CN115838677A - 一种基因工程改造需钠弧菌及其制备方法，以及在重金属处理中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种基因工程改造需钠弧菌，该基因工程改造需钠弧菌的基因序列包括基因序列CysE和基因序列CdsH；其中，所述基因序列CysE编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；所述基因序列CdsH编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，从而使菌株具有去除重金属离子并在胞内合成重金属硫化物的能力。本发明还涉及有关该基因工程改造需钠弧菌的制备方法；以及基于该基因工程改造需钠弧菌制备重金属纳米颗粒的方法。本发明还涉及该基因工程改造需钠弧菌在去除重金属污染中的应用。
Description
技术领域
本发明属于生物基因领域，具体涉及一种基因工程改造需钠弧菌及其制备方法，以及在重金属去除和制备中的应用。
背景技术
水资源是居民生产生活的立身之本，也是一个国家发展的动力之源。如果没有充足、清洁、安全的水资源作为支撑，国家的经济发展将处处受限、难以为继。近年来，我国制造业突飞猛进、经济飞速发展，但相应的环境治理能力相比发达国家仍存在诸多不足，水环境污染问题日益严峻，特别是重金属污染问题。电镀、冶金、采矿等工业废水中重金属离子污染物含量可达毫克级。一旦这些在自然环境中难以降解的重金属污染物，通过食物链聚集到生物体内，就会导致生物蛋白变性，造成中毒、致癌、致畸等严重健康危害。震惊世界的日本水俣病、痛痛病事件就是由水环境中的汞和镉污染引发。故此，需开发能够有效去除水体中重金属污染物的水处理技术。
目前，针对重金属废水的处理技术已有大量研究，包括化学沉积法、氧化还原法、电化学法、膜分离法、离子交换法、生物吸附法、螯合法等。然而，大多数技术存在反应条件苛刻、成本高、需进行二次处理等局限性。常采用化学沉积法去除废水中重金属污染物，其中，硫化物沉积法因具有处理效果好、适用pH值范围广、无需二次处理、成本低廉等优点而得到了广泛应用。通过向水中投加硫化钠、硫氢化钠等化学药剂，与重金属离子形成不溶性沉淀物，从而达到去除重金属离子、资源回收再生的目标。然而，传统的硫化物沉积法存在一定局限性。H2S的储存、运输和利用过程危险，且使用成本较高。S2-遇到酸性环境容易生成并泄漏有毒有害的H2S气体，造成二次污染；形成的金属硫化物颗粒尺寸较小、不易沉降，导致后续固液分离困难，并且存在着二次泄漏重金属的风险，最终处理效率低。
近年来，随着生物修复技术的兴起，研究者发现天然存在的硫酸盐还原菌，可以利用硫酸盐作为终端电子受体产生H2S，从而与溶液中的重金属离子在细胞内形成不溶性金属硫化物，达到去除重金属污染的效果，避免了硫化物沉积法的二次污染、固液分离困难的问题。然而，硫酸盐还原菌是专性厌氧菌，存在培养条件比较苛刻、不能利用复杂碳源、生长缓慢等局限性。根据现有文献，直接将硫酸盐还原菌中参与重金属去除的生物合成途径(酶)导入到微生物中，处理效果也并不理想。因此，亟需开发一种抗逆性较高、遗传操作成熟、生长速度快的基因工程模式菌株，定向构建基因工程菌，使其能够有效去除废水中重金属污染物，同时将合成的金属硫化物储存在细胞内，降低二次泄漏风险。此外，回收胞内合成的金属硫化物，其尺寸可达纳米级，是具有高价值的半导体材料，真正实现变废为宝的转变，具有经济价值。
综上，本发明的目的在于开发廉价、安全、高效、绿色、可持续的重金属污染治理技术，指导重金属污染废水的原位处理，并回收有价值的重金属硫化物纳米颗粒，实现废物资源化再利用。
发明内容
为解决上述现有技术问题，本发明开发了一种廉价、安全、高效、绿色、可持续的基因工程改造需钠弧菌及其制备方法，并将其应用于重金属的处理，为重金属污染治理和回收利用提供了新的思路。
本发明的一个目的在于，提供一种基因工程改造需钠弧菌，所述基因工程改造需钠弧菌的基因序列包括基因序列CysE和基因序列CdsH；
其中，
所述基因序列CysE编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述基因序列CdsH编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明的另一个目的在于，提供上述基因工程改造需钠弧菌的制备方法，所述基因工程改造需钠弧菌的制备方法包括如下步骤：
