CN115850454A - 抗柯萨奇病毒a16型的抗体及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及抗体技术领域，具体涉及抗柯萨奇病毒A16型的抗体及其制备方法和应用。本发明提供的抗体或其抗原结合片段的重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1‑3所示，轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4‑6所示。该抗体或其抗原结合片段能够特异性结合并中和CV‑A16毒株及其抗原，具有良好的特异性，对于CV‑A16感染动物具有较好的保护作用，可用于CV‑A16疫苗抗原性和免疫原性的评价、CV‑A16感染的诊断以及CV‑A16预防或治疗药物的开发。

Description

抗柯萨奇病毒A16型的抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及抗体技术领域，具体涉及抗柯萨奇病毒A16型的抗体及其制备方法和应用。

背景技术

手足口病(hand，foot and mouth disease，HFMD)为严重影响婴幼儿健康的传染病。柯萨奇病毒A组16型(Coxsackievirus A16,CV-A16)与肠道病毒71型(EnterovirusA71,EV-A71)是造成手足口病的主要病原体。疫苗接种是控制传染病流行的主要手段，目前处于研发阶段的CV-A16疫苗大多为灭活疫苗。

抗体不仅可应用于临床诊断及治疗，还可用于疫苗和抗原检测和评价。其中，单克隆抗体具有靶向性高、低毒性等特点，广泛应用于临床诊断、治疗及疫苗评价等方面。抗原含量的定量检测是疫苗生产过程及最终成品质量控制的重要方法之一，准确快速的抗原检测方法的建立能够有效促进CV-A16疫苗的研发进程，其中CA16单克隆抗体是保证检测特异性和准确性的重要组成部分。因此，开发性能优异的CA16抗体对于CV-A16疫苗的开发和检测以及CV-A16感染的临床诊断和防治具有重要意义。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗柯萨奇病毒A16型的抗体及其制备方法和应用。

具体地，本发明提供以下技术方案：

第一方面，本发明提供抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段的重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示，和/或，所述抗体或其抗原结合片段的轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6所示。

本发明中，抗原结合片段是指包含全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，或者可与全长抗体竞争对抗原的特异性结合。

在本发明的一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示，轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6所示。

本发明提供的上述抗体或其抗原结合片段能够特异性中和CV-A16毒株，具有良好的特异性。

优选地，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示或与如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列具有至少80％同源性；和/或，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或与如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列具有至少80％同源性。

在本发明的一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。

在本发明的一些实施方式中，在具有上述重链和轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的情况下，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区具有与如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同源性的氨基酸序列，轻链可变区具有与如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的序列同源性的氨基酸序列。

在本发明的一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列在重链可变区的N端还包含信号肽序列。

在本发明的一些实施方式中，在重链可变区的N端的信号肽具有如SEQ ID NO.9所示的氨基酸序列。

在本发明的一些实施方式中，所述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列在轻链可变区的N端还包含信号肽序列。

在本发明的一些实施方式中，在轻链可变区的N端的信号肽具有如SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列。

本发明中，所述抗体可为单克隆抗体、双特异抗体或多特异抗体。

其中，所述单克隆抗体可为动物源抗体(例如鼠源抗体)、嵌合抗体或人源化抗体。

本发明中，所述抗原结合片段可为Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段或单链抗体。

在本发明的一些实施方式中，所述抗体还包含重链恒定区。

在本发明的一些实施方式中，所述抗体的重链为IgG3。

在本发明的一些实施方式中，所述重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。

在本发明的一些实施方式中，所述抗体还包含轻链恒定区。

在本发明的一些实施方式中，所述抗体的轻链为Kappa。

在本发明的一些实施方式中，所述轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示。

第二方面，本发明提供一种核酸分子，其编码所述抗体或其抗原结合片段。

根据上述抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列，本领域技术人员可获得编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列。由于密码子的简并性，编码上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子的核苷酸序列并不唯一，所有能够编码产生上述抗体或其抗原结合片段的核酸分子均在本发明的保护范围内。

在本发明的一些实施方式中，编码上述抗体的重链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，编码上述抗体的轻链可变区的核酸分子的核苷酸序列如SEQ IDNO.14所示。

在本发明的一些实施方式中，编码上述抗体的重链的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，编码上述抗体的轻链的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

在本发明的一些实施方式中，编码含有信号肽的上述抗体的重链的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，编码含有信号肽的上述抗体的轻链的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示。

