CN115850265A - 一种苦参药材中喹诺里西啶类生物碱的选择性富集方法 - Google Patents
一种苦参药材中喹诺里西啶类生物碱的选择性富集方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及苦参药材中喹诺里西啶类生物碱的选择性富集方法，属于中药提取物的类化合物富集技术领域。本发明首次基于FC8HL(全氟辛基固定相)色谱柱，在简单的洗脱体系下实现对苦参药材中喹诺里西啶类生物碱的有效富集及非生物碱类成分的有效去除，提供高品质的生物碱类化合物组分，该方法简便、快速、高效。因此，本发明建立了一种喹诺里西啶类生物碱的选择性富集方法，对该类化合物的进一步药效研究和物质基础研究有着重要的应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及中药提取物的类化合物富集技术领域，特别涉及一种苦参药材中喹诺里西啶类生物碱的选择性富集方法。
背景技术
苦参为豆科槐属植物苦参Sophora flavescens Ait.的干燥根，始载于《神农本草经》。《本草纲目》有“苦以味名，参以功名，槐以叶形名也”的记载。苦参味苦、性寒，具有清热燥湿、杀虫、利尿之功效，常用于热痢、便血、黄疸尿闭、赤白带下、湿疹、皮肤瘙痒等疾病。其化学成分非常复杂，包括生物碱、黄酮、苯丙素、二苯甲酰基衍生物、萜类、甾体、有机酸、脂肪酸、挥发油等多种成分。其中，喹诺里西啶类生物碱成分的活性尤为突出，现代药理研究发现其在抗病毒、抗肿瘤及抗心血管疾病等方面均表现出显著的生物活性[李振等，苦参多路径抗冠状病毒的机制探究[J]，中草药，2020，51(04)：888-894；Zhou Y J et al.，Anti-cervical cancer role of matrine oxymatrine and Sophora flavescens alkaloidgels and its mechanism[J]，J Cancer，2018，9(08)：1357-1364；Cao Y G et al.，Antiarrhythmic effects and ionic mechanisms of oxymatrine from Sophoraflavescens[J]，Phytother Res，2010，24(12)：1844-1849]。与此同时，生物碱类成分其构效关系显著，以喹诺里西啶类苦参碱型化合物为例，当D环存在双键且无羟基取代时，抗乙型肝炎病毒活性明显增强；相反，在羟化苦参碱型衍生物的D环引入C13-C14双键时，会显著抑制抗乙型肝炎病毒(HBV)活性[Ding P L et al.，(+)-12alpha-Hydroxysophocarpine,anew quinolizidine alkaloid and related anti-HBV alkaloids from Sophoraflavescens[J]，Bioorg Med Chem Lett，2006，16(5)：1231-1235]。因此，深入研究苦参喹诺里西啶类生物碱，对于进一步分析研究药效特别是构效关系具有极为重要的价值。但是，目前研究发现，苦参生物碱紫外吸收较弱，且其在苦参中的占比约2.47％-2.96％[杨梦玉等，薄层扫描法测定苦参中苦参碱的含量[J]，中国中药杂志，1999(06)：17-18]，大量的其他成分对生物碱成分的深入研究造成较大干扰，特别是黄酮类成分，其含量占比与生物碱相当，约占2.01％[卢丽萍等，苦参中总黄酮含量测定方法的研究[J]，今日药学，2011，21(03)：146-148]，且紫外吸收较强，严重影响和制约了生物碱类成分的深入研究。因此，建立喹诺里西啶类生物碱成分的选择性富集方法具有很大意义。
目前，苦参喹诺里西啶类总生物碱的富集主要采用离子交换树脂[李蓉，张锋，一种用离子交换树脂分离苦参总生物碱的方法[P]，北京：CN102172365A]，离子交换树脂方法复杂，柱效低，容易产生死吸附，且该方法需要用高比例的氯化钠盐酸溶液，样品后处理复杂。因此，发展一种简便、高效的选择性富集方法具有重要的意义。
发明内容
基于此，为了解决上述技术问题，本发明的目的是提供了一种苦参药材中喹诺里西啶类生物碱的选择性富集方法。
具体技术方案为：
FC8HL色谱柱在不含缓冲盐的体系下对碱性化合物保留极强，体系中引入缓冲盐后，对碱性化合物可实现快速洗脱。利用色谱柱此特性，从苦参药材提取物中选择性富集喹诺里西啶类生物碱成分，提供一种新的、快速、高效的富集方法，具体包括以下步骤：
苦参总提物制备：将苦参药材粉碎，加入8-15倍的50％-100％甲醇或乙醇，在50-90℃回流或超声提取，每次30-120min，提取1-5次，合并提取液，得总提取物。
类组分制备：采用FC8HL色谱柱，提取物直接上样，以纯甲醇、乙醇中的一种或两种任意比例组合洗脱5-10倍柱体积，除去非生物碱类成分；以含5-50mmol/L甲酸铵、乙酸铵或碳酸氢铵中的一种或两种组合的甲醇或乙醇体系洗脱8-20倍柱体积，得到喹诺里西啶类生物碱类化合物组分。
类组分分析：采用UPLC-Q-TOF/MS进行分析。
选用粒径1.7μm的BEH C18色谱柱；柱温为20℃-40℃；流速为0.2-0.5mL/min；以乙腈(A)、pH 8.0-10.0氨水(B)做流动相，梯度洗脱(V/V)，梯度设置为0-1min，5％A；1-10min，5％A～60％A。
正离子模式下采集，一级扫描范围m/z 150-1000，二级扫描范围m/z 50-1000，碰撞能为20、40eV，干燥气温度设为320℃，流速为8L/min，喷雾器压为35psi，鞘气温度为350℃，鞘气流速为11L/min，毛细管电压为3500V(+)，一级扫描速率为2.5spectra/s，二级扫描速率为2spectra/s，碎裂电压为135V。
与现有技术相比，本发明具有以下的有益效果：
(1)、本发明首次基于高效色谱分离材料建立了喹诺里西啶类生物碱的选择性富集方法。
(2)、本发明的富集方法选择性好，且快速、简单、高效，可以获得高品质的喹诺里西啶类生物碱样品。
(3)、本发明通过引入低浓度挥发性的缓冲盐，实现了苦参中喹诺里西啶类生物碱类组分的高效洗脱，该洗脱方法较为温和，有利于样品的后处理或质谱分析。
附图说明
图1-8为20mM甲酸铵/甲醇标准品分析谱图；
图9为20mM甲酸铵/甲醇样品富集谱图；
图10-17为30mM甲酸铵/甲醇标准品分析谱图；
图18为30mM甲酸铵/甲醇样品富集谱图；
图19为苦参生物碱富集样品质谱分析谱图。
如下具体实施方式将结合上述附图进一步说明本发明。
具体实施方式
为了能够更加详尽地了解本发明的特点与技术内容，下面对本发明的实现进行详细阐述。以下实施例中所描述的实验流程仅用于证明本发明的可行性，本发明的应用并不仅限于此。实施例中所提及的实验操作，如无特殊说明，均为常规实验方法；所提及的试剂耗材，如无特殊说明，均为常规试剂耗材。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“及/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明采用以下仪器、试剂以及标准品：
仪器：Thermo Scientific UltiMate 3000高效液相色谱仪，Agilent 6545 Q-TOF/MS质谱仪。
试剂：甲醇(色谱纯，Fisher chemical)，甲酸铵(色谱纯，Aladdin)，乙酸铵(色谱纯，Aladdin)，碳酸氢铵(色谱纯，Aladdin)，乙腈(质谱级，Fisher chemical)，氨水(质谱级，Fisher chemical)，实验用水为Milli-Q超纯水系统生成超纯水；其余试剂均为分析纯。
标准品：苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱、N-甲基金雀花碱均购自成都普思生物科技有限公司，高丽槐素、毛蕊异黄酮均购自成都普瑞法科技开发有限公司。
本发明中的喹诺里西啶类生物碱具有以下1～5结构式中之一的主体结构：
实施例一
实施方法
1、苦参标准品溶液制备：
分别称取生物碱标准品苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱、N-甲基金雀花碱，非生物碱标准品高丽槐素、毛蕊异黄酮适量，精密称定，加70％甲醇配制成浓度分别为0.224mg/mL、0.217mg/mL、0.243mg/mL、0.212mg/mL、0.223mg/mL、0.223mg/mL、0.206mg/mL、0.212mg/mL的标准品储备液，离心(10min，10000r/min)，取上清液，备用。
2、苦参样品溶液制备：
称取苦参药材5g，加入10倍量甲醇回流提取60分钟，补足失重，摇匀，滤过，定容，离心(10min，10000r/min)，取上清液，备用。
3、分析条件：
仪器：Thermo Scientific UltiMate 3000高效液相色谱仪
色谱柱：FC8HL(4.6×100mm，3.5μm)
流速：1.5mL/min
柱温：30℃
进样量：标准品80μL；样品100μL
波长采集范围：190nm-400nm
流动相：A.甲醇B.20mM甲酸铵甲醇溶液
洗脱梯度：
4、结果分析：
1)、非生物碱标准品高丽槐素及毛蕊异黄酮标准品在甲醇做流动相时，1min左右全部完成洗脱，见图1～2；
2)、生物碱标准品苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱、N-甲基金雀花碱在依次在18.5min、15.5min、17min、15min、28.5min、12min分钟左右出峰，见图3～8。
3)、苦参提取液样品在10min前，有大量非生物碱成分完成洗脱，加入缓冲盐后大量生物碱类成分完成洗脱，液相分析图谱及放大图见图9。
实施例二
实施方法
1、苦参标准品溶液制备：
同实施例1“苦参标准品溶液制备”。
2、苦参样品溶液制备
同实施例1“苦参样品溶液制备”。
3、分析条件：
仪器：Thermo Scientific UltiMate 3000高效液相色谱仪
色谱柱：FC8HL(4.6×100mm，3.5μm)
流速：1.5mL/min
柱温：30℃
进样量：标准品80μL；样品100μL
波长采集范围：190nm-400nm
流动相：A.甲醇B.30mM甲酸铵甲醇溶液
洗脱梯度：同实施例1。
4、结果分析：
1)、非生物碱标准品高丽槐素及毛蕊异黄酮标准品在甲醇做流动相时，在1min左右全部完成洗脱，见图10～11。
2)、生物碱标准品苦参碱、氧化苦参碱、槐果碱、氧化槐果碱、槐定碱、N-甲基金雀花碱在依次在16.5min、14.5min、15min、14min、23min、12min分钟左右出峰，见图12～17。
3)、样品在10min前，有大量非生物碱成分完成洗脱，10.1min后大量生物碱类成分完成洗脱，液相分析图谱及放大图，见图18。与实施例1图9相比较，出峰时间明显前移，证明增加缓冲盐浓度洗脱能力显著增强。
4)、收集10.1-30min样品，浓缩，蒸干，即为苦参生物碱样品。
实施例三
实施方法
1、分析条件：
进样量：标准品80μL；样品500μL。
2、其他方法及条件同实施例2。
实施例四
实施方法
1、苦参样品溶液制备：
称取苦参药材5g，加入15倍量50％甲醇回流提取90分钟，补足失重，摇匀，滤过，离心(10min，10000r/min)，取上清液，备用。
2、其他条件同实施例2。
实施例五
实施方法
1、苦参样品溶液制备：
称取苦参药材5g，加入10倍量80％甲醇回流提取90分钟，补足失重，摇匀，滤过，离心(10min，10000r/min)，取上清液，备用。
2、其他条件同实施例2。
实施例六
实施方法
1、样品制备：实施例2中制备的苦参生物碱富集样品，甲醇溶解，离心(10min，10000r/min)取上清液。
2、分析条件：
仪器：Agilent Q-TOF(6545)
色谱柱：Acquity UPLC BEH C18(2.1×100mm，1.7μm)
