CN115825438A - Crabp2作为铂类抗肿瘤药物耐药标志物或胃癌预后标志物的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及CRABP2作为铂类抗肿瘤药物耐药标志物或胃癌预后标志物的应用。奥沙利铂是胃癌(GC)的主要化疗药物，临床治疗中易发生患者对奥沙利铂耐药，因此，迫切需要确定逆转GC患者化疗耐药的潜在靶点。本发明确定了潜在的化疗耐药相关蛋白CRABP2，在化疗耐药GC患者的肿瘤组织中显着上调，并且与预后密切相关。针对耐药的机制研究表明，CRAPB2加速了BAX和PARKIN在GC细胞中的结合，并促进了泛素化介导的BAX降解。进一步的，CRABP2的异常高表达受到TET1介导的DNA羟甲基化的影响。综上，本发明的研究结果表明，CRABP2是奥沙利铂耐药调控的关键分子，可能成为逆转GC耐药的新靶点。

Description

CRABP2作为铂类抗肿瘤药物耐药标志物或胃癌预后标志物的 应用

技术领域

本发明属于铂类药物耐药机制技术领域，具体涉及DNA羟甲基化酶TET1、细胞维甲酸结合蛋白2(CRABP2)、BAX/PARKIN结合体或BAX泛素化水平作为铂类抗肿瘤药物耐药标志物、预后标志物的应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

胃癌(GC)是世界上最常见的癌症类型之一，也是癌症相关死亡的第二大常见原因。在东亚、东欧和南欧以及中南美洲的部分地区，GC的发病率尤其高。虽然手术是GC的主要治疗方法，但相当多的患者被诊断为晚期，5年生存率<50％。多模式策略被用于提高GC患者的生存率。目前，化疗通常用于治疗晚期GC患者。在GC的各种化疗方案中，奥沙利铂(OXA)是GC患者化疗的基础药物。奥沙利铂属于第三代铂类抗肿瘤药物，与大多数化疗药物无毒性重叠，尤其是血液和胃肠道毒性发生率较低。2016年国家综合癌症网络(NCCN)指南确立了包含奥沙利铂的方案作为治疗胃肠道恶性肿瘤的一线化疗方案。目前，奥沙利铂在临床上主要用于治疗各种消化系统恶性肿瘤，如胃癌、肝癌、结直肠癌等。然而，许多胃肠道肿瘤患者对奥沙利铂表现出耐药性，导致治疗失败和预后不良。一些研究探索了奥沙利铂耐药的潜在分子机制，包括ATP结合转运蛋白的上调(促进化疗药物的流出)、奥沙利铂诱导的DNA损伤修复、增强对细胞凋亡和自噬的抗性、DNA甲基化和组蛋白修饰，但到目前为止，还没有发现有效的分子可以逆转对奥沙利铂的耐药性。

OXA引发的凋亡级联反应的特征是BAX易位至线粒体，细胞色素c释放到细胞质中，以及caspase 3的激活。BAX蛋白属于BCL-2蛋白家族，是一种促凋亡效应子。它控制线粒体凋亡途径，该途径由生理刺激或细胞毒性药物(包括OXA)参与。BCL-2促凋亡和抗凋亡家族成员之间的相互作用设定了决定生死决定的凋亡阈值：一旦平衡倾向于形成BAX寡聚体，细胞就会自杀。细胞凋亡信号传导和半胱天冬酶激活导致正常单体BAX的构象变化，暴露BAX的BH3结构域，导致二聚化和对泛素降解的抵抗。然后BAX易位到线粒体中，导致促凋亡线粒体因子如细胞色素c和第二个线粒体衍生的半胱天冬酶激活剂的释放。这导致caspase-3的激活和凋亡体的形成。

细胞视黄酸结合蛋白2(CRABP2)属于维甲酸结合蛋白家族，是维甲酸代谢过程中的主要调节因子。CRABP2将视黄酸转运至细胞核中的视黄酸受体，并调节细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移。有报道称，CRABP2的异常表达与神经母细胞瘤、肾母细胞瘤、头颈部鳞状细胞癌、非小细胞肺癌的发生发展密切相关。CRABP2促进胰腺癌细胞的侵袭和转移，抑制CRABP2的表达可以抑制癌细胞的迁移。在食管鳞状细胞癌中，Koreeda等人发现下调CRABP2可抑制细胞增殖并诱导细胞凋亡。此外，CRABP2通过Hippo通路调节乳腺癌的转移和侵袭。

TET1属于十一个十一易位(TET)蛋白家族，是DNA甲基化的重要调节因子。TET蛋白可以将5-甲基胞嘧啶(5mC)氧化成5-羟甲基胞嘧啶(5hmC)，这是TET蛋白去甲基化的基础。TET1在胚胎发育、生殖细胞形成和骨髓造血中起重要作用。在肝细胞癌中，TET1的上调可以通过HMGA2的异常增强子羟甲基化来驱动细胞生长。据报道，TET1通过PPARα启动子的羟甲基化抑制非酒精性脂肪肝疾病的进展。

发明内容

基于上述技术背景，本发明目的在于明确奥沙利铂(OXA)耐药机制，寻找逆转OXA耐药的关键靶点，提高胃癌(GC)患者的化疗效果。基于上述目的，本发明首先基于定量蛋白质组学确定了细胞视黄酸结合蛋白2(CRABP2)是GC化疗耐药患者肿瘤组织中最显著上调的蛋白，还证实了TET1介导的GC中DNA羟甲基化增加CRABP2的表达与OXA抗性有关。在OXA抗性GC细胞中，CRABP2促进BAX和PARKIN的结合，导致BAX的泛素化和降解，最终阻止OXA诱导的细胞凋亡，形成了GC肿瘤细胞的OXA抗性，因此，TET1、CRABP2、BAX和PARKIN的结合及BAX的泛素化有望成为逆转GC化学抗性的潜在新靶点。

基于上述研究成果，本发明具体提供以下技术方案：

本发明第一方面，提供DNA羟甲基化酶TET1、细胞维甲酸结合蛋白2(CRABP2)、BAX/PARKIN结合体或BAX泛素化水平作为铂类抗肿瘤药物耐药标志物的应用。

上述第一方面中，所述DNA羟甲基化酶TET1(Tet甲基胞嘧啶双加氧酶1)细胞维甲酸结合蛋白2(CRABP2)水平检测优选为肿瘤患者病灶样本中TET1、CRABP2蛋白表达量；所述BAX泛素化水平优选为肿瘤患者病灶样本中发生泛素化的BAX含量或比例。

进一步的，所述肿瘤患者为胃肠道肿瘤患者，如胃癌、小肠癌、结肠癌或直肠癌患者；进一步的，所述肿瘤患者为胃癌患者。

优选的，所述铂类药物为选自顺铂、卡铂、奈达铂、洛铂、奥沙利铂中的一种，进一步的，为奥沙利铂。

优选的，所述作为耐药标志物的应用，其应用方式包括但不限于以下任意一种：

(1)通过检测TET1、CRABP2、BAX/PARKIN结合体、BAX泛素化水平判断肿瘤患者是否会发生铂类药物耐药，从而调整治疗方案；

(2)TET1、CRABP2、BAX/PARKIN结合体、BAX泛素化水平检测试剂在制备铂类药物耐药检测试剂盒中的应用。

上述(1)方面中，TET1、CRABP2、BAX/PARKIN结合体或BAX泛素化水平与铂类药物耐药呈正相关，即上述蛋白、结合或泛素化水平升高，意味着患者发生耐药或具有较大可能发生耐药。

