CN115838654A - 一种具有砷吸附能力的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
一种具有砷吸附能力的植物乳杆菌及其应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115838654A CN115838654A CN202210895628.7A CN202210895628A CN115838654A CN 115838654 A CN115838654 A CN 115838654A CN 202210895628 A CN202210895628 A CN 202210895628A CN 115838654 A CN115838654 A CN 115838654A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- lactobacillus plantarum
- strain
- ali
- arsenic
- adsorption capacity
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 title claims abstract description 85
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 title claims abstract description 85
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 title claims abstract description 85
- RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N arsenic atom Chemical compound [As] RQNWIZPPADIBDY-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 43
- 229910052785 arsenic Inorganic materials 0.000 title claims abstract description 39
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 title claims abstract description 27
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 14
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 9
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 9
- 239000002068 microbial inoculum Substances 0.000 claims description 8
- 238000009360 aquaculture Methods 0.000 claims description 7
- 244000144974 aquaculture Species 0.000 claims description 7
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 3
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims 1
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 claims 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 29
- 241000238017 Astacoidea Species 0.000 description 24
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 108091006146 Channels Proteins 0.000 description 8
- 102000034573 Channels Human genes 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 5
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N glycerol Substances OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N cycloheximide Chemical compound C1[C@@H](C)C[C@H](C)C(=O)[C@@H]1[C@H](O)CC1CC(=O)NC(=O)C1 YPHMISFOHDHNIV-FSZOTQKASA-N 0.000 description 4
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 description 4
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 description 4
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000001095 inductively coupled plasma mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 3
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 3
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 3
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010078777 Colistin Proteins 0.000 description 2
- 208000035240 Disease Resistance Diseases 0.000 description 2
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 description 2