S1.将所述基因序列CysE和基因序列CdsH克隆至质粒载体，构建重组载体；
S2.用所述重组载体电转化需钠弧菌，得到中间产物；
S3.将所述中间产物培养并筛选后，获得所述基因工程改造需钠弧菌。
进一步地，步骤S1中，所述质粒载体为pUC-GW-Kan。
进一步地，步骤S2中，所述电转化法为，将所述重组载体和所述需钠弧菌加入容器，预冷后进行1-2次电脉冲。
进一步地，步骤S3中，所述筛选的方法为，将所述需钠弧菌涂布卡那霉素抗性平板，培养后挑取单菌落进行验证，筛选出所述需钠弧菌。
本发明的另一个目的在于，提供一种重金属纳米颗粒的制备方法，所述重金属纳米颗粒是基于上述基因工程改造需钠弧菌制备而成；
所述重金属纳米颗粒的制备方法包括：
L1.将所述基因工程改造需钠弧菌进行培养后，收集菌悬液；
L2.将所述菌悬液转移至基础培养基，加入含重金属离子的水溶液，恒温培养，得到菌体；
L3.离心收集所述菌体，超声破碎提取胞内重金属硫化物，得到所述重金属纳米颗粒。
进一步地，步骤L2中，所述重金属离子包括镉离子、铅离子、铜离子。
进一步地，步骤L2中，所述含重金属离子的水溶液浓度为0.05-0.2mM。
进一步地，步骤L2中，所述基础培养基的pH值为7.0-7.2。
本发明的另一个目的在于，提供上述基因工程改造需钠弧菌在去除重金属污染中的应用。
本发明具有以下有益效果：
1.本发明的基因工程改造需钠弧菌，具有培养体系不需要严格厌氧、生长速度快的特点，在常规环境下即可用于去除重金属污染，避免了因苛刻的培养环境和生长缓慢带来的局限性；
2.本发明的基因工程改造需钠弧菌，对重金属去除效率高，无需多次循环处理，单次即可实现重金属去除率达90％以上；
3.本发明的基因工程改造需钠弧菌处理重金属离子，避免了硫化氢气体运输、硫化物试剂投加，大大降低了二次泄漏重金属或者H2S的风险，提高了处理效率和安全性；
4.本发明制备的重金属硫化物颗粒尺寸可达纳米级别，并且具有良好的生物相容性和电化学性能，经过分离提纯后，可应用于新能源汽车电池制造、半导体制造、生物传感器、药物控释、生物成像以及诊疗等领域，具有较高的经济效益与广阔的发展前景。
附图说明
图1(a)-(c)分别示出了本发明实施例2中的基于基因工程改造需钠弧菌制备的重金属纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)检测图，
其中，
图1(a)示出了硫化镉纳米颗粒的结构及形貌特征；
图1(b)示出了硫化铅纳米颗粒的结构及形貌特征；
图1(c)示出了硫化铜纳米颗粒的结构及形貌特征。
图2示出了本发明实施例2中的基因工程改造需钠弧菌对镉、铅、铜离子的去除率。
图3示出了本发明测试例2中对基因工程改造需钠弧菌合成的硫化镉纳米颗粒的光响应特性分析曲线。
具体实施方式
为了更清楚地说明本发明的技术方案，列举如下实施例。实施例中所出现的原料、反应和后处理手段，除非特别声明，均为市面上常见原料，以及本领域技术人员所熟知的技术手段。
一种基因工程改造需钠弧菌，所述基因工程改造需钠弧菌的基因序列包括基因序列CysE和基因序列CdsH；
其中，
所述基因序列CysE编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述基因序列CdsH编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
本发明实施例1-4中，所述CysE基因序列和CdsH基因序列，均为设计胞内合成H2S的蛋白质氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2后，购买自GENEWIZ公司合成的对应DNA序列。
本发明实施例1和实施例3中，步骤S1所述克隆的方法为：根据文献“Sambrook J,Fritsch E F,Maniatis T.Molecular cloning:a laboratory manual[M].Cold springharbor laboratory press,1989.”中公开的方法进行。
实施例1
导入胞内合成H2S的基因序列的基因工程改造需钠弧菌的制备
基因工程改造需钠弧菌的制备，包括如下步骤：