本发明第二方面，提供一种铂类耐药检测试剂盒，所述试剂盒中包括以下检测试剂中的一种或几种的组合：

(1)TET1含量检测试剂；

(2)CRABP2含量检测试剂；

(3)BAX/PARKIN结合体含量检测试剂；

(4)BAX泛素化水平含量检测试剂。

上述(1)-(3)方面中所述的检测试剂为包括但不限于基于抗原抗体特异性识别或质量信息对上述蛋白、结合体含量进行检测的试剂；(4)方面中所述泛素化水平检测可通过本领域常规方式进行，如免疫印迹、免疫共沉淀或质谱检测等方式进行，上述检测手段中所涉及的检测试剂对本领域技术人员来说也是可常规确定的技术内容。

本发明首先针对CRABP2在OXA抗性GC中异常高表达的分子机制进行了研究，结果证实CRABP2对甲基化和羟甲基化修饰敏感。OXA抗性细胞的甲基化水平降低，而羟甲基化水平升高。本发明进一步证实了羟甲基化酶TET1的活性增强，TET1可以富集在CRABP2的启动子区域，证实了TET1在奥沙利铂耐药中的作用，CRABP2的表达受OXA抗性GC中TET1介导的DNA羟甲基化的影响。

为了进一步明确CRABP2的OXA抗性机制，本发明在体外和体内进行了救援实验。结果表明，CRABP2通过BAX依赖性细胞凋亡途径促进OXA抗性。泛素化是蛋白质降解的一种常见形式，PARKIN蛋白是一种高效的产物，可激活E3泛素-蛋白连接酶活性。本发明的结果CRABP2促进BAX和PARKIN的结合，导致BAX的泛素化和降解，这种作用最终抑制了细胞凋亡并在GC细胞中实现了OXA抗性。

上述OXA耐药机制的探究为逆转GC患者耐药提供了可供执行的靶点，同时明确了CRABP2与GC患者的不良预后有关，为了探索CRABP2作为潜在治疗靶点的价值，本发明还建立了患者来源的异种移植(PDX)模型，在这项研究中，发明人通过LIPID In VivoTransfection Reagent(Altogen Biosystems)构建了体内级siRNA注射液，以确保CRABP2在体内的干扰效率。PDX模型的结果表明，干扰CRABP2可逆转体内OXA抗性。这些结果揭示了CRABP2作为化疗耐药GC患者的分子治疗靶点的潜力。基于CRABP2作为GC患者预后及治疗靶点的应用，本发明还提供如下的技术方案：

本发明第三方面，提供细胞维甲酸结合蛋白2(CRABP2)作为胃癌患者预后标志物的应用。

上述第三方面中，所述作为胃癌患者预后标志物的应用，其应用方式包括但不限于以下任意一种：

(1)通过对患者病灶组织中CRABP2含量进行检测，从而对患者的生存期等进行判断；

(2)将CRABP2含量检测试剂应用于制备胃癌患者的预后判断试剂盒。

上述(1)方面中，CRABP2含量可作为胃癌患者预后情况的独立预测因素，两者呈正相关，即患者机体或病灶组织中CRABP2含量升高意味着更差的预后、更短的生存时间。

本发明第四方面，一种胃癌患者预后检测试剂盒，所述试剂盒中包括CRABP2含量检测试剂。

本发明第五方面，提供细胞维甲酸结合蛋白2(CRABP2)抑制剂在制备抗胃癌药物中的应用。

优选的，上述抑制剂为能够抑制、干扰患者机体或病灶组织中CRABP2表达的化合物、核酸类或多肽类成分，还可以是基于基因工程方式对上述蛋白表达相关基因进行敲除的试剂。

本发明进一步构建了靶向CRABP2的小干扰RNA(siRNA)并验证了干扰效率。siRNA是21-23bp双链RNA的短片段，可诱导RNA干扰。自2008年用于癌症治疗的siRNA药物首次进入临床试验以来，由于其特异性和高效性，siRNA有望成为一种有效的肿瘤治疗方法。本发明一种具体的实施方式中，所述CRABP2抑制剂为CRABP2的体内级siRNA，具体序列如下：5'-GCCAGCAGTGGAGATCAAATT-3'。

优选的，所述抗胃癌药物包括用于预防、改善或治疗胃癌疾病的药物制剂，进一步的，所述抗胃癌药物用于具有奥沙利铂耐药的胃癌患者。

本发明第六方面，提供一种胃癌治疗药物，所述药物中包括细胞维甲酸结合蛋白2(CRABP2)和/或PARKIN抑制剂。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为CRABP2在化疗耐药GC患者中的表达上调并预测预后。

a.接受NAC的CR和CS胃癌患者的典型图像示例；

b-c.CR和CS肿瘤组织中最上调/下调的差异表达蛋白的火山图(b)和热图(c)；

d-e.qRT-PCR(d，n＝22)和蛋白质印迹(e，n＝4)结果显示CRABP2在CR和CS患者的肿瘤组织中表达；

f-g.在CRABP2敲低/过表达后，用OXA(f)或氟尿嘧啶(g)处理的AGS细胞的CCK-8结果；

h.通过qRT-PCR在亲本和OXA抗性GC细胞中CRABP2的相对表达；

i.来自TCGA数据库的CRABP2的表达(肿瘤＝335；正常＝26)。Mann-Whitney U检验(Wilcoxon秩和检验)。异常值(中位数±2IQR)和极值(中位数±3.5IQR)被排除在外；IQR：四分位距；

j-k.通过qRT-PCR(j，n＝44)和蛋白质印迹(k，n＝12)在GC患者的肿瘤组织和邻近正常组织中表达CRABP2；

l.CRABP2阳性和CRABP2阴性肿瘤组织的典型IHC图像；

m.GC患者(n＝488)CRABP2表达与OS的相关曲线；

(CR：化疗耐药；CS：化疗敏感性；OXA：奥沙利铂；C：肿瘤组织；N：正常组织；IHC：免疫组化；OS：总生存期)。

图2为CRABP2促进GC细胞对奥沙利铂耐药性；

a.在敲除CRABP2后，在不同浓度的OXA下测定AGS-OXA和HGC-27-OXA细胞的活力；

b.敲低CRABP2后，在不存在或存在OXA的情况下测定AGS-OXA和HGC-27-OXA细胞的集落形成能力(浓度：2.0μM)；

c.流式细胞仪检测AGS-OXA和HGC-27-OXA细胞在OXA存在或不存在(浓度：2.0μM)下敲除CRABP2后的细胞凋亡结果；

d.在不同浓度的OXA存在下，通过细胞活力测定法确定过表达CRABP2的AGS和HGC-27细胞；

e.在OXA存在或不存在的情况下(浓度：AGS 0.2μM，HGC-27 0.4μM)，通过集落形成测定法确定过表达CRABP2的AGS和HGC-27细胞；

f.在OXA不存在或存在的情况下(浓度：AGS 0.2μM，HGC-27 0.4μM)，通过流式细胞术测定过表达CRABP2的AGS和HGC-27细胞的细胞凋亡结果。