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 229960001127 colistin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 2
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- ZESIAEVDVPWEKB-ORCFLVBFSA-N n-[(2s)-4-amino-1-[[(2s,3r)-1-[[(2s)-4-amino-1-oxo-1-[[(3s,6s,9s,12s,15r,18s,21s)-6,9,18-tris(2-aminoethyl)-3-[(1r)-1-hydroxyethyl]-12,15-bis(2-methylpropyl)-2,5,8,11,14,17,20-heptaoxo-1,4,7,10,13,16,19-heptazacyclotricos-21-yl]amino]butan-2-yl]amino]-3-h Chemical compound OS(O)(=O)=O.OS(O)(=O)=O.CC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O.CCC(C)CCCCC(=O)N[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]([C@@H](C)O)CN[C@@H](CCN)C(=O)N[C@H]1CCNC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CCN)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCN)NC1=O ZESIAEVDVPWEKB-ORCFLVBFSA-N 0.000 description 2
- 238000000053 physical method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 235000020255 yak milk Nutrition 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000195493 Cryptophyta Species 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 1
- 240000003826 Eichhornia crassipes Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000269799 Perca fluviatilis Species 0.000 description 1
- 241000238030 Procambarus clarkii Species 0.000 description 1
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N Sulphide Chemical compound [S-2] UCKMPCXJQFINFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N alumane Chemical class [AlH3] AZDRQVAHHNSJOQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000010868 animal carcass Substances 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L calcium dihydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[Ca+2] AXCZMVOFGPJBDE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000009194 climbing Effects 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 239000003651 drinking water Substances 0.000 description 1
- 235000020188 drinking water Nutrition 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 239000003337 fertilizer Substances 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 210000003495 flagella Anatomy 0.000 description 1
- 238000005189 flocculation Methods 0.000 description 1
- 230000016615 flocculation Effects 0.000 description 1
- 239000013505 freshwater Substances 0.000 description 1
- 235000013402 health food Nutrition 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002917 insecticide Substances 0.000 description 1
