CN115820829A - Mydgf在防治记忆损伤及其相关疾病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了MYDGF在防治记忆损伤及其相关疾病中的应用，本发明公开了MYDGF在记忆损伤个体中呈现显著性差异，施用MYDGF后，能防治记忆损伤，阻止新生神经元的死亡。

Description

MYDGF在防治记忆损伤及其相关疾病中的应用

技术领域

本发明属于生物医药领域，涉及MYDGF在防治记忆损伤及其相关疾病中的应用。

背景技术

慢性应激(chronic stress)是影响现代社会多种人类疾病的主要危险因素，大脑是慢性应激的主要目标。越来越多的证据表明，长期暴露在应激条件下会影响学习和记忆、决策和情绪反应，甚至可能诱发阿尔茨海默病(Alzheimer disease,AD 和抑郁症等病理过程(Oliveira T G,Chan R B,Bravo F V,et al.The impact of chronic stress on therat brain lipidome[J].Mol Psvchiatry，2016,21(1):80-88.)。长期处于慢性应激状态会增加肥胖、高血压、心脏病以及消化问题发生的风险，而且，它可能与免疫系统功能低下相关，进而导致抑郁、影响生育能力和出现记忆障碍。

当今社会生活节奏加快，人们的工作压力越来越大，加之频繁的自然灾害或公共卫生事件，各种各样的慢性应激随时都伴随着我们。据世界卫生组织估计，应激相关精神障碍的患病率为22.1％(Chanson F,Van OM,Flaxman A,et al.New WHO prevalenceestimates of mental disorders in conflict settings:a systematic review andmeta-analysis[J].Lancet,2019,394(10194):240-248.)，超过我国普通人群精神障碍的患病率(Huang Y,Wang Y,Wang H,et al.Prevalence of mental disorders in China:across-sectional epidemiological study[J].Lancet Psychiatry,2019,6(3):211-224.)，持续的慢性应激可能会对机体的学习记忆能力造成一定的损伤。

近年来，大量文献报道，慢性应激通过损伤HPA轴的负反馈平衡，激活海马糖皮质激素受体，增加神经细胞的代谢，减少神经细胞的存活和再生，此外，通过促进树突萎缩，影响长时程增强和认知功能(McEwen BS,Magarinos AM. Stress and hippocampalplasticity:implications for the pathophysiology of affective disorders[J].Human psychopharmacology.2001,16(S1):S7-s19.)，从而诱发神经精神疾病。慢性束缚应激模型(chronic restraint stress,CRS)是极为广泛使用的用于探讨慢性应激诱发学习记忆损伤及抑郁行为的常见应激模型(Liu Y,Zhuang X,Gou L, et al.Protectiveeffects of nizofenone administration on the cognitive impairments induced bychronic restraint stress in mice[J].Pharmacology,biochemistry, andbehavior.2013,103(3):474-80.)。目前针对慢性应激没有明确的治疗药物，因此急需抗应激的药物来改善状况，尤其是恢复认知功能。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供防治记忆损伤的药物和手段。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面提供了检测MYDGF的试剂在制备检测记忆损伤或记忆损伤相关疾病的产品中的应用。

在一些实施方案中，所述试剂包括特异性识别MYDGF基因的寡核苷酸探针、特异性扩增MYDGF基因的引物或特异性结合MYDGF基因编码的蛋白的结合剂。

本发明第二方面提供了检测MYDGF的试剂在制备诊断记忆损伤相关疾病的产品中的应用。

在一些实施方案中，所述试剂包括特异性识别MYDGF基因的寡核苷酸探针、特异性扩增MYDGF基因的引物或特异性结合MYDGF基因编码的蛋白的结合剂；

在一些实施方案中，所述记忆损伤相关疾病包括抑郁症、阿尔茨海默症。

本发明第三方面提供了一种检测记忆损伤或记忆损伤相关疾病的产品，其特征在于，所述产品包括能够检测MYDGF表达水平的芯片、试剂盒或核酸膜条。

在一些实施方案中，所述芯片包括基因芯片、蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测MYDGF基因转录水平的针对MYDGF基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括MYDGF蛋白的特异性结合剂；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测MYDGF基因转录水平的试剂、或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测MYDGF蛋白表达水平的试剂、或芯片。