第三方面，本发明提供一种生物材料，其包含以上所述的核酸分子；所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

上述表达盒可为由所述核酸分子与启动子可操作性地连接得到的重组DNA。

上述载体包括但不限于质粒载体、噬菌体载体、病毒载体、人工染色体载体等。

上述宿主细胞包括微生物细胞、动物细胞或细胞系。其中微生物细胞包括但不限于大肠杆菌、酵母等，动物细胞包括但不限于昆虫细胞，细胞系包括但不限于CHO细胞、293T细胞等。

第四方面，本发明提供一种抗体偶联物，其为将以上所述的抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。

第五方面，本发明提供所述抗体或其抗原结合片段的制备方法，所述方法包括：培养能够表达所述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞，经分离得到所述抗体或其抗原结合片段。

第六方面，本发明提供所述抗体或其抗原结合片段或所述核酸分子或所述生物材料或所述抗体偶联物的以下任一种应用：

(1)在制备用于检测柯萨奇病毒A16型在样品中的存在或其水平的产品中的应用；

(2)在制备用于诊断柯萨奇病毒A16型感染或由柯萨奇病毒A16型感染导致疾病的产品中的应用；

(3)在非诊断和治疗目的的检测柯萨奇病毒A16型在样品中的存在或其水平中的应用；

(4)在检测柯萨奇病毒A16型疫苗的抗原性或免疫原性中的应用；

(5)在柯萨奇病毒A16型疫苗生产的质量控制中的应用；

(6)在检测柯萨奇病毒A16型抗原的特异性或含量中的应用；

(7)在制备用于中和样品中的柯萨奇病毒A16型毒力的产品中的应用；

(8)在制备用于预防或治疗柯萨奇病毒A16型感染或由柯萨奇病毒A16型感染导致疾病的药物中的应用。

上述(1)、(3)所述的应用中，检测柯萨奇病毒A16型在样品中的存在是指检测样品中是否含有柯萨奇病毒A16型，检测柯萨奇病毒A16型的水平是指检测样品中柯萨奇病毒A16型的含量。

所述样品可以是来自有生命的人或动物的样品(包括血液、排泄物、口鼻分泌物等)，也可以是体外培养的细胞样品。

上述(1)、(2)所述的应用中，所述产品可为检测试剂或试剂盒。

上述(3)所述的应用中，所述样品可以是体外培养的细胞样品、疫苗等并非来自于有生命的人或动物的样品。

上述(2)、(8)所述的应用中，由柯萨奇病毒A16型感染导致疾病包括手足口病等。

上述(4)所述的应用中，免疫原性检测具体为检测柯萨奇病毒A16型疫苗引起动物机体免疫应答的性能，包括免疫动物体液免疫功能(例如：中和抗体及其水平、抗体的亲和力)的评价等。

上述(5)所述的应用中，柯萨奇病毒A16型疫苗的质量控制具体为检测柯萨奇病毒A16型疫苗中抗原质量、含量、稳定性等是否合格。

上述应用中，检测的方法可以使用酶联免疫吸附(ELISA)、化学发光免疫检测、放射免疫检测、荧光免疫检测、免疫色谱法等。本发明提供的抗体或其抗原结合片段可作为上述检测方法中的结合抗体，用于柯萨奇病毒A16型抗原的检测。

第七方面，本发明提供一种试剂盒，其包含所述抗体或其抗原结合片段或所述抗体偶联物。

上述试剂盒具有以下任一种用途：

(1)检测柯萨奇病毒A16型在样品中的存在或其水平；

(2)诊断柯萨奇病毒A16型感染或由柯萨奇病毒A16型感染导致疾病；

(3)检测柯萨奇病毒A16型疫苗的抗原性和免疫原性；

(4)柯萨奇病毒A16型疫苗生产的质量控制；

(5)检测柯萨奇病毒A16型抗原的特异性和含量。

上述试剂盒除包含所述抗体或其抗原结合片段或所述标记抗体外，还可包含携带可检测的标记的第二抗体以检测本发明的抗体或其抗原结合片段。其中，可检测的标记包括但不限于酶、放射性同位素，荧光染料等。

