CN115836999A

CN115836999A - 一种表皮蛋白促进剂及其制备方法和应用

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Publication number: CN115836999A
Application number: CN202210638518.2A
Authority: CN
Inventors: 杨帆; 郭苗; 周正; 周紫燕
Original assignee: Mcgill Biotechnology Co ltd; Shanghai Maijili Daily Necessities Co Ltd
Current assignee: Mcgill Biotechnology Co ltd; Shanghai Maijili Daily Necessities Co Ltd
Priority date: 2022-06-07
Filing date: 2022-06-07
Publication date: 2023-03-24

Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及一种表皮蛋白促进剂及其制备方法和应用。在米浆中加入酶，酶解，获得米浆酶解液；将酵母菌接种至米浆酶解液中，发酵后获得发酵液；收集含有活性物质的发酵液，即为表皮蛋白促进剂，其中所述活性物质为胞嘧啶核苷。本发明提供的表皮蛋白促进剂可以作为表皮紧密连接蛋白claudin‑1、claudin‑4表达促进剂，闭合蛋白occludin表达促进剂，水通道蛋白mRNA表达促进剂，纤维细胞内透明质酸合成酶3mRNA表达促进剂；可以将其作为表皮蛋白促进剂应用于产品。

Description

一种表皮蛋白促进剂及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种表皮蛋白促进剂及其制备方法和应用。

背景技术

角质层作为物理性屏障参与皮肤屏障功能，抵御外来伤害并阻止表皮的异常水分流失。紧密连接(tight junctions)作为角质层下方的细胞旁屏障起作用，表皮屏障的主要调控因子。二者既构成完整的皮肤屏障，维持皮肤环境稳态，又能互相作用影响。

紧密连接蛋白的功能很多，其主要作用包括以下几个方面：①紧密连接蛋白能够将上皮细胞紧密连接，使细胞不易受到破坏，因而是皮肤屏障功能的重要组成部分；②紧密连接结构和(或)紧密连接蛋白质能够控制分子的细胞旁通路，对分子大小、离子类型、细胞渗透性有选择性(屏障功能)；③它们能够分离细胞膜基底部分的脂质到胞膜顶部从而形成两个不同的膜功能区，从而阻止两个不同功能区之间的相互弥散，以保持细胞每个表面的专有功能，维持细胞的极性(分离作用)。紧密连接结构/蛋白质也参与信号转导通路及细胞表面受体如转化生长因子-β受体，参与细胞增殖和分化以及囊泡运输过程。

因此促进紧密连接蛋白生成可以帮助增强皮肤屏障功能，维持细胞功能，促进细胞增殖和分化，新陈代谢，保持皮肤结构和弹性，可以改善敏感、细纹、肌理等皮肤问题，对于皮肤的稳定和抗老有重要意义。

紧密连接蛋白一般存在于哺乳动物表皮中，紧密连接蛋白包括：claudin家族蛋白、闭合蛋白(occludin)、连接黏附分子家族蛋白以及紧密连接斑块蛋白，如属于MAGUK蛋白家族的ZO-1、ZO-2、ZO-3、扣带蛋白(cingulin)、symplekin蛋白和属于细胞极性复杂蛋白质家族的aPKC、Par3和Par6。不同的紧密连接蛋白在表皮中的表达量及表达部位各不相同，例如闭合蛋白和扣带蛋白仅限于颗粒层；ZO-1和Cldn-4分布于基底层；claudin-1和MUPP-1则可见于表皮的各层。此外，除角质形成细胞外，claudin-1在固定和迁徙的朗格汉斯细胞中也有表达。然而，尽管有几种紧密连接蛋白在表皮的全层均有表达，但是典型的紧密连接结构只存在于颗粒层。

紧密连接蛋白的作用与功能取决于其构成组分，而构成组分又决定于细胞类型和分化程度以及病理和生理刺激。例如，claudin家族蛋白(脊椎动物有24种该类蛋白质)不同的组合及配比率对于紧密连接的渗透性和离子选择性至关重要。

闭合蛋白(occludin)与之前两种claudin一样，闭合蛋白(occludin)同属于紧密连接结构的重要组成蛋白。它由4个跨膜区域、2个细胞外环状结构和3个细胞浆区域构成。皮肤的表皮细胞之间通过闭合蛋白使细胞间的空隙封闭，形成机体渗透屏障，保持细胞两侧的物质差异，维持机体的正常生理功能。