在一些实施方案中，所述试剂盒包括通过RT-PCR法、qRT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法检测MYDGF基因或蛋白表达水平的试剂。

本发明第四方面提供了MYDGF在构建预测记忆损伤/记忆损伤相关疾病的模型中的应用。

本发明第五方面提供了MYDGF在制备防治受试者记忆损伤的药物/保健品中的应用。

在一些实施方案中，所述药物/保健品包括MYDGF的促进剂。

在一些实施方案中，所述促进剂特异性促进MYDGF的表达水平。

在一些实施方案中，所述促进剂为MYDGF过表达的载体或MYDGF蛋白。

在一些实施方案中，所述记忆损伤相关疾病包括抑郁症、阿尔茨海默症。

在一些实施方案中，所述药物阻止新生神经元死亡。

本发明第六方面提供了MYDGF在制备防治受试者记忆损伤相关疾病的药物/保健品中的应用。

在一些实施方案中，所述药物/保健品包括MYDGF的促进剂。

在一些实施方案中，所述促进剂特异性促进MYDGF的表达水平。

在一些实施方案中，所述促进剂为MYDGF过表达的载体或MYDGF蛋白。

在一些实施方案中，所述记忆损伤相关疾病包括抑郁症、阿尔茨海默症。

在一些实施方案中，所述药物阻止新生神经元死亡。

本发明第七方面提供了一种防治记忆损伤或记忆损伤相关疾病的药物，所述药物包括MYDGF的促进剂。

在一些实施方案中，所述促进剂特异性促进MYDGF的表达水平。

在一些实施方案中，所述促进剂为MYDGF过表达的载体或MYDGF蛋白。

在一些实施方案中，所述药物包括药学上可接受的载体。

本发明第八方面提供了一种阻止新生神经元死亡的方法，施用有效量的 MYDGF促进剂。

在一些实施方案中，所述促进剂特异性促进MYDGF的表达水平。

在一些实施方案中，所述促进剂为MYDGF过表达的载体或MYDGF蛋白。

本发明中，所述方法可以用于研究和其他非治疗目的。

本发明第九方面提供了MYDGF在筛选防治记忆损伤或记忆损伤相关疾病的候选药物中的应用。

在一些实施方案中，筛选候选药物的方法如下：用待筛选物质处理表达或含有MYDGF基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中MYDGF基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质促进MYDGF基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是防治记忆损伤相关疾病的候选药物。

本发明第十方面提供了一种筛选防治记忆损伤相关疾病的候选药物的方法，所述方法包括：用待筛选物质处理表达或含有MYDGF基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中MYDGF基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质促进MYDGF基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是防治记忆损伤相关疾病的候选药物。

本发明的优点和有益效果：

本发明首次发现了MYDGF在记忆损伤患者中呈现显著性下调，通过检测 MYDGF的水平，可以实现记忆损伤或记忆损伤相关疾病的检测或诊断。

本发明首次发现了MYDGF可以用于记忆损伤或记忆障碍的预防和治疗。使用MYDGF可以较好的防治记忆损伤，阻止新生神经元的死亡。

附图说明

图1是细胞因子的表达情况图。

图2是水迷宫实验检测结果图，其中，2A是前4天水迷宫检测结果图，2B是第5天撤台后进入NW次数的检测结果图；2C是第5天撤台后在NW区域停留时间检测结果图。

图3是MYDGF对于海马新生神经元的影响图，其中，3A是免疫荧光检测神经元细胞图，3B是神经元细胞统计图。

具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的含义相同。否则，本文所用的某些术语具有本说明书中所述的含义。