图3为CRABP2加速BAX和PARKIN在GC中的结合能力。

a.通过SDS-PAGE分离来自Flag-CRABP2质粒转染的AGS细胞的总蛋白质。通过LC/LC-MS在CRABP2蛋白复合物中鉴定PARKIN和BAX；

b.通过Co-IP测定验证了BAX/PARKIN和Flag-CRABP2的相互相互作用；

c.通过SDS-PAGE分析，BAX和PARKIN蛋白被GST-CRABP2融合蛋白结合珠拉下；

d.BAX和CRABP2之间以及PARKIN和CRABP2之间的相互作用通过co-IP测定和蛋白质印迹验证；

e.在AGS细胞中干扰CRABP2后，BAX与PARKIN的结合能力下降；

f.在AGS细胞中BAX干扰后，CRABP2与PARKIN的结合能力不受影响；

g.在AGS细胞中干扰PARKIN后，CRABP2与PARKIN的结合能力不受影响；

h-i.免疫荧光测定显示CRABP2/BAX/PARKIN在AGS(h)和HGC-27(i)细胞中的亚细胞定位(红框)。

j-k.用放线菌酮(CHX)处理过表达(j)或敲低(k)CRABP2的AGS细胞0、2、4、6、8或10小时。通过蛋白质印迹检测Bax的表达。

图4为CRABP2通过调节Bax的泛素化降解来促进化学抗性；

a.在CRABP2敲低或过表达的AGS细胞中加入MG-132后，进行Bax的Co-IP，并通过蛋白质印迹检测泛素；

b.用HA标记的不同位点泛素化质粒转染CRABP2敲低或过表达的GC细胞，并进行HA的Co-IP实验；

c-d.在AGS/HGC-27细胞中加入OXA后，检测到caspase 9(c)和caspase 12(d)的活性；

e.在AGS/HGC-27细胞中加入OXA后，检测CC3的表达；

f.在AGS/HGC-27细胞中加入OXA后，通过蛋白质印迹检测DNA损伤/修复相关蛋白的表达；

g.OXA处理AGS/HGC-27细胞后，分离细胞质和线粒体，检测BAX的表达；

h.在AGS/HGC-27细胞中CRABP2敲低/过表达后检测到caspase 9的活性；

i.在CRABP2敲低/过表达并将OXA添加到AGS/HGC-27细胞后检查CC3的表达；

j.在将OXA添加到AGS/HGC-27细胞并敲低/过表达CRABP2后，通过蛋白质印迹检查DNA损伤/修复相关蛋白的表达；

k-l.CRABP2敲低或过表达的AGS/HGC-27细胞用OXA处理后，分离细胞质和线粒体，检测BAX的表达；

图5为CRABP2通过BAX依赖性细胞凋亡途径促进奥沙利铂耐药；

a.敲低CRABP2/BAX并加入OXA(浓度：AGS 0.2μM，HGC-27 0.4μM)后，流式细胞仪检测凋亡细胞百分比；

b.敲低CRABP2/BAX并加入OXA(浓度：AGS 0.2μM，HGC-27 0.4μM)后，检测裂解的caspase 9的活性；

c.敲低CRABP2/BAX并添加OXA(浓度：AGS 0.2μM，HGC-27 0.4μM)后，通过蛋白质印迹检测切割的caspase 3/BAX/CRABP2的表达；

d.裸鼠细胞衍生异种移植模型的实验程序示意图；

e.显示四组裸鼠肿瘤形成的照片；

f-g.四组裸鼠的肿瘤重量(f)和肿瘤体积(g)；

h.Western blotting检测四组裸鼠肿瘤中CRABP2和BAX的表达；

i.四组裸鼠肿瘤的HE和CRABP2 IHC染色。

图6为TET1介导的DNA羟甲基化加速CRABP2的表达；

a.在AGS和HGC-27细胞中加入5AZ、Bobcat339、DZNEP、TSA或SAHA后，检测CRABP2的mRNA表达变化；

b-c.检查了OXA抗性GC细胞和亲本GC细胞的甲基化(b)和羟甲基化(c)水平；

d.通过蛋白质印迹检测来自OXA抗性和亲代GC细胞的DNA甲基化酶、去甲基化酶和羟甲基化酶的表达和活性；

e.在OXA抗性GC细胞和亲代GC细胞中检测到羟甲基化酶TET1的活性；

f.CRABP2启动子区域中预测和设计的甲基化位点的示意图；

g.在OXA抗性GC细胞中进行使用TET1抗体的ChIP实验；

h.在OXA抗性GC细胞中进行羟甲基化ChIP测定；

i-j.在OXA抗性GC细胞中敲低或过表达TET1后，通过qRT-PCR(i)和蛋白质印迹(j)检查CRABP2的表达。

图7为通过干扰CRABP2逆转体内GC中的奥沙利铂耐药性；

a.来自患者的GC异种移植模型示意图；

b.两组NOD-SCID小鼠不同肿瘤形成的照片；

c-d.两组小鼠的肿瘤重量(c)和肿瘤体积(d)测量；

e.通过蛋白质印迹测定，两组小鼠肿瘤中CRABP2和BAX的表达；

f.对两组小鼠的肿瘤切片进行HE染色和CRABP2染色；

g.在正常生理条件下，Bax在细胞质中的合成和降解处于平衡状态。当用奥沙利铂处理细胞时，Bax会整合到线粒体外膜中，导致细胞色素C的释放和细胞凋亡。在化疗耐药的GC细胞中，CRABP2在细胞内的表达水平很高，CRABP2可以通过结合Bax和Parkin促进Bax的泛素化降解，最终使细胞存活。

图8为亲本和奥沙利铂耐药GC细胞系的细胞活力和IC₅₀值；

a-b.AGS(a)和AGS-OXA(b)细胞的细胞活力曲线和IC₅₀值；

c-d.HGC-27(c)和HGC-27-OXA(d)细胞的细胞活力曲线和IC₅₀值；

图9为肿瘤直径(a)、手术类型(b)、肿瘤分化(c)、pT分期(d)、pN分期(e)、pTNM分期(f)、淋巴血管侵犯(g)之间的相关曲线，和GC患者的总生存期(n＝488)；

图10为CRABP2对GC细胞的侵袭和迁移能力没有显着影响；

a.CRABP2干扰AGS和HGC-27细胞后Transwell迁移试验的结果；

b.干扰AGS和HGC-27细胞中CRABP2后Transwell侵袭试验的结果；

c-d.在AGS(c)和HGC-27(d)细胞中干扰CRABP2后伤口愈合测定的结果。

图11为敲除CRABP2可抑制AGS和HGC-27细胞对奥沙利铂的耐药性；

a.在敲低CRABP2后，在不同浓度的OXA存在下测定AGS和HGC-27细胞的活力；

b.敲低CRABP2后，测定了AGS和HGC-27细胞的集落形成能力；

c.流式细胞仪测定敲除CRABP2后AGS和HGC-27细胞凋亡的结果。

图12为对PARKIN表达的干扰在体外和体内抑制奥沙利铂耐药；

a-c.如图所示，在向细胞中添加OXA后，检查了BAX/PARKIN/CC3/CRABP2蛋白(a)的表达、凋亡细胞的百分比(b)和半胱天冬酶9(c)的活性；

d.显示不同裸鼠组肿瘤形成的照片；

e.不同组裸鼠的肿瘤体积；

f.不同组裸鼠的肿瘤重量；

g.通过蛋白质印迹测定，来自不同裸鼠组的肿瘤中PARKIN和BAX的表达。

图13为TET1在体外和体内促进奥沙利铂耐药的机制；

a-c.如图所示，在向细胞中添加OXA后，检查了BAX/TET1/CC3/CRABP2蛋白(a)的表达、凋亡细胞的百分比(b)和半胱天冬酶9(c)的活性；

d.通过qRT-PCR检测，GC肿瘤组织中TET1和CRABP2的表达呈正相关；

e.显示不同裸鼠组肿瘤形成的照片；

f.不同组裸鼠的肿瘤体积；

g.不同组裸鼠的肿瘤重量；

h.通过蛋白质印迹测定，来自不同裸鼠组的肿瘤中TET1/BAX/CRABP2的表达。

图14为sh-RNA转染后通过蛋白质印迹检查蛋白质的表达；

a-d.在AGS和HGC-27细胞中敲除CRABP2(a)/BAX(b)/PARKIN(c)/TET1(d)后，使用蛋白质印迹法检测蛋白质表达；

e-f.在AGS和HGC-27细胞中过表达CRABP2(e)/TET1(f)后，使用蛋白质印迹法检测蛋白质表达。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