- 230000006799 invasive growth in response to glucose limitation Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002505 iron Chemical class 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 230000000877 morphologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000000575 pesticide Substances 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000001223 reverse osmosis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- FJDHVPHQDPJCHK-UHFFFAOYSA-N trisodium;trioxidoarsane Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-][As]([O-])[O-] FJDHVPHQDPJCHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000012070 whole genome sequencing analysis Methods 0.000 description 1
- 229910000859 α-Fe Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A40/00—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production
- Y02A40/80—Adaptation technologies in agriculture, forestry, livestock or agroalimentary production in fisheries management
- Y02A40/81—Aquaculture, e.g. of fish
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供一种具有砷吸附能力的植物乳杆菌及其应用。本发明提供的具有砷吸附能力植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M 2022068。本发明提供的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株具有砷吸附能力，且具有耐低温性能。
Description
技术领域
本发明涉及微生物领域，具体涉及一种具有砷吸附能力的植物乳杆菌及其应用。
背景技术
砷污染已成为全球面临的一个严重环境污染问题。砷元素广泛存在于自然界，其化合物应用于农业中作为农药、除草剂、杀虫剂及化肥被广泛使用。在我国，由于矿山排放及工农业生产所使用的各种含砷化学物质等因素使土壤、地下水、饮用水中砷含量不断升高，最终通过“土壤/水→植物体/动物体→人体”的食物链被富集和摄入，严重危害人体健康。
目前针对水产养殖中砷污染水体的治理修复技术常见的主要有物理法和化学法。物理法包括沉淀法、吸附法、离子交换法、反渗透等，其中沉淀法和吸附法应用较多；化学法包括热沉淀法、絮凝沉淀法、铁氧体法等，其中常用的沉淀剂包括铁盐、铝盐、钙盐、石灰水、硫化物等，这些方法有些效果较好但普遍存在着成本高、工程量大、极易对环境造成二次污染等缺点。
小龙虾，学名克氏原螯虾，是深受中国消费者喜爱的淡水经济虾类，近几年年均养殖产量达200万吨左右，多以稻田养殖模式为主，占比超过80％。小龙虾生长速度快、摄食范围广(包括水草、藻类、水生昆虫、动物尸体等)、适应能力强，在受多种污染的水体中也可生存，这大大增加了其遭受重金属污染的风险。针对目前小龙虾以稻田养殖模式为主，稻田作为农业生产用地可能面临着砷等重金属污染的风险，导致小龙虾体内砷残留并最终威胁广大消费者的饮食健康问题。小龙虾体内积累的砷主要以三价砷As(Ⅲ)的形态存在，
研究表明，微生物的水-甘油通道蛋白(GlpF)是As(Ⅲ)进入细胞内部的通道蛋白，微生物表达GlpF基因可以提高其对砷的吸附能力。因此，寻找一株具有砷吸附功能的益生菌菌株，开辟一种绿色、高效、经济的食源性微生物砷污染治理方式显得尤为重要。
发明内容
针对现有技术中存在的水产生物砷污染的问题，本发明提供一种具有吸附砷的性能的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株。
本发明提供的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株能够在24～42℃范围内正常生长，且最适生长温度为32～34℃，而现有技术中的植物乳杆菌的最适生长温度为36～38℃，所以本发明提供的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株表现出具有耐低温生长的特性。
本发明提供一株具有砷吸附能力的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2022068。
优选地，所述植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株的16S rRNA基因序列如SEQ IDNO.1所示。
优选地，所述植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株表达氨基酸序列为SEQ ID NO.3的水-甘油通道蛋白(GlpF)。
优选地，所述植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株含有核苷酸序列为SEQ ID NO.2的水-甘油通道蛋白(GlpF)的基因序列。
本发明还提供一种植物乳杆菌菌剂的发酵制备方法，所述方法包含如下步骤：培养所述的植物乳杆菌菌株。
优选地，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将所述的植物乳杆菌菌株放大培养；
(2)将步骤(1)得到的产物加入到液体培养基中，在24-42℃条件下发酵培养。
本发明还提供一种菌剂，所述菌剂中含有所述的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株。
优选地，所述菌剂通过所述的发酵制备方法得到。
本发明还提供所述的植物乳杆菌或所述的菌剂在吸附砷中的应用。
本发明还提供所述的植物乳杆菌或所述的菌剂在水产养殖中的应用。
本发明还提供一种饲料，所述饲料中含有所述的植物乳杆菌或所述的菌剂。
本发明提供的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株具有砷吸附能力，且具有耐低温性能。将该菌株应用于水产生物养殖，能够适应水产生物的生长温度，小龙虾等水产生物通过进食具有砷吸附能力的益生菌菌株，菌株定植于小龙虾等水产生物的肠道中不仅可以提高小龙虾等水产生物的抗病能力，还可以促进砷通过粪便排出体外，从而达到降低小龙虾等水产生物体内砷残留，保障消费者食品安全的目的。
