剂盒，其特征在于，所述延伸模块中包含MMLV逆转录酶和/或Taq酶。

11.根据权利要求8-10中任一项所述的方法，其中，所述DNA内切酶是双链DNA内切酶；优选地，所述DNA内切酶选自下组：AatII，BamHI，BsaBI，BsrFI，DraI，HphI，NdeI，PauI，PvuII，SwaI，Acc65I，BanI，BsaHI，BsrGI，DraIII，Hpy188I，NgoMI，RsaI，TaqI，AccI，BanII，BsaI，BsrI，DrdI，Hpy188III，NheI，RsrII，TfiI，AciI，BbsI，BsaJi，BssHI，BssHII，EaeI，Hpy99I，NlaIII，SacI，TliI，AclI，BbvCI，BsaWI，BssKI，EagI，HpyCH4III，NlaIV，SacII，TseI，AcuI，BbvI，BsaXI，BssSI，EarI，HpyCH4IV，NotI，SalI，Tsp45I，AfeI，BccI，BseRI，BstAPI，EciI，HpyCH4V，NruI，SapI，Tsp509I，AflII，BceAI，BseYI，BstBI，EcoNI，KasI，NsiI，Sau3AI，TspRI，AflIII，BcgI，BsgI，BstEII，EcoO109I，KpnI，NspI，Sau96I，Tth111I，AgeI，BciVI，BsiEI，BstF5I，EcoRI，MboI，PacI，SbfI，XbaI，AhdI，BclI，BsiHKAI，BstNI，EcoRV，MboII，PaeR7I，ScaI，XcmI，AleI，BfaI，BsiWI，BstUI，FatI，MfeI，PciI，ScrFI，XhoI，AluI，BfrBI，BsiI，BstXI，FauI，MluI，PflFI，SexAI，XmaI，AlwI，BfuAI，BsmAI，BstYI，Fnu4HI，MlyI，PflMI，SfaNI，XmnI，AlwNI，BfuCI，BsmBI，BstZ17I，FseI，MmeI，PhoI，SfcI，ZraI，ApaI，BglI，BsmFI，Bsu36I，FspI，MnlI，PleI，SfoI，ApaLI，BglII，BsmI，BtgI，HaeII，MscI，PmeI，SgrAI，Nb.BbvCI，ApeKI，BlpI，BsoBI，BtgZI，HaeIII，MseI，PmlI，SmaI，Nt.BbvCI，ApoI，Bme1580I，Bsp1286I，BtsI，HgaI，MsiI，PpuMI，SmlI，Nb.BsmI，AscI，BmgBI，BspCNI，Cac8I，HhaI，MspA1I，PshAI，SnaBI，Nt.BstNBI，AseI，BmrI，BspDI，ClaI，HincII，MspI，PsiI，SpeI，AsiSI，BmtI，BspEI，CspCI，HindIII，MwoI，PspGI，SphI，AvaI，BpmI，BspHI，CviAII，HinfI，NaeI，PspOMI，SspI，AvaII，Bpu10I，BspMI，DdeI，HinP1I，NarI，PspXI，StuI，AvrII，BpuEI，BsrBI，DpnI，HpaI，NciI，PstI，StyD4I，BaeI，BsaAI，BsrDI，DpnII，HpaII，NcoI，PvuI，或StyI，

优选地，所述双链DNA内切酶不是AvaII，AvrII，BanI，HaeIII，HinfI，TaqI或别的在某些条件下可以切割DNA/RNA杂合链的酶。

12.根据权利要求1-7中任一项所述的方法或根据权利要求8-11中任一项所述的试剂盒在构建RNA测序文库中的用途；

优选地，所述RNA测序文库选自下组：血浆小RNA测序文库，CLIP文库，RIP文库，MeRIP文库和GRO文库。

13.一种确定小RNA分子的序列信息的方法，其包括：

基于小RNA分子样本，通过根据权利要求2所述的方法构建测序文库；对所述测序文库进行测序，以获得测序结果；以及基于所述测序结果，确定小RNA分子的序列信息。

14.一种确定小RNA分子的序列信息的系统，其包括：

根据权利要求8-11中任一项所述的试剂盒；

测序装置，其用于对通过所述试剂盒对样本构建的所述测序文库进行测序，获得所述样本的测序结果；和

分析装置，对所述测序结果进行分析，以获得小RNA分子的序列信息。

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