CN115844007A - 一种负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒及其制备方法，本发明基于蛋白质与酚类化合物溶解度和结构的pH响应性，采用植酸酸化‑pH驱法制备玉米醇溶蛋白‑海藻糖脂‑香芹酚复合纳米颗粒，其中海藻糖脂起到了乳化剂的作用。该方法工艺简单且易于操作，提升了香芹酚的水溶性与稳定性。与传统的盐酸酸化‑pH驱动法相比，植酸酸化‑pH驱法所制得复合纳米颗粒粒径更小，分散更均匀，环境稳定性更强，且香芹酚的封装效率最高可达98.84％，为生物活性物质的稳态化提供了新途径。
Description
技术领域
本发明属于农产品加工技术领域，尤其涉及一种负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒及其制备方法。
背景技术
食源性感染一直是较为严峻的全球性公共卫生问题，包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌等在内的常见病原体是其主要诱因。香芹酚是牛至精油和百里香精油化学成分中的主要酚类单萜，可破坏目标病原体生物膜的结构和功能，且在常用剂量范围内无毒性。然而，香芹酚的实际应用却受到其水溶性差和理化稳定性低的限制，这也是大多数疏水性生物活性物质的共性问题。
为此，通常采用相关技术对香芹酚进行封装以充分发挥其生物活性，其中，生物聚合物负载体系如玉米醇溶蛋白纳米颗粒等具有成本低、安全性高、方便快捷、生物相容性好等优点。由于含有高比例的非极性氨基酸，玉米醇溶蛋白高度疏水，却可溶解于60-95％的乙醇水溶液。因此，国内外发明人已通过反溶剂沉淀法制得玉米醇溶蛋白基纳米颗粒用于封装疏水性生物活性物质，并通过稳定剂弥补玉米醇溶蛋白纳米颗粒易在等电点附近的pH(pI≈6.2)聚集并对某些极端环境环境因素敏感的缺陷。例如一种负载金丝桃苷的玉米醇溶蛋白-果胶复合纳米颗粒(授权公告号：CN 112022834B)、一种芦丁-玉米醇溶蛋白-酪蛋白酸钠复合纳米颗粒(申请公布号：CN 106727428 A)、一种负载百里香酚的玉米醇溶蛋白-阿拉伯胶-壳聚糖盐酸盐复合纳米颗粒(申请公布号：CN 114948903 A)、一种玉米醇溶蛋白-卵磷脂-姜黄素复合胶体颗粒(申请公布号：CN 106942746 A)等。这些方法是反溶剂沉淀法，使用有机溶剂可能带来的环境和安全风险。
为了规避反溶剂沉淀法使用有机溶剂可能带来的环境和安全风险，研究人员基于蛋白质分子结构的pH响应性以及疏水性生物活性物质在酸碱环境中的电荷和油水分配系数的变化开发了pH驱动法，并构建玉米醇溶蛋白基纳米颗粒用于封装疏水性生物活性物质。该方法不但具有绿色节能和操作简易的特点，且所制备的纳米颗粒性能明显优于反溶剂沉淀法。然而，盐酸作为pH驱动法中最常见的酸化剂，在溶液中释放氢离子的速度较快，这可能会导致溶液中氢离子分布不均，从而对纳米颗粒的胶体稳定性产生负面影响。
发明内容
针对上述技术问题，本发明提出了一种负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒及其制备方法，所述负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒实质是一种玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚复合纳米颗粒，该方法采用氢氧化钠-植酸调控体系pH的玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚复合纳米颗粒制备，通过提升香芹酚的水溶性和稳定性，拓宽了其应用范围，且植酸的使用进一步提升了所制备纳米颗粒的综合性能。
海藻糖脂是一种由极性二糖单元(海藻糖)和非极性单不饱和脂肪酸链组成糖脂类生物表面活性剂，由放线菌中高含量GC的革兰氏阳性菌产生，可降低界面张力并提升疏水物质的伪溶解度，但目前尚未有海藻糖脂用于稳定玉米醇溶蛋白纳米颗粒的报道。
植酸是一种环境友好的天然弱酸性物质，含有六个通过磷酸二酯键对称连接的正磷酸基团，其不但能匀速提供氢离子，还可通过化学键与蛋白质发生相互作用，可能具有替代盐酸成为新型酸化剂的潜力。
本发明的具体技术方案如下：
一种负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒制备方法，包括以下步骤：
香芹酚溶液的制备：将香芹酚加入去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为大于或等于12.0，在沸水浴中加热后，得到香芹酚溶液；
玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液的制备：将玉米醇溶蛋白和海藻糖脂共溶于去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为大于或等于12.0后，搅拌，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液；
玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液的制备：将所述香芹酚溶液和玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液混合，搅拌，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液；
玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒的制备：在搅拌状态下，将植酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为中性，继续搅拌，并离心除去不溶性物质后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒的分散液。
上述方案中，所述香芹酚溶液的制备步骤中香芹酚质量为100-400mg，去离子水体积为50mL，NaOH溶液浓度为1.0M，沸水浴时间为20min。
进一步的，所述香芹酚质量为300mg。
上述方案中，所述香芹酚溶液的制备步骤中采用NaOH溶液将pH值调节为12.0。
