CN115819586A

CN115819586A - 抗人SIRPα单克隆抗体及其用途

Info

Publication number: CN115819586A
Application number: CN202211256154.8A
Authority: CN
Inventors: 刘佳禹; 洪乐莹; 王薇; 段世鑫
Original assignee: Livzon Mabpharm Inc
Current assignee: Livzon Mabpharm Inc
Priority date: 2022-10-13
Filing date: 2022-10-13
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2042-10-13
Also published as: CN115819586B

Abstract

本发明提供抗人SIRPα单克隆抗体及其用途，所述抗体能与SIRPα多种多态变体结合并阻断SIRPα多态变体与CD47之间的相互作用，并且不阻断或弱阻断SIRPγ和CD47的相互作用，用于抗癌治疗。

Description

抗人SIRPα单克隆抗体及其用途

技术领域

本发明属于肿瘤治疗及分子免疫学领域，涉及SIRPα单克隆抗体、其抗原结合片段、其药物组合物以及医药用途。

背景技术

髓系细胞(巨噬细胞、树突状细胞(DC,dendritic cell)、髓源性抑制细胞(MDSC,myeloid-derived suppressor cell)和粒细胞)是多种实体瘤微环境中丰度最高的免疫细胞，与患者不良预后息息相关(Willingham,S.B.等，Proc Natl Acad Sci U S A 109(17):6662-6667和Ring,N.G.等，Proc Natl Acad Sci U S A 114(49):E10578-E10585)。肿瘤微环境中，巨噬细胞固有的抗肿瘤活性被大大削弱，恢复并利用巨噬细胞吞噬和杀伤肿瘤细胞的功能已成为肿瘤免疫治疗中具有潜力的治疗策略之一。

信号调节蛋白α(SIRPα，也称为SIRPa、CD172a或SHPS-1)是表达于巨噬细胞，单核细胞，树突状细胞和粒细胞(Veillette,A.等，JBiol Chem 273(35):22719-22728)等髓系细胞膜表面的糖蛋白，属于免疫球蛋白超家族(IgSF)成员。CD47是一种广泛表达于正常组织和肿瘤组织的跨膜糖蛋白，其作为SIRPα的配体与SIRPα的NH2末端V样结构域结合。正常组织通过CD47-SIRPα的相互作用向巨噬细胞发送“别吃我”信号，阻止自身免疫反应并防止“自我”细胞被吞噬。然而，肿瘤细胞通过上调CD47表达来逃避免疫监视。抗CD47或抗SIRPα抗体通过阻断SIRPα-CD47相互作用解除该信号通路的抑制作用，恢复巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的活性。

阻断CD47-SIRPα相互作用的药物临床研究大多数以CD47为靶点，主要包括单/双抗、融合蛋白和小分子。CD47在红细胞和血小板的表达使其具有先天性的靶点缺陷，使用CD47抗体进行抗癌治疗极易引起血液毒性，如贫血。与CD47相比，SIRPα不在血液细胞表达，组织分布更受限制，靶向SIRPα是阻断CD47-SIRPα相互作用的更优选择。

信号调节蛋白(SIRPs，signal-regulatory proteins)家族有α，β，γ三个亚型，同源性达80％以上，α与γ均可与CD47结合，而β亚型结合受体暂不清楚。研究表明α与γ亚型作为CD47的配体功能相反，阻断SIRPα与CD47的结合，可促进巨噬细胞对肿瘤的吞噬作用，但阻断SIRPγ与CD47结合会损伤T细胞的正常功能。因此，特异性阻断SIRPα与CD47结合的抗体可有效规避靶向SIRPα的脱靶效应。SIRPα具有基因多态性，SIRPα在不同种族的人群中，变体分布具有一定差异性且以V1、V2和V8为主要多态变体(Voets,E.等，J ImmunotherCancer 7(1):340)。研究表明(Sim,J.等，MAbs 11(6):1036-1052)，当巨噬细胞表达SIRPαV1/V2的杂合体时，同时阻断SIRPαV1和SIRPαV2的抗体比只阻断SIRPαV1或V2的抗体，其促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞作用更强。同时阻断SIRPα主要多态变体(SIRPαV1、V2和V8)与CD47结合的SIRPα抗体，可覆盖90％以上不同种族的人群，提高临床用药的有效性。