在本发明中，“记忆损伤”、“记忆障碍”、“学习障碍”、“学习记忆障碍”、“认知障碍”可互换使用，应被理解为包括任何认知疾病或病症。这种认知疾病或病症的非限制性例子有注意力缺陷病症(ADD)、注意力缺陷多动症(ADHD)、阅读障碍、与年龄相关的记忆损伤和学习障碍、健忘症、轻度认知损伤、认知损伤型非痴呆性前阿尔茨海默病、孤独症、肌张力障碍及抽动秽语综合症、痴呆、与年龄相关的认知下降、认知衰退、中度精神损伤、由衰老所致的精神衰退、影响脑电波强度和/或脑部葡萄糖利用的病状、紧张、焦虑症、集中和注意力障碍、情绪恶化、一般认知及心理健康、神经退行性病症、激素失调、抑郁或它们的任意组合。

在本发明中，术语“差异表达”表示与第二种样品中相同的一种或多种本发明生物标志物的表达水平比较，经测定mRNA的量或水平，在一个样品中本发明的一种或多种生物标志物的RNA和/或所述生物标志物mRNA的一种或多种剪接变体表达水平的差异。“差异表达的”还可以包括与第二种样品或样品群中蛋白质表达量或水平比较，对样品或样品群中本发明生物标志物编码的蛋白质的测定。差异表达可以如本文所述和本领域技术人员理解的方法确定。术语“差异表达”或“表达水平的变化”表示与第二种样品中给定生物标志物的可测定表达水平比较，经测定RNA的量和/或蛋白质的量，样品中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。术语“差异表达”或“表达水平的变化”还可以表示与第二个样品群中生物标志物的可测定表达水平比较，样品群中给定生物标志物可测定表达水平的增加或降低。

本发明包括任何本领域可用的用于检测本文所述的内在基因表达的方法。“检测表达”是指确定内在基因的RNA转录物或其表达产物的量或存在。检测本公开的内在基因表达，即基因表达概况分析的方法包括基于多核苷酸杂交分析的方法、基于多核苷酸测序的方法、免疫组化方法、和基于蛋白质组学的方法。这些方法通常检测本文所述的内在基因的表达产物(例如mRNA)。在优选的实施方案中，使用基于PCR的方法，例如逆转录PCR(RT-PCR)，和基于阵列的方法例如微阵列。“微阵列”指可杂交阵列元件，如，例如，多核苷酸探针，在基质上的有序排列。术语“探针”指能与特别预期的靶生物分子，例如由内在基因编码的或相应于内在基因的核苷酸转录物或蛋白选择性结合的分子。探针可以由本领域技术人员合成，或者可以来自于合适的生物制备物。可以特异性地设计探针以对其进行标记。可以用作探针的分子的实例包括，但不限于RNA、DNA、蛋白、抗体、和有机分子。

本发明中特异性结合MYDGF基因编码的蛋白的结合剂例如蛋白质MYDGF 的受体、结合蛋白质MYDGF的凝集素、针对蛋白质MYDGF的抗体、针对蛋白质MYDGF的肽抗体(peptidebody)、双特异性双重结合剂或双特异性抗体形式。特异性结合剂的具体例子是肽、肽模拟物、aptamer、spiegelmer、darpin、锚蛋白重复蛋白、Kunitz型域、抗体、单域抗体和单价抗体片段。在本发明的具体实施例中，所述特异性结合剂为MYDGF特异性抗体。

本发明提供了MYDGF在构建预测记忆损伤或记忆损伤相关疾病的计算模型中的应用，正如熟练技术人员知道的，可以以不同方式实施和实现将标志物水平与某种可能性或风险关联起来的步骤。优选地，在数学上组合标志物和一种或多种其它标志物的测定浓度，并将组合值与根本的诊断问题关联起来。可以通过任何适宜的现有技术数学方法将标志物值的测定组合。