菌种保藏信息
本发明提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株于2022年1月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M2022068保藏地址：中国.武汉.武汉大学，邮政编码：430072；电话：027-68754052。
附图说明
图1所示为植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株的菌落形态；
图2所示为植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株镜检图；
图3所示为物种间进化关系图；
图4所示为不同温度下植物乳杆菌生长情况；
图5所示为植物乳杆菌在不同As(Ⅲ)浓度条件下生长曲线；
图6所示为不同处理时间植物乳杆菌对As(Ⅲ)清除率。
具体实施方式
本发明提供了一株具有砷吸附能力的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株。本发明提供的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株不仅能够吸附砷，而且其能够在24～42℃范围内正常生长，较现有技术中的植物乳杆菌具有耐低温特性。
本发明提供的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株分离自西藏阿里地区海拔约5000m的牧民家的牦牛奶中，属于天然野生型菌株，收录于《可用于保健食品的益生菌菌种名单》中，具有食品安全属性。经16S rDNA鉴定该菌株为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株，该菌株已于2022年1月13日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2022068。
对本发明提供的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ进行最适生长温度研究，结果显示该菌株在24～42℃范围内均可正常生长，且最适生长温度为32～34℃。现有技术中的植物乳杆菌的最适生长温度为36～38℃，如现有技术CN 109423467 B，CN 111436203 B，CN114672480 A，CN 114717150 A中涉及植物乳杆菌。本发明提供的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株较现有技术中的植物乳杆菌具有耐低温生长的特性。该特性可确保其在小龙虾等水产生物养殖的环境温度中正常生存，保持良好的生长活性，为菌株发挥应用效果提供保障。
本申请发明人对植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株进行了全基因组测序分析，结果显示该菌株含有编码水-甘油通道蛋白(GlpF)的基因片段，其核苷酸序列为：SEQ IDNO.2；该植物乳杆菌水-甘油通道蛋白(GlpF)，其氨基酸序列为：SEQ ID NO.3。水-甘油通道蛋白(GlpF)是As(Ⅲ)进入细胞的通道蛋白，表达GlpF基因的细菌可提高其对As(Ⅲ)吸附能力，为该菌株具有As(Ⅲ)吸附能力奠定理论基础。
对所述植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ进行As(Ⅲ)耐受性及吸附能力的研究，结果显示该菌株在终浓度50.0mg/LAs(Ⅲ)的环境中可正常生长，对As(Ⅲ)具有较强的吸附能力，1.0mg/L浓度As(Ⅲ)的环境下60min时间内对As(Ⅲ)清除率达55.57％；小龙虾进食含该菌株的饲料后，在砷暴露的条件下，21天生长实验周期内，粪便中的砷含量由4.67μg/g提高至8.18μg/g，该菌株可促进砷通过粪便排出体外，有效降低砷在龙虾体内的积累。
本发明提供的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株具有砷吸附能力，且具有耐低温性能。将该菌株应用于水产生物养殖，能够适应水产生物的生长温度，小龙虾等水产生物通过进食具有砷吸附能力的益生菌菌株，菌株定植于小龙虾等水产生物的肠道中不仅可以提高小龙虾等水产生物的抗病能力，还可以促进砷通过粪便排出体外，从而达到降低小龙虾等水产生物体内砷残留，保障消费者食品安全的目的。
本发明实施例中所用仪器及试剂来源信息如下表1和表2所示。
表1仪器信息表
| 仪器 | 型号 | 出售厂家 |
| 恒温恒湿培养箱 | HHS-506 | 海尔生物医疗 |
| 全自动生长曲线分析仪 | Bioscreen C | 芬兰Bioscreen公司 |
| 生物安全柜 | HR1500-IIA2-E | 海尔生物医疗 |
| 高速离心机 | Minispin | Eppendorf |
| PCR仪 | C1000Touch | Bio-rad |
| 电泳仪 | DYY-8C | 北京六一仪器厂 |
| 紫外分光光度计 | SP-754 | 上海光谱仪器有限公司 |
表2试剂信息表
| 试剂名称 | 纯度 | 生产厂商 |
| 石蕊牛乳培养基 | BR | 北京索莱宝生物科技有限公司 |
| BL琼脂培养基 | BR | 北京索莱宝生物科技有限公司 |
| 放线菌酮 | 95％ | 上海阿拉丁生化科技股份有限公司 |
| 硫酸粘菌素 | 19,000IU/mg | 西格玛奥德里奇(上海)贸易有限公司 |
| 碳酸钙 | 99％ | 上海源叶生物科技有限公司 |
| 革兰氏染色液 | 98％ | 北京索莱宝生物科技有限公司 |
| 高保真DNA聚合酶 | 2U/μL | 赛默飞世尔科技(中国)有限公司 |
| 亚砷酸钠 | ≥90％ | Merck公司 |
实施例1菌株的分离与鉴定
植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ的分离与鉴定，步骤如下：
(1)菌株富集：取5ml西藏阿里地区海拔约5000m的牧民家的牦牛奶样品加入45ml无菌生理盐水分散均匀，取2ml上述分散液加入到20ml灭菌的石蕊牛乳培养基中，置于37℃培养箱静置培养，待培养基酸化凝固并呈现粉红色时取出。
(2)培养单菌落：将石蕊牛乳培养基菌液稀释到10-5，吸取100μl涂布于含有10ppm放线菌酮和10ppm硫酸粘菌素的BL固体培养基平板上，置于37℃培养箱培养，待菌落形成。