材料和方法

患者样本和临床数据收集

2017年至2019年，山东大学齐鲁医院接受新辅助化疗(NAC)诊断为晚期GC的患者纳入本研究。所有患者均接受SOX方案[奥沙利铂+S-1(替加氟吉美西奥曲西钾胶囊)](奥沙利铂130mg/m²，静脉内，第1天；和S-1，40-60mg，每天两次，口服，第1天至14)2至4个周期，并在手术前评估对治疗的反应。所有患者在第一次NAC之前和最后一次NAC之后都接受了增强型计算机断层扫描(CT)。化疗反应按照实体瘤反应评估标准(RECIST)1.1标准进行评估。部分缓解(PR)定义为目标病灶直径总和至少减少30％，以基线总直径为参考。疾病进展(PD)被定义为目标病灶直径总和至少增加20％，以研究中最小的总和作为参考。疾病稳定(SD)被定义为既没有足够的收缩符合PR，也没有增加符合PD。根据国家综合癌症网络(NCCN)肿瘤消退分级(TRG)评分评估病理特征。反应被定义为没有证据表明肿瘤已经升级，TRG评分为0到3。本实施例在切除标本后30分钟内收集了肿瘤并匹配了相邻的非肿瘤(距离大于5厘米的组织)组织。每个样品用无菌盐水冲洗并切成两块。一件经福尔马林固定石蜡包埋进行病理检查。另一块在液氮中恢复，然后转移到-80℃冰箱中，用于定量蛋白质组学和蛋白质印迹。然后，基于对放射学和病理学证据的严格评估，将病例分为两组：化疗敏感组(PR组，n＝5)和化疗耐药组(SD组，n＝5)。所有患者自手术之日起每6个月接受一次随访。所有患者在治疗和样本采集前都提供了书面知情同意书。本研究经山东大学齐鲁医院伦理委员会批准。

基于串联质量标签(TMT)的定量蛋白质组学

根据蛋白质提取试剂盒(Thermo Fisher，MA，USA)的流程进行总蛋白质提取。按照制造商的方案进行总蛋白提取。BSA标准蛋白溶液按照Bradford蛋白定量试剂盒说明书配制，梯度浓度范围为0～0.5g/L。提取蛋白质，用胰蛋白酶消化，并用TMT试剂标记。在RigolL3000 HPLC上使用C18柱(Waters BEH C18 4.6×250mm,5μm)将合并的肽分离成15个级分。每个蛋白质样品总共使用120μg。然后加入100μL 0.1M TEAB缓冲液进行复溶，加入41μL乙腈溶解的TMT标记试剂，将样品在室温下振荡混合2h。然后，通过添加8％氨水终止反应。所有标记的样品均以等体积混合、脱盐和冻干。对于过渡文库的构建，使用EASY-nLCTM1200UHPLC系统(Thermo Fisher，MA，USA)与Q Exactive HF-X质谱仪(Thermo Fisher，MA，USA)在数据依赖模式下运行进行鸟枪法蛋白质组学分析。采集(DDA)模式。由搜索引擎Proteome Discoverer 2.2(Thermo Fisher，MA，USA)针对数据库分别搜索每次运行得到的光谱。蛋白质定量结果采用t检验进行统计学分析。实验组和对照组之间定量存在显着差异的蛋白质(P<0.05和|log2FC|>1(比率>1或比率<1[倍数变化，FC]))被定义为差异表达蛋白质(DEP)。

RNA提取和定量实时PCR(qRT-PCR)

使用RNeasy Micro Kit(Qiagen,Hilden,Germany)从培养的细胞和肿瘤组织中提取RNA。用PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa,otsu,Japan)将总RNA逆转录为cDNA。SYBRgreen qRT-PCR使用PCR Master Mix(Life Technology，NY，USA)进行。目的基因相对于β-actin的表达量测定，相对表达量采用ΔΔCt法计算。

细胞培养和化学抗性细胞系诱导

人胃细胞系AGS和HGC-27购自中国典型培养物保藏中心(中国上海)。细胞在补充有10％胎牛血清(HyClone,UT,USA)、100单位/mL青霉素和100mg/mL链霉素(HyClone,UT,USA)的RPMI 1640(Life Technology,NY,USA)中培养。在37℃下加湿5％ CO₂。纯度99.9％的奥沙利铂购自MCE(Monmouth Junction,NJ,USA)。耐药癌细胞系AGS-OXA和HGC-27-OXA是从AGS和HGC-27细胞系中用0.1μM OXA选择6个月(每3天更换一次含有OXA的新鲜培养基)。在过去3年内，所有人类细胞系均使用STR分析进行了验证，所有实验均使用无支原体细胞进行。在用增加剂量的OXA治疗后，使用细胞活力测定证实了耐药性。AGS-OXA和HGC-27-OXA细胞在含有5μM OXA的相同培养基中培养。

慢病毒载体构建和细胞感染

将CRABP2/BAX/TET1的编码序列插入慢病毒载体(pUbi-MCS-3FLAG-SV40-PURO，GV611)以稳定过表达CRABP2/BAX/TET1(命名为oe-CRABP2/oe-BAX/oe-TET1).此外，将CRABP2/PARKIN/TET1的sh-RNA序列插入慢病毒载体(phU6-MCS-pCMV-PURO，GV112)以稳定敲除CRABP2/PARKIN/TET1(命名为sh-CRABP2/sh-PARKIN/sh-TET1)。过表达和敲低慢病毒载体和空慢病毒载体(NC)由基因化学有限公司(中国上海)构建。然后，用慢病毒感染细胞并用嘌呤霉素(1.2μg/ml)选择。感染后，通过蛋白质印迹检查表达(图14)。

细胞转染

本研究中使用的sh-RNA由Hanbio Life Science Co.,Ltd.(中国上海)设计和合成。使用Lipofectamine RNAiMAX转染试剂(Invitrogen，MA，USA)转染细胞。48小时后收获细胞，然后通过蛋白质印迹检查(图14)。细胞计数试剂盒(CCK)-8检测

细胞转染48小时后，将细胞接种在96孔板中(2-3×10³个细胞/孔)，并将板在培养箱中培养。细胞附着后，在第1-5天向每个孔中加入10μL CCK-8溶液(Apexbio，TX，USA)。孵育2小时后，使用酶联免疫吸附测定法在450nm处测量吸光度。所有结果均表示为三个独立实验的平均值±SD。

菌落形成试验

对于集落形成测定，在转染48小时后胰蛋白酶化后对细胞进行计数，并将500个细胞添加到6孔板的每个孔中。培养8-14天后，用0.05％结晶紫染色对细胞进行计数。然后，对细胞集落进行计数和分析。

细胞活力测定

将细胞接种于96孔板中，培养24h，待细胞贴壁后加入药物。根据实验要求向板孔中加入不同浓度的OXA。在3个实验重复中评估每个浓度。没有细胞的调整孔和没有药物的对照孔用作对照。培养48h后弃培养基，每孔加入100μl新鲜完全培养基，每孔加入10μlCCK-8(Dojindo，Tokyo，Japan)溶液。培养1-4小时后，用Thermo Scientific Multiskan FC(Thermo Fisher,MA,USA)在OD450 nm处测量细胞活力。根据不同药物浓度的细胞存活率，使用GraphPad Prism 8软件(美国)绘制曲线，计算50％抑制浓度(IC₅₀)值。