上述方案中，所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液的制备步骤中玉米醇溶蛋白质量为0.5g，海藻糖脂质量为0.5g，去离子水体积为50mL，NaOH溶液浓度为1.0M，搅拌速度为600rpm，搅拌时间为2h。
上述方案中，所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液的制备步骤中采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0。
上述方案中，所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液的制备步骤中，搅拌速度为600rpm，搅拌时间为30min。
上述方案中，所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒的制备步骤中，植酸溶液浓度为2％，搅拌速度为600rpm，搅拌时间为30min，离心转速为4000rpm，离心时间为10min。
上述方案中，所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒的制备步骤中，将植酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为7.0。
一种负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒，根据所述的负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒制备方法制备得到的。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明首次在玉米醇溶蛋白为纳米颗粒封装系统材料的基础上加入海藻糖脂，海藻糖脂可与玉米醇溶蛋白产生相互作用，以改善纳米颗粒的胶体分散性和稳定性。此外，香芹酚被封装于玉米醇溶蛋白-海藻糖脂纳米颗粒中后，水溶性和稳定性大大提升，可在应用于食品或药品领域时充分发挥抗菌活性。
本发明采用的基于氢氧化钠-植酸调控体系pH的制备方法，使得玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚复合纳米颗粒具有较小的粒径，较高的ζ-电位和较高的封装效率其次，植酸的使用进一步增强了玉米醇溶蛋白、海藻糖脂和香芹酚之间的相互作用强度，从而提升了复合纳米颗粒对热降解的抗性和环境稳定性；所制备的复合纳米颗粒具有良好的再分散性，表明其便于作为粉体运输和储藏。
本发明基于蛋白质与酚类化合物溶解度和结构的pH响应性，采用植酸酸化-pH驱法制备玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚复合纳米颗粒，其中海藻糖脂起到了乳化剂的作用。该方法工艺简单且易于操作，提升了香芹酚的水溶性与稳定性。与传统的盐酸酸化-pH驱动法相比，植酸酸化-pH驱法所制得复合纳米颗粒粒径更小，分散更均匀，环境稳定性更强，且香芹酚的封装效率最高可达98.84％，为生物活性物质的稳态化提供了新途径。
附图说明
图1为香芹酚浓度-吸光度值标准曲线；
图2为新鲜制备的复合纳米颗粒分散液外观；
图3为复合纳米颗粒的透射电子显微镜图像；
图4为复合纳米颗粒的归一化透射曲线和不稳定性指数，其中图4(a)为复合纳米颗粒的归一化透射曲线，图4(b)为不稳定性指数；
图5为复合纳米颗粒贮藏过程中的外观；
图6为冷冻干燥后复合纳米颗粒再分散后的外观。
具体实施方式
在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。下面结合具体的实施例，并参照数据进一步详细地描述本发明。应理解，这些实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。
一种负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒制备方法，包括以下步骤：
香芹酚溶液的制备：将一定质量的香芹酚加入一定体积的去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在沸水浴中加热一定时间后，得到香芹酚溶液；
玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液的制备：将玉米醇溶蛋白和海藻糖脂共溶于一定体积的去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0后，匀速搅拌一定时间后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液；
玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液的制备：将所述香芹酚溶液和玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液混合，匀速搅拌一定时间后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液；
玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒的制备：在匀速搅拌状态下，将植酸溶液或盐酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为7.0，继续匀速搅拌一定时间，并离心除去不溶性物质后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒分散液。
所述香芹酚溶液的制备步骤中，香芹酚质量为100-400mg，去离子水体积为50mL，NaOH溶液浓度为1.0M，沸水浴时间为20min。
所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液的制备步骤中，玉米醇溶蛋白质量为0.5g，海藻糖脂质量为0.5g，去离子水体积为50mL，NaOH溶液浓度为1.0M，搅拌速度为600rpm，搅拌时间为2h。
所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液的制备步骤中，搅拌速度为600rpm，搅拌时间为30min。
