CN115820868A - 一种用于扩增黑棘鲷snp分子标记的多态性引物及其应用 - Google Patents

一种用于扩增黑棘鲷snp分子标记的多态性引物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于扩增黑棘鲷SNP分子标记的多态性引物，所述引物为引物对1‑引物对29，每对引物均包括上游引物和下游引物，所述引物对1‑引物对29的碱基序列依次如SEQ ID NO：1～58所示。还公开了引物在黑棘鲷遗传多样性分析中的应用以及上述SNP分子标记和引物的筛选方法。本发明首次在黑棘鲷上批量建立了具有丰富多态性的48个SNP分析标记，并筛选出了29对多态性引物，为黑棘鲷的家系鉴定、种群遗传结构、遗传育种，增殖放流等研究提供了高效的分析技术工具；本发明提供的黑棘鲷SNP分子标记及其多态性引物的筛选方法，简便、快捷、高效，节约了人力和成本。

Description

一种用于扩增黑棘鲷SNP分子标记的多态性引物及其应用
技术领域
本发明属于鱼类遗传育种领域，具体涉及一种用于扩增黑棘鲷SNP分子标记的多态性引物。
背景技术
黑棘鲷(Acanthopagrus schlegelii)隶属于鱼纲Pisces、鲈形目Perciformes、鲷科Sparidae、棘鲷属Acanthopagrus，广泛分布于西太平洋区，包括中国、日本、韩国、朝鲜、俄罗斯、越南沿海。黑棘鲷为浅海底层鱼类，喜栖息在沙泥底或多岩礁海区，杂食性，是一种重要的经济鱼类。近年来，由于环境污染、过度捕捞等导致黑棘鲷自然种群严重衰退，种质严重退化等；同时黑棘鲷养殖群体的近亲繁殖、小规格亲本人工育苗等原因，导致黑棘鲷养殖种质严重退化，抗病力减弱，养殖性能下降等。以上问题严重制约了黑棘鲷养殖业的持续健康发展。
目前在黑棘鲷遗传育种方面开展的工作较少，梁君等人采用现场调查与理论推算相结合的方法对黑棘鲷增值放流的情况进行了详细研究。吴仁协等人.基于SLAF-seq技术的黑棘鲷微卫星标记可以为鲷科鱼类的种群遗传学分析提供标记来源。此外，还有学者筛选了少量与黑鲷生长相关的单核苷酸多态性(Single-nucleotide polymorphisms，SNPs)位点。目前随着测序技术的飞速发展，大量的SNP应用到水产动物，如鲷科鱼类的黄鳍棘鲷等。这些SNPs具有高多态性，分布广泛等众多优点，在鲷科鱼类遗传育种中具有广泛的应用前景。目前，尚未见黑棘鲷SNP位点筛选的报道。
发明内容
本发明第一个目的在于提供一种用于扩增黑棘鲷SNP分子标记的多态性引物，该引物能用于扩增黑棘鲷SNP分子标记。
本发明目的还在于提供上述的引物在黑棘鲷遗传多样性分析中的应用。
为实现上述第一目的，本发明采用以下技术方案：
一种用于扩增黑棘鲷SNP分子标记的多态性引物，所述引物为引物对1-引物对29，每对引物均包括上游引物和下游引物，所述引物对1-引物对29的碱基序列依次如SEQ IDNO：1～58所示。
所述引物对1-引物对29用于扩增的SNP分子标记为ASSNP1～ASSNP48，所述ASSNP1～ASSNP48的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：59～106所示。
为实现上述第二目的，本发明采用以下技术方案：上述的引物在黑棘鲷遗传多样性分析中的应用。
遗传多样性分析时：选取最具多态性的29个引物对广东阳江的黑棘鲷野生群体进行遗传多样性分析。根据直接测序法得到相应位置的碱基，来确定基因型，之后使用Arlequin version3.5软件统计各标记在野生群体的等位基因数(NA)，观测杂合度(HO)，期望杂合度(HE)，最小等位基因频率(Minor allele frequency，MAF)，并进行哈迪·温伯格平衡(HWE)检验；使用Fstat2.93计算各标记在各样本的遗传分化程度(FIS)；使用PIC_CALC0.6计算各样本的多态信息含量(Polymorphic informationcontent,PIC)，以此来描述黑棘鲷SNP分子标记多态性的特征。
本发明还提供了一种黑棘鲷SNP分子标记及其多态性引物的筛选方法，包括以下步骤：
(1)提取黑棘鲷样品的基因组DNA，建立测序文库；
(2)采用Illumina HiSeq测序平台进行简化基因组测序，获得黑棘鲷原始序列；
(3)将步骤(2)中获得的原始序列去除接头并进行质量过滤后获得高质量序列，使用Trinity软件对高质量序列进行从头组装，得到637,783,356bp黑棘鲷Clean Base；
(4)有效测序数据通过BWA软件(参数：mem-t 4-k 32-M)比对到参考基因组，比对结果经SAMTOOLS去除重复(参数：rmdup)；
(5)采用SAMTOOLS等软件对20若干(比如20个)样本进行群体SNP的检测，SAMTOOLS软件检测公共的SNP位点，经过滤后，最后获得高质量的SNP位点用于后续分析，对于所有的SNP位点，利用Primer 5.0软件设计出21562对引物；
(6)使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取黑棘鲷鳍条的DNA；
(7)选取步骤(5)中的特异性引物(比如100对)对步骤(6)中的DNA进行PCR扩增和测序；
(8)检测步骤(6)中PCR产物的多态性，根据测序结果，筛选出29对具有多态性位点的扩增引物，获得上述的48个黑棘鲷微卫星标记；
优选的，步骤(7)中PCR扩增时的反应体系为10μL，包括100ng/μL基因组DNA 0.5μL、Buffer 1μL、dNTP 0.15μL、Taq酶0.15μL、ddH2O 7.6μL、正反引物均为0.3μL；
优选的，步骤(7)中PCR扩增时的反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存；
优选的，步骤(8)中PCR产物的多态性利用直接测序法，根据相应位置的碱基来判定基因型。
本发明具有以下有益效果：
(1)本发明首次在黑棘鲷上批量建立了具有丰富多态性的SNP分析标记(48个)，并筛选出了29对多态性引物，为黑棘鲷的家系鉴定、种群遗传结构、遗传育种，增殖放流等研究提供了高效的分析技术工具；
(2)本发明提供的黑棘鲷SNP分子标记及其多态性引物的筛选方法，简便、快捷、高效，节约了人力和成本。
具体实施方式
下面结合具体实施例详细说明本发明的技术方案，以便本领域技术人员更好理解和实施本发明的技术方案。实施例中所用试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
实施例1
本实施例中黑棘鲷SNP分子标记及引物，通过以下方法筛选获得：
(1)提取黑棘鲷样品的基因组DNA，建立测序文库；