第八方面，本发明提供一种药物，其包含所述抗体或其抗原结合片段。

上述药物具有以下任一种用途：

(1)预防柯萨奇病毒A16型感染或由柯萨奇病毒A16型感染导致疾病；

(2)治疗柯萨奇病毒A16型感染或由柯萨奇病毒A16型感染导致疾病。

上述药物除包含所述抗体或其抗原结合片段外，还可包含药学上可接受的载体、赋形剂或其他活性成分。

第九方面，本发明提供检测柯萨奇病毒A16型在样品中的存在或其水平的方法，所述方法包括，使用本发明的抗体或其抗原结合片段检测柯萨奇病毒A16型在样品中的存在或其水平。所述方法可以用于诊断目的(样品来自有生命的人或动物)，或者非诊断目的(样品是体外培养的细胞样品，而非来自有生命的人或动物的样品)。

第十方面，本发明提供诊断柯萨奇病毒A16型感染或由柯萨奇病毒A16型感染导致疾病的方法，所述方法包括：使用本发明的抗体或其抗原结合片段诊断柯萨奇病毒A16型感染或由柯萨奇病毒A16型感染导致疾病。

第十一方面，本发明提供用于中和样品中柯萨奇病毒A16型毒力的方法，所述方法包括，将包含柯萨奇病毒A16型的样品与本发明的抗体或其抗原结合片段接触。所述方法可以用于治疗目的或非治疗目的(样品是体外培养的细胞样品，而非来自有生命的人或动物的样品)。

第十二方面，本发明提供用于预防或治疗柯萨奇病毒A16型感染由柯萨奇病毒A16型感染导致疾病(包括手足口病等)的方法，所述方法包括：给予受试者预防或治疗有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段或包含所述抗体或其抗原结合片段的药物。

第十三方面，本发明提供一种柯萨奇病毒A16型疫苗生产的质量控制方法，所述方法包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段检测疫苗中所含柯萨奇病毒A16型抗原的步骤。

本发明的有益效果至少包括以下几方面：

本发明提供的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合CV-A16毒株及其抗原，具有良好的特异性，与其他型别肠道病毒(EV-A71/CV-A6/CV-A10)抗原和VERO细胞宿主蛋白无交叉结合反应，可用于CV-A16疫苗抗原性和免疫原性的评价、CV-A16病毒抗原的特异性检测和定量分析以及CV-A16感染的诊断，进一步开发为抗原检测试剂盒，对疫苗的开发、评价及CV-A16感染的临床诊断具有重要意义。

本发明提供的抗体或其抗原结合片段能够特异性中和CV-A16毒株，浓度为0.0012μg/mL时可以中和CV-A16病毒(100CCID₅₀/0.05ml)使其不能感染细胞，与其他型别肠道病毒(EV-A71/CV-A6/CV-A10)无交叉中和反应；该抗体可以竞争抑制96％的人自然感染血清中的中和抗体成分，具有很强的免疫竞争优势，为治疗性或预防性抗体药物的开发提供了基础；该抗体对于CV-A16感染动物具有较好的保护作用，保护效果与剂量呈现效应关系。在BALB/c乳鼠模型中，16μg剂量即可对CV-A16病毒感染的BALB/c乳鼠具有治疗作用，可应用于CV-A16预防或治疗药物的开发，对于CV-A16感染及其相关疾病的治疗具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实施例1中蔗糖密度梯度离心分离后电镜鉴定的实心病毒颗粒、空心病毒颗粒电镜比较图，其中，上图为空心颗粒，下图为实心颗粒。

图2为本发明实施例3中SDS-PAGE检测结果。

图3为本发明实施例3中中和抗体效价测定结果。

图4为本发明实施例3中荧光抗体染色(物镜20×)，其中，左图为CV-A16病毒感染，右图为细胞对照。

图5为本发明实施例3中单克隆抗体与人血清的竞争抑制试验结果。

图6为本发明实施例5中酶标抗体反应曲线。

图7为本发明实施例7中的线性相关性检测结果。

图8为本发明实施例7中的专属性检测结果。

图9为本发明实施例8中的生存曲线。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明中的附图，对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1CV-A16抗原的制备

病毒培养：取1支CV-A16毒株，按1:10000稀释，接种至4个长满单层Vero细胞的10层细胞工厂，每个工厂2L，置于35℃恒温箱内培养3～5天。待病变达到100％时收获病毒液。将病毒收获液分装至离心杯，6000rpm，离心40min，收获离心上清，得到CV-A16离心上清液。