所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒的制备步骤中，植酸溶液浓度为2％，盐酸溶液浓度为0.3％，搅拌速度为600rpm，搅拌时间为30min，离心转速为4000rpm，离心时间为10min。
一种负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒，根据所述的负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒制备方法制备得到的。
对比例1
将100mg香芹酚加入50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在沸水浴中加热20min后，得到香芹酚溶液；将0.5g玉米醇溶蛋白和0.5g海藻糖脂共溶于50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在600rpm下搅拌2h后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液；将所述香芹酚溶液和玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液混合，在600rpm下搅拌30min后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液；在600rpm搅拌状态下，将0.3％盐酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为7.0，在600rpm下搅拌30min，并在4000rpm下离心10min以除去不溶性物质，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒分散液。具体检测方法如下：
(1)粒径、PDI和ζ-电位：在室温条件下采用动态光散射测定复合纳米颗粒的粒度、PDI和ζ-电位。分别基于Stokes-Einstein方程和Smoluchowski模型计算样品的粒径。测量之前将纳米颗粒分散体稀释到合适浓度以避免多重散射效应。每个样品平行测定三次后取平均值。
(2)封装效率：将复合纳米颗粒分散液置于分子截留量为10kDa的超滤离心管中，在6000rpm下离心30min后，未被封装的香芹酚透过滤膜并位于管底，而被封装的部分则被截留。以80％乙醇稀释未被封装的香芹酚至适当浓度，并采用紫外分光光度计在275nm的波长下记录其吸光度，并通过标准曲线(Y＝0.0153X-0.0147，R2＝0.9995)转换为浓度当量(μg/mL)，如图1所示。封装效率根据以下公式计算：
如表1所示，所得复合纳米颗粒的粒径为155.1nm，PDI为0.242，ζ-电位为-31.92mV，封装效率为90.72％。其外观见图2中的对比例1所示。
实施例1
将100mg香芹酚加入50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在沸水浴中加热20min后，得到香芹酚溶液；将0.5g玉米醇溶蛋白和0.5g海藻糖脂共溶于50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在600rpm下搅拌2h后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液；将所述香芹酚溶液和玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液混合，在600rpm下搅拌30min后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液；在600rpm搅拌状态下，将2％植酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为7.0，在600rpm下搅拌30min，并在4000rpm下离心10min以除去不溶性物质，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒分散液。具体检测方法参照对比例1。
如表1所示，所得复合纳米颗粒的粒径为135.9nm，PDI为0.279，ζ-电位为-36.18mV，封装效率为93.69％，可见实施例1的粒径比对比例1的小，而ζ-电位和封装效率大，其外观见图2中实施例1所示。
对比例2
将200mg香芹酚加入50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在沸水浴中加热20min后，得到香芹酚溶液；将0.5g玉米醇溶蛋白和0.5g海藻糖脂共溶于50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在600rpm下搅拌2h后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液；将所述香芹酚溶液和玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液混合，在600rpm下搅拌30min后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液；在600rpm搅拌状态下，将0.3％盐酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为7.0，在600rpm下搅拌30min，并在4000rpm下离心10min以除去不溶性物质，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒分散液。具体检测方法参照对比例1。
如表1所示，所得复合纳米颗粒的粒径为137.2nm，PDI为0.268，ζ-电位为-34.84mV，封装效率为92.46％，其外观见图2中对比例2所示。
实施例2