WO2015138600专利公开提供了与抗SIRPα抗体有关的组合物和方法。此公开的抗体KWAR23可结合人SIRPα并可阻断靶细胞上表达的CD47与巨噬细胞上表达的SIRPs之间的相互作用。该抗体可用于多种治疗方法，在某些情况下，抗SIRPa抗体可与SIRPa结合，但不激活表达SIRPα细胞中SIRPα下游信号传导。此外，专利描述的抗体KWAR23可结合SIRPγ并阻断CD47和SIRPγ之间的相互作用。

WO2019175218A1专利公开提供了抗人SIRPαV1抗体的用途。公开的抗体18D5可结合人SIRPαV1变体并可阻断靶细胞上表达的CD47与表达SIRPαV1变体的巨噬细胞相互作用。该抗体不与SIRPαV2结合。此外，专利描述的抗体18D5不结合SIRPγ，不抑制T细胞增殖。

现有技术中描述的抗体缺乏区分SIRPs家族各成员的能力或者无法同时识别SIRPα主要多态变体。因此，仍需要有这样的SIRPα抗体，能与SIRPα多种多态变体结合并阻断SIRPα多态变体与CD47之间的相互作用，并且不阻断或弱阻断SIRPγ和CD47的相互作用，用于抗癌治疗。

发明内容

本发明提供了一种新的人源化抗人SIRPα抗体，其对三种主要的SIRPα多态变体(SIRPαV1、V2和V8)表现出特异性结合并可阻断SIRPα多态变体与CD47结合，该抗体单独使用可促进人源巨噬细胞吞噬肿瘤细胞，并在小鼠体内具有抑制肿瘤生长活性。此外，该SIRPα抗体不阻断或弱阻断SIRPγ和CD47的相互作用，不抑制T细胞激活。本发明的具体方面包括：

本发明提供一种抗人SIRPα抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区序列VH，所述重链可变区序列VH包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，其中所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3为如下的氨基酸序列：

(1)分别为SEQ ID NO:1、2和3；或

(2)VHCDR1为DYALH或SEQ ID NO:9，VHCDR2和VHCDR3为SEQ ID NO:10和11；或

(3)VHCDR1为NYGVH或SEQ ID NO:17，VHCDR2和VHCDR3为18和19；或

(4)VHCDR1为NYGVH或SEQ ID NO:49，VHCDR2和VHCDR3为50和51；

上述序列基于Kabat系统，其中SEQ ID NO：9、17、49基于Kabat和Chothia组合编号系统。

进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含轻链可变区VL，所述轻链可变区VL包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3为如下的氨基酸序列：

(5)分别为SEQ ID NO:4、5和6；或

(6)分别为SEQ ID NO:12、13和14；或

(7)分别为SEQ ID NO:20、21和22；或

(8)分别为SEQ ID NO:52、53和54；

上述序列基于Kabat系统。

进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其重链可变区序列VH和轻链可变区VL包含如下CDR组合：

组合I：

组合II：

组合III：

组合IV：

上述序列基于Kabat系统，其中SEQ ID NO：9、17、49基于Kabat和Chothia组合编号系统。。

进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区VH，所述重链可变区VH包含与SEQ ID NO:7、15、23、31、39、47或55具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区VL，所述轻链可变区VL包含与SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48或56有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含轻链可变区VL，所述轻链可变区VL包含与SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48或56具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其包含如下重链可变区VH和轻链可变区VL的组合：

抗体2A11：

或抗体2C3：

或抗体2E4：

或抗体2A11-6：

或抗体2C3-17：

或抗体2E4-13：

或抗体2E4-13m：

进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其满足以下二项中至少一项：

(1)所述抗体或其抗原结合片段选自全长抗体、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fv、scFv、纳米抗体(单域抗体)、双特异性抗体或最小识别单位(MRU)；

(2)所述抗体为小鼠、嵌合或人源化抗体或全人源抗体。

进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中所述重链包含重链恒定区(CH)，所述轻链包含轻链恒定区(CL)，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体或灵长目源抗体的至少之一。