流式细胞仪检测

对于细胞凋亡测定，收集在96孔板中培养的细胞，然后加入5μl Annexin V-FITC(Sigma-Aldrich，MO，USA)和5μl碘化丙啶(PI)染色(50μg/ml，Sigma–Aldrich,MO,USA)被添加。在流式细胞仪(Thermo Fisher，MA，USA)上分析细胞凋亡。FlowJo 7.6.2软件(BDPharmingen，NJ，USA)用于分析。

caspase 9和caspase 12的活性检测

按照caspase 9和caspase 12活性检测试剂盒(BioVision，CA，USA)的说明检测caspase 9/12的活性。在细胞中敲低或过表达CRABP2并用OXA处理后，检测到caspase 9和caspase 12的活性变化。

免疫共沉淀(Co-IP)测定

对于内源性CRABP2结合测定，收集1×10⁷个GC细胞并用PBS洗涤两次。为了验证内源性CRABP2、BAX、PARKIN结合，将sh-NC/sh-CRABP2/sh-BAX/sh-PARKIN转染到GC细胞中。通过用1ml IP裂解液进行20分钟的冰裂解收集上清液，并在4℃下以12000g离心15分钟。上清液分为三组：IgG(450μl)、IP(450μl)和输入(100μl)。Co-IP按照蛋白A+G琼脂糖(ThermoFisher，MA，USA)的说明进行。对Co-IP样品进行SDS-PAGE电泳。通过质谱进行进一步分析并通过蛋白质印迹验证。对于泛素化类型检测，将带有HA-UB-K63/HA-UB-K48/HA-UB-K11质粒的sh-NC或sh-CRABP2共转染到GC细胞中。48小时后样品用Co-IP处理，BAX抗体用于下拉，抗体用于检测泛素化水平。同时检测裂解液中CRABP2的干扰效率。

免疫组织化学(IHC)和评分

按照标准方案为IHC制备GC患者组织和异种移植物的石蜡切片。排除干扰因素，排除远处转移(M1期)患者。切片用IHC Imager(Leica，德国)观察，通过每张切片5个视野中检测到的阳性细胞的比例和强度来评价目的蛋白的表达水平，进行评分。IHC强度评分如下：0(阴性)、1(弱)、2(中等)或3(强)。阳性细胞百分比评分为0(阴性)、1(1％–25％)、2(26％–50％)、3(51％–75％)或4(76％–100％)。IHC评分＝阳性细胞评分百分比×IHC强度评分。最终分数范围为0-3被认为是“阴性”，4-12被认为是“阳性”。

免疫荧光

免疫染色按照标准方案进行。简而言之，将AGS细胞接种在24孔载玻片中。然后，将细胞用4％多聚甲醛固定15分钟，然后用PBS冲洗3次。用5％甘氨酸中和细胞5分钟，并用5％Triton X-100渗透15分钟。将载玻片与抗山羊血清一起孵育1小时，然后用PBS洗涤3次。接下来，将载玻片与小鼠来源的CRABP2(ProteinTech，Cat.#66468-1-Ig)一抗/兔来源的BAX(ProteinTech，Cat.#50599-2-lg)一抗/小鼠来源的BAX一起孵育(ProteinTech,Cat.#60267-1-Ig)一抗/兔源性PARKIN(ProteinTech,Cat.#14060-1-AP)一抗过夜。兔源性荧光二抗和小鼠源性荧光二抗在室温下孵育1h，PBS洗涤3次。载玻片用DAPI(Thermo Fisher,MA,USA)染色5分钟并用PBS洗涤3次。然后，将载玻片转移到载玻片上，并通过共聚焦显微镜LSM980(Carl Zeiss AG，Oberkochen，Germany)对载玻片进行拍照。

谷胱甘肽S转移酶(GST)下拉试验

为了研究CRABP2和BAX/PARKIN之间的相互作用，本实施例在37℃下培养用编码GST或GS T-CRABP2融合蛋白的质粒转化的大肠杆菌(E.coli)B21过夜，以纯化GST或GST-CRABP2融合蛋白。本实验中使用的质粒由Biosune Biotechnology Co.,Ltd.(中国上海)构建。然后，加入异丙基-β-D-硫代半乳糖苷并孵育4小时。用PBST缓冲液(10mM磷酸钠、2mM磷酸钾、140mM NaCl、3mM KCl、0.1％ Tween 20)裂解细菌。然后使用超声波破坏细胞壁。然后，加入100μl 20％ Triton X-100并置于冰上30分钟。将细菌裂解物上清液与谷胱甘肽琼脂糖(Thermo Fisher，USA)在4℃下孵育30分钟以分离GST或GST-CRABP2融合蛋白。重新悬浮与纯化的GST或GST-CRABP2融合蛋白结合的磁珠。同时，6×His引导的GST-BAX/PARKIN融合蛋白转化大肠杆菌B21在37℃培养过夜。随后的步骤与研究GST或GST-CRABP2融合蛋白的步骤相同。对于GST pulldown，将空载体蛋白、GST-BAX/PARKIN融合蛋白和细胞裂解物的上清液与纯化的GST-CRABP2融合蛋白(50μg/ml)在4℃下孵育6小时。通过添加琼脂糖珠并用PBST缓冲液洗涤3次来终止温育。通过蛋白质印迹分析与CRABP2-GST融合蛋白结合的BAX/PARKIN蛋白。

基因组甲基化和羟甲基化的定量分析

AGS和HGC-27亲本和OXA抗性细胞的基因组DNA通过TIANamp基因组DNA试剂盒(天根生物技术，北京，中国)提取。通过Global DNA Methylation Assay Kit(Abcam,MA,USA；ab233486)和Global DNA Hydroxymethylation Assay Kit(Abcam,MA,USA；ab233487)检测每个样品450nm处100ng基因组DNA的吸光度值。根据下式计算甲基化/羟甲基化修饰的百分比：5-mC％＝(样品OD-阴性对照OD)/斜率x S*100％；5-hmC％＝(样品OD-阴性对照OD)/斜率x S*100％。

CRABP2启动子甲基化修饰的定量检测

Methyl Primer ExpressTM v1.0(Applied Biosystems,MA,USA)软件用于预测CRABP2启动子区域的甲基化位点并设计相关引物。然后，从亲本和OXA抗性GC细胞中提取基因组DNA。超声处理10秒，然后暂停30秒，以48W的功率重复4次。在超声波条件下，基因组DNA被剪切成200到1000bp的片段。然后，根据羟甲基化定量检测试剂盒(Abcam，Cambridge，UK)的说明书，获得甲基化修饰的DNA片段，并通过qRT-PCR检测两种细胞系之间甲基化修饰的差异。亲本和OXA抗性GC细胞用1％甲醛交联，基因组DNA在相同的超声条件下被剪切成200至1000bp的片段。然后，使用抗TET1抗体(Abcam，MA，USA；ab272900)富集CRABP2启动子区域，并通过染色质免疫沉淀试剂盒(Abcam，MA，USA；ab500)检测。

蛋白质印迹

首先裂解细胞(Solarbio，北京，中国)，然后在SDS缓冲液中变性以获得总蛋白。在10％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶(每泳道30mg)上分离蛋白质并转移到PVDF膜(MerckMillipore，MA，USA)。在5％脱脂牛奶中封闭1小时后，将膜与一抗在4℃下孵育过夜，然后与二抗(1:15,000，GE Healthcare，Cambridge，UK)在室温下孵育1小时。然后，用ECL化学发光试剂(Merck Millipore，MA，USA)进行可视化。