将200mg香芹酚加入50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在沸水浴中加热20min后，得到香芹酚溶液；将0.5g玉米醇溶蛋白和0.5g海藻糖脂共溶于50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在600rpm下搅拌2h后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液；将所述香芹酚溶液和玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液混合，在600rpm下搅拌30min后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液；在600rpm搅拌状态下，将2％植酸溶液液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为7.0，在600rpm下搅拌30min，并在4000rpm下离心10min以除去不溶性物质，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒分散液。具体检测方法参照对比例1。
如表1所示，所得复合纳米颗粒的粒径为115.7nm，PDI为0.273，ζ-电位为-39.77mV，封装效率为96.74％，可见实施例2的粒径比对比例2的小，而ζ-电位和封装效率大，其外观见图2中实施例2所示。
对比例3
将300mg香芹酚加入50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在沸水浴中加热20min后，得到香芹酚溶液；将0.5g玉米醇溶蛋白和0.5g海藻糖脂共溶于50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在600rpm下搅拌2h后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液；将所述香芹酚溶液和玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液混合，在600rpm下搅拌30min后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液；在600rpm搅拌状态下，将0.3％盐酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为7.0，在600rpm下搅拌30min，并在4000rpm下离心10min以除去不溶性物质，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒分散液。具体检测方法参照对比例1。
如表1所示，所得复合纳米颗粒的粒径为125.1nm，PDI为0.277，ζ-电位为-36.48mV，封装效率为94.24％。其外观见图2中对比例3所示。
实施例3
将300mg香芹酚加入50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在沸水浴中加热20min后，得到香芹酚溶液；将0.5g玉米醇溶蛋白和0.5g海藻糖脂共溶于50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在600rpm下搅拌2h后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液；将所述香芹酚溶液和玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液混合，在600rpm下搅拌30min后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液；在600rpm搅拌状态下，将2％植酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为7.0，在600rpm下搅拌30min，并在4000rpm下离心10min以除去不溶性物质，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒分散液。具体检测方法参照对比例1。
如表1所示，所得复合纳米颗粒的粒径为94.2nm，PDI为0.272，ζ-电位为-44.94mV，封装效率为98.84％，可见实施例3的粒径比对比例3的小，而ζ-电位和封装效率大，其外观见图2中实施例3所示。
对比例4
将400mg香芹酚加入50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在沸水浴中加热20min后，得到香芹酚溶液；将0.5g玉米醇溶蛋白和0.5g海藻糖脂共溶于50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在600rpm下搅拌2h后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液；将所述香芹酚溶液和玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液混合，在600rpm下搅拌30min后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液；在600rpm搅拌状态下，将0.3％盐酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为7.0，在600rpm下搅拌30min，并在4000rpm下离心10min以除去不溶性物质，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒分散液。具体检测方法参照对比例1。
如表1所示，所得复合纳米颗粒的粒径为107.7nm，PDI为0.258，ζ-电位为-41.83mV，封装效率为91.48％。其外观见图2中对比例4所示。
实施例4
将400mg香芹酚加入50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在沸水浴中加热20min后，得到香芹酚溶液；将0.5g玉米醇溶蛋白和0.5g海藻糖脂共溶于50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在600rpm下搅拌2h后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液；将所述香芹酚溶液和玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液混合，在600rpm下搅拌30min后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液；在600rpm搅拌状态下，将2％植酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为7.0，在600rpm下搅拌30min，并在4000rpm下离心10min以除去不溶性物质，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒分散液。具体检测方法参照对比例1。