本发明提供了MYDGF在制备防治记忆损伤或记忆损伤相关疾病的药物中的应用以及防治记忆损伤或记忆损伤相关疾病的药物，所述药物包括MYDGF的促进剂。所述促进剂是指任何可增加MYDGF蛋白的活性、提高MYDGF基因或蛋白的稳定性、上调MYDGF蛋白的表达、增加MYDGF蛋白有效作用时间、或促进MYDGF基因的转录和翻译的物质，这些物质均可用于本发明，作为对于上调MYDGF有用的物质，从而可用于防治记忆损伤或记忆损伤相关疾病。例如所述的促进剂包括核酸促进剂，蛋白促进剂。所述促进剂包括但不限于过表达 MYDGF的载体、MYDGF蛋白或其活性肽。

本发明提供了防治记忆损伤或记忆损伤相关疾病的药物，所述药物包含有效量的MYDGF促进剂。

在一些实施方案中，所述促进剂特异性促进MYDGF的表达水平。

在一些实施方案中，所述促进剂为MYDGF过表达的载体或MYDGF蛋白。

虽然该药物可以单独施用，但优选地将其作为包含至少一种活性成分如 MYDGF以及一种或多种在药学上可接受的载体的药物制剂。每种载体都必须是“可接受的”，即与配方的其他成分相容，且不会对患者造成伤害。

配方包括适合口服、直肠、鼻、局部(包括经皮、口腔和舌下)、阴道、肠胃外(包括皮下、肌肉内、静脉内和皮内)和肺部给药的制剂。这些制剂可以方便地以单位剂型呈现，并且可以通过药学领域中众所周知的任何方法制备。此类方法包括将活性成分与构成一种或多种辅助成分的载体结合的步骤。一般来说，制剂的制备方法是将活性成分与液体载体或精细分离的固体载体或两者均匀紧密地结合，然后在必要时成型产品。

适合口服给药的本发明制剂可作为离散单元存在，例如胶囊、缓冲剂或片剂，每个单元包含预定量的活性成分；作为粉末或颗粒；作为水性或非水性液体中的溶液或悬浮液；或作为水包油液体乳状液或油包水液体乳状液。活性成分也可呈现为丸状、膏状或糊状。

片剂可通过压缩或模塑制成，可选地含有一种或多种辅助成分。可通过在适当的机器中压缩自由流动形式的活性成分(如粉末或颗粒)制备压缩片剂，可选地与粘合剂(例如聚维酮、明胶、羟丙基甲基纤维素)、润滑剂、惰性稀释剂、防腐剂、崩解剂(例如，乙醇酸淀粉钠、交联聚维酮、交联羧甲基纤维素钠)表面活性剂或分散剂混合。模制片剂可通过在适当的机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉状化合物的混合物来制备。片剂可任选地被包衣或刻痕，并且可被配制成使用例如羟丙基甲基纤维素以不同比例提供其中活性成分的缓慢或受控释放，以提供所需的释放曲线。片剂可以任选地提供肠衣，以在除胃以外的肠道部分释放。

适合口腔局部给药的制剂包括含片，含片以调味基础包含活性成分，通常为蔗糖和阿拉伯胶或黄芩；锭剂以惰性基础(如明胶和甘油，或蔗糖和阿拉伯胶) 包含活性成分。

根据本发明的用于局部给药的药物组合物可配制为软膏、乳膏、悬浮液、乳液、粉末、溶液、糊剂、凝胶、喷雾、气雾剂或油。

适合眼睛局部施用的制剂还包括滴眼液，其中活性成分溶解或悬浮在合适的载体中，尤其是用于制剂的水溶剂中。

适用于鼻腔给药的制剂，其中载体为固体，包括例如具有粒度在约20至约 500微米范围内的粗粉，其作为干粉给药，或在吸入器装置中通过鼻腔通道从靠近鼻子的粉末容器快速吸入。其中所述载体为供施用的液体(例如，鼻喷雾剂、滴鼻剂或通过雾化器的气雾剂)的合适制剂，包括所述制剂的水溶液或油溶液。

适合于肠胃外给药的制剂包括水性和非水性等渗无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和使制剂与预期受试者的血液等渗的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包括悬浮剂和增稠剂，以及脂质体或其他微粒系统，设计用于使化合物靶向血液成分或一个或多个器官。制剂可在单位剂量或多剂量密封容器(例如安瓿和小瓶)中呈现，并可在储存在冷冻干燥(冻干)条件下，仅需在使用前立即添加无菌液体载体(例如注射用水)。临时注射溶液和悬浮液可由上述类型的无菌粉末、颗粒和片剂制备。

在本发明中，药学上可接受的载体包括但不限于：稀释剂、缓冲剂、混悬剂、乳剂、颗粒剂、包囊剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、喷雾剂、透皮吸收剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、着色剂、矫味剂、吸附载体等。

药学上可接受的稀释剂包括磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在一些实施方案中，药学上可接受的稀释剂为无菌磷酸盐缓冲盐水。

应当理解，除了上述特别提到的成分之外，本发明的药物可以包括本领域常用的其他制剂，考虑到所述制剂的类型，例如，适合口服给药的制剂可以包括作为甜味剂、增稠剂和调味剂的其他制剂。

对于本领域的技术人员还将显而易见的是，本发明的药物的有效剂量将根据期望的效果而变化。因此，本领域技术人员可容易地确定待施用的最佳剂量，并且最佳剂量将随所使用的具体化合物、给药方式、制剂强度和疾病状况的进展而变化。另外，与接受治疗的具体受治疗者相关的因素，包括受治疗者年龄、体重、饮食和给药时间，将导致需要将剂量调整至适当的治疗水平。

根据具体实施方案，有效量或有效剂量是指足以实现下列效应中的一者、两者、三者、四者、或更多者的治疗量：(i)减少或改善欲被治疗的疾病、障碍、或病症的严重程度或与其相关的症状；(ii)减少所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的持续时间；(iii)预防所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状发展；(iv)引起所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状消退；(v)防止所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状发展或发作；(vi)防止所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状复发；(vii)减少患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的住院治疗；(viii)减少患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的住院时间；(ix)提高患有所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状的受试者的存活；(xi)抑制或减少受试者中所治疗疾病、障碍或病症或与之相关的症状；和/或(xii)增强或改善另一种疗法的预防或治疗效果。

治疗有效量或剂量可根据各种因素，诸如欲被治疗的疾病、障碍、或病症、给药方式、目标部位、受试者的生理状态(包括例如年龄、体重、健康)而变化，不论受试者是人或动物、给药的其他药物，以及是否为预防性或治疗性治疗。

在本发明中，“防治”病症或疾病是指(1)防止易感或尚未显示病症的受试者出现症状或疾病；(2)抑制疾病或阻止其发展或复发；或(3)改善或导致疾病或病症消退。如本领域所理解的，“防治”是用于获得有益的或期望的结果(包括临床结果)的方法。出于本技术的目的，有益的或期望的结果可以包括但不限于减轻或改善一个或多个症状、病症(包括疾病)程度的减轻、病症(包括疾病) 状态的稳定(即，不恶化)，病症(包括疾病)的延迟或减缓、病症(包括疾病)、状态和缓解(无论是部分还是全部)的进展、改善或缓解，无论是否可检测。

在本发明中，“受试者”是指任何动物，优选哺乳动物，最优选人。如本文所用，术语“哺乳动物”涵盖任何哺乳动物。哺乳动物的示例包括但不限于牛、马、绵羊、猪、猫、狗、小鼠、大鼠、兔子、豚鼠、猴子、人等，更进一步包括人，例如有记忆损伤、抑郁症、阿尔茨海默症的人。

本发明进一步提供了一种筛选防治记忆损伤或记忆损伤相关疾病的候选药物的方法，所述方法包括用待筛选物质处理表达或含有MYDGF基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中MYDGF基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质促进MYDGF基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是防治记忆损伤或记忆损伤相关疾病的候选药物。

在本发明中，所述的方法还包括：对上面步骤获得的候选药物进一步测试其抑制记忆损伤或记忆损伤相关疾病的效果，若测试化合物对记忆损伤或记忆损伤相关疾病有显著的抑制效果，则说明该候选药物为防治记忆损伤或记忆损伤相关疾病的候选药物。

所述培养体系包括(但不限于)细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系(如动物模型，优选非人哺乳动物的动物模型，如鼠、兔、羊、猴等)等。

下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 MYGDF在记忆损伤个体中的表达情况

既往申报“CD317诱导的抑郁和记忆损伤的小鼠模型的构建方法及其应用 (专利号：202011100708.6，2021-9-27授权)”的国家发明专利，发现CD317中和抗体长期清除pDC后导致抑郁和记忆损伤。使用专利中记载的方法构建抑郁和记忆损伤的小鼠模型，收集对照IgG注射、CD317中和抗体注射、和CD317 中和抗体联合刺五加苷E(EE)处理的小鼠脑组织进行整体高通量测序，检测呈现显著性差异的基因，检测步骤如下：

一、Trizol法提取总RNA

1.收集细胞置于干净的EP管中，并用预冷的PBS缓冲液洗一次，离心后弃上清；

2.加入500μl Trizol，吹打并颠倒混匀15s使细胞裂解，室温静置5min；

3.加入100μl三氯甲烷，剧烈颠倒混匀后涡旋震荡器涡旋10s，室温静置 10min；

4. 4℃，12,000rpm离心15min，此时EP管中的溶液分为上中下三层，吸取上层水相层于新的EP管中，注意不要吸到中间层以及下层的溶液，以免污染 RNA；

5.加入等体积的异丙醇(约200μl)，轻柔颠倒混匀，室温静置15min；

6. 4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，能看到试管底部有一小点白色沉淀即RNA，加入1ml预冷的75％乙醇(DEPC水配置)洗涤沉淀；

7. 4℃，12,000rpm离心10min，弃上清，开盖使剩余的乙醇挥发干净；

8.加入30μl DEPC水，涡旋混匀，测量RNA浓度，置于-80℃冰箱保存或进行后续实验。

二、cDNA文库构建和测序

1μg总RNA被用于后续的实验，利用NEBNext UltraTM RNA Library Prep 试剂盒制备cDNA文库。利用Illumina HiSeq平台测序，产生150bp末端配对的序列，利用HTSeqv0.6.0算出每个基因的序列读值，计算每个基因的FPKM (Fragments per Kilobase oftranscript sequence per Millions base pairs sequenced)。针对基因i，算式如下：FPKM_i＝X_i*10⁹/(l_iN)。X_i，基因i的原始测序读值；l_i，基因i的所有外显子长度总和；N:样本中所有基因的表达量，也叫做测序深度。

三、结果

结果如图1所示，抑郁和记忆损伤个体中的MYGDF mRNA水平降低， MYDGF mRNA水平的降低被维护记忆的刺五加苷E(EE)逆转。

实施例2 MYGDF对记忆损伤的影响

一、实验分组

将8周龄C57 BL/6小鼠随机分为三组，一组每天限制性束缚8小时(9:00- 17:00)，连续14天(Restraint组)；一组每天在限制性束缚之前滴鼻细胞因子 MYDGF(0.5μg/只/天；Restraint+MYDGF组)；另外一组不束缚，仅在每天其它老鼠束缚时拿掉食物和水(Ctrl组)。

限制性束缚处理方法：

束缚装置为改造过的50mL离心管(除管壁钻出若干小孔外，管尖及管盖也应各留有一个小孔方便小鼠呼吸及尾部活动)，束缚时应将束缚管45°倾斜放在笼子上，且小鼠尾部应从束缚管盖孔中穿过，防止尾部长时间卷曲造成断裂使小鼠死亡。束缚时间结束后将小鼠放回原笼正常饮水、喂食。