水通道蛋白AQP3和皮肤干燥的关系，大量研究证明AQP3的改变与鼠和人皮肤的干燥有关。但机制还有争论。AQP3表达增加和分布改变可增加经表皮水分丢失，导致特应性皮炎患者皮肤干燥，湿疹患者表皮中AQP3下降，认为经AQP3引起的水转运减少是皮肤干燥的主要原因。UV照射引起的AQP3下调和皮肤失水相关。目前认为，AQP3的调节既可以是皮肤失水的原因，也可能是失水的结果。有研究发现小鼠AQP3缺失引起皮肤干燥，同时也有认为在角质形成细胞中，高渗环境能够上调AQP3表达，即AQP3表达在暴露于失水环境的组织中。

AQP3和甘油代谢角质层是皮肤水合作用的重要部分。角质层中的甘油，少部分是由皮脂腺中甘油三酯水解而来。角质层和皮脂腺中均发现有脂肪酶的活性，但表皮中的甘油三酯作为能源被利用，因此只能来源于皮脂腺。甘油三酯在皮脂腺中水解成甘油并被转运到角质层。甘油是能量代谢的重要媒介，也是多种脂类生物合成的重要底物。甘油存在的情况下，磷脂酶D可以使磷酸卵磷脂代谢为磷脂酰甘油。研究显示，AQP3转运甘油能够促进磷脂酰甘油的合成。磷脂酰甘油是蛋白激酶C(protein kinase C，PKC)的重要激活剂，可以作为第二信使调节角质形成细胞的功能。AQP3转运甘油能够刺激角质形成细胞分化，AQP3过度表达，角质形成细胞增殖下降。以上结果提示AQP3转运甘油在角质形成细胞的增殖和分化中可能发挥复杂而重要的作用。

在体内催化透明质酸合成，透明质酸合成酶(HASs)是一类特异性双功能糖基转移酶，广泛存在于多种生物体中，从而在一系列生理、病理过程中扮演重要角色。HAS3催化生成的HA链最短，分子量在200ku～300ku之间。细胞外的大分子HA被透明质酸酶酶解或发生氧化反应降解可以获得小分子HA。小分子HA能够刺激细胞激增，启动信号级联反应，同时还参与血管生成和炎症反应。

现有技术中，米发酵液用于食品领域较多，而应用于化妆品领域涉及较少。

发明内容

本发明的目的在于提供一种表皮蛋白促进剂及其制备方法和应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明首先提供一种表皮蛋白促进剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)在米浆中加入酶，酶解，获得米浆酶解液；

(2)将酵母菌接种至米浆酶解液中，发酵后获得发酵液；

(3)收集含有活性物质的发酵液，即为表皮蛋白促进剂，其中所述活性物质为胞嘧啶核苷(胞苷)。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述米浆为大米的米浆。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述米浆的获得方式为：大米粉末加水，搅拌，得到米浆。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述米与水的质量比为3:7～7:3。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述米浆中加入含有钙离子的物质，使得Ca²⁺浓度为0.1～5mmol/L，例如所述米浆中可以加入0.1～5mmol/L的CaCl₂溶液。本发明中，选择向米浆中加入Ca²⁺主要目的是：Ca²⁺可以调节细胞膜的通透性，对于调节酶和酵母菌的生物活性有帮助。选择该选定浓度是基于细胞生物活性促进效率和钙离子的溶解性考虑的，浓度过大或过小都影响其效果。本发明通过控制离子种类和浓度可以改变细胞膜的通透性，加快特定成分(胞苷)由胞内向胞外分泌，以此提高胞苷产量。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述酶选自中性蛋白酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶或纤维素酶等中的一种或几种，优选为β-葡聚糖酶。

在本发明的一个实施方式中，步骤(1)中，所述酶选自为β-葡聚糖酶，β-葡聚糖酶的添加量为米浆质量的0.001％-0.5％，酶活为150-200U/g。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，所述酵母菌为saccharomyces veronae。所使用的Saccharomyces veronae发酵过程中不产生乙醇，且能高效生产胞嘧啶核苷。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，所述酵母菌Saccharomyces veronae为已知的生物材料，在一些专利文献以及论文中时有报道。

在本发明的一个实施方式中，步骤(2)中，发酵的条件为：发酵温度20-40℃，发酵时间24-48小时，发酵过程pH控制为6-6.5。

在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，收集发酵液中活性物质的方法为：发酵液通过反渗透技术浓缩，高效富集得到活性物质。

在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中所述反渗透技术浓缩至10倍，获得10倍浓缩米发酵滤液。

在本发明的一个实施方式中，步骤(3)中，富集的活性物质，进一步经过加温杀菌，冷却过滤。

本发明进一步提供采用如上所述制备方法制备所得的表皮蛋白促进剂。

本发明进一步提供如上所述表皮蛋白促进剂在制备化妆品中的应用。

在本发明的一个实施方式中，本发明进一步提供如上所述表皮蛋白促进剂在制备具有皮肤屏障功能的化妆品中的应用，其中所述表皮蛋白促进剂作为紧密连接蛋白claudin-1表达促进剂。

