CN115843690A

CN115843690A - 一种以金银花花药为外植体的再生方法

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Publication number: CN115843690A
Application number: CN202211619800.2A
Authority: CN
Inventors: 刘迪; 甄军波; 刘琳琳; 欧阳艳飞; 任子蓓; 任士福; 迟吉娜; 周英书
Original assignee: Institute Of Cotton Hebei Academy Of Agriculture And Forestry Sciences Hebei Special Economic Crop Research Institute Academy Of Agriculture And Forestry Sciences
Current assignee: Institute Of Cotton Hebei Academy Of Agriculture And Forestry Sciences Hebei Special Economic Crop Research Institute Academy Of Agriculture And Forestry Sciences
Priority date: 2022-12-15
Filing date: 2022-12-15
Publication date: 2023-03-28
Anticipated expiration: 2042-12-15
Also published as: CN115843690B

Abstract

本发明涉及植物组织培养技术领域，提出了一种以金银花花药为外植体的再生方法，包括以下步骤：S1、制备愈伤组织诱导培养基M1、愈伤组织诱导培养基M2、分化培养基、生根培养基；S2、获取金银花外植体并灭菌，得到金银花花药；S3、将金银花花药于愈伤组织诱导培养基M1中培养后于愈伤组织诱导培养基M2继代培养至产生胚性愈伤组织；S4、将胚性愈伤组织进行分化培养至形成再生植株，将再生植株转接到生根培养基培养，得到金银花组培苗。本发明提供的培养方法可直接诱导金银花花药产生胚性愈伤组织，简化了生产步骤，缩短了成苗的时间。利用本发明得到的胚性愈伤组织和再生苗方法可用于金银花的基因编辑研究和新品种选育。

Description

一种以金银花花药为外植体的再生方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，具体的，涉及一种以金银花花药为外植体的再生方法。

背景技术

金银花(Lonicera japonica)，为忍冬科忍冬属植物，因花开初时为白色，两三天后变为黄色，黄白花同时存在，故名金银花。金银花是一种药食两用植物，是我国重要的传统大宗中药材，其主要有效成分为绿原酸和类黄酮等，具有清热解毒、消炎除火、保肝利胆等功效，用于治疗风热感冒、温病、咽喉肿痛肺炎、痢疾、痛肿溃疡等症，具有极大的市场需求。目前金银花的主要栽培方式为大田种植，扦插繁殖等，不仅育苗周期长、受季节限制、易感病菌，还易使金银花生长不良，药用有效成分积累减少，造成产品品质的下降。

前人关于金银花组培的研究，多以茎尖、茎段、芽等为外植体，已公开的发明专利申请号201110292502.2和201210509936.8就以茎段作为外植体进行金银花的快繁，且主要产生丛生芽，只在基部产生少量愈伤组织。经检索尚未见以金银花花药为外植体进行组织培养，并产生胚性愈伤组织的报道。另外，金银花作为忍冬科属植物，常用的植物生长调剂为主要为IBA、NAA和6-BA，本发明的植物生长调节剂组合在金银花组织培养过程中几乎未见报道。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明以金银花花药为外植体，通过调整诱导培养基成分、优化诱导培养条件等，最终提供了一种金银花花药培养直接诱导出胚性愈伤组织并生成植株的方法。

本发明的技术方案如下：

一种以金银花花药为外植体的再生方法，包括以下步骤：

S1、制备愈伤组织诱导培养基M1、愈伤组织诱导培养基M2、分化培养基、生根培养基；

S2、获取金银花外植体并灭菌，收集金银花花药；

S3、将金银花花药于愈伤组织诱导培养基M1中培养后，于愈伤组织诱导培养基M2继代培养至产生胚性愈伤组织；

S4、将胚性愈伤组织进行分化培养至形成再生植株，将再生植株转接到生根培养基培养，得到金银花组培苗。

作为进一步的技术方案，所述愈伤组织诱导培养基M1以MS为基本培养基，添加葡萄糖25～35g/L，植物凝胶2.0～3.0g/L，2,4-D 0.05～0.15mg/L，IAA0.1～0.5mg/L，KT0.05～0.15mg/L，并调pH值为5.8；

