CN115851597A

CN115851597A - 一种将诱导多能干细胞分化为神经干细胞的方法及应用

Info

Publication number: CN115851597A
Application number: CN202211488571.5A
Authority: CN
Inventors: 邓智敏; 丰玫玫; 杨宗繁; 王利群; 李健; 曾胜; 岳峰; 黄鑫鑫
Original assignee: Hainan Susheng Biotechnology Co ltd
Current assignee: Hainan Susheng Biotechnology Co ltd
Priority date: 2022-11-25
Filing date: 2022-11-25
Publication date: 2023-03-28

Abstract

本申请公开了一种将诱导多能干细胞分化为神经干细胞的方法及应用，本方法包括以下步骤：将小分子抑制剂CHIR99021与淫羊藿苷组合添加于培养基中，获得诱导培养基，用所述诱导培养基将诱导多能干细胞诱导分化为神经干细胞。本发明仅需要一种小分子抑制剂结合淫羊藿苷即可完成诱导，该方法降低成本的同时保持高效的分化效率，还具有诱导周期短、培养基成分明确、操作过程简单等优点。

Description

一种将诱导多能干细胞分化为神经干细胞的方法及应用

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种将诱导多能干细胞分化为神经干细胞的方法及应用。

背景技术

神经干细胞具有增殖、自我更新并生成大量可以分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的功能性子代细胞的能力。利用转分化技术可实现神经干细胞(NSCs)在体外大量繁殖、自我更新及多向分化。NSCs移植入人体后，在体内微环境的影响下，可分化为相应的神经细胞，使受损的神经的功能得到修复，而且植入的NSCs可以向神经病变部位迁移和聚焦，促进宿主神经系统受损功能的恢复。神经干细胞可用于治疗神经退行性疾病和中枢神经损伤等，因此其在神经系统疾病的治疗及机制研究中日趋重要。

神经干细胞的获取途径包括胚胎干细胞转分化、诱导性多能干细胞(inducedpluripotent stem cells，iPSC)体外分化等，其中诱导性多能干细胞来源广泛，无伦理约束，是体外获得NSC的理想途径。诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)是指通过基因转染技术将转录因子(Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc)导入动物的体细胞，使体细胞发生重编程而建立的多潜能细胞。用iPS细胞已经成功培养和分化出心肌、神经、胰腺、骨等多种体细胞和不同的组织。早期主要采用基质细胞共培养法诱导iPSC分化为神经干细胞，但该方法存在如下缺陷：由于基质细胞的存在使得培养条件不清楚，诱导分化时间较长，分化不均一，分化效率低。此外，研究人员一直致力于优化小分子抑制剂的组合，例如GSK-3抑制剂CHIR99021、SB216763、CHIR98014，BMP抑制剂DMH1、DOR、LDN212854，ALK抑制剂SB431542、Gul788388等以期得到诱导时间短且分化效率高的神经干细胞，但是小分子抑制剂组合的成本较高，且分化得到的神经干细胞纯度仍然偏低。

发明内容

鉴于现有技术的不足，本发明旨在提供一种利用小分子抑制剂和淫羊藿苷组合的方法，高效地将诱导多能干细胞分化为神经干细胞，以解决现有技术中神经干细胞诱导分化成本高、周期长且不稳定等技术问题。

本发明方案包括以下主要内容：

一种将诱导多能干细胞分化为神经干细胞的方法，包括以下步骤：

将小分子抑制剂CHIR99021与淫羊藿苷组合添加于培养基中，获得诱导培养基，用所述诱导培养基将诱导多能干细胞诱导分化为神经干细胞。

本发明所述小分子抑制剂CHIR99021，CAS号1797989-42-4，分子式C₂₂H₁₉C_l3N₈，市售产品。

本发明所述淫羊藿苷(淫羊藿甙)，CAS号489-32-7，分子式C₃₃H₄₀O₁₅，市售产品。

作为优选方案：所述诱导多能干细胞由成纤维细胞转化而来。

作为优选方案：所述成纤维细胞为人包皮成纤维细胞。

目前，有多种体细胞都可被重编程为iPS细胞，如成纤维细胞、肝细胞、脐带血细胞、角质细胞等。重编程后的iPS细胞携带了原代细胞的部分基因特点，存在来源细胞的“表观遗传记忆”，因此，不同来源的iPS细胞具有分化潜能、分化效率的差异性。本发明对于将人包皮成纤维细胞来源的iPS细胞诱导分化为神经干细胞具有特别的优势，诱导分化效果显著。

