CN115851663A - 通过复配酶系提高甜菜根渣制备糖和果胶产量的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了通过复配酶系提高甜菜根渣制备糖和果胶产量的方法，属于甜菜根渣处理及生物酶技术领域。该复配酶系由果胶甲酯酶与里氏木霉生物质降解酶系复配；果胶甲酯酶氨基酸序列如SEQIDNO：12所示；里氏木霉生物质降解酶系为里氏木霉(Trichodermareesei)h61发酵制得；里氏木霉h61保藏编号为CGMCCNo.23207；将复配酶系用于甜菜根渣的糖化处理，可有效提高酶解产物中糖和果胶的产量，进而可应用于乙醇的发酵，实现甜菜根渣的高价值利用。

Description

通过复配酶系提高甜菜根渣制备糖和果胶产量的方法

技术领域

本发明属于甜菜根渣处理及生物酶技术领域，具体涉及通过复配酶系提高甜菜根渣制备糖和果胶的方法。

背景技术

甜菜根渣是甜菜根榨汁后的废弃物，富含多糖大分子，可对其进行降解处理，以实现甜菜根渣的有效利用。由于甜菜根渣中并非仅含有一种多糖，不同的多糖相互作用会形成顽固结构，使用单一的降解酶降解效率较低；并且甜菜根渣的吸水性使其具有很高的粘性，在高固体含量下不利于工业降解。因此，需要开发能够有效降解甜菜根渣中多糖的酶系。

里氏木霉是工业生产纤维素酶使用最广泛的微生物，但由于其基因中编码降解果胶的酶较少，使其在富含果胶的材料上的应用受到限制。添加果胶酶可增强里氏木霉木质纤维素降解酶系对某些植物细胞壁材料的降解。然而，基于不同植物细胞壁中果胶组分的结构存在很大的差异，大多数研究中添加使用的商业果胶酶制剂或实验室发酵的粗酶，通常不能实现对果胶乃至其他多糖大分子组分的有效降解。

因此，具体如何提供一种针对甜菜根渣降解效果好，能够有效提高甜菜根渣制备糖和果胶产量的方法是本领域需解决的问题。

发明内容

本发明公开了通过复配酶系提高甜菜根渣制备糖和果胶产量的方法，将复配酶系用于甜菜根渣的糖化处理，可有效提高酶解产物中的糖和果胶产量，进而可应用于乙醇的发酵，实现甜菜根渣的高价值利用。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

通过复配酶系提高甜菜根渣制备糖和果胶产量的方法：

复配酶系由果胶甲酯酶与里氏木霉生物质降解酶系复配，用于甜菜根渣的糖化处理；

果胶甲酯酶氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示：

MRLLTLLSLAASVLAGSRTSAPSGSIVVAKSGGTYSTINQAISALSTTTTSTQTIFIKAGTYDEQVYIPKLAGELIIYGQTADDTSYSSNTVTITHGISLATASNDDNTATLRNYAAKSRIYNINVKNTYGQGHQALALSAYNTEQGYYGCQFIGFQDTVLAETGYQVYAKCYIEGAVDFIFGQTGNAWFHDCDIGLVTYSTGTITAQGRPSSSSSGYFVINGGTVKAAPGHTVAAGSYALGRPWTEYARVVFQKTNLSAAIKSAGWDVWSSSSPNTADVLFGEYSNTGSGASGTRASFAKKLSSAVSISSILGSGYTSWVDTSYLS；

里氏木霉生物质降解酶系为里氏木霉(Trichoderma reesei)h61发酵制得；

里氏木霉h61保藏编号为CGMCC No.23207，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏时间：2021年08月11日，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。

优选地，糖化处理时的温度为40-50℃，pH为4.8-5.6，150rpm处理24h-72h。

优选地，糖化处理时甜菜根渣在反应体系中的添加量(以甜菜根渣干重计)为80-120g/L，复配酶系的用量以每克甜菜根渣(干重)计为2.67-4mg/g。

上述方法可应用于乙醇发酵。

优选地，上述应用包括如下步骤：

(1)使用复配酶系对甜菜根渣进行糖化处理，获得酶解产物；

(2)酶解产物离心取上清，加入硫酸铵，灭菌，获得无菌酶解液；

(3)将乙醇发酵用菌接种到无菌酶解液中进行发酵。

优选地，步骤(1)中先对甜菜根渣进行灭菌处理再添加复配酶系进行糖化。

优选地，糖化处理过程中补充添加甜菜根渣。

一种甜菜根渣糖化用复配酶系，包括果胶甲酯酶和里氏木霉生物质降解酶系；

果胶甲酯酶氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；

里氏木霉生物质降解酶系为里氏木霉h61发酵制得；

里氏木霉h61保藏编号为CGMCC No.23207。

优选地，里氏木霉生物质降解酶系的制备方法如下：

(1)种子培养：

将里氏木霉h61接种于种子培养基中，30℃、200rpm培养24h-36h，获得种子液；

(2)发酵培养：

将种子液接种于发酵培养基中，30℃、200rpm培养6天，获得发酵液；

(3)发酵液取上清，得到里氏木霉生物质降解酶系。

优选地，种子培养基成分如下：

麦麸20g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖10g/L、(NH₄)₂SO₄2g/L、KH₂PO₄3g/L和MgSO₄0.5g/L。

优选地，发酵培养基成分如下：

麦麸30g/L、微晶纤维素30g/L、豆饼粉15g/L、(NH₄)₂SO₄2g/L、KH₂PO₄5g/L和MgSO₄0.5g/L。

优选地，里氏木霉h61在种子培养基中的接种浓度为10⁶个/mL。

优选地，种子液接种量为10v/v％。

综上所述，本发明将果胶甲酯酶与里氏木霉生物质降解酶系复配，用于甜菜根渣的糖化处理，果胶甲酯酶能显著提高里氏木霉生物质降解酶系对甜菜根残渣的降解效果，较短时间、较少酶用量即可使甜菜根渣降解后葡萄糖及果胶产量显著提高，为优化木质纤维素降解酶系提高对高果胶含量生物质的降解提供了参考。同时，伴随着甜菜根渣的降解，酶解后固体残渣的蛋白质含量也显著提高36.1％。

附图说明

图1所示为不同果胶降解酶聚丙烯酰胺凝胶电泳检测及酶活力测定结果；

图2所示为不同果胶降解酶在不同温度和不同pH下的活性；

图3所示为添加不同果胶降解酶对甜菜根渣糖化制备糖的不同效果；

图4所示为a)组甜菜根渣糖化处理后状态；

图5所示为a)组甜菜根渣糖化处理后上清液中葡萄糖含量；

图6所示为b)组甜菜根渣糖化处理后状态；

图7所示为b)组甜菜根渣糖化处理后上清液体积及葡萄糖、阿拉伯糖含量；

图8所示为b)组甜菜根渣经糖化、发酵后乙醇含量；

图9所示为b)组甜菜根渣糖化后固体残渣中蛋白含量；

图10所示为a)组甜菜根渣糖化后提取的果胶傅里叶变换红外光谱结果以及分子量。

具体实施方式

下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

1.甜菜根渣的制备

将含水量为91.7％的新鲜红色甜菜根(生产于中国吉林省长春市)切成碎片，与同等重量的蒸馏水混合，72℃水浴中处理1小时。挤压果汁，用蒸馏水冲洗固体残留物3次，直到果汁变为无色。

所有固体残留物在45℃下干燥，然后用搅拌器粉碎成粒度<0.5mm的粉末，即甜菜根渣。

按照Sluiter等人(Sluiter等人，2008年)的方法测定，制备的甜菜根残渣按干重计含有21.93％的葡聚糖、7.91％的阿拉伯多糖当量和6.21％的聚半乳糖醛酸。

2.菌株及质粒：

1)里氏木霉QMP尿苷营养缺陷型菌株，山东大学微生物技术国家重点实验室保藏，其构建过程为：

以里氏木霉QM9414(市售)基因组为模板，分别以pyr4-UF、pyr4-UR和pyr4-DF、pyr4-DR引物对扩增得到上游同源臂和下游同源臂片段，用重叠延伸PCR方法扩增得到敲除盒Δpyr4。将Δpyr4敲除盒转化菌株QM9414，经同源重组替换删除pyr4基因而得到QMP尿苷营养缺陷型菌株。

扩增过程使用的引物序列为：

pyr4-UF:ACACGTATGTACAGCAAGGAGCA，SEQ ID NO：1；

pyr4-UR:TCTTGCTAAATGCCTTTCTTTCGAGGCGAGGGAGTTGCTTTA，SEQ ID NO：2；

pyr4-DF:AAAGCAACTCCCTCGCCTCGAAAGAAAGGCATTTAGCAAGA，SEQ ID NO：3；

pyr4-DR:GACAAACCGATTCAGTCACATTG，SEQ ID NO：4。

2)质粒：pPcdna1质粒，山东大学微生物技术国家重点实验室保藏，其构建过程为：

将构巢曲霉的pyr4基因(核苷酸序列为SEQ ID NO：5：GCAACTTCCTCGAGAACGCGCCGCAGACAATGCTCTCTATCCTGGTGGCAGGCGTCAAGTACCCAGAGGCAGCAGCGGGCTTAGGAGCGGCCTGGGTTGTTCTCCGCACCCTCTACATGCTGGGCTATATTTATAGCGACAAGCCGAACGGCACCGGCAGGTACAATGGTTCGCTGTACTTGCTTGCGCAAGCGGGTCTTTGGGGATTGAGCGCATTTGGTGTTGCAAAGGATTTGATGTAAATGTAGTCGACATCTTAGCACAGAGGGGAGAGTTGATAAAATGTGGTCTGTTTGAATGATAGTCGGGTTCGTGACCTATATTCGTGATAGTGGAGATAGGTCTGCGCCTATCTTATCGGGCCGGAGCAAAAATTCCACCGCAGCGGGGTGAGTTTTCGTTATACAGCCATCCCACTTCCAGCTTCAAATTGTCAGTTTAATCCAGCCCAATTCAATCATTGGAGAACCGCCATCATGTCTTCGAAGTCCCACCTCCCCTACGCAATTCGCGCAACCAACCATCCCAACCCTTTAACATCTAAACTCTTCTCCATCGCCGAGGAGAAGAAAACCAACGTCACCGTCTCCGCAGACGTTACTACTTCCGCCGAGCTCCTCGATCTTGCTGACCGTACATCCTGCACCAATGCCCCTCCAGGATAACAAATAGCTGATGCGTAGTGAGTACAGGCCTAGGCCCCTATATCGCAGTTCTGAAAACCCACATCGACATCCTCACCGATCTCACCCCGTCGACCCTTTCCTCGCTCCAATCCCTCGCGACAAAGCACAACTTCCTCATCTTTGAGGACCGCAAGTTCATCGACATCGGCAACACCGTGCAAAAGCAGTACCACGGTGGCGCTCTCCGCATCTCCGAATGGGCACACATCATCAACTGCGCCATCCTGCCGGGCGAAGGGATCGTCGAGGCCCTCGCACAGACAACCAAGTCTCCTGACTTTAAAGACGCGAATCAACGAGGTCTCCTGATTCTTGCCGAGATGACGAGTAAGGGATCTCTTGCGACAGGGGAGTACACGGCACGCTCGGTTGAGTACGCGCGGAAGTATAAGGGGTTTGTGATGGGATTCGTGAGTACAAGGGCGTTGAGTGAGGTGCTGCCCGAACAGAAAGAGGAGAGCGAGGATTTTGTCGTCTTTACGACTGGGGTGAATCTGTCGGATAAGGGGGATAAGCTGGGGCAGCAGTATCAGACACCTGGGTCGGCGGTTGGGCGAGGTGCGGACTTTATCATTGCGGGTAGGGGCATCTATAAGGCGGACGATCCAGTCGAGGCGGTTCAGAGGTACCGGGAGGAAGGCTGGAAAGCTTACGAGAAAAGAGTTGGACTTTGAGTGTGAGTGGAAATGTGTAACGGTATTGACTAAAAGGG)通过酶切连接的方式插入至pUC19质粒的KpnI-EcoRI酶切位点，作为筛选正确转化子的筛选标记。

以里氏木霉QM9414基因组为模板，cdna1-F、cdna1-R引物对扩增cdna1启动子(核苷酸序列为SEQ ID NO：6：TGGTACATGGATCTCGAACTGAGAGCGTACAAGTTACATGTAGTAAATCTAGTAGATCTCGCTGAAAGCCCTCTTTCCCGGTAGAAACACCACCAGCGTCCCGTAGGACAAGATCCTGTCGATCTGAGCACATGAATTGCTTCCCTGGATCTGGCGCTGCATCTGTTTCCCCAGACAATGATGGTAGCAGCGCATGGAAGAACCCGGTTGTTCGGAATGTCCTTGTGCTAACAGTGGCATGATTTTACGTTGCGGCTCATCTCGCCTTGGCACCGGACCTCAGCAAATCTTGTCACAACAGCAATCTCAAACAGCCTCATGGTTCCCAGATTCCCTGATTCAGAACTCTAGAGCGGCAGATGTCAAACGATTCTGACCTAGTACCTTGAGCATCCCTTTCGGATCCGGCCCATGTTCTGCCTGCCCTTCTGAGCACAGCAAACAGCCCAAAAGGCGCCGGCCGATTCCTTTCCCGGGATGCTCCGGAGTGGCACCACCTCCCAAAACAAGCAACCTTGAACCCCCCCCCCAAATCAACTGAAGCGCTCTTCGCCTAACCAGCATAAGCCCCCCCCAGGATCGTTAGGCCAAGTGGTAGGGCCAGCCAATTAGCGAGCGGCCATTTGGAGGTCATGGGCGCAGAATGTCCTGACAGTGGTATGATATTGACTGCCCGGTGTGTGTGGCATCTGGCCATAATCGCAGGCTGAGGCGAGGAAGTCTCGTGAGGATGTCCCGACTTTGACATCATGAGGGAGTGAGAAACTGAAGAGAAGGAAAGCTTCGAAGGTTCGATAAGGGATGATTTGCATGGCGGGCGACAGGATGCGATGGCTCGTTGGGATACATAATGCTTGGGTTGGAAGCGATTCCAGGTCGTCTTTTTTTGGTTCATCATCACAGCATCAACAAGCAACGATACAAGCAATCCACTGAGGATTACCTCTCAACTCAACCACTTTCCAAACCATCTCAACTCCCTAAGATTCTTTCAGTGTATTATCACTAGGATTTTTCCCAAGCCGGCTTCAAAACACACAGATAAACCACCAACTCTACAACCAAAGACTTTTTGATCAATCCAACAACTTCTCTCAAC)。

以商用质粒pAN7-1为模板，使用TtrpC-F、TtrpC-R引物对扩增得到trpC的终止子。

扩增过程使用的引物序列为：

cdna1-F:ACGCCAAGCTTGCATGCTGGTACATGGATCTCGAACTG，SEQ ID NO：7；

cdna1-R:TAACGTTAAGTGGATCCTGCAGGTTGAGAGAAGTTGTTGGATTG，SEQ ID NO：8；

TtrpC-F:CAACTTCTCTCAACCTGCAGGATCCACTTAACGTTACTGAAATC，SEQ ID NO：9；

TtrpC-R:GATCCTCTAGAGTCGACAACCCAGGGCTGGTGACGGAA，SEQ ID NO：10。

使用重叠延伸PCR方法扩增得到cdna1-TtrpC片段(中间含PstI酶切位点序列)，后用一步克隆方法将其插入到pUC19质粒的PstI酶切位点处，构建得到pPcdna1质粒。

3)里氏木霉Pme菌株，中国农业科学院烟草研究所保藏，其构建过程为：

将果胶甲基酯酶Pme(GenBank登录号为EPS26592.1)编码基因片段(核苷酸序列为SEQ ID NO：11：

ATGAGACTCTTAACTTTGCTCTCGTTGGCGGCCTCGGTGCTGGCAGGAAGTCGCACGTCGGCTCCGTCTGGTTCCATCGTGGTGGCCAAGTCTGGCGGTACCTACTCTACGATCAATCAAGCCATCTCAGCGTTGAGCACCACTACCACCTCCACCCAGACCATCTTCATCAAGGCGGGTACCTATGATGAGCAGGTGTACATTCCCAAACTCGCAGGTGAGCTGATCATCTATGGACAAACAGCAGATGACACTTCCTATTCTTCCAACACGGTCACCATCACTCATGGGATCAGCTTGGCGACGGCCAGCAACGATGACAACACCGCAACACTCCGGAACTACGCTGCCAAGTCTCGCATCTACAATATCAACGTGAAGAATACATATGGTCAGGGTCATCAGGCTCTTGCTCTCAGTGCCTACAACACTGAACAAGGCTATTATGGCTGTCAATTCATTGGATTCCAGGATACCGTCCTCGCCGAAACCGGCTACCAAGTCTACGCCAAGTGTTACATTGAAGGCGCAGTCGATTTCATCTTTGGCCAGACGGGCAACGCCTGGTTCCACGACTGTGATATCGGTCTCGTCACCTATTCAACGGGGACTATCACCGCACAAGGTCGTCCCTCCAGCTCCAGCTCGGGATACTTTGTCATCAACGGCGGCACTGTCAAAGCTGCCCCGGGTCATACGGTGGCTGCAGGAAGCTATGCGTTGGGTCGGCCCTGGACCGAGTATGCTCGAGTGGTTTTCCAGAAGACGAATCTGAGTGCGGCGATCAAGTCGGCGGGATGGGATGTGTGGTCATCTAGTTCGCCGAATACGGCGGATGTTTTGTTCGGTGAGTATTCGAACACTGGGAGCGGTGCCTCGGGGACGCGGGCTTCGTTTGCCAAGAAGTTGTCTTCGGCGGTGTCGATTAGTAGTATCCTCGGGAGTGGATATACAAGCTGGGTGGATACTAGTTATCTTTCTTGA)用一步克隆方法将其插入到pPcdna1质粒Pcdna1启动子与TrpC终止子之间，以此得到Pme的表达盒。

将该质粒转化里氏木霉QMP尿苷营养缺陷型菌株，经异源插入得到里氏木霉Pme菌株。

4)里氏木霉Pel菌株，山东中烟工业有限责任公司保藏。其构建过程参考里氏木霉Pme菌株，将果胶裂解酶Pel(GenBank登录号为EPS32299.1)编码基因片段插入至pPcdna1质粒Pcdna1启动子与TrpC终止子之间得到Pel的表达盒，后经转化异源插入里氏木霉QMP尿苷营养缺陷型菌株的基因组得到。

5)里氏木霉Pga菌株，山东中烟工业有限责任公司保藏。其构建过程参考里氏木霉Pme菌株，将聚半乳糖醛酸水解酶Pga(GenBank登录号为EPS32977.1)编码基因片段插入至pPcdna1质粒Pcdna1启动子与TrpC终止子之间得到Pel的表达盒，后经转化异源插入里氏木霉QMP尿苷营养缺陷型菌株的基因组得到。

6)里氏木霉h61菌株，已由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号CGMCC No.23207。

3.酶制备：

1)Tcel纤维素酶的制备：

于50mL种子培养基(g/L：麦麸20、蛋白胨10、葡萄糖10、(NH₄)₂SO₄2、KH₂PO₄3和MgSO₄0.5)中接种h61菌株，使其终浓度为10⁶个/mL，30℃、200rpm的旋转振动筛上培养24小时。然后将培养物以10％(v/v)接种率接种到发酵培养基(g/L：麦麸30、微晶纤维素30、豆饼粉15、(NH₄)₂SO₄2、KH₂PO₄5和MgSO₄0.5)中，并在30℃、200rpm下培养6天。收集发酵液上清液以获得粗纤维素酶Tcel。

2)Pme酶的制备

将Pme菌株分生孢子接种到100mL葡萄糖基培养基(g/L：葡萄糖10、酵母抽提物20、(NH₄)₂SO₄5、KH₂PO₄5、CaCl₂1和MgSO₄0.6)中，使其终浓度为10⁶个/mL，并在30℃、200rpm的旋转振动筛上培养36小时。

发酵液的上清液用分子量截止值为10K的MacrosepAdvance离心装置浓缩(PALL,United States)，制备得到Pme酶(氨基酸序列SEQ ID NO：12)。

3)Pme酶的检测

以牛血清白蛋白为标准，使用改良的Bradford试剂(生工生物，中国)测量蛋白质浓度。使用浓度为12.5％(w/v)的聚丙烯酰胺凝胶对蛋白质进行SDS-PAGE分析。凝胶用考马斯亮蓝R250染色(生工生物，中国)。

使用1％(w/v)的苹果果胶(Sigma-Aldrich)作为底物测定果胶甲基酯酶活性。将由90μL底物和10μL稀释酶组成的反应混合物培养15分钟，反应温度分别设定为：30、40、50、60、70、80℃；反应pH值分别设定为2.4、3、4、4.6、5、5.6、6、7、8。然后煮沸10分钟以停止反应。

释放的甲醇通过乙醇氧化酶(Sigma-Aldrich)在37℃，0.1M Tris-HCl缓冲液，pH7.5的条件下转化为甲醛，后在Nash试剂(15.4g乙酸铵，205μL酰丙酮和295μL冰醋酸，每100mL)中，甲醛与乙酰丙酮反应生成3,5-diacetyl-1,4-dihydro-2,6-dimethyl-pyridine，在412nm处读取吸光度值。

4)Pel酶及Pga的制备

参照Pme酶的制备。

5)Pel酶及Pga的检测

Pel酶活力测定：使用0.5％(w/v)的苹果果胶(Sigma-Aldrich)作为底物，2mL底物和20μL酶溶液组成的反应混合物在不同温度、不同pH条件下培养15min，然后添加3mL 0.2MHCl以停止反应。在235nm处测量上清液的吸光度。将OD235读值增加1时所需的酶量被定义为1个果胶裂解酶活性单位(U)。

Pga酶活力测定：使用1％(w/v)聚半乳糖醛酸底物溶液作为底物，1.5mL底物和0.5mL酶液，组成的反应混合物在不同温度、不同pH条件下培养15min，加入3mLDNS试剂然后置于沸水浴中煮10min，加入20ml双蒸水终止反应。混匀，540nm波长读取OD值。

结果如图1-4所示，在以葡萄糖为唯一碳源的培养基中培养36小时后，上清液中检测到相对纯净的蛋白质(图1)。0.2M柠檬酸-磷酸钠，50℃、pH 4.8下测定果胶甲酯酶、果胶裂解酶和聚半乳糖醛酸水解酶活性的测量表明，各蛋白质具有相应的活性(图1)。

对果胶甲酯酶的酶学性质进行测定，Pme的最佳温度为40-50℃。酶的活性在70℃时急剧下降(图2)。Pme在pH值分别为5.6时的活性最高。由于里氏木霉纤维素酶的典型应用条件为50℃、pH4.8，因此，将Pme酶添加到里氏木霉纤维素酶中是可行的。

4.甜菜根渣糖化及乙醇发酵

1)甜菜根渣糖化：

糖化过程中使用pH值为5.0、最终浓度为50mM的柠檬酸钠缓冲液，加入终浓度100μg/mL氯霉素以抑制细菌生长。

甜菜根渣的糖化在50mL三角瓶中进行，设置两组：

a)反应体积25mL，糖化底物甜菜根渣和蛋白添加浓度(mg/g底物)分别为80g/L、4mg/g；蛋白为质量分数95％Tcel纤维素酶+质量分数5％Pme酶、质量分数95％Tcel纤维素酶+质量分数5％Pel酶或质量分数95％Tcel纤维素酶+质量分数5％Pga酶；

b)反应体积30mL，加入80g/L的甜菜渣底物，先115℃高压灭菌30分钟处理后，添加浓度为4mg/g底物(以底物120g/L计)的蛋白量，糖化5h后，补加40g/L的甜菜渣底物；蛋白为质量分数95％Tcel纤维素酶+质量分数5％Pme酶、质量分数95％Tcel纤维素酶+质量分数5％Pel酶或质量分数95％Tcel纤维素酶+质量分数5％Pga酶；。

其中，每组还设置仅添加95％Tcel纤维素酶(3.8mg/g底物)的对照处理以及不添加蛋白的对照处理。

各处理50℃、150rpm恒温空气浴摇床上共孵育24小时。

2)乙醇发酵：

甜菜根渣的酶解产物在9391g下离心10分钟，取上清，添加终浓度2g/L的硫酸铵，然后在115℃下高压灭菌30分钟，获得无菌酶解液。

将安琪耐高温活性干酵母在30℃的酵母蛋白胨葡萄糖培养基(1％酵母浸粉，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中培养17小时，直到OD600达到3.0，然后以5％(v/v)的接种率接种到无菌酶解液中，32℃、200rpm下发酵24小时。

3)糖化及发酵产物测定：

使用DNS试剂通过葡萄糖标准曲线比色测定还原糖。如前所述(Ye等人，2017)，使用Aminex HPX-87H柱(Bio-Rad)通过HPLC测定糖和乙醇的浓度。为了计算酶水解后糖的产率(最大值的％)，使用反应的初始体积，分别对葡萄糖和阿拉伯糖应用0.9和0.88的校正因子。发酵后的固体残渣冷冻干燥，并使用凯氏定氮法估算蛋白质含量，换算系数为6.25。

甜菜根渣糖化后，用乙醇从上清液中提取果胶：将上清液与三倍体积的96％(v/v)乙醇混合，然后在4℃下培养1h。通过离心收集果胶凝胶，用三倍体积的70％(v/v)乙醇洗涤两次，然后冷冻干燥。

傅里叶变换红外光谱(FTIR)：在Nicolet iS50 FTIR光谱仪(Thermo Scientific)上使用KBr颗粒在400至4000cm^-1范围内分析提取的果胶。

分子量测定：样品用蒸馏水溶解(5mg/mL)，以12000rpm离心10min，然后通过0.22μm滤膜过滤上清液。在配备串联凝胶柱(BRT105-104-102，BoRui糖类，中国)和RI-10A差分检测器的HPLC系统(LC-10A，日本岛津)上，在40℃下通过高效凝胶渗透色谱法(HPGPC)分析溶液。使用NaCl溶液(0.05M)作为流动相，流速为0.6mL/min。使用已知分子量的葡聚糖标准品(Sigma-Aldrich)构建校准曲线。

实验结果如下：

a)组固体含量80g/L，不同的果胶降解酶组分与Tcel酶进行复配时，甜菜根渣产生的可溶性糖量不同，其中以添加果胶甲酯酶，糖的产量提升最为显著，这说明甜菜渣中果胶的降解对果胶降解酶是有选择性的，果胶甲酯酶相对于其他两种果胶降解酶组分的添加更适于整个酶系水解甜菜渣中的多糖大分子组分(图3)；甜菜根渣在加水后迅速膨胀；在糖化24小时后，仅添加Tcel的甜菜根渣仍以泥浆的形式存在，而添加复配酶系的甜菜根渣液化程度更高(图4)。葡萄糖是酶处理后上清液中的主要产物，复配酶系释放的葡萄糖比未添加Pme的情况下多31.1％(图5)。因此，Pme的加入不仅降低了浆料的粘度，而且改善了甜菜根渣中纤维素的水解。

b)组中未经酶降解的甜菜根渣在24小时后保持固体状态，添加酶后呈现不同程度的液化，添加Pme有利于液化(图6)。与单独使用Tcel相比，当向反应中添加5％Pme时，糖化24小时后的上清液体积增加了44.4％(图6、7)。复配酶系处理后上清液中的葡萄糖浓度达到22.9g/L，比单独使用Tcel的浓度高9.5％(图7)。此外，随着Pme的加入，阿拉伯糖的浓度增加了9.0％。使用复配酶系的处理，葡萄糖和阿拉伯糖的产率分别为78.3％和37.3％。因此，复配酶系处理的酶解液用于乙醇发酵产生的乙醇浓度比未添加Pme的水解液高13.6％(图8)。另一方面，复配酶系糖化后固体残渣的蛋白质含量达到18.7％(w/w)，比单独使用Tcel的蛋白质含量高36.1％(图9)。固体残渣中蛋白质含量的增加归因于多糖的降解增强，有望提高甜菜根残渣作为动物饲料的营养价值。

a)组添加Pme后，果胶得率达到13.9％，而单独添加Tcel的果胶得率仅为8.0％。FTIR光谱分析表明，通过复配酶系处理获得的果胶中的羧酸基(峰值约为1600-1630cm-1)增加，而酯羰基(1730-1760cm-1)减少(图10A)。此外，随着Pme的加入，提取果胶的分子量降低(图10B)。

本说明书中各个实施例采用递进的方式描述，每个实施例重点说明的都是与其他实施例的不同之处，各个实施例之间相同相似部分互相参见即可。

对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对上述实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

Claims (10)

1.通过复配酶系提高甜菜根渣制备糖和果胶产量的方法，其特征在于，

所述复配酶系由果胶甲酯酶与里氏木霉生物质降解酶系以质量比为5：95复配，用于甜菜根渣的糖化处理；

所述果胶甲酯酶氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；

所述里氏木霉生物质降解酶系为里氏木霉(Trichodermareesei)h61发酵制得；

里氏木霉h61保藏编号为CGMCCNo.23207。

2.根据权利要求1所述通过复配酶系提高甜菜根渣制备糖和果胶产量的方法，其特征在于，

糖化处理时的温度为40-50℃，pH为4.8-5.6，150rpm处理24h-72h。

3.权利要求1或2所述的方法应用于乙醇发酵。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，包括如下步骤：

(1)使用复配酶系对甜菜根渣进行糖化处理，获得酶解产物；

(2)酶解产物离心取上清，加入硫酸铵，灭菌，获得无菌酶解液；

(3)将乙醇发酵用菌接种到无菌酶解液中进行发酵。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，

步骤(1)中先对甜菜根渣进行灭菌处理再添加复配酶系进行糖化。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，

糖化处理过程中补充添加甜菜根渣。

7.一种甜菜根渣糖化用复配酶系，其特征在于，

包括果胶甲酯酶和里氏木霉生物质降解酶系；

所述果胶甲酯酶氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示；

所述里氏木霉生物质降解酶系为里氏木霉h61发酵制得；

里氏木霉h61保藏编号为CGMCCNo.23207。

8.根据权利要求7所述的一种甜菜根渣糖化用复配酶系，其特征在于，

所述里氏木霉生物质降解酶系的制备方法如下：

(1)种子培养：

将里氏木霉h61接种于种子培养基中，30℃、200rpm培养24h-36h，获得种子液；

(2)发酵培养：

将种子液接种于发酵培养基中，30℃、200rpm培养6天，获得发酵液；

(3)发酵液取上清，得到里氏木霉生物质降解酶系。

9.根据权利要求8所述的一种甜菜根渣糖化用复配酶系，其特征在于，

所述种子培养基成分如下：

麦麸20g/L、蛋白胨10g/L、葡萄糖10g/L、(NH₄)₂SO₄2g/L、KH₂PO₄3g/L和MgSO₄0.5g/L。

10.根据权利要求8所述的一种甜菜根渣糖化用复配酶系，其特征在于，

所述发酵培养基成分如下：

麦麸30g/L、微晶纤维素30g/L、豆饼粉15g/L、(NH₄)₂SO₄2g/L、KH₂PO₄5g/L和MgSO₄0.5g/L。

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