所述愈伤组织诱导培养基M2以MS为基本培养基，添加葡萄糖25～35g/L，植物凝胶2.0～3.0g/L，IAA0.1～0.6mg/L，KT 0.2-0.6mg/L，并调pH值为5.8。

作为进一步的技术方案，所述分化培养基包括：硝酸钾1900mg/L，硝酸镁320mg/L，硝酸铵250mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸铵220mg/L，二水氯化钙400mg/L，磷酸二氢钠40mg/L，七水硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，六水氯化钴0.025mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，碘化钾0.83mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，肌醇100mg/L，硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，甘氨酸2mg/L，谷氨酰胺1000mg/L，天冬酰胺500mg/L，葡萄糖30g/L，IBA0.2～0.6mg/L，KT 0.10～0.20mg/L，植物凝胶2.5～2.8g/L，并调节pH值为5.9。

作为进一步的技术方案，所述生根培养基包括：硝酸钾950mg/L，硝酸镁160mg/L，硝酸铵125mg/L，磷酸二氢钾85mg/L，硫酸铵110mg/L，二水氯化钙200mg/L，磷酸二氢钠20mg/L，七水硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，六水氯化钴0.025mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，碘化钾0.83mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，肌醇100mg/L，硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，葡萄糖30g/L，植物凝胶2.0～3.0g/L，并调节pH值为5.9。

作为进一步的技术方案，所述步骤S2获取外植体和灭菌的方法为，取下金银花枝条的花蕾，于升汞溶液中灭菌处理后，经无菌水清洗至去除升汞，将花蕾放到灭菌的滤纸上，取出内部花药，花药为鹅黄色或黄绿色。

作为进一步的技术方案，所述取下的花蕾呈棒状，颜色为黄白或绿白色。

作为进一步的技术方案，所述步骤S3胚性愈伤组织诱导为，将获取的金银花花药接种到愈伤组织诱导培养基M1上，培养20天后继代到愈伤组织诱导培养基M2上，每20天继代1次，继代培养2-3次直至产生胚性愈伤组织。

作为进一步的技术方案，所述将金银花花药接种到愈伤组织诱导培养基M1上的培养条件为，培养温度24～26℃，暗光或弱光培养；继代到愈伤组织诱导培养基M2的培养条件为，培养温度24～26℃，光照时间每天10-12小时。

作为进一步的技术方案，所述步骤S4分化及生根培养为，将诱导出的胚性愈伤组织转接到分化培养基上，继代培养1-2次后，形成再生植株；将再生植株转接到生根培养基培养。

作为进一步的技术方案，所述将再生植株转移到生化培养基的培养条件为，培养温度24～26℃，光照时间每天10～12小时；将再生植株转移到生根培养基的培养条件为，温度24～26℃，光照时间每天10～12小时。

本发明的工作原理及有益效果为：

1、本发明创造性的以金银花花药为外植体，通过外植体的获取，愈伤组织的诱导，胚性愈伤组织的分化成苗及生根的过程，建立了一种金银花的组织培养体系，能稳定诱导胚性愈伤组织及无菌幼苗，解决了试验所需，缩短了金银花培育的周期，并且不受季节限制，为金银花的基因编辑育种及产业的发展提供技术支持。

2、本发明可以短期内获得形状稳定的再生植株，缩短育种周期，培养4个月后，获得再生植株茎伸长至5厘米以上，叶片数4～5个，根系发育良好，本方法培育的再生植株是健康有效个体。

3、本发明采用金银花花药为外植体可直接诱导产生胚性愈伤组织，减少了现有技术中先生成愈伤组织再诱导产生胚性愈伤组织的过程，节约了时间成本；且诱导出的胚性愈伤组织可以作为基因编辑的受体，通过基因编辑技术加快金银花的育种进程。

4、本发明中愈伤组织诱导培养基M1、愈伤组织诱导培养基M2和分化培养基以2,4-D、IAA和KT为激素组合，取代了忍冬科植物常用培养基中的6-BA和NAA的组合，并在不同时期调整所需浓度，在配合相应光照条件、光照时间等培养条件下，有效提高了愈伤组织的诱导率，并且发明人发现将本发明中培养基的配方进行替换、增减以及配比的调整，都不能使金银花花药较好的生长，因此只有用本发明中的培养基才能使金银花花药更好的生长，诱导率高。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