(2)采用Illumina HiSeq测序平台进行简化基因组测序，获得黑棘鲷原始序列；
(3)将步骤(2)中获得的原始序列去除接头并进行质量过滤后获得高质量序列，使用Trinity软件对高质量序列进行从头组装，得到637,783,356bp黑棘鲷Clean Base；
(4)有效测序数据通过BWA软件(参数：mem-t 4-k 32-M)比对到参考基因组，比对结果经SAMTOOLS去除重复(参数：rmdup)；
(5)采用SAMTOOLS等软件对20个样本进行群体SNP的检测，SAMTOOLS软件检测公共的SNP位点，经过滤后，最后获得高质量的SNP位点用于后续分析，对于所有的SNP位点，利用Primer 5.0软件设计出21562对引物；
(6)使用海洋动物组织基因组DNA提取试剂盒提取黑棘鲷鳍条的DNA；
(7)随机选取100对步骤(5)中的特异性引物对步骤(6中的DNA进行PCR扩增；
(8)检测步骤(7)中PCR产物的多态性，筛选出29对具有多态性位点的扩增引物，获得48个黑棘鲷微卫星标记。
在该黑棘鲷SNP分子标记的筛选方法中：
步骤(7)中的PCR扩增的反应体系为10μL，包括100ng/μL基因组DNA 0.5μL、Buffer1μL、dNTP 0.15μL、Taq酶0.15μL、ddH2O 7.6μL、正反引物均为0.3μL。
步骤(7)中的PCR扩增的反应程序为:94℃预变性5min；94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸10min，最后4℃保存。
步骤(8)中的PCR产物的多态性利用直接测序法，根据相应位置的碱基来判定基因型。
遗传多样性分析：选取最具多态性的29个引物对广东阳江的黑棘鲷野生群体进行遗传多样性分析。根据直接测序法得到相应位置的碱基，来确定基因型，之后使用Arlequinversion 3.5软件统计各标记在野生群体的等位基因数(NA)，观测杂合度(HO)，期望杂合度(HE)，最小等位基因频率(Minor allele frequency，MAF)，并进行哈迪·温伯格平衡(HWE)检验；使用Fstat2.93计算各标记在各样本的遗传分化程度(FIS)；使用PIC_CALC 0.6计算各样本的多态信息含量(Polymorphic informationcontent,PIC)，以此来描述黑棘鲷SNP分子标记多态性的特征。
本实施例提供的用于扩增黑棘鲷SNP分子标记的多态性引物，所述引物为引物对1-引物对29，每对引物均包括上游引物和下游引物，所述引物对1-引物对29的碱基序列如SEQ ID NO：1～58所示，具体如下表1所示。
表1 48个SNP标记及29个引物对的多态性相关信息
Figure BDA0003767638790000041
Figure BDA0003767638790000051
Figure BDA0003767638790000061
Figure BDA0003767638790000071
Figure BDA0003767638790000081
注：HO为表观杂合度，HE为期望杂合度，PHWE为哈迪温伯格平衡检验，PIC为多态信息含量，MAF为最小等位基因频率，FIS为遗传分化程度。
如表1所示，在31个野生黑棘鲷样本中对这48个SNP分子标记遗传多样性分析的结果表明：48个SNP分子标记的表观测杂合度在0.1290～0.6452，期望杂合度在0.3980～0.5094，PIC值在0.3188～0.3950，最小等位基因频率在0.0161～0.5000，遗传分化程度在-0.3953～0.7260。从而证明本发明筛选的微卫星位点的引物具有遗传多态性。
获得的黑棘鲷SNP分子标记为ASSNP1～ASSNP48，所述ASSNP1～ASSNP48的核苷酸序列如SEQ ID NO：59～106所示，具体如下表2所示：
所述ASSNP1的核苷酸序列如SEQ ID NO：59所示，所述ASSNP2～ASSNP3的核苷酸序列如SEQ ID NO：60所示，所述ASSNP4的核苷酸序列如SEQ ID NO：61所示，所述ASSNP5的核苷酸序列如SEQ ID NO：62所示，所述ASSNP6～ASSNP8的核苷酸序列如SEQ ID NO：63所示，所述ASSNP9的核苷酸序列如SEQ ID NO：64所示，所述ASSNP10～ASSNP12的核苷酸序列如SEQ ID NO：65所示，所述ASSNP13～ASSNP14的核苷酸序列如SEQ ID NO：66所示，所述ASSNP15的核苷酸序列如SEQ ID NO：67所示，所述ASSNP16～ASSNP17的核苷酸序列如SEQID NO：68所示，所述ASSNP18～ASSNP20的核苷酸序列如SEQ ID NO：69所示，所述ASSNP21的核苷酸序列如SEQ ID NO：70所示，所述ASSNP22～ASSNP23的核苷酸序列如SEQ ID NO：71所示，所述ASSNP24的核苷酸序列如SEQ ID NO：72所示，所述ASSNP25～ASSNP27的核苷酸序列如SEQ ID NO：73所示，所述ASSNP28的核苷酸序列如SEQ ID NO：74所示，所述ASSNP29～ASSNP30的核苷酸序列如SEQ ID NO：75所示，所述ASSNP31的核苷酸序列如SEQ ID NO：76所示，所述ASSNP32～ASSNP33的核苷酸序列如SEQ ID NO：77所示，所述ASSNP34的核苷酸序列如SEQ ID NO：78所示，所述ASSNP35～ASSNP36的核苷酸序列如SEQ ID NO：79所示，所述ASSNP37～ASSNP39的核苷酸序列如SEQ ID NO：80所示，所述ASSNP40的核苷酸序列如SEQID NO：81所示，所述ASSNP41的核苷酸序列如SEQ ID NO：82所示，所述ASSNP42的核苷酸序列如SEQ ID NO：83所示，所述ASSNP43的核苷酸序列如SEQ ID NO：84所示，所述ASSNP44～ASSNP45的核苷酸序列如SEQ ID NO：85所示，所述ASSNP46～ASSNP47的核苷酸序列如SEQID NO：86所示，所述ASSNP48的核苷酸序列如SEQ ID NO：87所示。
表2 48个微卫星位点的序列信息
Figure BDA0003767638790000091
Figure BDA0003767638790000101
Figure BDA0003767638790000111
Figure BDA0003767638790000121
以上实施例仅用于阐述本发明，而本发明的保护范围并非仅仅局限于以上实施例。所属技术领域的普通技术人员依据以上本发明公开的内容均可实现本发明的目的，任何基于本发明构思基础上做出的改进和变形，均落入本发明的保护范围之内，具体保护范围以权利要求书记载的为。