超滤浓缩：将离心上清液用300KD膜包进行超滤浓缩。用10mmol/L PBST溶液连续洗滤，洗膜2次，洗膜液与未滤过液合并为超滤产物。

蔗糖密度梯度离心：将超滤产物用10mmol/L PBS溶液(0.15mol/L NaCl)稀释3.5倍，进行梯度离心。蔗糖浓度为40％～55％。30000rpm，离心15～18h，每管35ml，收集24管。取样进行SDS-PAGE检测，根据检测结果合并空心颗粒和实心颗粒，用电镜鉴定空实心颗粒。

蔗糖密度梯度离心分离后电镜鉴定的实心病毒颗粒、空心病毒颗粒电镜比较图见图1。

实施例2单克隆抗体的制备

杂交瘤细胞株制备：将空心颗粒和实心颗粒收集后进行脱糖处理，按1:1体积合并，即得到该CV-A16病毒纯化液，免疫NIH小鼠，每型免疫5只；在0，2，4，6，8周共5针背部皮下多点免疫；免疫剂量：第1针为30μg/只，弗氏完全佐剂；第2、3针为15μg/只，弗氏不完全佐剂；第4针不加佐剂，15μg/只，尾静脉注射；采血检测：分别于免疫第2针和第3针后1周采血检测间接酶联免疫法效价，对抗体效价达到10⁴以上的小鼠进行第4针腹腔注射进行加强免疫。

细胞融合：采用电融合方法进行细胞融合。平均融合效率是用大约2500个脾细胞即能融合产生1个杂交瘤细胞。

筛选验证：用间接ELISA方法初步筛选融合细胞的上清液，挑选出对免疫原阳性的上清。对初筛阶段得到的所有阳性克隆，采用间接ELISA方法确认筛选。采用中和抗体测定的方法对确认筛选的阳性克隆进行中和活性验证。筛选具有中和活性且结合效价高的阳性克隆。

亚克隆、扩大培养和冻存：将阳性母克隆细胞转到24孔板扩大培养，收集细胞上清进行再次验证。最终采用有限稀释法对阳性母克隆进行两次亚克隆，用间接ELISA方法和中和抗体测定方法进行筛选。二次亚克隆后确认的阳性克隆株进行扩大培养，免疫小鼠制备腹水。

实施例3单克隆抗体的纯化及鉴定

经筛选获得一株单克隆抗体，将其命名为单克隆抗体24G9，单克隆抗体24G9的纯化和性能鉴定结果如下：

抗体纯化：将实施例2中免疫小鼠制备的腹水2～8℃、4000～8000r/min离心5～15分钟，取上清经采用0.45μm滤膜过滤，采用Protein A/G亲和层析方法纯化抗体，用透析方法将纯化抗体保存在磷酸盐缓冲液(PBS)中。采用Lowry法检测蛋白质含量为0.881mg/ml。对纯化后的单克隆抗体进行纯度检测和效价的测定。

SDS-PAGE纯度测定：分析显示单克隆抗体24G9的重链和轻链分别为50KD和25KD左右，如图2所示。

结合抗体效价测定：分别将EV-A71、CV-A16、CV-A6、CV-A10病毒纯化液及Vero细胞宿主蛋白用碳酸盐缓冲液稀释至1.0μg/ml，包被96孔酶标板于4℃过夜。加入终浓度为0.05％吐温20的0.01M磷酸盐缓冲液(PBST)洗3～5遍，再每孔加入150μl含有3～6％BSA的PBST于37℃封闭1～2小时，弃去封闭液并拍干。待检单克隆抗体和阴性对照(样品稀释液)按照10倍梯度法进行系列梯度稀释至10⁸倍，依次加入10^-2至10^-8稀释度样品于上述96孔板，每孔加入100μl，37℃孵育1小时，每孔加入300μl PBST，洗涤2～5遍，加入1:5000稀释的羊抗小鼠IgG-HRP，每孔100μl，于37℃孵育45分钟，PBST洗板2-5遍后，拍干，加入底物显色液于室温避光显色10～15分钟，1M H₂SO₄终止反应，于酶标仪波长450nm处读数。阴阳性临界值判定标准：应≥阴性对照均值×2.1。结果表明单抗24G9只特异性与CV-A16抗原结合，其结合抗体效价为1.28*10⁵，而不与其他型别和Vero细胞宿主蛋白结合，表明其具有良好的特异性。