本研究中使用的抗体如下：CRABP2(1:1,000,ProteinTech,Cat.#10225-1-AP),BAX(1:1,000,Abcam,ab32503),BCL-2(1:1,000,Abcam,ab32124),cleaved caspase-3(1:1,000,Abcam,ab32042),PARKIN(1:1,000,ProteinTech,Cat.#14060-1-AP),ATR(1:1,000,Abcam,ab2905),p-ATR(1:1,000,Abcam,ab178407),ATM(1:1,000,Abcam,ab32420),p-ATM(1:1,000,Abcam,ab81292),P53(1:1,000,Abcam,ab32389),p-P53(1:1,000,Abcam,ab33889),TET1(1:1,000,Abcam,ab272900),DNMT3A(1:1,000,Abcam,ab188470),DNMT3B(1:1,000,Abcam,ab2851),P62(1:1,000,ProteinTech,Cat.#18420-1-AP)、TOMM40(1:1,000,Abcam,ab185543),α-微管蛋白(1:5,000,Abcam,ab7291),β-肌动蛋白(1:5,000,ProteinTech,Cat.#66009-1-Ig),GAPDH(1:20,000,ProteinTech,Cat.#60004-1-Ig)。

裸鼠异种移植试验

所有动物实验均以人道方式进行，并符合山东大学齐鲁医院伦理委员会审查的方案。4周龄雄性BALB/c裸鼠购自维塔河实验动物科技有限公司(中国北京)。对于细胞源性异种移植(CDX)模型，将小鼠随机分为三组：1×10⁶个HGC-27细胞感染阴性对照慢病毒(NC组，20只小鼠)，CRABP2过表达慢病毒(oe-CRABP2组，10小鼠)或CRABP2加BAX过表达慢病毒(oe-CRABP2+oe-BAX组，10只小鼠)注射到裸鼠右腋窝。注射后4周，观察到肿瘤的生长。然后将NC组小鼠随机分为两组(每组10只)，每周3次腹腔注射等量(5mg/kg)PBS或PBS溶解的奥沙利铂。其他两组小鼠每周给予3次等量PBS溶解的奥沙利铂。

对于PARKIN和TET1体内测定，相同数量的HGC-27细胞感染了阴性对照慢病毒(NC组)、PARKIN敲低慢病毒(sh-PARKIN组)、TET1敲低慢病毒(sh-TET1组)或将TET1过表达慢病毒(oe-TET1组)注射到裸鼠的右腋窝。4周后，每只裸鼠每周3次腹腔注射等量(5mg/kg)PBS溶解的奥沙利铂。

对于患者来源的异种移植(PDX)模型，本实施例选择了一名在手术前未接受辅助化疗的GC患者。在手术后30分钟内从该患者收集GC组织。然后，将组织清洗并切成1mm3的组织块并皮下移植到20只NOD-SCID(非肥胖糖尿病-服务器联合免疫缺陷)小鼠的右腋窝中。4周后，当异种移植物达到约100mm3时，所有小鼠腹腔注射生理盐水溶解的奥沙利铂(5mg/kg/小鼠；3次/周)。八周后，分离出最大的异种移植物(表明对OXA最具抗性)并切成1mm3的组织块。然后，将组织块皮下移植到另外20只NOD-SCID小鼠的右腋窝，用于第二代PDX模型。4周后，当异种移植物达到近100mm3时，将小鼠随机分为两组。然后，本实施例使用LIPID InVivo Transfection Reagent(Altogen Biosystems,NV,USA)构建了体内级siRNA注射液。所有小鼠均使用上述方案用奥沙利铂处理，每个异种移植物腹腔注射生理盐水溶解的奥沙利铂(5mg/kg/小鼠；3次/周)并局部注射5nmol siRNA(si-CRABP2，第1组)或其阴性对照(si-NC,Group 2)每周3次，持续4周。

所用siRNA寡核苷酸序列如下：

si-CRABP2,5'-GCCAGCAGTGGAGATCAAATT-3'(SEQ ID NO:1)；

si-NC，5'-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3'(SEQ ID NO:2)。

在这些裸鼠异种移植模型中，每三天测量一次最长和最短的肿瘤直径，并分别记录为L和W。肿瘤体积计算如下：V(mm3)＝L×W²×0.5。

在进行所有治疗后，对小鼠实施安乐死，并取出异种移植物。一半的肿瘤在液氮中冷冻，按照上述方法提取总蛋白。通过蛋白质印迹检查来自不同组的肿瘤中CRABP2和BAX的表达。将另一半肿瘤浸入福尔马林石蜡包埋，苏木精-伊红(HE)染色确认病理诊断，IHC检测CRABP2的表达。

统计分析

癌症基因组图谱(TCGA)数据通过客户端软件从癌症基因组图谱-胃腺癌(TCGA-STAD)服务器下载，然后提取和分析数据。本实施例从TCGA下载胃癌样本的RNAseq数据，将数据转换为TPM(每百万读取的转录本)并进行log2转换。因为样本分布不符合正态分布，所以本实施例使用了Mann-Whitney U检验(Wilcoxon秩和检验)。异常值[中位数±2四分位距(IQR)]和极值(中位数±3.5IQR)被排除在外。所有入组病例均根据第7版美国癌症联合委员会(AJCC)分期系统进行分期。患者人口统计信息、组织病理学信息、病理肿瘤分期(pT分期)、病理淋巴结分期(pN分期)、病理肿瘤-淋巴结-转移分期(pTNM分期)、治疗细节(包括化疗细节、手术类型)、生存期数据被收集。总生存期(OS)定义为从初次手术切除日期到最后一次已知接触或死亡日期的时间间隔。所有值均表示为平均值±标准偏差(SD)。SPSS 20.0(IBM，USA)和GraphPad Prism 8.0(GraphPad Software，USA)软件用于分析数据并制作图表。通过χ2或Fisher检验评估CRABP2与临床病理学特征之间的相关性。生存曲线分析采用Kaplan-Meier法，统计学显着性比较采用log-rank检验。单变量生存分析中的重要变量包含在Cox比例风险回归模型中。t检验用于比较两个独立组，单因素方差分析用于比较多个组。P<0.05被认为具有统计学意义。CRABP2在化疗耐药的GC患者中上调

为寻找GC患者的化疗耐药相关蛋白，本实施例首先从新辅助化疗(NAC)后的GC患者中获取肿瘤组织样本，并将患者分为化疗敏感(CS)组和化疗耐药(CR)组。符合RECIST1.1标准(图1a)。对于两组不同的肿瘤组织(CS组，n＝5；CR组，n＝5)，本实施例基于定量蛋白质组学进行了串联质量标签(TMT)。然后，本实施例通过P<0.05选择蛋白质。log2倍数变化(FC)|>0.58(图1b)。通过上述方法，本实施例鉴定了23个蛋白质分子，其中8个分子上调，15个分子下调(图1c)。其中，本实施例选择了细胞维甲酸结合蛋白2(CRABP2)，其表达上调最多(log2 FC＝1.89)。此外，CR患者组织中CRABP2的表达水平显着上调(图1d-e)。由于参加本研究的患者接受了SOX(奥沙利铂加氟尿嘧啶)方案，为了指定主要影响CRABP2的药物，本实施例过表达CRABP2并进行了CCK-8测定。结果表明，CRABP2的过表达促进了细胞对奥沙利铂的耐药性(图1f)，但对氟尿嘧啶没有(图1g)。为了进一步研究CRABP2促进奥沙利铂耐药的机制，本实施例获得了奥沙利铂耐药的AGS和HGC-27细胞系，分别命名为AGS-OXA和HGC-27-OXA(图8)。qRT-PCR结果显示，奥沙利铂耐药细胞中CRABP2的表达显着高于相应的亲代细胞(P<0.001，图1h)。