Claims (4)

1.一种用于扩增黑棘鲷SNP分子标记的多态性引物，所述引物为引物对1-引物对29，每对引物均包括上游引物和下游引物，所述引物对1-引物对29的碱基序列依次如SEQ ID NO：1～58所示。
2.根据权利要求1所述的引物，其特征是：所述引物对1-引物对29用于扩增的SNP分子标记为ASSNP1～ASSNP48，所述ASSNP1～ASSNP48的核苷酸序列依次如SEQ ID NO：59～106所示。
3.权利要求1所述的引物在黑棘鲷遗传多样性分析中的应用。
4.一种黑棘鲷SNP分子标记及其多态性引物的筛选方法，其特征是包括以下步骤：
(1)提取黑棘鲷样品的基因组DNA，建立测序文库；
(2)采用Illumina HiSeq测序平台进行简化基因组测序，获得黑棘鲷原始序列；
(3)将步骤(2)中获得的原始序列去除接头并进行质量过滤后获得高质量序列，使用Trinity软件对高质量序列进行从头组装，得到637,783,356bp黑棘鲷Clean Base；
(4)有效测序数据通过BWA软件比对到参考基因组，比对结果经SAMTOOLS去除重复；
(5)采用SAMTOOLS软件对若干样本进行群体SNP的检测，SAMTOOLS软件检测公共的SNP位点，经过滤后，获得高质量的SNP位点用于后续分析，对于所有的SNP位点，利用Primer5.0软件设计出21562对引物；
(6)提取黑棘鲷鳍条的DNA；
(7)选取步骤(5)中的特异性引物对步骤(6)中的DNA进行PCR扩增和测序；
(8)检测步骤(7)中PCR产物的多态性，筛选出权利要求1中的29对具有多态性位点的扩增引物，获得权利要求2中的48个黑棘鲷SNP分子标记。
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