中和抗体效价测定：对纯化单克隆抗体24G9(事先稀释至10μg/ml)进行1︰8稀释，加至96孔细胞培养板中，作2倍系列稀释，0.05ml/孔，再分别与100CCID₅₀(半数细胞感染量)的CV-A16/CV-A6/CV-A10/EV-A71病毒悬液于37℃中和2h；加入1～2×10⁵个/ml的RD细胞悬液，0.1ml/孔，置35±0.5℃,5％CO₂培养箱中培养7天。将能抑制50％细胞病变的最高稀释度定为中和抗体效价，并以稀释倍数的倒数表示。每次试验均设病毒回滴试验，回滴结果在32～320 CCID₅₀/孔时试验判为成立。以中和效价≥8判为中和抗体阳性，＜8则为阴性，阴性抗体的几何平均滴度(geometric mean titer，GMT)均按4计算。结果如图3所示，结果显示，单克隆抗体24G9对CV-A16毒株的中和抗体效价为1:8192(0.0012μg/ml)，对EV-A71、CV-A6、CV-A10毒株的中和抗体效价为＜1:8，表明该单克隆抗体具有很高的体外中和活性，且不与其他型别肠道病毒有交叉反应。

亚型鉴定：将纯化抗体24G9用PBST稀释至200ng/ml，50μl/孔加入预包被酶标板(厂家：Proteintech)中，再将1×羊抗鼠IgM+IgG-HRP加入样品孔中，50μl/孔，轻轻混匀，室温孵育1小时。弃去孔内液体，PBST洗板3次，拍干。加入显色液，100μl/孔。室温避光10～20min。每孔加入100μl终止液终止反应。通过酶标仪读取OD450nm，OD值最深孔对应的即为相应的亚型。单克隆抗体24G9的亚型检定结果见表1，其重链为IgG3，轻链为Kappa。

表1亚型鉴定结果

亚型分类	IgG1	IgG2a	IgG2b	IgG2c	IgG3	IgM	Kappa	Lambda
									吸光值450nm	0.0839	0.0613	0.0564	0.0528	1.8539	0.0561	0.4219	0.0557

免疫荧光染色：经CV-A16病毒感染Vero细胞24～48小时，弃去培养液，用PBS洗涤3次，再用预冷的85％丙酮固定15～20min。固定的细胞用含有3％BSA的PBS于37℃封闭1小时。将单克隆抗体24G9用含3％BSA的PBS稀释到最终浓度0.1μg/ml后与细胞进行37℃孵育1小时。用PBS清洗3遍，将FITC标记的抗鼠IgG(索莱宝，中国)稀释100倍，作为检测二抗，37℃孵育1小时。用PBS清洗3遍。用免疫荧光显微镜(奥林巴斯，中国)观察。

结果如图4所示，单克隆抗体24G9能通过免疫荧光染色法检测CV-A16病毒感染细胞。

人血清(健康人血清、人自然混合感染血清及人自然感染血清1，其中，人自然混合感染血清由16份流调人自然感染血清混合得到，16份流调人自然感染血清均经血清学检测为特异性感染CV-A16的血清样品)的竞争抑制检测：将CV-A16的抗原稀释至0.01μg/ml包被至96孔酶标板上，人血清用样品稀释液从1:4起稀释，连续2倍倍比稀释，100μL/孔，37℃孵育1h；用抗体稀释液将24G9-HRP(HRP标记的单克隆抗体24G9)进行1:200稀释，100μL/孔，37℃孵育1h；以对照孔吸光值均值作为B0，待测样品组吸光值均值作为B1，抑制率％＝(B0-B1)/B0*100。以抑制率作为纵坐标，待测血清稀释度(以log2为底取对数)作为横坐标，四参数法拟合确定反应曲线(R²依次为0.9921、0.9885、0.9169)。

结果如图5所示，健康人血清与单克隆抗体24G9无明显竞争抑制，而人自然混合感染血清和人自然感染血清与单克隆抗体24G9有明显的竞争抑制，其中人自然混合感染血清抑制率达到96％以上。证明单克隆抗体24G9所对应表位在人体感染引起的免疫应答中占有重要地位。