诱导多能干细胞可以通过逆转录病毒、慢病毒、仙台病毒、电转以及小分子化合物等方式诱导产生。本发明采用仙台病毒方法进行重编程获得iPS细胞，该方法不引起外源基因整合，相对安全，同时诱导效率较高。

作为优选方案：所述小分子抑制剂CHIR99021在诱导培养基中的质量浓度为2μmol/L～6μmol/L，所述淫羊藿苷在诱导培养基中的质量浓度为40μg/mL～80μg/mL。

作为优选方案：所述诱导培养基中含有以下组分：谷氨酰胺、N2添加剂、B27添加剂、抗坏血酸、CHIR99021、淫羊藿苷、DMEM/F12培养基和神经细胞基础培养基。

本发明所述N2添加剂(即N2 Supplement)、B27添加剂，是无血清添加剂，市售产品。

作为优选方案：所述诱导培养基中含有以下质量浓度的组分：谷氨酰胺0.5～1.5％、N2添加剂0.5～1.5％、B27添加剂1～2％、抗坏血酸0.05～0.15mmol/L、CHIR99021 2～6μmol/L、淫羊藿苷40～80μg/mL，剩余部分是DMEM/F12培养基和神经细胞基础培养基。

作为更优选方案：所述诱导培养基中含有以下质量浓度的组分：谷氨酰胺1％、N2添加剂1％、B27添加剂2％、抗坏血酸0.1mmol/L、CHIR99021 3μmol/L、淫羊藿苷50μg/mL，剩余部分是体积比为1:1的DMEM/F12培养基和神经细胞基础培养基。

作为优选方案，所述诱导培养基中还含有15～35μg/mL野樱苷。野樱苷可加速诱导多能干细胞分化为神经干细胞。

本发明所述野樱苷，CAS号99-18-3，分子式：C₁₄H₁₇NO₆，分子量：295.29。

作为优选方案：在诱导多能干细胞融合度为20-30％时开始使用所述诱导培养基进行诱导分化。

另一方面，本发明还涉及所述的方法在制备神经干细胞制剂中的应用。

本发明所取得的有益效果：

本发明的诱导多能干细胞分化为神经干细胞的新方法，加入上述诱导培养基，诱导7天内可获得大量神经干细胞，诱导效率可达90％以上。本发明的诱导方法是一种较新颖的诱导方向，不需要多种抑制剂组合才进行诱导，只需要一种小分子抑制剂和淫羊藿苷即可进行诱导，材料简单。

CHIR99021组合淫羊藿苷进行诱导，诱导效率可达90％以上，而CHIR99021和淫羊藿苷单独作用效率低于组合。

本发明还发现，诱导培养基中进一步添加野樱苷后，可以加速诱导多能干细胞分化为神经干细胞。

附图说明

图1～图3：实验一诱导分化至第6天的神经干细胞的Nestin免疫荧光染色鉴定结果图(放大倍数:100×)，其中，图1为Nestin染色图；图2为DAPI核染图，图3为Merge共染组合图。

图4～图6：实验一诱导分化至第6天的神经干细胞的SOX1免疫荧光染色鉴定结果图(放大倍数:100×)，其中，图4为SOX1染色图；图5为DAPI核染图，图6为Merge共染组合图。

图7～图8：实验二诱导分化至第6天的神经干细胞的Nestin免疫荧光染色鉴定结果图(放大倍数:100×)，使用只含有小分子抑制剂的诱导培养基。其中，图7为Nestin染色图；图8为DAPI核染图。

图9～图11：实验二诱导分化至第6天的神经干细胞的Nestin免疫荧光染色鉴定结果图(放大倍数:100×)，使用只含有淫羊藿苷的诱导培养基。其中，图9为Nestin染色图；图10为DAPI核染图，图11为白场。