(3)筛选产酸菌种：将初筛得到的单菌落，在含0.2％CaCO3的BL固体培养基平板上划线培养，37℃培养箱培养36h，结束培养后观察有无透明圈，选择透明圈大的单菌落进行纯化实验。
(4)革兰氏染色初步鉴定：对复筛菌株进行革兰氏染色，如果菌体是紫色，则为革兰氏阳性菌，留下来进行后续研究，如果染色呈现红色，该菌株是革兰氏阴性菌直接淘汰。鉴定结果显示：所得复筛菌株为革兰氏阳性菌，不运动，无芽孢，无鞭毛，无荚膜，菌体呈杆状，成对存在，此菌株是目标菌株。在BL平板上，菌落呈圆形，中等大小，凸起，微白色，湿润，边缘整齐，直径为3mm±1mm，菌落背面为微黄色，其菌落形态如图1所示；菌株镜检形态特征如图2所示。
(5)分子生物学鉴定16S rDNA：使用高保真酶对待鉴定菌株进行16S rDNA测序及菌种鉴定。采用的引物信息及PCR扩增反应体系和条件如表3和表4所示，16S rDNA基因测序结果如SEQ ID NO.1所示。
表3.引物信息
表4.PCR扩增反应体系和条件
SEQ ID NO.1序列如下所示：
将16S rDNA基因测序结果进行NCBI-BLAST比对，鉴定该菌株为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，命名为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Ali.Plateau.LP.Ⅷ。该菌株于2022年1月13日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2022068，保藏地址：中国.武汉.武汉大学。
菌株同源性分析结果如图3所示，植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株与其他9株植物乳杆菌相比单独位于系统发育树的一支，说明该菌株具有特异性。
实施例2植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ全基因组测序分析
将实施例1中获得的目的菌株植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ委托北京诺禾致源科技股份有限公司进行全基因组测序分析,并与NCBI数据库中收录的遗传信息较为完整的其他9株植物乳杆菌进行菌株同源性分析。结果显示，该菌株含有表达水-甘油通道蛋白(GlpF)的基因，其序列如SEQ ID NO.2所示：
水-甘油通道蛋白(GlpF)是As(Ⅲ)进入细胞的通道蛋白，表达GlpF基因的细菌可提高其对As(Ⅲ)吸附能力。该基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示：
实施例3植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ最适生长温度研究
将在MRS液体培养基活化后的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ按5％(V/V)的接种量接种于MRS液体培养基的试管中，分别置于24℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃、38℃、40℃、42℃的恒温培养箱中静置培养20h后涡旋混匀，在600nm波长处分别测定不同温度下各试管培养液的吸光度值(OD600nm)，每种温度条件设置三组平行。不同温度下植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ培养20h后培养液的OD600nm如图4所示。植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ在温度24～42℃范围内均可生长，其最适生长温度为32～34℃，
现有技术中的植物乳杆菌最适生长温度为37℃，如现有技术CN 109423467 B，CN111436203 B，CN 114672480 A，CN 114717150 A中涉及植物乳杆菌，本发明提供的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ较现有技术中的植物乳杆菌最适生长温度偏低3～5℃，具有耐低温特性。本发明提供的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株耐低温生长的特征可以确保其在小龙虾养殖的水温环境中自身保持良好的生长活性，为菌株发挥应用效果提供保障。
实施例4植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ对As(Ⅲ)耐受能力测定
将活化后的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ分别接种到As(III)终浓度为1.0mg/L、5.0mg/L、10.0mg/L、20.0mg/L、50.0mg/L、100.0mg/L的MRS液体培养基中，使用BioscreenC全自动生长曲线分析仪37℃条件下培养，600nm波长下每30min取样测定吸光度值(OD600nm值)，以MRS液体培养基作对照，测得的数据用于生长曲线的绘制，各培养基中植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ的生长曲线如图5所示。
由图5可知，随着培养基中As(Ⅲ)浓度的升高，菌株的生长逐渐受到抑制，当As(Ⅲ)浓度≤50.0mg/L时，菌株的生长部分受到抑制；当As(Ⅲ)浓度为100.0mg/L时，菌株的生长几乎完全受到了抑制，无法正常生长。实验结果表明，该植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ可耐受As(Ⅲ)浓度为50.0mg/L的生长环境，对As(Ⅲ)具有较强的耐受性。
实施例5.植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株对As(Ⅲ)吸附能力的测定
将活化后的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株接种到MRS液体培养基中于37℃下静置培养16h，于4℃，6000rpm条件下离心10min后弃上清收集菌体，菌体用PBS洗涤三次，并重悬于PBS中使菌体终浓度为109CFU/mL。将As(III)液添加到上述细菌溶液中，使As(III)终浓度为1.0mg/L(按As计)，置于摇床在37℃条件下分别处理30min、60min、90min后取出，6000rpm条件离心10min后，收集上清液用0.22μm的滤膜过滤，用ICP-MS(电感耦合等离子体质谱法)检测上清液中残留的As(III)含量。菌株对As(III)的吸附能力用砷清除率衡量，砷清除率按以下公式计算：