在本发明的一个实施方式中，本发明进一步提供如上所述表皮蛋白促进剂在制备具有皮肤屏障功能的化妆品中的应用，其中所述表皮蛋白促进剂作为紧密连接蛋白claudin-4表达促进剂。

在本发明的一个实施方式中，本发明进一步提供如上所述表皮蛋白促进剂在制备具有皮肤屏障功能的化妆品中的应用，其中所述表皮蛋白促进剂作为闭合蛋白occludin表达促进剂。

在本发明的一个实施方式中，本发明进一步提供如上所述表皮蛋白促进剂在制备具有皮肤屏障功能的化妆品中的应用，其中所述表皮蛋白促进剂作为水通道蛋白AQP3mRNA表达促进剂。

在本发明的一个实施方式中，本发明进一步提供如上所述表皮蛋白促进剂在制备具有皮肤屏障功能的化妆品中的应用，其中所述表皮蛋白促进剂作为纤维细胞内透明质酸合成酶3 mRNA表达促进剂。

嘧啶核苷包括胞嘧啶核苷和尿嘧啶核苷，胞嘧啶核苷作为嘧啶核苷，具有多方面的生理活性，尤其在生物体内生理生化过程中起着重要的调控作用。胞嘧啶核苷不仅是很多抗病毒、抗肿瘤和抗艾滋病药物的良好中间体，也是基因工程研究的重要原材料，本发明中，胞嘧啶核苷是作为表皮蛋白促进剂发挥功效的，因此，本发明的表皮蛋白促进剂，即含有活性成分胞嘧啶核苷的米发酵滤液，具有优异的表皮紧密连接蛋白表达促进作用、闭合蛋白表达促进作用、水通道蛋白mRNA表达促进作用、纤维细胞内透明质酸合成酶3 mRNA表达促进作用。

本发明的表皮蛋白促进剂(即含有活性成分的米发酵滤液)也适合于皮肤外用或经口组合物中。此时，可以直接使用米发酵滤液也可以使用由米发酵滤液制备的表皮紧密连接蛋白表达促进剂、闭合蛋白表达促进剂、水通道蛋白mRNA表达促进剂、纤维细胞内透明质酸合成酶3 mRNA表达促进剂。

此处，作为皮肤外用剂，对其分类没有限制，广范地包括经皮使用的皮肤化妆品、准药品、药品等，具体而言，例如可列举出软膏、霜、乳液、化妆水、美容液、爽肤水、啫喱、美容油、面膜、粉底、唇膏、入浴剂、生发油、生发水、洗发剂、护发素、肥皂、沐浴露等。

经口组合物是指危害人体健康的可能性小、在通常的社会生活中通过经口或消化道施与而摄取的物质，不受行政区对饮食、药品、准药品等的分类的限制。因此，本实施方案中的“经口组合物”广范地包括可经口摄取的普通食品、饲料、健康食品、保健功能食品(特定保健用食品、营养功能食品、功能性标示食品)、准药品、药品等。

此外，由于本发明的表皮蛋白促进剂，即含有活性成分的米发酵滤液具有优异的表皮紧密连接蛋白表达促进作用、闭合蛋白表达促进作用、水通道蛋白mRNA表达促进作用、纤维细胞内透明质酸合成酶3 mRNA表达促进作用，因此本发明的表皮蛋白促进剂除了发挥相应的表皮蛋白促进剂以外，也可以作为用于表皮紧密连接蛋白表达、闭合蛋白表达、水通道蛋白mRNA表达、纤维细胞内透明质酸合成酶3 mRNA表达机制相关研究的试剂使用。

此外，本发明的表皮蛋白促进剂，即含有活性成分的米发酵滤液，能够作为表皮紧密连接蛋白表达促进剂、水通道蛋白mRNA表达促进剂、闭合蛋白表达促进剂、纤维细胞内透明质酸合成酶3 mRNA表达促进剂，除了适用于人以外，只要可发挥各自的作用效果，则也可适用于除人以外的动物(例如，鼠、猫、兔、狗、猪、猴等)。

本发明提供了表皮蛋白促进剂及其制备方法，本发明提供的表皮蛋白促进剂可以作为表皮紧密连接蛋白claudin-1、claudin-4表达促进剂，闭合蛋白occludin表达促进剂，水通道蛋白mRNA表达促进剂，纤维细胞内透明质酸合成酶3 mRNA表达促进剂。

本发明通过生产和富集米发酵液中特定的对肌肤有益的活性成分，同时通过表皮蛋白方面的研究可以验证其在皮肤领域的应用效果。更进一步的可以将其作为表皮蛋白促进剂应用于产品，进行了功效验证，开发出了高效的新型化妆品原料。