具体实施方式

为了便于技术人员理解本发明技术内容，下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

实施例1

诱导培养基：谷氨酰胺0.5％、N2添加剂0.5％、B27添加剂1％、抗坏血酸0.05mmol/L、CHIR99021 2μmol/L、淫羊藿苷40μg/mL，剩余部分是体积比为1:1的DMEM/F12(1:1)和神经细胞基础培养基Neurobasal medium。使用前进行配制，4℃可保存14天。

实施例2

诱导培养基：谷氨酰胺1.5％、N2添加剂1.5％、B27添加剂2％、抗坏血酸0.15mmol/L、CHIR99021 6μmol/L、淫羊藿苷80μg/mL，剩余部分是体积比为1:1的DMEM/F12(1:1)和神经细胞基础培养基Neurobasal medium。使用前进行配制，4℃可保存14天。

实施例3

诱导培养基：谷氨酰胺1％、N2添加剂1％、B27添加剂1.5％、抗坏血酸0.1mmol/L、CHIR99021 3μmol/L、淫羊藿苷60μg/mL，剩余部分是体积比为1:1的DMEM/F12(1:1)和神经细胞基础培养基Neurobasal medium。使用前进行配制，4℃可保存14天。

实验一CHIR99021与淫羊藿苷组合作用使诱导多能干细胞向神经干细胞分化

1)诱导多能干细胞的获得：

利用仙台病毒将四个转录因子(Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc)转入人包皮成纤维细胞，使其重编程，培养获得iPS细胞。iPS细胞呈碱性磷酸酶阳性，表达干细胞特异标志物，核型检测正常，具有多向分化潜能。

2)诱导多能干细胞的铺板：

a.Matrigel包被12孔板：提前将分装的Matrigel(基质胶)置于4℃冰盒上解冻，使用相应量预冷的DMEM/F12稀释，1000μL/孔铺12孔板，37℃至少包被1h后备用。

b.铺板前诱导多能干细胞状态良好，细胞之间排列紧密，分化细胞少。

c.弃旧培养基，加入2mL/孔的DPBS(杜氏磷酸盐缓冲液)清洗一遍细胞后。再加入1mL/孔的accutase酶，置于37℃孵育细胞3-4min，当细胞间隙变大、细胞周围变得透亮时，小心弃accutase酶，每孔加入1mL的mTeSR^TMPlus培养基，轻轻吹打成单细胞悬液后，收集细胞悬液至15mL离心管中，800-1000rpm/min，离心5min。

d.弃上清，加入mTeSRTMPlus培养基重悬，计数，以1×10⁵/孔铺12孔板。

e.铺板前弃Matrigel，先加入mTeSR^TMPlus+Y27632(10μg/mL)培养基，再加入细胞悬液(1×10⁵/孔)，每孔的培养基总量定为1mL/孔。

f.摇匀使细胞分布均匀，放于37℃、CO₂培养箱中培养，铺板后24h内进行诱导分化。

2)诱导多能干细胞的诱导分化

a.分化前细胞融合度为20％-30％，细胞呈短梭形或不规则形状贴壁，有触角。在细胞融合度为20-30％时开始替换为诱导培养基进行诱导分化，之后每日更换诱导培养基。

诱导培养基配方：谷氨酰胺1％、N2添加剂1％、B27添加剂2％、抗坏血酸0.1mmol/L、CHIR99021 3μmol/L、淫羊藿苷50μg/mL，剩余部分是体积比为1:1的DMEM/F12(1:1)和神经细胞基础培养基Neurobasal medium。

b.诱导期间，细胞不断增殖，主要呈团簇状生长，没有明显的脱落，细胞之间变得紧密，诱导至第三天，细胞出现隆起生长，诱导至第六天，细胞融合度95％-100％。

c.诱导分化至第6天，获得的神经干细胞为P0代，进行Nestin和SOX1的免疫荧光染色鉴定或者用神经干细胞消化液将诱导获得的细胞消化下来进行传代扩增再进行相应的鉴定。