如表1所示，所得复合纳米颗粒的粒径为86.9nm，PDI为0.263，ζ-电位为-45.99mV，封装效率为95.34％，可见实施例4的粒径比对比例4的小，而ζ-电位和封装效率大，其外观见图2中实施例4所示。
表1各实施例及对比例的粒径、PDI、ζ-电位和封装效率
由表1可见，随着香芹酚添加量的上升，复合纳米颗粒的粒径逐渐减小，而ζ-电位的绝对值逐渐增大，这归因于香芹酚的表面活性对复合纳米颗粒分散液胶体分散性的改善，所有复合纳米颗粒的PDI均小于0.3，说明复合纳米颗粒呈单分散分布。所有复合纳米颗粒对香芹酚的封装效率呈现先上升后下降的趋势，在香芹酚为300mg时，复合纳米颗粒的封装效率达到峰值，这是由于香芹酚由不饱和状态转为不饱和，因此香芹酚添加量300mg应用于后续对比例和实施例的进行。
对比例5
将300mg香芹酚加入50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在沸水浴中加热20min后，得到香芹酚溶液；将0.5g玉米醇溶蛋白和0.5g海藻糖脂共溶于50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在600rpm下搅拌2h后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液；将所述香芹酚溶液和玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液混合，在600rpm下搅拌30min后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液；在600rpm搅拌状态下，将0.3％盐酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为7.0，在600rpm下搅拌30min，并在4000rpm下离心10min以除去不溶性物质，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒分散液。具体检测方法如下：
透射电子显微镜观测：将新鲜制备的纳米颗粒分散液适当稀释后，滴于碳膜铜网上静置2-3min，以滤纸吸取多余液体后，采用乙酸双氧铀进行负染，自然晾干后在透射电子显微镜下进行观测。
实施例5
将300mg香芹酚加入50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在沸水浴中加热20min后，得到香芹酚溶液；将0.5g玉米醇溶蛋白和0.5g海藻糖脂共溶于50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在600rpm下搅拌2h后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液；将所述香芹酚溶液和玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液混合，在600rpm下搅拌30min后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液；在600rpm搅拌状态下，将2％植酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为7.0，在600rpm下搅拌30min，并在4000rpm下离心10min以除去不溶性物质，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒分散液。具体检测方法参照对比例5。
如图3所示，复合纳米颗粒呈现不规则的球形，周围蓬松的深色边缘表明海藻糖脂和玉米醇溶蛋白颗粒之间的结合。相比于对比例5，实施例5所观测到纳米颗粒的平均直径更小，这是由于植酸对各组分相互作用的增强，而盐酸并不具备此功能，此结果也与动态光散射结果一致。然而，透射电子显微镜的观测到纳米颗粒的平均直径和动态光散射测量所得的颗粒粒径存在误差，这是由于仪器工作原理的不同，前者测量脱水后纳米颗粒的尺寸，后者则是计算纳米颗粒的流体动力学尺寸。
对比例6
将300mg香芹酚加入50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在沸水浴中加热20min后，得到香芹酚溶液；将0.5g玉米醇溶蛋白和0.5g海藻糖脂共溶于50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在600rpm下搅拌2h后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液；将所述香芹酚溶液和玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液混合，在600rpm下搅拌30min后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液；在600rpm搅拌状态下，将0.3％盐酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为7.0，在600rpm下搅拌30min，并在4000rpm下离心10min以除去不溶性物质，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒分散液。具体检测方法如下：
复合纳米颗粒的物理稳定性：使用LUMiSizer记录样品长度上与空间和时间相关的透射曲线以及离心过程中样品透光率的变化，作为物理稳定性的指标。测量参数设计如下：纳米颗粒分散液的体积为1.8mL，仪器波长为870nm，离心转速为4000rpm、执行时间为5400s，时间间隔为10s，温度为25℃。