单克隆抗体的基因序列分离及鉴定：从生长良好的杂交瘤细胞株中用Trizol试剂提取总RNA，逆转录合成cDNA，然后PCR扩增出轻、重链可变区基因，进行氨基酸序列测定。结果显示，单克隆抗体24G9的重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示，轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.4-6所示；重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示；重链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；轻链恒定区的氨基酸序列如SEQ ID NO.12所示；编码重链可变区的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，编码轻链可变区的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；编码重链的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，编码轻链的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

实施例4 CV-A16病毒颗粒抗原的特异结合能力检测

夹心ELISA实验：用包被液碳酸盐缓冲液(CBS pH9.6)稀释抗CV-A16的兔多克隆抗体(1:1000、1：5000、1:10000、1:20000)，加入酶标板(康宁，可拆卸)，每孔100μl，2～8℃包被过夜；PBST洗涤3次，拍干；用含3％BSA的PBST封闭，每孔150μl，37℃孵育2h；PBST洗涤3次，拍干；用样品稀释液(含0.5％BSA的PBS溶液)稀释抗原标准品(空心病毒颗粒和实心病毒颗粒的混合物，由中国食品药品检定研究院制备发售国家抗原标准品(2016〃国生标字〃0031)，批号为201507001)至200U/ml作为阳性对照，样品稀释液作为阴性对照，每孔100μl，37℃孵育2h；PBST洗涤3次，拍干；用抗体稀释液(含10％FBS的PBST)稀释单克隆抗体24G9至适当浓度(1:1000、1：5000、1:10000、1:20000)，每孔100μl，于37℃作用1h；PBST洗涤3次，拍干；用抗体稀释液稀释羊抗小鼠-HRP至1:8000，每孔100μl，于37℃作用30～60min；PBST洗涤4次，拍干；每孔加入TMB底物显色液100μl，于室温下避光显色15min；每孔加入50μl1mol/L H₂SO₄。于450nm/630nm读值。结果显示，包被多抗稀释倍数为1:10000，单克隆抗体24G9作为检测抗体1:5000稀释时，P/N值最大，表明单克隆抗体24G9可以作为检测抗体用于空心病毒颗粒和实心病毒颗粒的混合物的检测(在病毒液生产实践中，制得的病毒颗粒也为空实心病毒颗粒的混合物)。

实施例5辣根过氧化物酶标记单克隆抗体

取HRP 5mg溶于0.2mol/L，pH 5.6醋酸盐缓冲液0.5ml中；加入新鲜配置的0.1mol/LNaIO₄ 0.25ml，此时溶液由原棕色变为墨绿色，置4℃放置30min，此时溶液由原棕色变为墨绿色；加入2.5％乙二醇0.5ml，室温下轻微搅拌1h，终止反应；加入10mg单克隆抗体24G9，用1.0mol/L，pH 9.5CBS，调节pH值至9.0；混匀，置4℃过夜；加入硼氢化钠溶液0.1ml，混匀，4℃放置3h；用0.15mol/L，pH 7.4PBS溶液，4℃透析过夜，换液3次；3000r/min离心30min，去除沉淀物；收集上清液即为酶标记抗体24G9。加入等体积60％甘油，小量分装，于-20℃以下保存。

酶标记抗体的效价测定：先将CV-A16抗原用0.05mol/L pH 9.6包被缓冲液稀释为10μg/ml左右，于聚苯乙烯板孔内加100μl，4℃过夜，用PBST洗涤3次。采用3％BSA-PBST封闭板子，150μl/孔，37℃孵育2小时，用PBST洗涤3次。酶标记抗体用0.5％BSA-PBST液从1:100起始稀释，2倍系列稀释至12800，分别加入反应孔中，每个稀释度二孔，每孔100μl，37℃孵育1小时后洗涤。然后加显色液，每孔100μl，室温避光10分钟。以1mol/L H₂SO₄终止反应，每孔50μl。

主要以ELISA酶标仪读取各孔OD450nm/630nm值，并以OD(450nm-630nm)为纵坐标，酶标抗体稀释度为横坐标，绘制滴定曲线。由曲线上查得OD值为1.0左右，且曲线斜率最大时的酶标抗体稀释度，即为该标记物的抗体效价。结果见表2和图6，显示酶标抗体24G9的效价为51200。