二、水迷宫实验

1、实验前准备：

1)将水注入水迷宫中，水的高度在高过站台1cm左右。保持合适水温(小鼠：21～22℃)，如果水温过低，可使用快速热水器将热水加入水迷宫中，调至合适温度。实验前30min把动物带入实验室中熟悉环境。

2)打开实验电脑，通过监视系统观察水面光线是否分布均匀。由于开灯会反光，应关上室内灯，打开窗帘。

3)检查标记物是否在固定的位置，整个几天实验中，标记物不可移动。

2、正式实验：

将已经编好号的小鼠依次放入水迷宫进行实验，具体操作如下：

1)鼠笼中取出小鼠，将动物面向池壁放入快速放入水迷宫中，不可直接扔下去。入水点选4个象限的位置，每个入水点每组都检测，共四轮(按距离站台由近到远的顺序顺时针或逆时针，每天交替进行)；在小鼠入水的一瞬间，应立即围紧围帘，防止光线及人员干扰。然后快速的按下录像键。

2)设置录像时间为60s，当动物到达站台保持30s视为找到站台，这时录像自动停止；如果小鼠在规定时间内没有游上站台，应引导小动物上站台，让动物在站台上30s熟悉周边环境后取走；如果小鼠在规定时间到达平台，也需要在站台上熟悉10s后取走；

3)在测完一只后应用毛巾将其擦干，再进行下一只测试。一轮过后，间隔 30min进行下一轮，共四轮。

4)定位航行实验(检测其学习能力)做4天，第5天，撤去站台，即空间探索实验(检测其记忆能力)，选择站台所在象限的对侧象限为入水点，只做一次，录像时间为60s。

注意事项：

1.保证标记物体的位置在同一实验中不要改变

2.不要任意改变实验室中其他实验物品的位置

3.在实验进行中尽量保证实验室的安静

4.在进行水迷宫实验期间，实验人员最好不要使用香水或者其他有刺激性气味的物品

3、统计分析

1)有站台时，从到达平台的时间、路程、速度三个指标统计分析。

2)无站台时，四个指标：比较穿梭平台所在象限及穿梭平台的次数和时间。

3)数据分析用SPSS软件，采用多样重复分析。

4、结果

结果显示，在前4天，Restraint组小鼠学习速度较Ctrl组减慢(4天的P值分别为0.805，0.016，0.266，0.025)，Restraint+MYDGF组较Restraint组小鼠小鼠学习速度加快(4天的P值分别为0.979，0.314，0.025，0.008)，和Ctrl组相似；第5天撤掉平台后，Restraint组小鼠进入平台所在象限次数少于Ctrl组， Restraint+MydGF组较Restraint组小鼠进入平台所在象限次数呈现增多趋势，而且进入平台所在象限时间延长(图2)，说明MYDGF具有维护记忆的作用。

三、免疫荧光实验检测新生神经元

1、免疫荧光检测

1)小鼠海马冰冻切片室温放置5～10min使其复温，之后PBS洗涤3次，每次5min。

2)倒入冰甲醇保证体积能够淹没组织，-20℃固定1h。

3)时间结束后取出片子，PBS洗涤3次，每次5min。

4)用组化笔小心围绕贴片画圈，之后加入适量3％BSA-TritonX-100-PBS封闭液室温封闭1～2h。

5)用封闭液1:100稀释DCX抗体(CST，4604)滴加在组织上，放入4℃展示柜内孵育过夜。

6)第二天取出片子，根据使用次数决定是否回收一抗，之后PBS洗涤3次，每次5min。

7)加入TRITC标记的山羊抗兔荧光二抗(中山金桥)，37℃染色1h。

8)PBS洗涤3次，每次5min。

9)加入封片剂后一周内使用荧光显微镜观察结果。

2、结果

结果如图3示，反映新生神经元数量的DCX+神经元的确在Restraint组小鼠中降低，Restraint+MydGF组较Restraint组小鼠新生神经元增多，说明MYDGF 阻止海马新生神经元细胞的死亡，具有维护记忆的作用。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测MYDGF的试剂在制备检测记忆损伤或记忆损伤相关疾病的产品中的应用；