实施例6
将300mg香芹酚加入50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在沸水浴中加热20min后，得到香芹酚溶液；将0.5g玉米醇溶蛋白和0.5g海藻糖脂共溶于50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在600rpm下搅拌2h后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液；将所述香芹酚溶液和玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液混合，在600rpm下搅拌30min后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液；在600rpm搅拌状态下，将2％植酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为7.0，在600rpm下搅拌30min，并在4000rpm下离心10min以除去不溶性物质，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒分散液。具体检测方法参考对比例6。
离心后，纳米颗粒分散液可能出现不稳定现象，如沉降、絮凝或乳化。因此，所得的透射曲线(图4a)和不稳定性指数(图4b)可以用作纳米颗粒的物理稳定性的指标。随着归一化透过率(％)和不稳定性指数的变化越高，纳米颗粒的物理稳定性越低。实施例6和对比例6中纳米颗粒显示出类似的相分离过程，并定量为纳米颗粒的不稳定性指数，分别为0.398和0.496，说明实施例6具有更高的物理稳定性。
对比例7
将300mg香芹酚加入50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在沸水浴中加热20min后，得到香芹酚溶液；将0.5g玉米醇溶蛋白和0.5g海藻糖脂共溶于50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在600rpm下搅拌2h后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液；将所述香芹酚溶液和玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液混合，在600rpm下搅拌30min后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液；在600rpm搅拌状态下，将0.3％盐酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为7.0，在600rpm下搅拌30min，并在4000rpm下离心10min以除去不溶性物质，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒分散液。具体检测方法如下：
复合纳米颗粒的贮藏稳定性：将复合纳米颗粒在4℃和25℃下储存21天。参考对比例1中的检测方法测量复合纳米颗粒的粒径、PDI、ζ-电位和香芹酚的保留率。
实施例7
将300mg香芹酚加入50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在沸水浴中加热20min后，得到香芹酚溶液；将0.5g玉米醇溶蛋白和0.5g海藻糖脂共溶于50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在600rpm下搅拌2h后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液；将所述香芹酚溶液和玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液混合，在600rpm下搅拌30min后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液；在600rpm搅拌状态下，将2％植酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为7.0，在600rpm下搅拌30min，并在4000rpm下离心10min以除去不溶性物质，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒分散液。具体检测方法参考对比例7。
如表2所示，整个贮藏过程对复合纳米颗粒的粒径、PDI和ζ-电位几乎没有影响。此外，纳米颗粒分散体的外观没有显著变化，如图5所示。但实施例7相比于对比例7显示出更高的香芹酚保留率。
表2实施例7和对比例7的粒径、PDI、ζ-电位和香芹酚保留率
实施例8
将300mg香芹酚加入50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在沸水浴中加热20min后，得到香芹酚溶液；将0.5g玉米醇溶蛋白和0.5g海藻糖脂共溶于50mL去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0，在600rpm下搅拌2h后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液；将所述香芹酚溶液和玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液混合，在600rpm下搅拌30min后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液；在600rpm搅拌状态下，将2％植酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为7.0，在600rpm下搅拌30min，并在4000rpm下离心10min以除去不溶性物质，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒分散液。具体检测方法如下：
复合纳米颗粒的再分散性：将50mg冷冻干后的粉末状复合纳米颗粒分散在10mL去离子水中以达到5mg/mL的蛋白质浓度。将溶液在600rpm下搅拌2h后，将pH值调节至7.0。参考对比例1中的检测方法测量复合纳米颗粒的粒径、PDI和ζ-电位。