S1.将设计好的蛋白质氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2对应的CysE基因序列和CdsH基因序列克隆至质粒载体pUC-GW-Kan，构建重组载体pXG203；
S2.将100μL需钠弧菌感受态细胞和200ng纯化的重组载体pXG203加入预冷的转化杯(2mm，Bio-Rad产品)，混匀后在冰上放置10min，用电脉冲仪进行1次电脉冲(1.7kv/cm)，转化所述需钠弧菌，得到中间产物；
S3.将0.8mL BHI恢复培养基(37g/L脑心浸液肉汤(BHI)，204mM NaCl，4.2mM KCl，23.14mM MgCl2，680mM蔗糖)加入转化杯，然后将中间产物和恢复培养基从转化杯转移至15mL培养管中恢复培养2h，将恢复培养后的需钠弧菌涂布卡那霉素抗性平板(LB培养基中添加v2盐(204mmol/L NaCl，4.2mmol/L KCl，23.14mmol/L MgCl2)，卡那霉素浓度200μg/mL)，培养12h后挑取单菌落进行验证，筛选出所述基因工程改造需钠弧菌XG203。
实施例2
重金属纳米颗粒的制备
L1.将实施例1中制备的基因工程改造需钠弧菌XG203接种于预培养基(10g/L蛋白胨，5g酵母膏，21.9g/L NaCl，0.313g/L KCl，2.2g/L MgCl2)，在摇床中培养1h后(220rpm，37℃)，用离心机离心(4500rpm，10min)，收集菌体并重悬为富集的菌悬液；
L2.将所述菌悬液转移至基础培养基(1g/L NH4Cl，12.4g/L NaCl，10.99g/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，0.34g/L盐酸硫胺素，4mL甘油，1g/L酪蛋白水解物，0.24g/L MgSO4，0.0136g/L CaSO4，0.313g/L KCl，2.2g/L MgCl2，pH为7.0)，分别加入0.2mM的镉、铅、铜离子，在摇床中培养1h(220rpm，37℃)，得到菌体；
L3.用离心机离心(10000rpm，10min)，收集所述菌体后，超声破碎(200W，60min)并清洗，得到基因工程改造需钠弧菌合成的镉、铅、铜硫化物纳米颗粒。
图1(a)-(c)分别示出了实施例2制备的硫化镉、硫化铅、硫化铜纳米颗粒的透射电子显微镜(TEM)检测图，其示出制备的重金属纳米颗粒为球形，直径为5-10nm。
实施例3
导入胞内合成H2S的基因序列的基因工程改造需钠弧菌的制备
基因工程改造需钠弧菌的制备，包括如下步骤：
S1.将设计好的蛋白质氨基酸序列SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2对应的CysE基因序列和CdsH基因序列克隆至质粒载体pUC-GW-Kan，构建重组载体pXG203；
S2.将100μL需钠弧菌感受态细胞和200ng纯化的重组载体pXG203加入预冷的转化杯(2mm，Bio-Rad产品)，混匀后在冰上放置10min，用电脉冲仪进行1次电脉冲(1.7kv/cm)，转化所述需钠弧菌，得到中间产物；
S3.将0.8mL BHI恢复培养基(37g/L脑心浸液肉汤(BHI)，204mM NaCl，4.2mM KCl，23.14mM MgCl2，680mM蔗糖)加入转化杯，然后将中间产物和恢复培养基从转化杯转移至15mL培养管中恢复培养2h，将恢复培养后的需钠弧菌涂布卡那霉素抗性平板(LB培养基中添加v2盐(204mmol/L NaCl，4.2mmol/L KCl，23.14mmol/L MgCl2)，卡那霉素浓度200μg/mL)，培养16h后挑取单菌落进行验证，筛选出所述基因工程改造需钠弧菌XG203。
实施例4
重金属纳米颗粒的制备
L1.将实施例3制备的基因工程改造需钠弧菌XG203接种于预培养基(10g/L蛋白胨，5g酵母膏，21.9g/L NaCl，0.313g/L KCl，2.2g/L MgCl2)，在摇床中培养3h后(200rpm，30℃)，用离心机离心(4000rpm，5min)，收集菌体并重悬为富集的菌悬液；