进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段的重链恒定区和轻链恒定区均来自于人源IgG抗体。

进一步的，所述的抗体或其抗原结合片段，所述重链恒定区包含如SEQ ID NO:57、59或60所示的氨基酸序列；所述轻链恒定区包含如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。

本发明还提供一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码上述任一的抗体或其抗原结合片段。

本发明还提供一种人源化抗人SIRPα抗体，其特征在于将下述序列片段的组合依据VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的次序插入来源自人种系IgG重链可变区和轻链可变区的框架区(FR)：

组合I：

组合II：

组合III：

组合IV：

上述人源化抗体中，优选的人种系IgG重链分别为IGHV1-69*08，IGHV1-3*04和IGHV4-4*08，优选的人种系IgG轻链分别为IGKV1D-16*01，IGKV1-39*01和IGKV3-20*01。

本发明还提供一种载体，其特征在于，所述的载体含有上述的核酸分子。

本发明还提供一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有上述的载体或染色体中整合有上述的核酸分子或表达上述任一的抗体或其抗原结合片段。

本发明还提供一种药物组合物，其包含上述任一所述的抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的佐剂。

本发明还提供上述任一的抗体或其抗原结合片段、上述的核酸分子、上述的载体、上述细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

本发明还提供一种治疗癌症的方法，其包括以有效治疗癌症的量向需要其的对象施用上述任一发明所述的抗体分子或其结合片段或者上述的药物组合物。

其中所述癌症或肿瘤选自肺癌、黑色素瘤、NSCLC、经典霍奇金淋巴瘤、HNSCC、肾细胞癌、尿路上皮癌、头颈部癌、胃癌、血液恶性肿瘤、前列腺癌、子宫颈癌、脑癌、肝细胞癌和结直肠癌。

优选的，其中所述癌症或肿瘤是炎性癌症和具有浸润的髓样细胞(特别是浸润的树突状细胞和/或髓源性抑制细胞(MDSC)和/或肿瘤相关的巨噬细胞(TAM))的癌症。

在本发明的具体实施方式中，采用SIRPα重组蛋白免疫小鼠，通过分离免疫小鼠脾脏细胞并运用单B细胞筛选技术获得符合筛选标准的小鼠单B细胞，其可分泌同时识别三种主要SIRPα多态变体(SIRPαV1、V2和V8)的SIRPα单克隆抗体；采用基因工程手段从单B细胞中获得SIRPα鼠单克隆抗体重链可变区VH及轻链可变区VL序列；将可变区序列拼接到人源免疫球蛋白IgG1框架中并重组表达获得人鼠嵌合抗体用于抗体鉴定；利用3D建模的方法，将SIRPα鼠单克隆抗体重链可变区VH及轻链可变区VL序列与数据库人源抗体序列比对，将鼠源序列突变成人源序列并拼接到人源免疫球蛋白IgG1框架中获得人源化SIRPα抗体；上述人源免疫球蛋白IgG1框架中Fc片段含L234A,L235A或N297G氨基酸突变以降低抗体与Fcγ受体的结合，进而去除IgG1亚型抗体介导的ADCC及ADCP效应。

本发明相关术语的解释

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属技术领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。

本发明所述的“抗体(antibody)”包括全长抗体、全长抗体的抗原结合片段以及包含抗体CDR、VH区和/或VL区的分子。抗体的实例包括(但不限于)单克隆抗体、以重组方式产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、鼠抗人抗体、人源化抗体、嵌合抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚体抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、抗体-药物缀合物、单域抗体、单价抗体、单链抗体或单链Fv(scFv)、骆驼化抗体以及以上任一个的抗原结合片段。

本发明优选的抗体形式包括Fab、Fab′、Fv、scFv、(Fab′)2片段。

Fab是指含有一条轻链的可变区和恒定区和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的抗体分子的一部分。术语Fab′通常是指在重链CH1结构域的羧基端添加少量残基(包括一个或多个来自抗体铰链区的半胱氨酸)而不同于Fab的片段，其一般由(Fab′)2还原得到。