与现有技术相比，本发明具有以下优点及有益效果：

本发明能够制备出可作为表皮蛋白促进剂使用的米浆发酵液，具体可作为表皮紧密连接蛋白(claudin-1，claudin-4)表达促进剂、闭合蛋白(occludin)表达促进剂、水通道蛋白mRNA表达促进剂、纤维细胞内透明质酸合成酶3 mRNA表达促进剂使用，能够修复增强皮肤屏障，促进皮肤新陈代谢，预防改善皱纹，皮肤干燥，弹性降低，经皮失水率降低，皮肤老化等问题。

除此以外，本发明制备的表皮蛋白促进剂，由于具备表皮紧密连接蛋白表达促进剂、闭合蛋白表达促进剂、水通道蛋白mRNA表达促进剂、纤维细胞内透明质酸合成酶3 mRNA表达促进剂等功能，可用于药品、准药品、饮食等广泛的用途中。

具体实施方式

本发明提供了一种米浆发酵液的制备方法，包括以下步骤：

(1)在米浆中加入酶，酶解，获得米浆酶解液；

(2)将酵母菌接种至米浆酶解液中，发酵后获得发酵液；

(3)收集含有活性物质的发酵液，即为表皮蛋白促进剂，其中所述活性物质为胞嘧啶核苷，本发明研究发现，发酵液中的胞嘧啶核苷对紧密连接蛋白claudin-1、claudin-4，闭合蛋白occludin表达具有促进作用，对水通道蛋白(AQP3)mRNA表达具有促进作用，纤维细胞内透明质酸合成酶3(HAS3)mRNA表达具有促进作用。

因此，本发明提供含有活性物质胞嘧啶核苷的发酵液可以分别作为表皮紧密连接蛋白(claudin-1，claudin-4)表达促进剂、闭合蛋白(occludin)表达促进剂、水通道蛋白mRNA表达促进剂、纤维细胞内透明质酸合成酶3 mRNA表达促进剂。

本发明一个实施方式中，具体提供一种基于大米发酵液的表皮蛋白促进剂的制备方法，包括以下步骤：

(1)大米粉末加水加热，搅拌，成为米浆，在米浆中加入β-葡聚糖酶，酶的添加量为米浆质量的0.001％-0.5％，酶活为150-200U/g，进行酶解，获得米浆酶解液；

(2)将酵母菌种Saccharomyces veronae接种米浆酶解液中，发酵的条件为：发酵温度20-40℃，发酵时间24-48小时，发酵过程pH控制为6-6.5，发酵后获得发酵液；

(3)发酵液通过反渗透技术浓缩，高效富集活性物质胞嘧啶核苷，经过加温杀菌，冷却过滤得到米发酵液，即含有活性物质胞嘧啶核苷(胞苷)的米发酵液，其可作为表皮蛋白表达促进剂。

本发明所制备的表皮蛋白促进剂以米发酵滤液为有效成分，能够修复增强皮肤屏障，促进皮肤新陈代谢，预防改善皱纹，皮肤干燥，弹性降低，经皮失水率降低，皮肤老化等问题。

此外，作为本发明的表皮紧密连接蛋白表达促进剂、闭合蛋白表达促进剂、水通道蛋白mRNA表达促进剂、纤维细胞内透明质酸合成酶3 mRNA表达促进剂的有效成分，可使用含有米发酵滤液有效成分的组合物来代替单独的米发酵滤液。此处，在本发明中，含有米发酵滤液的组合物包括含有米发酵滤液和其它物质复配的得到的组合物，将米发酵滤液浓缩或者稀释得到的液体，米发酵液干燥得到的干燥物。

米发酵滤液可以通过其具有的表皮紧密连接蛋白表达促进作用来促进皮肤屏障构建和增强，使细胞不易破坏，维持细胞的极性，维持渗透屏障功能，是皮肤屏障功能改善剂。米发酵滤液可以发挥水通道蛋白mRNA表达促进作用、纤维细胞内透明质酸合成酶3mRNA表达促进作用。

本发明的含有表皮蛋白促进剂的米发酵滤液所具有的水通道蛋白mRNA表达促进作用、纤维细胞内透明质酸合成酶3 mRNA表达促进作用，可强化皮肤的屏障功能，预防、治疗或改善皮肤粗糙、干性皮肤等皮肤的老化症状、或者鱼鳞癣、银屑病、特应性皮炎、干皮病等干燥性皮肤病等。然而，除了这些用途以外，还可用于发挥水通道蛋白mRNA表达促进作用具有意义的所有用途。

下列实施例进一步说明了本发明范围内的各种实施方案。这些实施例仅是为了说明目的而给出的，并不用来限定本发明，因为在不脱离本发明的精神和范围的情况下，可以对本发明进行许多变化。