表2酶标抗体反应吸光值

稀释倍数	吸光值1	吸光值2	吸光值均值
				3200	3.816	3.793	3.804
6400	3.522	3.437	3.480
				12800	2.951	2.877	2.914
25600	2.019	1.893	1.956
				51200	1.133	1.024	1.078
102400	0.590	0.544	0.567
				204800	0.318	0.294	0.306
409600	0.156	0.144	0.150
				819200	0.074	0.062	0.068
1638400	0.025	0.021	0.023

实施例6抗原检测方法的建立

将兔多抗作为包被抗体，24G9单克隆抗体作为检测抗体建立双抗体夹心酶联免疫检测方法，用来检测CV-A16抗原。采用棋盘法进行试验，具体方法如下：将兔多抗用碳酸盐缓冲液(pH 9.6)稀释至1.6μg/ml、0.32μg/ml、0.16μg/ml、0.08μg/ml，包被96孔酶标板，100μl/孔，37℃包被2小时。用PBST洗板3次，用封闭液(0.01M PBS含3％BSA，0.5‰吐温20)封闭非特异性结合位点，150μl/孔，37℃封闭2小时。将CV-A16疫苗抗原用PBS(含0.5％BSA)稀释至100U/ml，按100μl/孔加入酶标板，同时以样品稀释液为阴性对照，同时设置空白对照，各2孔，37℃孵育2小时。PBST洗板4次，加入HRP标记的24G9单抗(1:1000、1:2000、1:5000、1:10000)，37℃孵育30～45min。PBST洗板5次，每孔加入100μl TMB显色液显色室温避光显色15min，再每孔加入50μl终止液(1M硫酸溶液)终止反应，于酶标仪450/630nm读值。检测结果见表3，P/N值最高时，包被抗体以0.08μg/ml包被，酶标抗体以1:10000稀释，该组合最优。说明以24G9为检测抗体的双抗体夹心方法，可以用于CV-A16抗原的检测。

表3棋盘法

注：P代表待测样品均值，N代表阴性对照均值。

实施例7抗原检测方法的评价

线性范围：按照已确定的抗原检测方法，将国家抗原标准品从400U/ml起，连续2倍稀释8个稀释度(400U/ml、200U/ml、100U/ml、50U/ml、25U/ml、12.5U/ml、6.25U/ml、3.125U/ml)，每个稀释度均做复孔。独立测定6次。以标准品含量取对数作为横坐标，吸光值取对数作为纵坐标，绘制标准曲线，考察6次结果的R²的一致性。以2.1*阴性均值作为阴阳性判定标准。

6次试验结果的R²＞0.98，见图7，表明该方法的线性和平行性良好，并且标准品在400～3.125U/ml内，线性良好。

专属性评价：参照实施例6方法，选择与CV-A16同为微小核糖核酸病毒科的EV-A71、CV-A6、CV-A10抗原及生产用细胞基质Vero细胞宿主蛋白分别稀释至1000ng/mL作为待测样品(以蛋白含量计算)，以及脊髓灰质炎病毒(Poliovirus，PV)抗原和CV-A16抗原样品中的可能存在的其他成分M199、DMEM、PEG6000、58％蔗糖、10mmol/L PBST(1M NaCl，0.1％吐温80)作为待测样品(简写为S)，以CV-A16抗原作为阳性对照，样品稀释液作为阴性对照，以阴性对照的2.1倍作为CUT-OFF值(简写为CO)，验证该抗原检测系统对肠道病毒检测的专属性。

结果如图8所示，该抗原评价系统具有很好的专属性，对其它型别的肠道病毒均不反应。表明本发明提供的抗原评价系统对CV-A16病毒检测具有专属特异性。

准确度：将国家标准品2000U/ml稀释至浓度为150U/ml，50U/ml，10U/ml作为高中低浓度的待测样品，单人按照实施例6重复实验6次，计算高中低三个浓度的回收率及回收率的置信区间。其中，回收率的计算方法是实测值/理论值×100％。结果表明，回收率在80～120％之间(表4)，符合可接受范围。

表4准确度-抗原回收率％

试验次数	150U/ml	50U/ml	10U/ml
				1	96.7	108.0	90.0
2	97.0	106.0	80.0
				3	80.7	120.0	100.0
4	100.7	110.0	90.0
				5	96.0	102.0	110.0
6	89.3	90.0	90.0
				均值	93.4	106.0	93.3
95％置信区间	85.8～101	95.6～116	92.3～102.9

