CN105858596B - 一种由柠檬色赤杆菌合成并自组装的生物纳米材料及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了柠檬色赤杆菌(Erythrobacter citreus)X3‑1411在制备纳米材料中的应用；所述柠檬色赤杆菌(Erythrobacter citreus)X3‑1411已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山，保藏号：CCTCC M 2016156。本发明还公开了一株柠檬色赤杆菌合成并进行自组装的生物纳米材料，由所述的柠檬色赤杆菌(Erythrobacter citreus)X3‑1411在含磷水体中合成并经自组装制备而成。本发明的菌株具有自絮凝和自组装的功能，菌株在降解水体中污染物的同时，还可以利用水体中原料在低浓度条件下合成钙磷纳米颗粒，且具有纳米自组装的能力，不需要额外投加化学试剂，环境友好成本低，实现了磷资源的循环利用。

Description

一种由柠檬色赤杆菌合成并自组装的生物纳米材料及其应用
技术领域
本发明涉及一种由柠檬色赤杆菌合成并自组装的生物纳米材料及其应用。
背景技术
随着纳米技术的快速发展，纳米材料越来越受到人们的重视。我国的纳米材料发展的部署是结合环境、能源、生物医药等行业重点发展相关纳米技术。但我国纳米技术发展与国际相比，还存在一定的差距。纳米材料的基础研究、应用研究尚不够完善，尤其是在纳米组装体系、人工组装合成的纳米结构材料体系等研究领域。
目前，国内外纳米材料的合成方法主要有两相法、反相微乳法、光化学合成法、电极电解法以及加热法、超声法等等，但是这些传统的合成方法具有种种难以克服的缺陷，如原料价格高，耗能高，反应条件苛刻或者难于规模化生产，同时化学合成方法往往需要前驱体，然而这些前驱体价格昂贵且可能具有毒性，并且化学合成方法都需要在高饱和度的溶液中进行，需要投加大量化学试剂导致成本较高，这些缺陷都极大的限制了化学方法的应用。与之相比，生物合成纳米材料具有清洁、反应条件温和、成本低、操作简单等优势，且生物合成的纳米材料具有良好的分散性、稳定性、生物相容性及可调节性等优点，现已成为国内外研究热点。但目前已发现的具有合成纳米材料的微生物种类很有限，而且已报道的应用生物方法合成的纳米材料主要集中于贵金属包括及金属硫化物纳米材料方面，如金(Au)、银(Ag)、铂(Pt)及硫化镉(CdS)、硒化镉(CdSe)等。
另一方面，磷作为一种有限的重要资源，目前陆地上已探明的可用磷资源将在几十年内被开采殆尽，因此磷的循环利用越来越受到重视。钙磷纳米材料作为一种回收磷的有效手段，并将其作为产品应用到环境、生物医药等领域开始受到研究人员的关注，但关于生物合成钙磷纳米颗粒的菌株报道更少，有文献报道一株沙雷氏菌Serratia sp.能够在不同的培养条件下可以合成不同粒径和特性的羟基磷灰石纳米颗粒。但该沙雷氏菌Serratiasp.只能在高饱和的溶液(P：5mM)以及生物缓冲液中产生钙磷纳米颗粒，并且此类钙磷纳米颗粒的产生并不是严格意义上的生物合成，而是一种生物降解过程。该沙雷氏菌Serratiasp.通过产生一种非典型性酸性磷酸酶来分解基质中的甘油磷酸钠从而释放出大量无机磷酸根离子，高浓度的磷酸根离子与钙离子在细胞表面或者胞外聚合物中形成羟基磷灰石纳米颗粒，然后将之应用于水溶液中放射性核素的去除。
因此，开发一种既能够降解废水中的污染物，又能在低浓度条件下合成纳米羟基磷灰石并进行自组装的生物合成方法具有十分重要的研究和应用价值。
发明内容
针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种由柠檬色赤杆菌合成并自组装的生物纳米材料及其应用。
本发明是基于柠檬色赤杆菌(Erythrobacter citreus)X3-1411在高盐浓度水体除磷的研究中发现，该菌株具有自絮凝和自组装功能，能够在降解水体中污染物的同时，利用水体中的钙磷，合成生物纳米材料并进行自组装，实现了磷资源的循环利用。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
根据本发明的第一方面，提供柠檬色赤杆菌(Erythrobacter citreus)X3-1411在制备纳米材料中的应用；
上述柠檬色赤杆菌(Erythrobacter citreus)X3-1411已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山，保藏号：CCTCC M 2016156。
根据本发明的第二方面，提供一种由柠檬色赤杆菌合成并自组装的生物纳米材料，由柠檬色赤杆菌(Erythrobacter citreus)X3-1411在含磷水体中合成并经自组装制备而成。
所述含磷水体中，磷元素的浓度为0.3mM-1.3mM。
根据本发明的第三方面，提供上述生物纳米材料的制备方法，包括柠檬色赤杆菌(Erythrobacter citreus)X3-1411菌株活化的步骤，以及将活化后的菌株在含磷水体中进行培养及自组装的步骤。
上述制备方法中，所述菌株活化的步骤包括：将柠檬色赤杆菌(Erythrobactercitreus)X3-1411接种于LB培养基中，180～220rpm，20-30℃，活化培养18-30h；优选的，活化培养条件为200rpm，25℃，活化培养24h。
所述LB培养基的配方为：1％蛋白胨，0.3％酵母粉，陈海水配制。
上述制备方法中，所述培养及自组装的步骤包括：将活化后的菌株接种于含磷水体中，180～220rpm，15～30℃，培养42-54h；优选的，200rpm，25℃，培养48h。
所述活化后的菌株的接种量为8-12％(v/v)。