实施例1酵母菌的培养

从试管挑取酵母菌种Saccharomyces veronae接种于500mL无菌种子培养液中，摇床转速150rpm，pH为6.5，30℃下培养24h后，至对数生长期，再次接种扩培到5L种子培养基中，二次培养12h后至对数期，以15000rpm离心40min后弃掉上清液获得用于后续米浆发酵液制备的酵母菌种Saccharomyces veronae。

实施例2表皮蛋白促进剂(含有活性物质胞嘧啶核苷的米发酵滤液)的制备表皮蛋白促进剂(含有活性物质胞嘧啶核苷的米发酵滤液)的制备方法如下：

(1)称取30kg糙米浸入70kg水催芽24h，然后50℃烘干12h、粉碎为全部过200目的糙米粉，水分为10％；加70L水混为米浆，加入1.5mmol/L的CaCl₂溶液；

(2)在米浆中加入β-葡聚糖酶，酶的添加量为米浆质量的0.5％，酶活为150-200U/g，进行酶解，酶解温度为35-40℃之间，时间10小时，酶解到终点，酶解终点为间隔1h的葡萄糖含量不再变化，获得米浆酶解液；其中，所述葡萄糖含量测定可采用常用的化学法如DNS法、斐林试剂法、间接碘量法以及旋光法等。

(3)将酵母菌种Saccharomyces veronae接种米浆酶解液中，发酵的条件为：发酵温度30℃，发酵时间24小时，发酵过程pH控制为6±0.2之间，发酵后获得发酵液；

(4)发酵液通过多段式反渗透技术，反渗透压为3.5MPa，控制反渗透膜滤过温度为35℃，运行至截流部分体积为总体积的50％，通过5段式渗透过程，浓缩至10倍，高效富集活性物质胞嘧啶核苷(胞苷)，得到10倍浓缩含有表皮蛋白促进剂的米发酵滤液，且富含活性成分。

对比例1

(2)将酵母菌种Saccharomyces veronae接种米浆酶解液中，发酵的条件为：发酵温度30℃，发酵时间24小时，发酵过程pH控制为6，发酵后获得发酵液。

对比例2

(1)称取30kg糙米浸入70kg水催芽24h，然后50℃烘干12h、粉碎为全部过200目的糙米粉，水分为10％；加70L水混为米浆；

对比例3

(2)选用葡萄汁酵母(Saccharomyces uvarum)；

(3)将酵母菌接种于米浆培养液中，发酵24小时获得发酵液；

(4)发酵液通过多段式反渗透技术，反渗透压为0.1～5.5MPa，控制反渗透膜滤过温度为20-50℃，运行至截流部分体积为总体积的50％，通过5段式渗透过程，浓缩至10倍，高效富集活性物质胞嘧啶核苷(胞苷)。

(5)得到10倍浓缩米发酵滤液。

对比例4

(2)在米浆中加入纤维素酶，酶的添加量为米浆质量的0.2％，酶活为150-200U/g，进行酶解，酶解到终点，获得米浆酶解液；

(3)将酵母菌种Saccharomyces veronae接种米浆酶解液中，发酵的条件为：发酵温度30℃，发酵时间24小时，发酵过程pH控制为6，发酵后获得发酵液选用特定的酵母菌：saccharomyces veronae，且发酵过程中不产生乙醇，且能高效生产胞嘧啶核苷(胞苷)；

(4)将酵母菌接种于米浆培养液中，发酵24小时，获得米发酵液。发酵液通过多段式反渗透技术，反渗透压为3.5MPa，控制反渗透膜滤过温度为35℃，运行至截流部分体积为总体积的50％，通过5段式渗透过程，浓缩至10倍，高效富集活性物质胞嘧啶核苷(胞苷)，得到10倍浓缩含有表皮蛋白促进剂的米发酵滤液，且富含活性成分。

配方例

以下实施例为含有米发酵滤液的外用护肤制品。

配方例1

利用常规方法制造下述组成的霜。

INCI名	含量％
		水	To 100
实施例2米发酵滤液	10
		黄原胶	3.5
羧甲基纤维素	4.2
		苯氧乙醇	0.5
戊二醇	0.2
		高岭土	1.0
二氧化钛	1.0
		植物甾醇	2.1
角鲨烷	1.7
		生育酚乙酸酯	2.3
山嵛醇	3.7
		异壬酸异壬酯	0.6
PEG-100硬脂酸酯	1.3
		日用香精	0.04
乳酸	0.32
		精氨酸	0.42