式中：C0表示初始As离子浓度，C1表示经吸附处理后As离子浓度。
实验结果如图6所示，处理30min、60min和90min后植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株对As(Ⅲ)的清除率分别为35.23％、55.57％和55.46％，植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株对As(Ⅲ)的清除率在0～60min时间段内呈上升趋势，60min后对As(Ⅲ)的清除率基本不变。
实施例6植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ对龙虾体内砷吸附效果的测试
将从水产市场购买的鲜活健康小龙虾随机分为两组，每组20只。饲养于经消毒的水箱中，水箱中放适量水葫芦供小龙虾隐蔽栖息，水箱上方罩网纱，防止小龙虾爬出，且便于空气流通，实验养殖用水为曝气24h以上洁净的自来水。两组小龙虾在水箱环境中饲喂普通饲料适应一周，而后每天两次(间隔10h)按表5饲喂不同配方饲料，周期21天。每次喂食2h后，通过虹吸法从水箱底部将粪便吸出，离心(5000rpm,5min)收集重相，将同一组收集的粪便混合后经处理，其中的砷含量通过ICP-MS进行测定。
表5.小龙虾实验分组及饲喂方式情况
注：添加As(III)的饲料：普通饲料中添加50.0mg/kg的As(III)；添加植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株的饲料：每克普通饲料中添加1×108CFU植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株的饲料。
经测定，对照组与实验组小龙虾粪便中的砷含量分别为4.67μg/g和8.18μg/g，实验结果表明，该菌株有助于砷从粪便中排出体外，从而降低小龙虾体内砷的残留。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (11)
1.一种具有砷吸附能力的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株，其特征在于，其保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO:M2022068。
2.根据权利要求1所述的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株，其特征在于，所述植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株的16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.根据权利要求1或2所述的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株，其特征在于，所述植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株表达氨基酸序列为SEQ ID NO.3的水-甘油通道蛋白(GlpF)。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株，其特征在于，所述植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株含有核苷酸序列为SEQ ID NO.2的水-甘油通道蛋白(GlpF)的基因序列。
5.一种植物乳杆菌菌剂的发酵制备方法，其特征在于，所述方法包含如下步骤：培养权利要求1-4任意一项所述的植物乳杆菌菌株。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将权利要求1-4任意一项所述的植物乳杆菌菌株放大培养；
(2)将步骤(1)得到的产物加入到液体培养基中，在24-42℃条件下发酵培养。
7.一种菌剂，其特征在于，所述菌剂中含有权利要求1-4任意一项所述的植物乳杆菌Ali.Plateau.LP.Ⅷ菌株。
8.根据权利要求7所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂通过权利要求5或6所述的发酵制备方法得到。
9.权利要求1-4任意一项所述的植物乳杆菌或权利要求7或8所述的菌剂在吸附砷中的应用。
10.权利要求1-4任意一项所述的植物乳杆菌或权利要求7或8所述的菌剂在水产养殖中的应用。
11.一种饲料，其特征在于，所述饲料中含有权利要求1-4任意一项所述的植物乳杆菌或权利要求7或8所述的菌剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210895628.7A CN115838654A (zh) | 2022-07-27 | 2022-07-27 | 一种具有砷吸附能力的植物乳杆菌及其应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202210895628.7A CN115838654A (zh) | 2022-07-27 | 2022-07-27 | 一种具有砷吸附能力的植物乳杆菌及其应用 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115838654A true CN115838654A (zh) | 2023-03-24 |
Family
ID=85574780
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202210895628.7A Pending CN115838654A (zh) | 2022-07-27 | 2022-07-27 | 一种具有砷吸附能力的植物乳杆菌及其应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115838654A (zh) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009159955A (ja) * | 2007-12-12 | 2009-07-23 | Kyushu Medical:Kk | クルマエビ腸内から分離したプロバイオティクス乳酸菌 |