流动相：A：乙腈；B：pH 9.0氨水溶液
流速：0.4mL/min
柱温：30℃
进样量：5μL
波长采集范围：190nm-400nm
质谱参数：正离子模式下采集，一级扫描范围m/z 150-1000，二级扫描范围m/z50-1000，碰撞能为20、40eV，干燥气温度设为320℃，流速为8L/min，喷雾器压为35psi，鞘气温度为350℃，鞘气流速为11L/min，毛细管电压为3500V(+)，一级扫描速率为2.5spectra/s，二级扫描速率为2spectra/s，碎裂电压为135V。
洗脱条件：
3、结果分析：在总离子流图中提取分析苦参中所有已知生物碱类化合物的质荷比，可提出到较为丰富色谱峰信息，见图19，证明本发明所述苦参中喹诺里西啶类生物碱富集方法十分有效，解析结果见表1。
表1
以上实施例描述了本发明的基本设计原理、主要特征及优点，本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。在不脱离本发明原理的范围下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明保护的范围内。
Claims (8)
1.一种苦参药材中喹诺里西啶类生物碱的选择性富集方法，其特征在于，具体包括以下步骤：
1)苦参药材总提取物制备：称取苦参药材粉末，加入8-15倍50％-100％的甲醇或乙醇溶液，在50-90℃条件下回流或超声提取，每次30-120min，提取1-5次，合并提取液，得总提取物；
2)类组分制备：采用FC8HL色谱柱，总提取液直接上样，以纯有机相体系洗脱5-10倍柱体积，除去非生物碱类成分；以含缓冲盐的有机相体系洗脱8-20倍柱体积，洗脱总生物碱成分；
3)类组分分析：采用UPLC-Q-TOF/MS进行分析。
2.根据权利要求1所述的苦参药材中喹诺里西啶类生物碱的选择性富集方法，其特征在于，FC8HL色谱柱为一种粒径为2.5μm、3.5μm、5μm或10μm的全氟辛基固定相。
3.根据权利要求1所述的苦参药材中喹诺里西啶类生物碱的选择性富集方法，其特征在于，所述苦参药材总提取物以0.1％-5％的上样量直接上样。
4.根据权利要求1所述的苦参药材中喹诺里西啶类生物碱的选择性富集方法，其特征在于，采用纯甲醇、乙醇中的一种或两者任意比例组合作为洗脱溶剂除去总提物中的非生物碱类成分；采用含缓冲盐的甲醇、乙醇中的一种或两者任意比例组合作为总生物碱的洗脱溶剂。
5.根据权利要求4所述的苦参药材中喹诺里西啶类生物碱的选择性富集方法，其特征在于，所述总生物碱的洗脱溶剂的流动相中加入的缓冲盐为5-50mmol/L甲酸铵、乙酸铵、碳酸氢铵中的一种或两种组合。
6.根据权利要求1所述的苦参药材中喹诺里西啶类生物碱的选择性富集方法，其特征在于，所述类组分分析采用粒径为1.7μm的BEH C18作分析色谱柱；柱温为20℃-40℃；流速为0.2-0.5mL/min；以乙腈(A)、pH 8.0-10.0氨水(B)做流动相，梯度洗脱(V/V)，梯度设置为0-1min，5％A；1-10min，5％A～60％A。
7.根据权利要求1所述的苦参药材中喹诺里西啶类生物碱的选择性富集方法，其特征在于，所述类组分分析为正离子模式下采集，一级扫描范围m/z 150-1000，二级扫描范围m/z 50-1000，碰撞能为20、40eV，干燥气温度设为320℃，流速为8L/min，喷雾器压为35psi，鞘气温度为350℃，鞘气流速为11L/min，毛细管电压为3500V(+)，一级扫描速率为2.5spectra/s，二级扫描速率为2spectra/s，碎裂电压为135V。
8.根据权利要求1所述的苦参药材中喹诺里西啶类生物碱的选择性富集方法，其特征在于，所述喹诺里西啶类生物碱具有苦参碱型、鹰爪豆碱型、金雀花碱型、苦豆碱型、羽扇豆碱型5种结构式之一的主体结构。
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