L2.将所述菌悬液转移至基础培养基(1g/L NH4Cl，12.4g/L NaCl，10.99g/L三羟甲基氨基甲烷盐酸盐，0.34g/L盐酸硫胺素，2mL甘油，1g/L酪蛋白水解物，0.24g/L MgSO4，0.0136g/L CaSO4，0.313g/L KCl，2.2g/L MgCl2，pH为7.2)，分别加入0.05mM的镉、铅、铜离子，在摇床中培养12h(200rpm，30℃)，得到菌体；
L3.用离心机离心(8000rpm，5min)，收集所述菌体后，超声破碎(100W，180min)并清洗，得到基因工程改造需钠弧菌合成的镉、铅、铜硫化物纳米颗粒。
测试例1
基因工程改造需钠弧菌对重金属离子去除能效测试
测试方法：在实施例2的S2步骤中，利用电感耦合等离子体-质谱仪检测培养前和培养后基础培养基中的镉、铅、铜离子浓度变化，分析去除率。
测试结果：
表1
表1和图2示出了本发明的基因工程改造需钠弧菌对重金属离子去除的能效，对镉、铅、铜离子的去除率均达90％以上。基因工程改造需钠弧菌将重金属离子转化为重金属硫化物并储存在胞内，可以实现重金属离子的高效去除，同时避免了二次污染。
测试例2
基因工程改造需钠弧菌制备的纳米重金属硫化物光电化学性能测试
测试方法：将实施例2合成的硫化镉纳米颗粒超声分散后，均匀涂抹在导电玻璃片上，干燥成膜后，用作工作电极。构建三电极体系，其中铂丝作为对电极，甘汞电极作为参比电极，Na2SO4溶液作为电解质溶液，在每20s切换有光、无光的条件下，采用Gamry电化学工作站进行i-t曲线测试，分析材料的光响应特性。
测试结果：图3示出了本发明的基于基因工程改造需钠弧菌合成的硫化镉纳米颗粒可产生1.0-1.5μA的光响应电流，对半导体制造等领域具有的较高的实用价值。
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (10)
1.一种基因工程改造需钠弧菌，其特征在于，所述基因工程改造需钠弧菌的基因序列包括基因序列CysE和基因序列CdsH；
其中，
所述基因序列CysE编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示；
所述基因序列CdsH编码的蛋白质氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。
2.权利要求1所述的基因工程改造需钠弧菌的制备方法，其特征在于，所述基因工程改造需钠弧菌的制备方法包括如下步骤：
S1.将所述基因序列CysE和基因序列CdsH克隆至质粒载体，构建重组载体；
S2.用所述重组载体电转化需钠弧菌，得到中间产物；
S3.将所述中间产物培养并筛选后，获得所述基因工程改造需钠弧菌。
3.根据权利要求2所述的基因工程改造需钠弧菌的制备方法，其特征在于，步骤S1中，所述质粒载体为pUC-GW-Kan。
4.根据权利要求2所述的基因工程改造需钠弧菌的制备方法，其特征在于，步骤S2中，所述电转化法为，将所述重组载体和所述需钠弧菌加入容器，预冷后进行1-2次电脉冲。
5.根据权利要求2所述的基因工程改造需钠弧菌的制备方法，其特征在于，步骤S3中，所述筛选的方法为，将所述需钠弧菌涂布卡那霉素抗性平板，培养后挑取单菌落进行验证，筛选出所述需钠弧菌。
6.一种重金属纳米颗粒的制备方法，其特征在于，所述重金属纳米颗粒是基于权利要求1所述的基因工程改造需钠弧菌制备而成；
所述重金属纳米颗粒的制备方法包括：
L1.将所述基因工程改造需钠弧菌进行培养后，收集菌悬液；
L2.将所述菌悬液转移至基础培养基，加入含重金属离子的水溶液，恒温培养，得到菌体；
L3.离心收集所述菌体，超声破碎提取胞内重金属硫化物，得到所述重金属纳米颗粒。
7.根据权利要求6所述的重金属纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤L2中，所述重金属离子选自镉离子、铅离子、铜离子中的至少一种。
8.根据权利要求6所述的重金属纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤L2中，所述含重金属离子的水溶液的浓度为0.05-0.2mM。
9.根据权利要求6所述的重金属纳米颗粒的制备方法，其特征在于，步骤L2中，所述基础培养基的pH值为7.0-7.2。
10.权利要求1所述的基因工程改造需钠弧菌在去除重金属污染中的应用。
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