上述培养及自组装的步骤，还包括：将培养后的培养液离心，去除上清液，得到含纳米材料的菌体，即为生物纳米材料。
所述离心的转速为5000rpm，离心时间为10min。
本发明中，所述含磷水体可以为海水冲厕废水或生活废水。
上述生物纳米材料在去除水体中污染物中的应用，或者在作为药物载体、硬组织修复材料、在制备抗肿瘤药物中的应用也属于本发明的保护范围。
所述水体中的污染物包括磷、氟、重金属和放射性废物。
本发明的有益效果：
(1)本发明的菌株具有自絮凝和自组装的功能，菌株在降解水体中污染物的同时，还可以利用水体中原料在低浓度条件下合成钙磷纳米颗粒，且具有纳米自组装的能力，不需要额外投加化学试剂，环境友好成本低，实现了磷资源的循环利用。
(2)本发明的生物纳米材料的制备方法，条件温和，操作简单，清洁无污染，成本低廉，效率高且能大规模推广应用。
(3)本发明制备的生物纳米材料，纳米颗粒分布于细菌细胞表面及周围，利用该生物纳米材料去除水中的氟，吸附苯酚，去除铅镉等重金属和放射性废物的清理时，去除效果得到显著的提高。将生物纳米材料的菌体去除后，可以形成多孔纳米材料，可以作为药物载体等方面的应用。
附图说明
图1：菌株的革兰氏染色结果；
图2：菌体形态的AFM图片；
图3：菌体在模拟海水冲厕废水中的自絮凝电镜照片；
图4：菌体在模拟海水冲厕废水中的合成纳米材料的透射电镜照片。
具体实施方式
下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
实施例1：菌株的分离和鉴定
1.菌株的分离
(1)将取自于中国南海的464株菌株在海水LB液体培养基中培养24h(200rpm、25℃)。然后静置15min，观察菌体是否能自絮凝。
(2)将能自絮凝的菌株在5000rpm下离心10min，弃去上清液，用去离子水清洗两遍菌体，然后在透射电镜下观察菌体表面是否有纳米级颗粒产生。
(3)筛选得到的能够自絮凝且菌体表面产生纳米级颗粒的菌株，将筛选的能够自絮凝且菌体表面产生纳米级颗粒的菌株按10％的接种量接种至模拟海水冲厕废水中，按时间点取样测定菌株对水体中TP和COD的去除效果，选择除磷速度和除磷率最优的菌株X3-1411即为目标菌株。
上述分离方法中，海水LB液体培养基的配方为：1％蛋白胨，0.3％酵母粉，陈海水配制。
上述模拟海水冲厕废水配方为(陈海水配制):
2.菌株的鉴定
菌株X3-1411的主要生物学特性为：革兰氏染色呈阴性(结果如图1所示)，电子显微镜下观察为杆菌，单独、成双或短链状，有荚膜、无鞭毛(结果如图2所示)。菌株固体LB培养24h菌落特征为圆形，光滑，黄色。
该菌株可在15～30℃，pH值7～8，盐度为0～12％(最佳1％～5％)培养条件下生长。
柠檬色赤杆菌(Erythrobacter citreus)X3-1411的16s rDNA的序列如SEQ IDNO.1所示。具体如下：
1 gtcggctgcc tcctaaaggt tagcgcaccg ccttcgggtg aatccaactc ccatggtgtg
61 acgggcggtg tgtacaaggc ctgggaacgt attcaccgcg gcatgctgat ccgcgattac
121 tagcgattcc gccttcatgc tctcgagttg cagagaacaa tccgaactga gacatctttt
181 ggagattagc taaccctcgc gggatcgctg ctcactgtag atgccattgt agcacgtgtg
241 tagcccagcc tgtaagggcc atgaggactt gacgtcatcc ccaccttcct ccggcttatc
301 accggcagtt tccttaaagt gcccaactaa atgatggcaa ctaaggacga gggttgcgct
361 cgttgcggga cttaacccaa catctcacga cacgagctga cgacagccat gcagcacctg
421 tcactaggtc cccgaaggga agaaatctgt ctccagaagt cgtcctagga tgtcaaaggc
481 tggtaaggtt ctgcgcgttg cttcgaatta aaccacatgc tccaccgctt gtgcaggccc
541 ccgtcaattc ctttgagttt taatcttgcg accgtactcc ccaggcggat aacttaatgc
601 gttagctgcg ccacccaagc tccatgagcc cggacagcta gttatcatcg tttacggcgt
661 ggactaccag ggtatctaat cctgtttgct ccccacgctt tcgcacctca gcgtcaataa
721 ctgtccagtg agtcgccttc gccactggtg ttcttccgaa tatctacgaa tttcacctct
781 acactcggaa ttccactcac ctctccagta ttctagccat ccagtttcaa gggcagttcc
841 ggggttgagc cccgggattt cacccctgac ttgaaaagcc gcctacgtgc gctttacgcc
901 cagtaattcc gaacaacgct agctccctcc gtattaccgc ggctgctggc acggagttag
961 ccggagctta ttctccaggt actgtcatta tcatccctgg taaaagagct ttacaaccct