| CN104651268A (zh) * | 2014-12-31 | 2015-05-27 | 北京博锦元生物科技有限公司 | 一种植物乳杆菌及其应用 |
| EP3168292A1 (en) * | 2015-11-06 | 2017-05-17 | Probis Sp. z o.o. | New lactobacillus plantarum strain amt14 and composition containing the strain of lactobacillus plantarum amt14 |
-
2022
- 2022-07-27 CN CN202210895628.7A patent/CN115838654A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009159955A (ja) * | 2007-12-12 | 2009-07-23 | Kyushu Medical:Kk | クルマエビ腸内から分離したプロバイオティクス乳酸菌 |
| CN104651268A (zh) * | 2014-12-31 | 2015-05-27 | 北京博锦元生物科技有限公司 | 一种植物乳杆菌及其应用 |
| EP3168292A1 (en) * | 2015-11-06 | 2017-05-17 | Probis Sp. z o.o. | New lactobacillus plantarum strain amt14 and composition containing the strain of lactobacillus plantarum amt14 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| CLAUDIA MILENA RODRÍGUEZ-LÓPEZ等: "Isolation and identification of Lactobacillus spp. (Lactobacillaceae) resistant to Cd(II) and As(III) from fermented cocoa", 《ACTA BIOLÓGICA COLOMBIANA》, vol. 26, no. 1, pages 19 - 29 * |
| GENBANK: MCJ2384506.1: "aquaporin family protein [Lactiplantibacillus plantarum]", 《GENBANK》 * |
| MARÍA JESÚS CLEMENTE等: "In vitro evaluation of the efficacy of lactobacilli and yeasts in reducing bioavailability of inorganic arsenic", 《LWT》, vol. 126, pages 1 - 7 * |
| RAFAAT M. ELSANHOTY等: "Application of lactic acid bacteria in removing heavy metals and aflatoxin B1 from contaminated water", 《WATER SCIENCE & TECHNOLOGY》, vol. 74, no. 3, pages 625 - 638 * |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109554316B (zh) | 一种促进植物生长发育及强化积累污染土壤重金属的生物修复试剂及修复方法 | |
| CN112625952B (zh) | 一株枯草芽孢杆菌斯氏亚种及其在抑制蓝藻水华中的应用 | |
| CN101921710B (zh) | 过度养殖区水体微生物修复剂 | |
| CN102899277B (zh) | 一种蜡状芽孢杆菌及其应用 | |
| CN111671000B (zh) | 一种包含粪肠球菌的微生态复合预混合饲料及其在水产养殖中的应用 | |
| CN115710566B (zh) | 一种用于稻田综合种养的菌株及其应用 | |
| CN115895960B (zh) | 一种用于稻渔综合种养的菌株及其应用 | |
| CN110878265A (zh) | 一株降解黄曲霉毒素的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN117070428B (zh) | 枯草芽孢杆菌bs-22株在改善养殖环境中的应用 | |
| CN107937301B (zh) | 一种解淀粉芽孢杆菌及其在水产养殖中的应用 | |
| CN113699057A (zh) | 一株具有异养硝化-好氧反硝化功能的椿象红球菌及其应用 | |
| CN115725466B (zh) | 一株马胃葡萄球菌及其在鱼类养殖中应用 | |
| CN114437964B (zh) | 一株贝莱斯株芽孢杆菌及其应用 | |
| CN114292762B (zh) | 一种棕榈油假丝酵母及其应用 | |
| CN113980838B (zh) | 一株高效定向表达细菌素m6的枯草芽孢杆菌及其应用 | |
| CN113234608B (zh) | 一株可降解亚硝酸盐的异常威克汉姆酵母菌 | |
| CN115612647A (zh) | 一种富硒生物絮团的制备方法 | |
| CN115838654A (zh) | 一种具有砷吸附能力的植物乳杆菌及其应用 | |
| CN114621884B (zh) | 一株枯草芽孢杆菌及其在水质净化中的应用 | |
| CN114921369A (zh) | 一株产蛋白酶的菌株及其应用 | |
| CN115895935B (zh) | 一种枯草芽孢杆菌及其在青苔防治方面的应用 | |
| CN115975846B (zh) | 一株沙阿霉素链霉菌、其微生态制剂及其制备方法 | |
| CN117106676B (zh) | 一株枯草芽孢杆菌及其在饲料生产中的应用 | |
| CN117165480B (zh) | 一株产ddp-iv抑制剂、铁载体的维德曼氏芽孢杆菌及其应用 | |
| CN108004181A (zh) | 一株甲基营养型芽孢杆菌及其培养物和应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |