CN115836643A - 借助花粉蒙导手段提高辣椒远缘杂交率的方法 - Google Patents

Abstract

本申请公开了一种借助花粉蒙导手段提高辣椒远缘杂交率的方法，包括以下步骤：步骤S1：获取父本辣椒花粉、与辣椒不同属的蒙导材料花粉；步骤S2：将蒙导花粉授粉至柱头上；步骤S3：于初次授粉后1小时重复至少一次步骤S2操作，得到杂交株；步骤S4：对杂交株进行水肥管理、病虫害防治操作，并修剪植株至采收期，收获果实。该方法以C.annuum和C.baccatum中的辣椒自交系为亲本材料（C.annuum×C.baccatum），针对出现的受精前障碍开展克服远缘杂交障碍研究，采用与辣椒同科不同属作物（茄子、番茄、烟草、龙葵）蒙导与重复授粉相结合的方式减少辣椒种间障碍，增加远缘杂交亲和性，提高坐果率。

Description

借助花粉蒙导手段提高辣椒远缘杂交率的方法

技术领域

本申请涉及辣椒远缘杂交育种技术领域，特别是一种借助花粉蒙导手段提高辣椒远缘杂交率的方法。

背景技术

辣椒(Capsicum)是茄科(Solanaceae)辣椒属(Capsium)一年生或多年生草本植物，是一种世界范围内广泛种植且具有重要经济价值的蔬菜作物。随着现代设施农业的推广，中国辣椒栽培面积也逐渐增大，成为世界上辣椒种植大国之一。目前中国绝大部分栽培品种都是一年生栽培种C. annuum，但是长期的人工选择，使得一年生辣椒栽培育种方面可供利用的遗传资源相对狭窄。其它 4个栽培种C.chinense、C. frutescens、C. baccatum和C. pubescens具有许多优异性状，是改良C. annuum的重要资源。

如何有效地利用辣椒属种间这些有益基因拓展C. annuum遗传基础， 已成为当今辣椒育种的重要课题。

种间杂交是远缘杂交的一种杂交方式，通过人为控制，将外源基因转移到栽培品种中，从而培育出优良的品种。种间杂交是实现基因转移的重要途径， 通过种间杂交， 结合渐渗育种能提高辣椒栽培种C.annuum的抗虫、 抗病性， 改善营养品质、增加产量及对逆境的适应性。

在长期的人工选择下，辣椒(C. annuum)品种的遗传基础已趋于狭窄，进而严重影响了辣椒生产。近年来，辣椒因疫病和病毒病导致减产高达 30%~80%，甚至绝收。现有育种模式导致遗传基础日趋狭窄，因此，可以通过加大利用辣椒属种间杂交获得新种质材料。

种间杂交是辣椒种质创新、改良现有栽培种遗传基础的有效途径。充分利用辣椒野生种、近缘野生种，进行种间杂交，对提高现有辣椒栽培品种产量、品质以及抗性具有重要的意义。

由于辣椒属种间有性杂交存在显著的不亲和性，综合国内外对辣椒属主要种间杂交的研究，其杂交难易情况概括如下：

⑴C.annuum×C.chinense：正反交两个方向上都可成功杂交，但C.annuum作母本更容易些。F1从完全不育到中等育性，与双亲回交都可获得回交后代； F2代不育度高，但易于与双亲回交。

⑵C. annuum×C. frutescens：有将烟草花叶病毒(TMV)及烟草蚀刻病毒(TEV)的抗性从C. frutescens成功转入C.annuum的报道；以C. frutescens作母本时通常能获得2%种子，F1代花粉变异情况为从部分可育至完全不育；回交 F2代花粉不育。

⑶C. annuum×C. pendulum：以C. pendulum作母本不能获得 F1代种子，但可通过早期胚拯救获得 F1代植株，F1代自交高度不育，但偶尔可获得 F2代种子。此种间杂交组合中基因可转移，但较困难。

⑷C. annuum×C. pubescens：完全杂交不育，很少结果实，即使坐果也收不到种子。

⑸C. chinense×C.frutescens：互为父母本都可获得成功杂交，但C. chinense作母本时困难些。F1代中度自交不育，F1代与双亲均可回交获得后代。

⑹C. chinense×C. pendulum：以C. pendulum作母本杂交有些困难，可获得一些F2代种子，但都无活力，回交成功数量有限。

⑺C. chinense×C. pubescens：以C. chinense作母本可获得果实，且成熟种子也很多，胚饱满但无胚乳，胚必须在人工培养基上生长才能获得F1代植株，但F1代完全不育，与 亲本不能回交。

⑻C.frutescens×C. pendulum：以C. pendulum作母本更易成功。F1代植株高度不育，很少能获得 F2代种子，回交偶尔能获得有活力的种子。

⑼C. frutescens×C. pubescens：采用重复授粉正反交都尚未获得到果实，只能通过胚培养。

⑽C. pendulum×C. pubescens： 尚未获得成功杂交。

(11)C.annuum×C. baccatum：传统杂交育种，仍在探索中，成功率极低。综上可以看出，辣椒种间杂交存在很大的挑战。

目前，一般辣椒种内杂交普遍采用蕾期授粉、 重复授粉和药物处理等方法或措施， 这些方法仅适用于对同一复合体内的种间杂交，无法适用于亲缘关系更远的不同复合体的种间杂交。

实施胚胎拯救存在以下不够完善的技术环节：①拯救不同的种间杂种，适用的培养基最佳配方不同； ②不同熟性的材料最佳拯救时期不同， 即使是相同的两个种间杂种，不同季节、 不同植株发育程度， 拯救时期亦不相同； ③拯救成功后，存在继代扩繁系数低和移栽过程中成活率不高的问题。倍性改变则存在亲本本身加倍的困难的问题。以上杂交方法的成功案例均存在耗费时间长、成本高、效率低、速度慢的问题。

杂交育种仍然是辣椒育种的主要方法，鉴于传统种间杂交的局限性，在研究过程中，发现辣椒不同种间的亲和性较差，由于生殖障碍的存在，辣椒种间有性杂交障碍通常分为 3 类：

(1)杂交不亲和：表现为不坐果或只能获得无籽果实；

(2)杂种难育：表现为因杂种胚败育或发育不健全而种子不能萌发或虽萌发但苗期夭亡或生长异常；

(3)杂种难稔：表现为杂种生长正常， 且部分配子有活力， 但不能自交结实。

以上问题主要表现为植株坐果率低。

远缘杂交中常出现不亲和性，造成杂交结实率大幅度下降，极大地降低了育种效率。由于国内外辣椒属种间杂交及进一步深入研究的报道不多，尤其是源于中国的种质资源仅有 2 个栽培种 (C. annuum及C. frutescens)，国内种间杂交试验的相关报道公开较少。受精前障碍问题并没有较好的解决手段。

蒙导方式：是指在自花花粉中加入不同比例的异属花粉。该方法主要应用于粮食作物（小麦×黑麦、小麦×大麦、水稻×玉米）、观赏植物（百合、牡丹、羽衣甘蓝）的杂交中，运用范围有限，在辣椒中还未见报道。

发明内容

本申请针对远缘种间杂交辣椒坐果率低的技术问题，提供了一种借助花粉蒙导手段提高辣椒远缘杂交率的方法，该方法操作简单，操作周期短，授粉后可有效提高远缘杂交辣椒的坐果率，最高可达80%。

本申请提供了一种借助花粉蒙导手段提高辣椒远缘杂交率的方法，包括以下步骤：

步骤S1：获取父本辣椒花粉、与辣椒不同属的蒙导材料花粉；

步骤S2：将蒙导材料花粉与父本辣椒花粉按体积比为1~2:1均匀混合后得到蒙导花粉，左手捏住母本辣椒植株的辣椒花柄，右手掐住辣椒花的花冠底端环剥，将花冠和花药全部剥离后，露出柱头，将蒙导花粉授粉至柱头上；

步骤S3：于初次授粉后1小时重复至少一次步骤S2操作，得到杂交株；

步骤S4：对杂交株进行水肥管理、病虫害防治操作，并修剪植株至采收期，收获果实；

蒙导材料花粉为茄子花粉、烟草花粉、番茄花粉中的至少一种；

母本辣椒为C.annuum属辣椒植株；父本辣椒植株为C. baccatum属辣椒植株。

采用上述方法进行杂交后母本辣椒植株的坐果率最高可达80%，坐果率在60~80%之间，其中所得果实均不含籽果实、无法自交结实果实；杂种胚败坏果实；发育不健全果实；该方法相对仅采用该父本辣椒植株与母本辣椒直接杂交的坐果率22.64~32.08%实现显著提高。

优选地，母本辣椒为C.annuum属的792、793号辣椒植株；父本辣椒植株为C. baccatum属的0314102112-1-1-1号辣椒植株。采用该属辣椒植株作为母本、父本能较好的提高远缘杂交的坐果率。

优选地，母本辣椒为C.annuum属的792号辣椒植株；蒙导材料花粉为茄子花粉、烟草花粉、番茄花粉中的至少一种。按该组合进行杂交，杂交坐果率可达60.00~73.33%。

优选地，母本辣椒为C.annuum属的793号辣椒植株；蒙导材料花粉为烟草花粉或番茄花粉。按该组合进行杂交，杂交坐果率可达66.67~80.00%。

优选地，步骤S1包括以下步骤：

步骤S11：通过调节蒙导材料植株的生长环境条件，在母本辣椒植株进入盛花期时，蒙导材料植株进入开花期；

步骤S12：在开花期每日的7:00-9:00 或17:00以后分别采集父本辣椒和蒙导材料的含苞待放或半包花蕾，将所得花蕾放入干燥盒内直至花药开裂、花粉散出后收集花粉。

按上述步骤进行花粉收集，效率高，收集得率高，在温度较低、日照较弱的7:00-9:00 或17:00以后采收花蕾，能防止水分散失过多影响花粉散出导致花粉散落；将收集的花蕾至于干燥盒内通过降低环境湿度，实现花蕾自动脱水后花药开裂，有利于缩短等待时间，提高收集花粉效率。

优选地，步骤S1包括：步骤S13：所得花粉保存在3℃的干燥环境下备用。

采用3℃干燥环境保存所得花粉，能避免花粉失活，利于解决异地杂交和花期不遇的问题。

优选地，步骤S2在7：00-9：30内完成。按此时间进行步骤S2操作能避免环境温度过高，导致授粉的花粉失活，有利于提高杂交成功率，进而提高坐果率。

优选地，步骤S3为于初次授粉后1小时重复一次步骤S2操作。仅需进行一次重复授粉有利于减少杂交操作次数的同时，获得较高的杂交成功率。

具体地，一种借助花粉蒙导手段提高辣椒种间杂交率的方法，包括如下步骤 ：

1、 材料准备：1）辣椒播种育苗，移栽，进行常规生长管理；

2）选择与辣椒同科不同属作物（茄子、番茄、烟草、龙葵等）作为蒙导材料：茄子、番茄、烟草、龙葵等在人工气候培养箱分期分批播种育苗，使其开花期与辣椒的盛花期正好相遇，保证花粉质量；

3）长出2-3对真叶后单独移栽到温室大棚，生育期内常规管理。

2 、花粉采集：在温度较低、日照较弱的 7:00-9:00 或17:00以后（以防水分散失过多影响花粉散出），采集含苞待放或半包的辣椒和蒙导材料（茄子、烟草、番茄等）的花蕾，放于长宽约4cm的塑料方形药盒中，将药盒开盖置于装了干燥剂的干燥器中（此搜集方法较传统的花粉管更加简单便捷）；待花药开裂、花粉散出后用于第二天早上的杂交。注：为解决异地杂交和花期不遇的问题，本申请采用低温干燥贮藏法保存花粉，具体方法如下：将装有花粉的小盒（不盖盖子）置于装有硅胶的干燥器中，再将干燥器置于冰箱冷藏室中，温度为3℃。

3 、蒙导花粉制备：将辣椒花粉分别与蒙导材料例如茄子、番茄、烟草等的花粉按1：1比例进行均匀混合。

4 、去雄授粉：左手轻轻捏住辣椒花柄，右手小心的掐住花冠底端环剥，即可将花冠和花药全部剥离，露出柱头，轻轻蘸一下药盒中制备的蒙导花粉（由于接触面积较传统的花粉管大，不仅增加了柱头粘上的花粉量，而且加快了杂交速度，也提高了授粉率）；授粉1小时后，进行二次杂交授粉即重复授粉（有利于提高杂交率），此过程在上午7：00-9：30之前完成，否则温度太高，花粉容易失活，影响杂交率。

5 、杂交植株管理：授粉后定期对杂交情况进行跟踪调查以了解果实的发育情况，杂交后加强植株的田间管理，定期做好肥水管理和病虫害防治，定期修剪以确保杂交果实营养充足，正常生长。

6 、采收期统计坐果数，计算坐果率。

7 、采收后的辣椒果实放在阴凉通风处，并剥出种子置于网袋自然干燥，来年进行播种。

本申请能产生的有益效果包括：

1）本申请所提供的借助花粉蒙导手段提高辣椒远缘杂交率的方法，采用茄子、番茄、烟草植株的花粉与C. baccatum属辣椒植株花粉混合后作为蒙导花粉材料，对C.annuum属辣椒植株授粉，从而有效提高辣椒远缘杂交坐果率，坐果率最高可达80%，所得果实中不含无籽果实、无法自交结实果实；杂种胚败坏果实；发育不健全果实，有效降低此类果实在辣椒中的结果比例，有效解决了远缘种间辣椒杂交果实存在的问题。

2）本申请所提供的借助花粉蒙导手段提高辣椒远缘杂交率的方法，以C.annuum和C. baccatum中的辣椒自交系为亲本材料（C.annuum×C. baccatum），针对出现的受精前障碍开展克服远缘杂交障碍研究，采用与辣椒同科不同属作物（茄子、番茄、烟草、龙葵）蒙导与重复授粉相结合的方式减少辣椒种间障碍，增加远缘杂交亲和性，提高坐果率，为创制辣椒新种质、培育新品种提供理论和现实依据。

具体实施方式

为使本发明实施方式的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施方式对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。

本申请中未详述的且并不用于解决本申请技术问题的技术手段，均按本领域公知常识进行设置，且多种公知常识设置方式均可实现。

实施例

以下实施例中所用原料、种子、试剂，如无特殊说明，均为商业渠道获得。

实施例1

1.1 材料

试验用辣椒、茄子、番茄、烟草、龙葵材料由云南省农业科学院园艺作物研究所茄果类团队提供。

其中，0314102112-1-1-1（C. baccatum）为父本，792、793（C.annuum）为母本，远缘杂交组合分别为:792×0314102112-1-1-1、793×0314102112-1-1-1。以茄子、番茄、烟草、龙葵的花粉作为蒙导材料。

1.2 播种与移栽

辣椒育苗工作于2021年3月下旬在云南省元江县播种育苗。由于茄子、龙葵萌发期长，所以播种分别于2月下旬、3月初分批开展；番茄、烟草生育期较短，到4月中旬开始分批播种育苗；每品种50粒。待所有材料长至15cm左右移栽至大棚，于安宁试验基地栽培，进行常规水肥、病虫害管理。

1.3 蒙导花粉处理

以未经处理的0314102112-1-1-1辣椒花粉作为对照，以茄子、烟草、番茄、龙葵、0314102112-1-1-1与茄子、0314102112-1-1-1与番茄、0314102112-1-1-1与龙葵、0314102112-1-1-1与烟草的混合花粉（按体积比为1：1混合）作为蒙导处理花粉（父本），分别与792、793（母本）进行杂交。具体杂交各处理参见表1。各处理中，蒙导材料花粉与父本辣椒花粉按体积比为1:1均匀混合后得到蒙导花粉。

1.4 花粉采集与制备

在温度较低、日照较弱的 7:00-9:00 或17:00以后（以防水分散失过多影响花粉散出），采集含苞待放或半包的辣椒和蒙导材料（茄子、烟草、番茄等）的花蕾，放于长宽约4cm的塑料方形药盒中，将药盒开盖置于装了干燥剂的干燥器中（此搜集方法较传统的花粉管更加简单便捷）；再将干燥器置于冰箱冷藏室中，温度为3℃。待花药开裂、花粉散出后，将辣椒0314102112-1-1-1花粉分别与茄子、烟草、番茄、龙葵的花粉按1：1均匀混合，用于后续杂交。

1.5 去雄授粉

左手轻轻捏住辣椒花柄，右手小心的掐住花冠底端环剥，即可将花冠和花药全部剥离，露出柱头，轻轻蘸一下药盒中制备的各处理的蒙导花粉，由于接触面积较传统的花粉管大，不仅增加了柱头粘上的花粉量，而且加快了杂交速度，也提高了授粉率；

授粉1小时后，进行二次杂交授粉即重复授粉（有利于提高杂交率），此过程在上午7：00-9：30之前完成，否则温度太高，花粉容易失活，影响杂交率。

1.6 杂交植株管理

授粉后定期对杂交情况进行跟踪调查以了解果实的发育情况，杂交后加强植株的田间管理，定期做好肥水、土壤湿度、病虫害防治，定期修剪以确保杂交果实营养充足，正常生长。

1.7 采收期统计坐果数，计算杂交成功率，所得结果参见表1。

本申请统计坐果数中计数的果实均不含：无籽果实、无法自交结实果实、杂种胚败坏果实、畸形果、发育不健全果实，此类果实的检测方法按现有常用方法进行。

表1辣椒远缘杂交C.annuum×C. baccatum花粉蒙导杂交处理及其结果表

结果与分析：

通过表1可以看出：792或793直接与茄子、烟草、番茄、龙葵进行远缘杂交操作后，坐果率非常低。远低于母本与父本直接杂交的坐果率，说明不按本申请提供方法，上述与辣椒不同属的植株无法实现与辣椒较好的杂交。