Fv指的是含有抗体重链可变区、轻链可变区并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。

scFv指的是由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体。

(Fab′)2指的是Fab′的二聚体。

本发明的抗体形式还包括单域抗体(纳米抗体)、双特异性抗体或最小识别单位。

术语“单域抗体”也被称为“纳米抗体”，是指仅包含一个重链可变区的抗体,，因此也称为VHH抗体。

术语“双特异性抗体”是含有两种特异性抗原结合位点的人工抗体，其可以为本领域已知的任何形式。

最小识别单位或分子识别单位(molecular recognition unit,MRU)：抗体与抗原的结合主要涉及CDR，而CDR中以CDR3尤其重链CDR3最为关键。基于这一事实有人用来自CDR的短肽模拟了亲本抗体的特异结合活性，证实CDR确有可能成为特异结合抗原的最小分子，被称为最小识别单位或分子识别单位。

本发明还包括抗体氨基酸序列的保守序列变体的抗体，保守氨基酸序列变体包括不显著改变本发明抗体对三种主要SIRPα多态变体特异性结合活性的氨基酸序列的修饰，如源于本领域熟知的相似氨基酸替代的变体，氨基酸的缺失、增加导致的变体。

本发明所述的抗体，还包括CDR区之外抗体重链可变区氨基酸序列和抗体轻链可变区氨基酸序列具有80％以上，或90％以上，或95％以上，或99％以上同一性的序列。

在本发明中，术语“同一性”或“同源性”通常是指将候选序列中核苷酸碱基或氨基酸残基与相应序列进行比较，经序列比对和必要情况下引入间隔以实现整段序列的最大相同百分数并且不把任何保守取代视为序列同一性的一部分后，二者碱基或残基相同的比例。无论N端或C端延伸或插入均不应理解为降低同一性或同源性。对于比对的方法和计算程序均可获得，并为本领域所熟知，例如，可以通过序列分析软件测定序列同一性。

本发明中的术语“VH区”和“VL区”分别是指包含FR(框架区)1、2、3和4以及CDR(互补决定区)1、2和3的单一抗体重链和轻链可变区。

本发明所述的“CDR”或“互补决定区”意指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点，对抗体可变区进行CDR和FR区域的标注，需要选择一种编号系统，编号方案(antibody numbering scheme)有：IMGT,Chothia,Kabat,Martin(扩展版Chothia)等，如无特殊说明，本发明使用Kabat编号系统。

本发明中的术语“VL”和“VL区”指抗体的轻链可变区。

本发明中的术语“VH”和“VH区”指抗体的重链可变区。

本发明中的术语“恒定区”是本领域中常见的。恒定区是不直接参与抗体与抗原的结合但可以展现各种效应功能，如与Fc受体(例如Fcγ受体)的相互作用的抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基端部分。其中在IgG1亚类的Fc区引入LALA突变(L234A，L235A)，可以降低抗体与Fcγ受体和其补体(complement)的结合，但不影响体内的药物动力学。免疫球蛋白分子的恒定区通常具有相对于免疫球蛋白可变结构域来说更为保守的氨基酸序列。

本发明中的术语“嵌合抗体”是指“人-鼠嵌合抗体”，是将鼠源单抗的轻链、重链可变区插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞进行表达所产生的单克隆抗体。

本发明中，术语“单克隆抗体”通常是指从一群基本上同质的抗体中获得的抗体，即集群中的抗体是相同的，除了可能存在的少量的自然突变。单克隆抗体通常针对单个抗原位点具有高度特异性。本发明中，术语“分离的核酸分子”通常是指从其天然环境中分离的或人工合成的任何长度的分离形式的核苷酸、脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。

本发明中，术语“载体”通常是指能够转运与它连接的另一个核酸分子，并在合适的宿主中自我复制的核酸分子。载体包括任何遗传元件，例如质粒、转座子、人工染色体、病毒等，其在与适当的控制元件组合时能够进行自我复制并且将基因序列转移到宿主或宿主之间。

本发明中，术语“K_D”、“K_D”或“KD”可互换使用，通常是指抗体-抗原相互作用的平衡解离常数。本发明中使用的“KD”是解离速率常数(kdis，也称为“解离率(off-rate)(koff)”或“kd”)与结合速率常数(kon，也称为“结合率(kon)”或“ka”)的比值。

附图说明

图1：嵌合抗体阻断SIRPα与CD47结合

图2：嵌合抗体阻断SIRPγ与CD47结合

图3：嵌合抗体对T细胞激活的影响

图4：人源化抗体阻断SIRPα与CD47结合

图5：Fc突变后人源化抗体阻断SIRPα与CD47结合

图6：SIRPα抗体对巨噬细胞吞噬肿瘤细胞功能的影响

图7：SIRPα抗体对不同类型巨噬细胞吞噬肿瘤细胞功能的影响

图8：SIRPα人源化抗体在小鼠模型中抑制肿瘤生长

具体实施方式

1.抗人SIRPα抗体鼠单克隆抗体的产生

实验动物：所有动物实验均在珠海市丽珠单抗生物技术有限公司实验动物中心的授权下进行，BALB/c小鼠购自广东省医学实验动物中心。

单克隆抗体产生：对雌性BALB/c小鼠皮下注射(S.C.)人SIRPα(GenBank ID:NP_001035111)胞外结构域重组蛋白(AcroBiosystems)进行3次免疫，每次间隔为两周。第三次注射后一周，对免疫小鼠进行采血，收集血清用于间接ELISA法确定免疫应答。将小鼠脾脏作为单B细胞来源组织，分离免疫小鼠的脾细胞后，采用CD138阳选磁珠试剂盒(STEMCELL)富集小鼠B细胞。将富集小鼠B细胞导入单细胞光导系统(Beacon)芯片中并按照标准程序将其分成单细胞放入系统芯片独立小室中。分别采用人SIRPα多态变体重组蛋白(SIRPαV1、V2和V8)以及人SIRPγ重组蛋白修饰的实验微球在系统芯片中进行抗原抗体结合试验，实时检测芯片独立小室中单B细胞分泌抗体与实验微球上不同蛋白抗原的结合情况。通过芯片上进行的4轮抗原抗体结合试验确定可分泌目标抗体(分别命名为2A11，2C3和2E4)的单B细胞，目标抗体可结合人SIRPα多态变体重组蛋白(SIRPαV1、V2和V8)但不结合人SIRPγ重组蛋白。

单B细胞测序获得抗体序列：按照标准程序在芯片上裂解可分泌目标抗体的单B细胞并通过捕获微球捕获其mRNA，将mRNA反转录成cDNA后导出。以cDNA为模板进行PCR扩增后测序，通过序列分析得到鼠单克隆抗体2A11，2C3和2E4轻重链可变区序列。

2A11的重链可变区序列具体如下：

注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。加粗并下划线部分分别为VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3。

2A11的轻链可变区序列具体如下：

注：顺序为FR1-CDR1-FR2-CDR2-FR3-CDR3-FR4。加粗并下划线部分分别为VLCDR1、VLCDR2、VLCDR3。

2C3的重链可变区序列具体如下：

2C3的轻链可变区序列具体如下：

2E4的重链可变区序列具体如下：

2E4的轻链可变区序列具体如下：

2.抗人SIRPα嵌合抗体BLI检测亲和力

嵌合抗体表达与纯化：将鼠源抗体可变区序列与人IgG抗体恒定区基因拼接，获得嵌合分子抗体序列，对照抗体18D5序列来源于公开专利WO2019175218A1。抗体重链采用IgG1恒定区CH1-Fc，Fc中含L234A,L235A氨基酸突变，轻链采用kappa轻链恒定区VL。将嵌合抗体分子轻重链基因插入pcDNA3.4中构建表达载体，并瞬转入HEK293细胞中表达。收集表达上清液后采用ProteinA亲和纯化获得人鼠嵌合抗体。

生物膜干涉技术(BLI)检测抗体亲和力：通过Octet RED96e(ForteBio)测定抗SIRPα嵌合抗体结合人SIRPαV1、V2和V8重组蛋白(AcroBiosystems)的亲和力。表1显示2A11，2C3和2E4的检测结果。结果显示SIRPα嵌合抗体2C3和2E4结合人SIRPαV2和V8亲和力明显优于对照抗体18D5。

表1抗SIRPα嵌合抗体与人SIRPαV1、V2和V8亲和力

3.抗人SIRPα嵌合抗体ELISA检测阻断SIRPα或SIRPγ与CD47结合

阻断SIRPα与CD47结合：将人SIRPαV1、V2和V8重组蛋白(AcroBiosystems)包被于96孔酶标板4度过夜，洗板后加入1％BSA-PBS封闭液，37℃封闭2小时。将不同浓度抗体(204nM起始，3倍稀释，共7个浓度)和辣根过氧化物酶(HRP)标记的CD47(AcroBiosystems)加入板中，37℃孵育1小时。洗板后加入TMB溶液，37℃孵育10分钟，加入2M H2SO4终止反应，酶标仪检测450nm波长吸光度。Human IgG1(L234A/L235A)(百英生物，货号B109802)作为同型对照。结果见图1，显示嵌合抗体2A11，2C3和2E4能不同程度阻断CD47与SIRPα多态变体V1、V2和V8结合，其中2C3和2E4阻断SIRPαV2和V8与CD47结合能力明显优于对照抗体18D5。

阻断SIRPγ与CD47结合：将人CD47重组蛋白(AcroBiosystems)包被于96孔酶标板板4度过夜，洗板后加入1％BSA-PBS封闭液，37℃封闭2小时。将不同浓度抗体(10ug/mL起始，3倍稀释，共3个浓度)和SIRPγ(Sino Biological)加入板上，37℃孵育1小时。洗板后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的抗His标签抗体(Abcam),37℃孵育1小时。洗板后加入TMB溶液，37℃孵育10分钟，加入2M H2SO4终止反应，酶标仪检测450nm波长吸光度。Human IgG1(L234A/L235A)(百英生物，货号B109802)作为同型对照。结果见图2，显示专利WO2015138600所述抗体KWAR23明显阻断CD47和SIRPγ之间的相互作用；嵌合抗体2A11和2E4均不能阻断CD47与SIRPγ结合，与18D5一致；2C3在高浓度时具有弱阻断功能。

4.抗人SIRPα嵌合抗体对T细胞激活的影响

使用人单核细胞诱导成熟的DC细胞(Allcells)与人CD3阳性T细胞(Allcells)混合，激活T细胞，同时加入SIRPα嵌合抗体，在5％CO₂、37℃下共同孵育5天。然后收集细胞培养上清液，按照ELISA试剂盒(Bio-Techne)说明书检测伽马干扰素(IFN-gamma)的含量。结果如图(3)所示，嵌合抗体2A11，2C3和2E4不影响T细胞激活，IFN-gamma分泌水平与18D5相似，高浓度KWAR23显示与文献报道描述(Gabriela Andrejeva.等，J Immunol 2021；206:712-721)结果相似，可抑制T细胞激活。

5.鼠源抗体人源化

将上述抗体的重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)与人IgG基因序列数据库进行比较，确定最佳匹配的人种系IgG基因序列。2A11，2C3和2E4优选的人种系IgG重链分别为IGHV1-69*08，IGHV1-3*04和IGHV4-4*08，2A11，2C3和2E4优选的人种系IgG轻链分别为IGKV1D-16*01，IGKV1-39*01和IGKV3-20*01。将2A11，2C3和2E4轻重链可变区中CDR区序列分别移植到匹配的人种系轻重链基因的框架基因上，人源化分子分别命名为2A11-6，2C3-17和2E4-13，构建后所得各人源化抗体的VH、VL以及CDR区序列如下述所示。2A11-6，2C3-17和2E4-13抗体重链恒定区(HC)一致，2A11-6，2C3-17和2E4-13抗体轻链恒定区(LC)一致，如下述所示。本领域技术人员根据上述披露信息可以清楚2A11-6，2C3-17和2E4-13抗体的重链和轻链的完整氨基酸序列。

2A11-6的重链可变区(VH)序列具体如下：

2A11-6的轻链可变区(VL)序列具体如下：

2C3-17的重链可变区(VH)序列具体如下：

2C3-17的轻链可变区(VL)序列具体如下：

2E4-13的重链可变区(VH)序列具体如下：

2E4-13的轻链可变区(VL)序列具体如下：

2A11-6，2C3-17和2E4-13抗体重链恒定区(HC)序列具体如下：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