配方例2

利用常规方法制造下述组成的乳液。

配方例3

利用常规方法制造下述组成的精华水。

配方例4

利用常规方法，制造具有以下组成的片剂。

成分	Mg
		实施例2米发酵滤液	33.5
维生素C	21.5
		维生素B	45.0
维生素E	28.6
		蔗糖脂肪酸酯	17.5
胶原蛋白	15.3
		酪蛋白磷酸肽	22.7
麦芽糖醇	138.0

配方例5

利用常规方法，制造具有以下组成的经口液状制剂。(1个安瓿瓶(1瓶100mL)中的组成)

成分	含量％
		实施例2米发酵滤液	1.5
苯甲酸钠	0.2
		山梨醇	15.0
木糖醇	0.5
		硫酸钙	0.7
纯化水	To 100％

效果验证试验例

效果验证试验例1紧密连接蛋白claudin-1促进作用试验

对于实施例2，以下述方式对紧密连接蛋白claudin-1促进作用进行试验。

使用75cm²烧瓶作为正常人表皮角质细胞用生长培养基(KGM)对正常人表皮角质细胞(NHEK)进行预培养。在对数阶段收集细胞并以使细胞密度为(2×10⁴细胞/100μL)接种在96孔板中培养过夜。培养后，取100μL实施例2和对照样(使用未添加实施例2所得米发酵滤液的KBM培养基以相同的方式进行培养)、100μL对比例1、100μL对比例2、100μL对比例3加入培养基培养24小时。之后，将细胞接种到每个孔上。通过ELISA方法测定细胞表面claudin-1的表达量。根据得到的值，利用下述公式计算出claudin-1的表达促进率。

Claudin-1 mRNA表达促进率(％)＝A/B*100

A：含测试样品λ405nm处的吸光度

B：不含测试样品λ405nm处的吸光度

样品选用405nm的吸收光波长为测试所使用的基质(ABTS)的测定波长。Claudin-1的产生量越多，405nm的吸光度值越高。

结果见于表1。

表1 紧密连接蛋白claudin-1促进作用试验结果

表1中，Conc.(μg/mL)所在列的数据表示加入的实施例2或对比例的发酵液进行测试的样本中，实验样品的实施浓度，以表格中的不同浓度实施实验。通过不同浓度的选择，研究Claudin-1表达促进作用和实验样品的实施浓度是否有正相关。

表1中，均值±S.E.，n＝3，*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001。

如表1所示，确认到实施例2的米发酵滤液具有优异的Claudin-1 mRNA表达促进作用。同时，根据对比例与实施例的结果可以看出，本发明中设置酶解步骤，可以提高最终产物的得率。

效果验证试验例2紧密连接蛋白claudin-4促进作用试验

使用75cm²烧瓶作为正常人表皮角质细胞用生长培养基(KGM)对正常人表皮角质细胞(NHEK)进行预培养。在对数阶段收集细胞并以使细胞密度为(2×10⁴细胞/100μL)接种在96孔板中培养过夜。培养后，取100μL实施例2和对照样(使用未添加实施例2所得米发酵滤液的KBM培养基以相同的方式进行培养)、100μL对比例1、100μL对比例2、100μL对比例3加入培养基培养24小时。之后，将细胞接种到每个孔上。通过ELISA方法测定细胞表面claudin-4的表达量。根据得到的值，利用下述公式计算出claudin-4的表达促进率。

claudin-4 mRNA表达促进率(％)＝A/B*100

A：含测试样品λ405nm处的吸光度

B：不含测试样品λ405nm处的吸光度

结果见于表2。

表2 紧密连接蛋白claudin-4促进作用试验结果

	Conc.(μg/mL)	Claudin-4表达促进率(％)
			实施例2	12.5	112.9±5.5**
对比例1	12.5	103.5±1.7*
			对比例2	12.5	98.3±2.5
对比例3	12.5	96.7±1.4*
			对比例4	12.5	101±2.1*

表2中，Conc.(μg/mL)所在列的数据表示加入的实施例2或对比例的发酵液进行测试的样本中，实验样品的实施浓度，以表格中的不同浓度实施实验。

表2中，均值±S.E.，n＝3，*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001

如表2所示，确认到实施例2的米发酵滤液具有优异的Claudin-4 mRNA表达促进作用。

效果验证试验例3 AQP3 mRNA表达促进作用试验

使用正常人表皮角质细胞用生长培养基(KGM)对正常人表皮角质细胞(NHEK)进行预培养，并通过胰蛋白酶处理来回收细胞。以使细胞密度成为2×10⁵个细胞/mL的方式用KGM培养基稀释回收的细胞。取2ml的混合物在35mm细胞培养皿上培养过夜。培养后，移除培养基，并将溶解在KGM中的2mL测试样品实施例2，对比例1，对比例2，对比例3加入培养皿中。培养24小时，按照标准方法分离总RNA。对照组，(使用未添加实施例2所得米发酵滤液的KBM培养基以相同的方式进行培养)，未添加测试样本的培养细胞的总RNA以相同的方式分离。