优选地，所述试剂包括特异性识别MYDGF基因的寡核苷酸探针、特异性扩增MYDGF基因的引物或特异性结合MYDGF基因编码的蛋白的结合剂。

2.检测MYDGF的试剂在制备诊断记忆损伤相关疾病的产品中的应用；

优选地，所述试剂包括特异性识别MYDGF基因的寡核苷酸探针、特异性扩增MYDGF基因的引物或特异性结合MYDGF基因编码的蛋白的结合剂；

优选地，所述记忆损伤相关疾病包括抑郁症、阿尔茨海默症。

3.一种检测记忆损伤或记忆损伤相关疾病的产品，其特征在于，所述产品包括能够检测MYDGF表达水平的芯片、试剂盒或核酸膜条；

优选地，所述芯片包括基因芯片、蛋白芯片，所述基因芯片包括用于检测MYDGF基因转录水平的针对MYDGF基因的寡核苷酸探针，所述蛋白芯片包括MYDGF蛋白的特异性结合剂；所述试剂盒包括基因检测试剂盒、蛋白检测试剂盒，所述基因检测试剂盒包括用于检测MYDGF基因转录水平的试剂、或芯片，所述蛋白检测试剂盒包括用于检测MYDGF蛋白表达水平的试剂、或芯片；

优选地，所述试剂盒包括通过RT-PCR法、qRT-PCR法、生物芯片检测法、DNA印迹法、原位杂交法、免疫印迹法检测MYDGF基因或蛋白表达水平的试剂。

4.MYDGF在构建预测记忆损伤/记忆损伤相关疾病的模型中的应用。

5.MYDGF在制备防治记忆损伤的药物/保健品中的应用；

优选地，所述药物/保健品包括MYDGF的促进剂；

优选地，所述促进剂特异性促进MYDGF的表达水平；

优选地，所述促进剂为MYDGF过表达的载体或MYDGF蛋白；

优选地，所述记忆损伤相关疾病包括抑郁症、阿尔茨海默症；

优选地，所述药物阻止新生神经元死亡。

6.MYDGF在制备治疗记忆损伤相关疾病的药物/保健品中的应用；

优选地，所述药物/保健品包括MYDGF的促进剂；

优选地，所述促进剂特异性促进MYDGF的表达水平；

优选地，所述促进剂为MYDGF过表达的载体或MYDGF蛋白；

优选地，所述记忆损伤相关疾病包括抑郁症、阿尔茨海默症；

优选地，所述药物阻止新生神经元死亡。

7.一种防治记忆损伤或记忆损伤相关疾病的药物，其特征在于，所述药物包括MYDGF的促进剂；

优选地，所述促进剂特异性促进MYDGF的表达水平；

优选地，所述促进剂为MYDGF过表达的载体或MYDGF蛋白；

优选地，所述药物包括药学上可接受的载体。

8.一种阻止新生神经元死亡的方法，其特征在于，施用有效量的MYDGF促进剂；

优选地，所述促进剂特异性促进MYDGF的水平；

优选地，所述促进剂为MYDGF过表达的载体或MYDGF蛋白。

9.MYDGF在筛选防治记忆损伤或记忆损伤相关疾病的候选药物中的应用。

10.一种筛选防治记忆损伤相关疾病的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括：用待筛选物质处理表达或含有MYDGF基因或其编码的蛋白的培养体系；和检测所述体系中MYDGF基因或其编码的蛋白的表达或活性；其中，当所述待筛选物质促进MYDGF基因的或其编码的蛋白的表达水平或活性时，该待筛选物质是防治记忆损伤相关疾病的候选药物。

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