CRABP2的表达预测GC患者的总生存期

为验证CRABP2在GC组织中的表达，本实施例从癌症基因组图谱(TCGA)数据库下载了GC肿瘤(n＝335)和正常组织(n＝26)的表达数据。数据分析结果显示，GC肿瘤组织中CRABP2的表达显着上调(P<0.001，图1i)。为了在临床样本中进一步验证这一点，本实施例在44对GC肿瘤和正常组织中进行了qRT-PCR(图1j)，并在12对GC和正常组织中进行了蛋白质印迹(图1k)。结果显示，GC组织中CRABP2的表达在蛋白质和mRNA水平均显着增加(P<0.001)。此外，本实施例在488对GC肿瘤和邻近的正常组织中进行了免疫组织化学(IHC)(图1l)。相关分析显示，CRABP2的表达与肿瘤直径、pT分期、pN分期、pTNM分期有关(P<0.05)。单因素分析显示肿瘤直径、手术类型、肿瘤分化、pT分期、pN分期、pTNM分期、淋巴血管侵犯和CRABP2表达与GC患者的OS相关(P<0.05，图1m和图9)。多因素分析显示，pTNM分期、淋巴血管侵犯和CRABP2表达是GC患者的独立预后因素(P<0.05)。

CRABP2促进GC细胞对奥沙利铂的耐药性

为证实CRABP2对GC细胞化疗耐药性的影响，本实施例构建了稳定的敲低AGS-OXA和HGC-27-OXA细胞系，其中携带慢病毒的sh-RNA靶向CRABP2(命名为sh-CRABP2)和稳定的过表达AGS和HGC-27细胞系(命名为oe-CRABP2)。细胞功能实验表明，敲低CRABP2并加入不同浓度的奥沙利铂48小时后，AGS-OXA和HGC-27-OXA细胞的细胞活力显着降低(P<0.001，图2a)。然后，在有或没有奥沙利铂的两种奥沙利铂耐药细胞系中敲低CRABP2，结果显示细胞的集落形成能力显着降低(P<0.01，图2b)，细胞凋亡显着增加(P<0.001，图2c)。此外，在存在或不存在奥沙利铂的情况下，AGS和HGC-27细胞中CRABP2的过表达显示出相反的结果(图2d-f)。本实施例进一步进行了Transwell和伤口愈合试验，以研究CRABP2在GC细胞中的迁移和侵袭能力。然而，在干扰CRABP2后，结果显示AGS和HGC-27细胞的迁移和侵袭能力没有显着变化(图10)。为了确保OXA抗性GC细胞的细胞特征在奥沙利铂诱导过程中没有改变，本实施例在亲本AGS和HGC-27细胞中进行了细胞功能实验(图11)。这些结果表明，在奥沙利铂存在或不存在的情况下，CRABP2可以促进GC细胞的增殖并抑制其凋亡。

CRABP2加速GC细胞中BAX和PARKIN的结合

为探索CRABP2在调节GC细胞化学抗性中的分子机制，本实施例进行了Co-IP实验并通过质谱分析了相互作用的蛋白质(图3a)。Co-IP测定和蛋白质印迹的结果证实CRABP2与BAX和PARKIN相互作用(图3b)。然后，本实施例采用GST下拉分析来研究相互关系。当两种蛋白质都被纯化时，BAX和PARKIN蛋白被GST-CRABP2融合蛋白结合的珠子拉下，而不是通过SDS-PAGE分析的对照珠子，表明CRABP2和BAX/PARKIN的物理相互作用(图3c)。这些发现表明CRABP2可以直接与BAX和PARKIN相互作用。此外，本实施例进行了co-IP测定和蛋白质印迹以验证BAX和CRABP2之间以及PARKIN和CRABP2之间的相互作用(图3d)。为了进一步证实相互作用，本实施例干扰了AGS细胞中CRABP2的表达，BAX与PARKIN的结合能力降低(图3e)。然而，AGS细胞中CRABP2与PARKIN的结合能力不受BAX表达的影响(图3f)，而AGS细胞中CRABP2与BAX的结合能力不受PARKIN表达的影响(图3g)。此外，免疫荧光实验显示

CRABP2/BAX/PARKIN蛋白在AGS和HGC-27细胞中的常见亚细胞定位(图3h-i)。这些结果表明，CRABP2可以独立地与BAX和PARKIN结合。PARKIN是一种激活E3泛素-蛋白连接酶活性的蛋白质。为了验证PARKIN和BAX的组合是否促进了BAX的降解，本实施例在AGS细胞中过表达CRABP2，并用放线菌酮(CHX)处理细胞0、2、4、6、8或10小时。结果表明BAX蛋白的半衰期显着降低(图3j)。在具有CRABP2敲低的AGS细胞中，CHX显示出相反的效果(图3k)。总之，这些结果表明，CRABP2通过加速BAX和PARKIN在GC细胞中的结合来促进BAX的降解。

CRABP2促进BAX的泛素化降解并诱导奥沙利铂耐药

为进一步研究BAX降解的分子机制，本实施例使用MG-132(Z-Leu-Leu-Leu-al，一种蛋白酶体抑制剂)在敲低或过表达CRABP2后阻断AGS细胞中蛋白酶体的形成。Co-IP和蛋白质印迹的结果证实CRABP2可以促进BAX的泛素化降解(图4a)。为了研究CRABP2促进BAX泛素化降解的具体机制，本实施例干扰/过表达CRABP2的表达，并在不同位点转染HA标记的泛素化质粒。然后，本实施例进行了HA的Co-IP实验。结果证实CRABP2影响BAX在第48个赖氨酸残基(Lys48)的泛素化(图4b)。在AGS/HGC-27细胞中加入OXA后，caspase 9的活性显着上调(图4c)，而caspase 12的活性没有明显变化(图4d)，说明OXA主要影响线粒体凋亡途径。在将OXA添加到AGS/HGC-27细胞后，切割的半胱天冬酶3(CC3)的表达上调(图4e)。此外，在AGS和HGC-27细胞中添加OXA后，DNA损伤/修复相关蛋白的表达增加(图4f)，并且OXA引发了由BAX引起的线粒体途径的细胞凋亡(图4g)。在AGS/HGC-27细胞中CRABP2敲低/过表达后，半胱天冬酶9的活性发生显着变化(图4h)。此外，在敲除CRABP2后，裂解的半胱天冬酶3(CC3)的表达水平在AGS和HGC-27细胞中均上调，而过表达CRABP2导致相反的结果(图4i)。为了验证CRABP2对OXA抗性的影响，本实施例将OXA添加到AGS和HGC-27细胞中并敲低/过表达CRABP2。结果表明CRABP2可以抑制OXA诱导的P53-BAX凋亡途径的激活(图4j)。此外，在AGS/HGC-27细胞中加入OXA并过表达CRABP2后，OXA触发的线粒体途径的细胞凋亡被抑制，反之亦然(图4k-1)。这些结果表明CRABP2可以抑制线粒体BAX依赖性途径引起的细胞凋亡，并诱导GC中的奥沙利铂耐药。

CRABP2通过抑制BAX依赖性细胞凋亡促进奥沙利铂耐药

先前的实验表明，CRABP2抑制了由OXA引起的BAX依赖性细胞凋亡。为了验证CRABP2的奥沙利铂耐药机制，本实施例进行了体外和体内实验。同时敲除CRABP2和BAX后，由敲除CRABP2引起的凋亡细胞百分比增加恢复(图5a)，caspase 9的活性恢复(图5b)，切割的caspase 3的表达恢复(图5b)。图5c)。这些结果表明CRABP2对细胞凋亡的抑制依赖于体外BAX。为了进行体内实验，本实施例构建了一个细胞衍生的异种移植物(CDX)模型。首先，过表达CRABP2或BAX(分别命名为oe-CRABP2或oe-BAX)的慢病毒用于感染HGC-27细胞。然后，将40只裸鼠随机分为4组(NC+PBS、oe-CRABP2+OXA、oe-CRABP2+oe-BAX+OXA和NC+OXA)并给予不同的治疗(参见方法部分图1和5d)。最后，对所有小鼠实施安乐死，取出肿瘤并进行测量(图5e)。来自四组CDX小鼠的肿瘤重量和体积表明，在同时过表达CRABP2和BAX后，由过表达CRABP2引起的HGC-27细胞增加的化学抗性能力被逆转(图5f-g)。一半的肿瘤用于通过蛋白质印迹检查来自不同组的肿瘤中CRABP2和BAX的表达(图5h)，而另一半的肿瘤用HE和IHC染色检查(图5i)。结果表明，CRABP2通过BAX依赖性细胞凋亡通路促进奥沙利铂耐药。