分别以792、793辣椒为母本，与父本0314102112-1-1-1进行杂交后，坐果成功率分别为32.08%、22.64%；以茄子、烟草、番茄、龙葵单独授粉，与792、793的杂交成功率在0%-33.33%之间；而以辣椒与茄子、番茄的混合花粉分别与792进行杂交，坐果成功率最高可达到73.33%（辣椒与茄子、番茄花粉组合），其次为辣椒与烟草花粉组合，坐果成功率达到60%；辣椒与龙葵花粉组合最低，只有33.33%。以辣椒与茄子、烟草、番茄、龙葵的混合花粉分别与793进行杂交，坐果成功率最高可达到80%（辣椒与烟草花粉组合），其次为辣椒与番茄花粉组合，坐果成功率达到66.67%；辣椒与茄子、龙葵花粉组合坐果率较低，分别为33.33%、26.67%。

小结：利用同科异属花粉作为蒙导材料，可以提高辣椒远缘杂交C.annuum×C. baccatum种间的坐果数，提高辣椒杂交成功率，该方法充分利用上述作物的异属花粉进行蒙导可有效实现辣椒远缘杂交，克服种间杂交存在的问题，提高坐果率。

实施例2

与实施例的区别在于：蒙导材料花粉与父本辣椒花粉按体积比为2:1均匀混合后得到蒙导花粉。

实施例2所得结果与实施例1接近，在此不累述。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换,凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种借助花粉蒙导手段提高辣椒远缘杂交率的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤S1：获取父本辣椒花粉、与辣椒不同属的蒙导材料花粉；

步骤S2：将蒙导材料花粉与父本辣椒花粉按体积比为1~2:1均匀混合后得到蒙导花粉，左手捏住母本辣椒植株的辣椒花柄，右手掐住辣椒花的花冠底端环剥，将花冠和花药全部剥离后，露出柱头，将蒙导花粉授粉至柱头上；

步骤S3：于初次授粉后1小时重复至少一次步骤S2操作，得到杂交株；

步骤S4：对杂交株进行水肥管理、病虫害防治操作，并修剪植株至采收期，收获果实；

蒙导材料花粉为茄子花粉、烟草花粉、番茄花粉中的至少一种；

母本辣椒为C.annuum属辣椒植株；父本辣椒植株为C. baccatum属辣椒植株。

2.根据权利要求1所述的借助花粉蒙导手段提高辣椒远缘杂交率的方法，其特征在于，母本辣椒为C.annuum属的792、793号辣椒植株；父本辣椒植株为C. baccatum属的0314102112-1-1-1号辣椒植株。

3.根据权利要求2所述的借助花粉蒙导手段提高辣椒远缘杂交率的方法，其特征在于，母本辣椒为C.annuum属的792号辣椒植株；蒙导材料花粉为茄子花粉、烟草花粉、番茄花粉中的至少一种。

4.根据权利要求2所述的借助花粉蒙导手段提高辣椒远缘杂交率的方法，其特征在于，母本辣椒为C.annuum属的793号辣椒植株；蒙导材料花粉为烟草花粉或番茄花粉。

5.根据权利要求1所述的借助花粉蒙导手段提高辣椒远缘杂交率的方法，其特征在于，步骤S1包括以下步骤：

步骤S11：通过调节蒙导材料植株的生长环境条件，在母本辣椒植株进入盛花期时，蒙导材料植株进入开花期；

步骤S12：在开花期每日的7:00-9:00 或17:00以后分别采集父本辣椒和蒙导材料的含苞待放或半包花蕾，将所得花蕾放入干燥盒内直至花药开裂、花粉散出后收集花粉。

6.根据权利要求5所述的借助花粉蒙导手段提高辣椒远缘杂交率的方法，其特征在于，步骤S1包括：步骤S13：所得花粉保存在3℃的干燥环境下备用。

7.根据权利要求5所述的借助花粉蒙导手段提高辣椒远缘杂交率的方法，其特征在于，步骤S2在7：00-9：30内完成。

8.根据权利要求5所述的借助花粉蒙导手段提高辣椒远缘杂交率的方法，其特征在于，步骤S3为于初次授粉后1小时重复一次步骤S2操作。