图1为胚性愈伤组织诱导过程图；

图2为分化及生根培养过程图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。

实施例1

一种以金银花花药为外植体的组培繁殖方法，包括以下步骤：

(1)制备愈伤组织诱导培养基M1、愈伤组织诱导培养基M2、分化培养基、生根培养基

①愈伤组织诱导培养基M1：以MS为基本培养基，添加葡萄糖30g/L，植物凝胶2.5g/L，2,4-D 0.1mg/L，IAA0.1～0.5mg/L，KT 0.1mg/L，并调pH值为5.8；

②愈伤组织诱导培养基M2：以MS为基本培养基，添加葡萄糖30g/L，植物凝胶2.5g/L，IAA0.5mg/L，KT 0.2-0.6mg/L，并调pH值为5.8；

③分化培养基包括：硝酸钾1900mg/L，硝酸镁320mg/L，硝酸铵250mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸铵220mg/L，二水氯化钙400mg/L，磷酸二氢钠40mg/L，七水硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，六水氯化钴0.025mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，碘化钾0.83mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，肌醇100mg/L，硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，甘氨酸2mg/L，谷氨酰胺1000mg/L，天冬酰胺500mg/L，葡萄糖30g/L，IBA0.5mg/L，KT 0.15mg/L，植物凝胶2.6g/L，并调节pH值为5.9；

④生根培养基包括：硝酸钾950mg/L，硝酸镁160mg/L，硝酸铵125mg/L，磷酸二氢钾85mg/L，硫酸铵110mg/L，二水氯化钙200mg/L，磷酸二氢钠20mg/L，七水硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，六水氯化钴0.025mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，碘化钾0.83mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，肌醇100mg/L，硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，葡萄糖30g/L，植物凝胶2.6g/L，并调节pH值为5.9；

各培养基均需灭菌，将配制好的培养基封好后装进灭菌锅，调节灭菌温度为121℃，灭菌15分钟。

(2)获取金银花外植体和灭菌

从大田选取健壮、无病害带有花芽的金银花枝条，取下棒状，黄白色或绿白色未开放花蕾，于浓度为0.1％的升汞溶液中灭菌处理10分钟，然后用无菌水清洗3次，彻底去除升汞。将花蕾放到灭菌的滤纸上，用尖头镊子将内部的花药轻轻挤出或挑出，花药为鹅黄色或黄绿色为宜。

(3)胚性愈伤组织诱导

将获取的金银花花药接种到愈伤组织诱导培养基M1上，培养温度24～26℃，暗光培养，20天后继代到愈伤组织诱导培养基M2上，培养温度24～26℃，光照时间每天11小时，每20天继代1次，继代培养3次直至产生黄色、颗粒状胚性愈伤组织。如图1所示，图1中A为鹅黄色或淡黄色花药，B为黄色颗粒状胚性愈伤组织。

(4)分化及生根培养

将诱导出的胚性愈伤组织转接到分化培养基上，培养温度24～26℃，光照时间每天11小时，继代培养2次后，逐渐形成具有根和芽的完整的再生植株。将再生植株转接到生根培养基，培养条件：温度24～26℃，光照时间每天11小时。如图2所示，图2中A为胚性愈伤组织分化出再生植株，B为再生植株转入生根培养基。

在实施例1的基础上又进行了两次重复试验，分别为实施例2、实施例3。

诱导率(％)＝(诱导出的胚性愈伤组织数/接种外植体数)×100％

表1实施例1～3花药数、愈伤组织数及诱导率

通过表1可知，本发明愈伤诱导率极高，能稳定诱导胚性愈伤组织及无菌幼苗，不受季节限制，为金银花的基因编辑育种及产业的发展提供技术支持。在植物组织培养过程中，愈伤组织的诱导是至关重要的一步，稳定诱导出的愈伤组织具有再分化的能力，可以获得再生植株，提高产品品质。

以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，且以此发明为基础，开展金银花的遗传转化、基因编辑、新品种选育等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种以金银花花药为外植体的再生方法，其特征在于，包括以下步骤：