本实施例进一步研究了PARKIN在奥沙利铂耐药中的作用。添加奥沙利铂，同时过表达CRABP2和敲除PARKIN后，裂解的caspase 3水平降低(图12a)、细胞凋亡百分比(图12b)和裂解的caspase 9的活性(图12c)被恢复。体内实验表明，敲除PARKIN显着降低了肿瘤大小(图12d)、体积(图12e)和重量(图12f)。通过蛋白质印迹(图12g)检查BAX/PARKIN的表达。

CRABP2的表达受TET1介导的DNA羟甲基化的影响

初步实验表明，与亲本细胞相比，OXA抗性GC细胞中CRABP2的表达在mRNA水平上显着上调(图1h)。因此，本实施例验证了表观遗传修饰对CRABP2表达的影响。添加5AZ(DNA甲基化酶抑制剂，5mM)、Bobcat339(DNA羟甲基化酶抑制剂，1mM)、DZNEP(组蛋白甲基化酶抑制剂，5mM)、TSA(组蛋白去乙酰化酶抑制剂，2mM)、SAHA(组蛋白去乙酰化酶抑制剂，2mM)至AGS和HGC-27细胞中48h，检测CRABP2的mRNA表达变化。结果证实CRABP2对甲基化和羟甲基化修饰敏感(图6a)。本实施例进一步检查了OXA抗性GC细胞和亲代GC细胞的甲基化/羟甲基化水平，发现OXA抗性细胞的甲基化水平降低(图6b)，而羟甲基化水平增加(图6c)。之后，本实施例检测了OXA抗性和亲本GC细胞中DNA甲基化酶、去甲基化酶和羟甲基化酶的表达和活性，发现甲基化酶和去甲基化酶的表达水平没有显着变化(图6d)，而羟甲基化酶TET1增强(图6d-e)。接下来，本实施例使用Methyl Primer Express v1.0(https://products.appliedbiosystems.com)来预测和设计CRABP2启动子区域中的甲基化位点(图6f)，并使用TET1抗体进行ChIP实验。结果证实TET1可以在CRABP2的启动子区域富集(图6g)。羟甲基化ChIP测定的结果也证实了CRABP2的启动子区域存在羟甲基化修饰(图6h)。在敲低或过表达TET1后，在两种抗OXA的GC细胞中，TET1在mRNA和蛋白质水平上都会影响CRABP2的表达(图6i-j)。

为证实TET1在奥沙利铂耐药中的重要作用，本实施例进行了体外和体内实验。在添加奥沙利铂，同时过表达TET1和敲低CRABP2后，切割的caspase 3水平降低(图13a)、细胞凋亡百分比(图13b)和切割的caspase 9的活性(图13c)被恢复，反之亦然。此外，如qRT-PCR所示，GC患者肿瘤组织中TET1和CRABP2的表达呈正相关(图13d)。体内实验表明，敲低/过表达TET1显着影响肿瘤大小(图13e)、体积(图13f)和重量(图13g)。通过蛋白质印迹检查TET1/BAX/CRABP2的表达(图13h)。

干扰CRABP2可逆转体内GC对奥沙利铂的耐药性

为进一步证实CRABP2在体内介导GC中奥沙利铂耐药的重要性，本实施例构建了GC患者来源的异种移植物(PDX)模型(图7a)。PDX模型构建的细节显示在方法部分。简而言之，将来自GC患者的肿瘤组织皮下移植到小鼠的右腋窝并用OXA治疗。分离出最大的异种移植物(表明对OXA最具抗性)并皮下移植到另一只小鼠的右腋窝，用于第二代PDX模型。然后，本实施例构建了CRABP2的体内级siRNA。在用OXA治疗和局部注射siRNA后，将小鼠安乐死，取出肿瘤并进行测量(图7b)。本实施例称重肿瘤并计算每组小鼠的肿瘤体积(P<0.001，图7c-d)。通过蛋白质印迹测量CRABP2和BAX的表达(图7e)。用福尔马林处理肿瘤标本，包埋在石蜡中，然后通过HE和IHC染色检查(图7f)。结果表明，CRABP2的异常高表达受TET1介导的DNA羟甲基化影响，并通过增强BAX和PARKIN的结合来促进BAX的泛素化，在奥沙利铂处理下抑制细胞凋亡(图7g)。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.TET1、CRABP2、BAX/PARKIN结合体或BAX泛素化水平作为铂类抗肿瘤药物耐药标志物的应用。

2.如权利要求1所述TET1、CRABP2、BAX/PARKIN结合体或BAX泛素化水平作为铂类抗肿瘤药物耐药标志物的应用，其特征在于，所述肿瘤患者为胃肠道肿瘤患者，包括胃癌、小肠癌、结肠癌或直肠癌患者；进一步的，所述肿瘤患者为胃癌患者。

3.如权利要求1所述TET1、CRABP2、BAX/PARKIN结合体或BAX泛素化水平作为铂类抗肿瘤药物耐药标志物的应用，其特征在于，所述铂类药物为选自顺铂、卡铂、奈达铂、洛铂、奥沙利铂中的一种，进一步的，为奥沙利铂。

4.如权利要求1所述TET1、CRABP2、BAX/PARKIN结合体或BAX泛素化水平作为铂类抗肿瘤药物耐药标志物的应用，其特征在于，所述作为耐药标志物的应用，其应用方式包括但不限于以下任意一种：

(1)通过检测TET1、CRABP2、BAX/PARKIN结合体、BAX泛素化水平判断肿瘤患者是否会发生铂类药物耐药，从而调整治疗方案；

(2)TET1、CRABP2、BAX/PARKIN结合体、BAX泛素化水平检测试剂在制备铂类药物耐药检测试剂盒中的应用。

5.一种铂类耐药检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括以下检测试剂中的一种或几种的组合：

(1)TET1含量检测试剂；

(2)CRABP2含量检测试剂；

(3)BAX/PARKIN结合体含量检测试剂；

(4)BAX泛素化水平含量检测试剂。

6.CRABP2作为胃癌患者预后标志物的应用。

7.如权利要求6所述CRABP2作为胃癌患者预后标志物的应用，其特征在于，所述作为胃癌患者预后标志物的应用，其应用方式包括但不限于以下任意一种：

(1)通过对患者病灶组织中CRABP2含量进行检测，从而对患者的生存期等进行判断；

(2)将CRABP2含量检测试剂应用于制备胃癌患者的预后判断试剂盒。

8.一种胃癌患者预后检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括CRABP2含量检测试剂。

9.CRABP2抑制剂在制备抗胃癌药物中的应用；

优选的，所述抑制剂为抑制、干扰患者机体或病灶组织中CRABP2表达的化合物、核酸类或多肽类成分，还可以是基于基因工程方式对上述蛋白表达相关基因进行敲除的试剂；进一步的，所述抑制剂为靶向CRABP2的siRNA，具体序列如下：5'-GCCAGCAGTGGAGATCAAATT-3'；

优选的，所述抗胃癌药物包括用于预防、改善或治疗胃癌疾病的药物制剂，进一步的，所述抗胃癌药物用于具有奥沙利铂耐药的胃癌患者。

10.一种胃癌治疗药物，其特征在于，所述药物中包括CRABP2和/或PARKIN抑制剂。

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