粉末状纳米颗粒具有可接受的再分散性。重新分散后，纳米颗粒的粒径为83.58nm，PDI为0.269，与实施例3中所述的原始值相近，表明冷冻干燥未对纳米颗粒产生负面影响。如图6所示，粉末状纳米颗粒可以完全溶解在水中，且所得分散液的外观与图2中所示分散液外观基本一致。重新分散后，纳米颗粒的ζ-电位变得更负，表明阴离子表面电荷密度增加和/或水离子强度降，有利于纳米颗粒抗聚集性的提升。
本发明基于蛋白质与酚类化合物溶解度和结构的pH响应性，采用植酸酸化-pH驱法制备玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚复合纳米颗粒，其中海藻糖脂起到了乳化剂的作用。该方法工艺简单且易于操作，提升了香芹酚的水溶性与稳定性。与传统的盐酸酸化-pH驱动法相比，植酸酸化-pH驱法所制得复合纳米颗粒粒径更小，分散更均匀，环境稳定性更强，且香芹酚的封装效率最高可达98.84％，为生物活性物质的稳态化提供了新途径。
Claims (10)
1.一种负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
香芹酚溶液的制备：将香芹酚加入去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为大于或等于12.0，在沸水浴中加热后，得到香芹酚溶液；
玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液的制备：将玉米醇溶蛋白和海藻糖脂共溶于去离子水中，采用NaOH溶液将其pH值调节为大于或等于12.0后，搅拌，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液；
玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液的制备：将所述香芹酚溶液和玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液混合，搅拌，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液；
玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒的制备：在搅拌状态下，将植酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为中性，继续搅拌，并离心除去不溶性物质后，得到玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒的分散液。
2.根据权利要求1所述的负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒制备方法，其特征在于，所述香芹酚溶液的制备步骤中香芹酚质量为100-400mg，去离子水体积为50mL，NaOH溶液浓度为1.0M，沸水浴时间为20min。
3.根据权利要求2所述的负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒制备方法，其特征在于，所述香芹酚质量为300mg。
4.根据权利要求1所述的负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒制备方法，其特征在于，所述香芹酚溶液的制备步骤中采用NaOH溶液将pH值调节为12.0。
5.根据权利要求2所述的负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒制备方法，其特征在于，所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液的制备步骤中玉米醇溶蛋白质量为0.5g，海藻糖脂质量为0.5g，去离子水体积为50mL，NaOH溶液浓度为1.0M，搅拌速度为600rpm，搅拌时间为2h。
6.根据权利要求1所述的负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒制备方法，其特征在于，所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂溶液的制备步骤中采用NaOH溶液将其pH值调节为12.0。
7.根据权利要求2所述的负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒制备方法，其特征在于，所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液的制备步骤中，搅拌速度为600rpm，搅拌时间为30min。
8.根据权利要求2所述的负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒制备方法，其特征在于，所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒的制备步骤中，植酸溶液浓度为2％，搅拌速度为600rpm，搅拌时间为30min，离心转速为4000rpm，离心时间为10min。
9.根据权利要求1所述的负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒制备方法，其特征在于，所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚纳米颗粒的制备步骤中，将植酸溶液缓慢注入所述玉米醇溶蛋白-海藻糖脂-香芹酚溶液中，直至溶液pH值为7.0。
10.一种负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒，其特征在于，根据权利要求1-9任意一项所述的负载香芹酚的玉米醇溶蛋白基纳米颗粒制备方法制备得到的。
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| CN116251077A (zh) * | 2023-03-30 | 2023-06-13 | 盐城工业职业技术学院 | 一种负载香芹酚的复合纳米颗粒的制备方法 |
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