200ng总RNA逆转录合成cDNA，实时合成PCR检测使用实时PCR装置Real Time PCRSystem Smart Cycler II(Cepheid，Sunnyvale，CA)，SYBR ExScript RT-PCR kit(TakaraBio Inc，Otsu，Japan)，引物使用AQP3或G3PDH。

相对表达以AQP3基因和G3PDH基因表达之间的比率(AQP3/G3PDH比率)给出。

根据得到的值，利用下述公式计算出AQP3的表达促进率。

AQP3 mRNA表达的促进率(％)＝A/B*100

A：测试样AQP3/G3PDH比值

B：对照样AQP3/G3PDH比值

表3 AQP3 mRNA表达促进作用试验结果

	Conc.(μg/mL)	AQP3表达促进率(％)
			实施例2	50	115.6±1.1*
对比例1	50	102±2.0**
			对比例2	50	97.2±2.4
对比例3	50	95.3±1.6*

表3中，Conc.(μg/mL)所在列的数据表示加入的实施例2或对比例的发酵液进行测试的样本中，实验样品的实施浓度，以表格中的不同浓度实施实验。

表3中，均值±S.E.，n＝3，*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001

如表3所示，确认到实施例2的米发酵滤液具有优异的AQP3 mRNA表达促进作用。

效果验证试验例4 HAS3 mRNA表达促进作用试验

使用正常人表皮角质细胞用生长培养基(KGM)对正常人表皮角质细胞(NHEK)进行预培养，并通过胰蛋白酶处理来回收细胞。以使细胞密度成为2×10⁵个细胞/mL的方式用KGM培养基稀释回收的细胞。取2ml的混合物在35mm细胞培养皿上培养过夜。培养后，移除培养基，并将溶解在KGM中的2mL测试样品实施例2，对比例1，对比例2，对比例3加入培养皿中。培养24小时，按照标准方法分离总RNA。对照组(使用未添加实施例2所得米发酵滤液的KBM培养基以相同的方式进行培养)，未添加测试样本的培养细胞的总RNA以相同的方式分离。

200ng总RNA逆转录合成cDNA，实时合成PCR检测使用实时PCR装置Real Time PCRSystem Smart Cycler II(Cepheid，Sunnyvale，CA)，SYBR ExScript RT-PCR kit(TakaraBio Inc，Otsu，Japan)，引物使用HAS3或G3PDH。

相对表达以HAS3基因和G3PDH基因表达之间的比率(HAS3/G3PDH比率)给出。

根据得到的值，利用下述公式计算出HAS3的表达促进率。

HAS3 mRNA表达的促进率(％)＝A/B*100

A：测试样HAS3/G3PDH比值

B：对照样HAS3/G3PDH比值

表4 HAS3 mRNA表达促进作用试验结果

表4中，均值±S.E.，n＝3，*：p<0.05，**：p<0.01，***：p<0.001

如表4所示，确认到实施例2的米发酵滤液具有优异的HAS3 mRNA表达促进作用。

效果验证试验例5皮肤屏障功效测试

测试样品：配方例3中的精华水。

当皮肤屏障受损时，紧密连接蛋白可以帮助修复皮肤屏障功能。一般通过胶带剥离实验进行验证。

测试方法：用Tewameter TM 210(德国Courage&Khazak)测量胶带剥离操作之后的经皮失水，与经胶带剥离且未处理的皮肤(阳性对照物)比较，用以测量皮肤屏障功能的恢复情况。

实验步骤和结果如下：

1)测试者：30人健康女性(20～45岁)，使用同种配方产品。

2)测试区域：于左手或右手前臂内侧划定测试区域3*3cm。

3)使用：先测未剥离前的经皮失水率。使用胶带剥离15次。一边使用精华水，另一边不使用。

4)检测皮肤角质层水分含量。分别在以下4个时间段测试结果：在胶带剥离15次操作之后立即测量经皮失水(t＝0)、在胶带剥离操作之后10mins、30mins和60min再次测量经皮失水。

测试结果：

如表5所示是皮肤屏障恢复的测试结果，在保湿舒缓功效组合物处理的皮肤中，经皮失水逐渐下降，皮肤屏障功能的恢复速度明显提高，说明所制备的精华水组合物能够有效修复皮肤屏障，起到锁水保湿的作用。

表5 皮肤角质层水分含量变化率(％)

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如表5所示，配方例3显示出优于空白例的皮肤屏障修复和锁水保湿作用。

效果验证试验例6皮肤科医生临床评价

测试样品：配方例3中的精华水。

测试方法：30人健康女性(20～45岁)，使用同种配方产品。每天一次，早晚使用样品，试用4周。随机一侧面部涂抹适量的测试样品，另一侧不使用测试样品。每天早上使用防晒产品涂抹于整个面部。

使用样品28天后(D28)评估测试结果。

1)肤色暗沉：0分表示肤色暗沉，昏暗的，9分表示肤色明亮。

2)皮肤的亮度：0分表示皮肤不透亮，不反光，0分表示皮肤透亮反光。

3)皮肤的白皙度：0分表示不白皙的，深的肤色，9分表示非常白皙，如瓷器般的肤色。

变化率＝(使用样品后测量值-使用样品前测量值)/使用样品前测量值*100％。

皮肤科医生临床评估结果：

使用样品28天后，样品区域皮肤的亮度临床评分均值显著性增加24.98％，对照区域皮肤的亮度临床评分均值显著性增加6.92％；样品区域皮肤的白皙度临床评分均值显著性增加27.15％，对照区域皮肤的白皙度临床评分均值显著性增加10.29％；样品区域皮肤的光泽度临床评分均值显著性增加28.36％，对照区域皮肤的光泽度临床评分均值显著性增加10.55％。

在同样使用防晒霜的情况下，屏蔽紫外线的干扰。可以发现配方例3精华水具有提升皮肤亮度，白皙度，光泽度的功效。其得益于精华水中的米发酵液提供的表皮紧密连接蛋白(claudin-1，claudin-4)表达促进、闭合蛋白(occludin)表达促进、水通道蛋白mRNA表达促进、纤维细胞内透明质酸合成酶3 mRNA表达促进作用，能够修复和增强皮肤屏障功能，增加肌肤水分，改善粗糙，提供紧致抗老的功效。

本发明的表皮紧密连接蛋白表达促进剂、闭合蛋白表达促进剂、水通道蛋白mRNA表达促进剂、纤维细胞内透明质酸合成酶3 mRNA表达促进剂，能够修复和增强皮肤屏障功能，帮助皮肤透明质酸形成，肌肤保湿，减少皮肤水分散失，改善皱纹，降低皮肤老化症状，改善干燥性皮肤屏障功能降低的症状。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种表皮蛋白促进剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)在米浆中加入酶，酶解，获得米浆酶解液；

(2)将酵母菌接种至米浆酶解液中，发酵后获得发酵液；

(3)收集含有活性物质的发酵液，即为表皮蛋白促进剂，其中所述活性物质为胞嘧啶核苷。

2.根据权利要求1所述的一种表皮蛋白促进剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述米浆为大米的米浆。

3.根据权利要求1所述的一种表皮蛋白促进剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述米浆中加入含有钙离子的物质，使得Ca²⁺浓度为0.1～5mmol/L。

4.根据权利要求1所述的一种表皮蛋白促进剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酶选自中性蛋白酶、果胶酶、β-葡聚糖酶、木聚糖酶或纤维素酶中的一种或几种。

5.根据权利要求1所述的一种表皮蛋白促进剂的制备方法，其特征在于，步骤(1)中，所述酶解的条件为：所述酶选自为β-葡聚糖酶，β-葡聚糖酶的添加量为米浆质量的0.001％-0.5％，酶活为150-200U/g。

6.根据权利要求1所述的一种表皮蛋白促进剂的制备方法，其特征在于，步骤(2)中，所述酵母菌为saccharomyces veronae。

7.根据权利要求1所述的一种表皮蛋白促进剂的制备方法，其特征在于，步骤(3)中，收集发酵液中活性物质的方法为：发酵液通过反渗透技术浓缩，高效富集得到活性物质。

8.采用权利要求1-7中任一项所述制备方法制备所得的表皮蛋白促进剂。

9.权利要求8所述表皮蛋白促进剂在制备化妆品中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，

所述表皮蛋白促进剂在制备具有皮肤屏障功能的化妆品中的应用，其中所述表皮蛋白促进剂作为紧密连接蛋白claudin-1表达促进剂，和/或，

所述表皮蛋白促进剂在制备具有皮肤屏障功能的化妆品中的应用，其中所述表皮蛋白促进剂作为紧密连接蛋白claudin-4表达促进剂，和/或，

所述表皮蛋白促进剂在制备具有皮肤屏障功能的化妆品中的应用，其中所述表皮蛋白促进剂作为闭合蛋白occludin表达促进剂，和/或，

所述表皮蛋白促进剂在制备具有皮肤屏障功能的化妆品中的应用，其中所述表皮蛋白促进剂作为水通道蛋白AQP3 mRNA表达促进剂，和/或，

所述表皮蛋白促进剂在制备具有皮肤屏障功能的化妆品中的应用，其中所述表皮蛋白促进剂作为纤维细胞内透明质酸合成酶3mRNA表达促进剂。