3)实验结果

结果见图1～图6，结果显示获得的细胞可表达神经干细胞标记物Sox1和Nestin。

进一步研究结果显示标记物Nestin阳性细胞比例为97％，标记物Sox1阳性细胞比例为94％。

实验二小分子抑制剂和淫羊藿苷分别单独作用诱导多能干细胞向神经干细胞分化

①组1

制备最佳比例下只含有小分子抑制剂(CHIR99021)的诱导培养基，诱导培养基：谷氨酰胺1％、N2添加剂1％、B27添加剂2％、抗坏血酸0.1mmol/L、CHIR99021 3μmol/L，剩余部分是体积比为1:1的DMEM/F12(1:1)和神经细胞基础培养基Neurobasal medium。

②组2

制备最佳比例下只含有淫羊藿苷的诱导培养基，诱导培养基：谷氨酰胺1％、N2添加剂1％、B27添加剂2％、抗坏血酸0.1mmol/L、淫羊藿苷50μg/mL，剩余部分是体积比为1:1的DMEM/F12(1:1)和神经细胞基础培养基Neurobasal medium。

诱导分化步骤同实验一。

实验结果见图7～图11。结果显示虽然获得的细胞可表达神经干细胞标记物Nestin，但是阳性率显著(P＜0.01)低于实验一。

实施例4

诱导培养基：谷氨酰胺1％、N2添加剂1％、B27添加剂2％、抗坏血酸0.1mmol/L、CHIR99021 3μmol/L、淫羊藿苷50μg/mL、20μg/mL野樱苷，剩余部分是体积比为1:1的DMEM/F12(1:1)和神经细胞基础培养基Neurobasal medium。

参照前述实验一的方法进行试验，分析发现，在诱导培养基中进一步添加野樱苷后，分化诱导至第5天时，细胞融合度即达到95％-100％，且标记物Nestin阳性细胞比例达到97％以上，标记物Sox1阳性细胞比例达到94％以上。结果显示，培养基配方中的野樱苷可加速诱导多能干细胞分化为神经干细胞。

在本实施例中，野樱苷的添加量为20μg/mL，然而该添加量并非固定不变的，经试验，其在培养基中的添加量可以为15～35μg/mL。

以上所述仅为本发明的部分较佳实施例，并不用以限制本发明，本发明的保护范围并不限于上述内容。凡在本发明的精神和原则之内，所做的等同替换、改进等，均包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种将诱导多能干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：

2.根据权利要求1所述将诱导多能干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述诱导多能干细胞由成纤维细胞转化而来。

3.根据权利要求2所述将诱导多能干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述成纤维细胞为人包皮成纤维细胞。

4.根据权利要求1所述将诱导多能干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述小分子抑制剂CHIR99021在诱导培养基中的质量浓度为2μmol/L～6μmol/L，所述淫羊藿苷在诱导培养基中的质量浓度为40μg/mL～80μg/mL。

5.根据权利要求1所述将诱导多能干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述诱导培养基中含有以下组分：谷氨酰胺、N2添加剂、B27添加剂、抗坏血酸、CHIR99021、淫羊藿苷、DMEM/F12培养基和神经细胞基础培养基。

6.根据权利要求1所述将诱导多能干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述诱导培养基中含有以下质量浓度的组分：谷氨酰胺0.5～1.5％、N2添加剂0.5～1.5％、B27添加剂1～2％、抗坏血酸0.05～0.15mmol/L、CHIR99021 2～6μmol/L、淫羊藿苷40～80μg/mL，剩余部分是DMEM/F12培养基和神经细胞基础培养基。

7.根据权利要求1所述将诱导多能干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述诱导培养基中含有以下质量浓度的组分：谷氨酰胺1％、N2添加剂1％、B27添加剂2％、抗坏血酸0.1mmol/L、CHIR99021 3μmol/L、淫羊藿苷50μg/mL，剩余部分是体积比为1:1的DMEM/F12培养基和神经细胞基础培养基。

8.根据权利要求1所述将诱导多能干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，所述诱导培养基中还含有15～35μg/mL野樱苷。

9.根据权利要求1所述将诱导多能干细胞分化为神经干细胞的方法，其特征在于，在诱导多能干细胞融合度为20-30％时开始使用所述诱导培养基进行诱导分化。

10.权利要求1～9任一项所述的方法在制备神经干细胞制剂中的应用。