1021 aaggccttca tcactcacgc ggcattgctg gatcaggctt tcgcccattgtccaatattc
1081 cccactgctg cctcccgtag gagtctgggc cgtgtctcag tcccagtgtggctgatcatc
1141 ctctcagacc agctatggat cgtcgacttg gtaggccatt accccaccaactatctaatc
1201 caacgcgggc ccatctaaag gcaataaatc tttggtccga agacattatccggtattagc
1261 agtcatttct aactgttatt ccgaacctaa aggcaggttc ccacgcgttacgcacccgtg
1321 cgccactaac cccgaagggt tcgttcgact tgca
将该序列在GenBank数据库进行BLAS(网址：http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比对,结果该序列与Erythrobacter citreus菌株的相似性为99.26％。
基于菌株的生物学特性分析和16s rDNA的同源性比对结果，将菌株X3-1411鉴定为柠檬色赤杆菌(Erythrobacter citreus)，已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山，保藏号：CCTCC M 2016156。
实施例2：生物纳米材料的制备
菌株Erythrobacter citreus X3-1411在LB中活化24h，其培养条件为200rpm、25℃。然后①在无菌操作台中用事先灭菌的离心管取25mL活化的培养液，10000rpm离心10min；②去其上清液，然后用10mL的灭菌去离子水重悬菌液，10000rpm离心10min；③重复步骤②一次。将重悬的菌液分别接种到模拟海水冲厕废水和模拟生活废水中(接种量10％)，200rpm、25℃培养48h。将培养液在5000rpm下离心10min，弃去上清液，离心管底部的菌体用去离子水清洗两遍，即得含纳米材料的菌体。重悬一部分该菌体，在铜网上固定并染色，最后烘干后用于透射电镜观察。
上述LB配方为：1％蛋白胨，0.3％酵母粉，陈海水配制。
上述模拟海水冲厕废水配方为(陈海水配制):
上述模拟生活废水配方为(去离子水配制):
菌体在模拟海水冲厕废水中的自絮凝的电镜照片如图3。菌体在模拟海水冲厕废水中的合成纳米材料及自组装的透射电镜照片如图4，图3和图4显示该材料的分散性好、粒径分布均匀。

Claims (11)

1.柠檬色赤杆菌( Erythrobacter citreus )X3-1411在含磷水体系中合成并经自组装制备纳米材料中的应用； 所述柠檬色赤杆菌( Erythrobacter citreus )X3-1411已于2016年3月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武昌珞珈山，保藏号：CCTCCM 2016156；
所述含磷水体系为海水冲厕废水或生活废水，磷元素的浓度为0 .3mM-1 .3mM；所述纳米材料为钙磷纳米颗粒。
2.一种由柠檬色赤杆菌合成并自组装的生物纳米材料，其特征在于，由权利要求1所述的柠檬色赤杆菌( Erythrobacter citreus )X3-1411在含磷水体系中合成并经自组装制备而成；
所述含磷水体系为海水冲厕废水或生活废水，磷元素的浓度为0 .3mM-1 .3mM。
3.权利要求2所述的生物纳米材料的制备方法，其特征在于，包括柠檬色赤杆菌(Erythrobacter citreus )X3-1411菌株活化的步骤，以及将活化后的菌株在含磷水体系中进行培养及自组装的步骤。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述菌株活化的步骤包括：将柠檬色赤杆菌( Erythrobacter citreus )X3-1411接种于LB培养基中，180～220rpm，20-30℃，活化培养18-30h。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，将柠檬色赤杆菌( Erythrobactercitreus )X3-1411接种于LB培养基中，200rpm，25℃，活化培养24h。
6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述LB培养基的配方为：1％蛋白胨，0.3％酵母粉，陈海水配制。
7.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养自组装的步骤包括：将活化后的菌株接种于含磷水体系中，180～220rpm，15～30℃，培养42-54h。
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，将活化后的菌株接种于含磷水体中，200rpm，25℃，培养48h。
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述活化后的菌株的接种量为8-12％。
10.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述培养及自组装的步骤，还包括：将培养后的培养液离心，去除上清液，得到含纳米材料的菌体。
11.权利要求2所述的生物纳米材料在去除水体中污染物中的应用；或者在作为药物载体、硬组织修复材料、制备抗肿瘤药物中的应用。
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