S2、获取金银花外植体并灭菌，收集金银花花药；

2.根据权利要求1所述的一种以金银花花药为外植体的再生方法，其特征在于，所述愈伤组织诱导培养基M1以MS为基本培养基，添加葡萄糖25～35g/L，植物凝胶2.0～3.0g/L，2,4-D 0.05～0.15mg/L，IAA0.1～0.5mg/L，KT 0.05～0.15mg/L，并调pH值为5.8；

所述愈伤组织诱导培养基M2以MS为基本培养基，添加葡萄糖25～35g/L，植物凝胶2.0～3.0g/L，IAA0.1～0.6mg/L，KT 0.2～0.6mg/L，并调pH值为5.8。

3.根据权利要求1所述的一种以金银花花药为外植体的再生方法，其特征在于，所述分化培养基包括：硝酸钾1900mg/L，硝酸镁320mg/L，硝酸铵250mg/L，磷酸二氢钾170mg/L，硫酸铵220mg/L，二水氯化钙400mg/L，磷酸二氢钠40mg/L，七水硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，六水氯化钴0.025mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，碘化钾0.83mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，肌醇100mg/L，硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，甘氨酸2mg/L，谷氨酰胺1000mg/L，天冬酰胺500mg/L，葡萄糖30g/L，IBA0.2～0.6mg/L，KT 0.10～0.20mg/L，植物凝胶2.5～2.8g/L，并调节pH值为5.9。

4.根据权利要求1所述的一种以金银花花药为外植体的再生方法，其特征在于，所述生根培养基包括：硝酸钾950mg/L，硝酸镁160mg/L，硝酸铵125mg/L，磷酸二氢钾85mg/L，硫酸铵110mg/L，二水氯化钙200mg/L，磷酸二氢钠20mg/L，七水硫酸亚铁27.8mg/L，乙二胺四乙酸二钠37.3mg/L，六水氯化钴0.025mg/L，五水硫酸铜0.025mg/L，碘化钾0.83mg/L，七水硫酸锌8.6mg/L，硼酸6.2mg/L，四水硫酸锰22.3mg/L，二水钼酸钠0.25mg/L，肌醇100mg/L，硫胺素0.1mg/L，盐酸吡哆醇0.5mg/L，烟酸0.5mg/L，肌醇100mg/L，甘氨酸2mg/L，葡萄糖30g/L，植物凝胶2.0～3.0g/L，并调节pH值为5.9。

5.根据权利要求1所述的一种以金银花花药为外植体的再生方法，其特征在于，所述步骤S2获取外植体和灭菌的方法为，取下金银花枝条的花蕾，于0.1％的升汞溶液中灭菌处理后，经无菌水清洗至去除升汞，将花蕾放到灭菌的滤纸上，取出内部花药，花药为鹅黄色或黄绿色。

6.根据权利要求5所述的一种以金银花花药为外植体的再生方法，其特征在于，所述取下的花蕾呈棒状，颜色为黄白或绿白色。

7.根据权利要求1所述的一种以金银花花药为外植体的再生方法，其特征在于，所述步骤S3胚性愈伤组织诱导为，将获取的金银花花药接种到愈伤组织诱导培养基M1上，培养20天后继代到愈伤组织诱导培养基M2上，每20天继代1次，继代培养2-3次直至产生胚性愈伤组织，胚性愈伤组织呈黄色、颗粒状。

8.根据权利要求7所述的一种以金银花花药为外植体的再生方法，其特征在于，所述将金银花花药接种到愈伤组织诱导培养基M1的培养条件为：培养温度24～26℃，暗光或弱光培养；继代到愈伤组织诱导培养基M2的培养条件为，培养温度24～26℃，光照时间每天10-12小时。

9.根据权利要求1所述的一种以金银花花药为外植体的再生方法，其特征在于，所述步骤S4分化及生根培养为，将诱导出的胚性愈伤组织转接到分化培养基上，继代培养1-2次后，形成再生植株；将再生植株转接到生根培养基培养。

10.根据权利要求9所述的一种以金银花花药为外植体的再生方法，其特征在于，所述将再生植株转移到生化培养基的培养条件为，培养温度24～26℃，光照时间每天10～12小时；将再生植株转移到生根培养基的培养条件为，温度24～26℃，光照时间每天10～12小时。