精密度：由3名实验员在不同时间，选择150U/ml，50U/ml，10U/ml的国家抗原标准品作为待测样品，按照实施例6，独立测定3次，计算3人的CV值％。结果见表5和表6，结果表明，由3名实验员测定3次，CV值在5.43～10.44％之间；由实验员1测定3次，CV值为5.02～6.66％。表明检测方法具有良好的重复性和中间精密度。

表5中间精密度

表6重复性

抗原检测试剂盒对空实心颗粒结合能力的评价：按照已确定的抗原检测方法，分别将空心病毒颗粒和实心病毒颗粒按照一定的浓度系列稀释，按照达到相同OD值的条件下，加入空心、实心病毒蛋白的浓度比值的倒数即为该抗原检测试剂盒对空心病毒颗粒和实心病毒颗粒的反应能力的比值。

结果显示，空实心颗粒反应能力为8:1(表7)。该抗原检测试剂盒可以很好地对空心颗粒和实心颗粒进行检测。

表7对空心颗粒和实心颗粒反应能力比较

实施例8单克隆抗体24G9在小鼠体内治疗CV-A16感染实验

用编号为R00880662的CV-A16毒株(保藏编号为CGMCC No.19534，已在专利CN113564132B中公开)的致死剂量(448CCID₅₀/鼠)感染1日龄BALB/c乳鼠，包括病毒对照组在内共8组，0.5h后实验组分别注射10.0μg/g、2.0μg/g、0.4μg/g、0.08μg/g、0.016μg/g、0.0032μg/g的单克隆抗体24G9，空白对照组注射相同剂量的MEM，连续21d观察记录乳鼠的生存状态，做生存曲线。

其中，MEM对照组全部存活，病毒对照组小鼠在攻毒后9天100％死亡。结果显示(图9)：10μg组别的乳鼠可全部存活，不表现消瘦、四肢麻痹的临床症状；2μg组别的乳鼠83％存活，0.4μg和0.08μg组别的乳鼠50％存活，其余组别的乳鼠33％存活。说明单克隆抗体24G9可作为用于治疗CV-A16感染药物的候选药物。

最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

Claims (10)

1.抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQ ID NO.1-3所示，

和/或，

所述抗体或其抗原结合片段的轻链互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列如SEQID NO.4-6所示。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示或与如SEQ ID NO.7所示的氨基酸序列具有至少80％同源性；

和/或，所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示或与如SEQ ID NO.8所示的氨基酸序列具有至少80％同源性。

3.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体为单克隆抗体、双特异抗体或多特异抗体；所述抗原结合片段为Fab、Fab'、F(ab')2、Fd、Fv、dAb、互补决定区片段或单链抗体。

4.核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

5.生物材料，其特征在于，所述生物材料包含权利要求4所述的核酸分子，所述生物材料为表达盒、载体或宿主细胞。

6.一种抗体偶联物，其特征在于，其为将权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段与标记物偶联得到，所述标记物选自酶标记、生物素标记、荧光染料标记、化学发光染料标记、放射性标记中的一种或多种。

7.权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段的制备方法，其特征在于，所述方法包括：培养能够表达所述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞，经分离得到所述抗体或其抗原结合片段。

8.权利要求1～3任一项所述的抗体或其抗原结合片段或权利要求4所述的核酸分子或权利要求5所述的生物材料或权利要求6所述的抗体偶联物的以下任一种应用：

(1)在制备用于检测柯萨奇病毒A16型在样品中的存在或其水平的产品中的应用；

(2)在制备用于诊断柯萨奇病毒A16型感染或由柯萨奇病毒A16型感染导致疾病的产品中的应用；

(3)在非诊断和治疗目的的检测柯萨奇病毒A16型在样品中的存在或其水平中的应用；

(4)在检测柯萨奇病毒A16型疫苗的抗原性或免疫原性中的应用；

(5)在柯萨奇病毒A16型疫苗生产的质量控制中的应用；

(6)在检测柯萨奇病毒A16型抗原的特异性或含量中的应用；

(7)在制备用于中和样品中的柯萨奇病毒A16型毒力的产品中的应用；

(8)在制备用于预防或治疗柯萨奇病毒A16型感染或由柯萨奇病毒A16型感染导致疾病的药物中的应用。

9.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段，或包含权利要求6所述的抗体偶联物。

10.一种药物，其特征在于，所述药物包含权利要求1-3任一项所述的抗体或其抗原结合片段。

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