2A11-6，2C3-17和2E4-13抗体轻链恒定区(LC)序列具体如下：

RTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC。

分析2E4抗体VH序列发现CDR2处存在氨基酸DG组合，该组合被报道为翻译后修饰位点(post-translational modifications，PTM)，可出现天冬氨酸异构化现象，进而影响抗体质量稳定性(Xiaojun Lu.等，MABS 2019,VOL.11,NO.1,45–57)。为避免抗体不稳定现象发生，本发明将2E4抗体VH序列CDR2处氨基酸DG组合突变为DA，并将其运用到人源化抗体2E4-13中，新的人源化抗体命名为2E4-13m。人源化抗体2E4-13m的VH、VL以及CDR区序列如下所示。

2E4-13m的重链可变区(VH)序列具体如下：

2E4-13m的轻链可变区(VL)序列具体如下：

将人源化抗体分子2A11-6，2C3-17，2E4-13以及2E4-13m轻重链基因插入pcDNA3.4中构建表达载体，并瞬转入HEK293细胞中表达。收集表达上清液后采用ProteinA亲和纯化获得纯化抗体用于后续鉴定。

6.抗人SIRPα人源化抗体BLI检测亲和力

通过Octet RED96e(ForteBio)测定抗SIRPα人源化抗体2A11-6，2C3-17，2E4-13以及2E4-13m与人SIRPαV1、V2和V8重组蛋白(AcroBiosystems)的亲和力，并将其分别与母本嵌合抗体2A11，2C3和2E4进行比较。表2检测结果显示人源化抗体2A11-6，2C3-17，2E4-13以及2E4-13m结合SIRPαV1、V2和V8重组蛋白亲和力分别与母本嵌合抗体2A11，2C3和2E4相当。

表2抗SIRPα人源化抗体与人SIRPαV1、V2和V8亲和力

7.抗人SIRPα人源化抗体阻断SIRPα与CD47结合

采用具体实施例3中方法检测人源化抗体2A11-6，2C3-17，2E4-13以及2E4-13m阻断CD47与SIRPα多态变体V1、V2和V8结合的能力，结果如图(4)所示。人源化抗体2A11-6，2C3-17以及2E4-13m阻断CD47与SIRPα多态变体V1、V2和V8结合的能力分别与母本嵌合抗体2A11，2C3和2E4相当。

8.抗人SIRPα人源化抗体对巨噬细胞吞噬肿瘤细胞的促进作用

人源化抗体Fc进行氨基酸突变：将上述人源化抗体2A11-6，2C3-17以及2E4-13m重链序列中Fc部分进行L234A/L235A/N297G(LALANG)或者S267E/L328F(SELF)突变，得到新的抗体命名为2A11-6 LALANG，2A11-6 SELF，2C3-17 LALANG，2C3-17 SELF，2E4-13mLALANG，2E4-13m SELF。突变后重链HC氨基酸序列如下所示：

2A11-6 LALANG，2C3-17 LALANG和2E4-13m LALANG抗体重链恒定区(HC)序列具体如下：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYGSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

2A11-6 SELF，2C3-17 SELF和2E4-13m SELF抗体重链恒定区(HC)序列具体如下：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

Fc氨基酸突变对抗体阻断特性的影响：采用具体实施例3中方法检测Fc突变后人源化抗体2A11-6 LALANG，2A11-6 SELF，2C3-17 LALANG，2C3-17 SELF，2E4-13m LALANG，2E4-13m SELF阻断CD47与SIRPα多态变体V1、V2和V8结合的能力，结果如图(5)所示。Fc突变体不影响人源化抗体2A11-6，2C3-17以及2E4-13m阻断CD47与SIRPα多态变体V1、V2和V8结合的能力。

Fc氨基酸突变对巨噬细胞吞噬肿瘤细胞功能的影响：取CD14阳性人单核细胞(Milestone)用RPMI-1640培养基(Gibco)在5％CO₂、37℃下进行培养，加入刺激因子(50ng/mLM-CSF)进行诱导。培养至7-8天得到巨噬细胞。将MCF-7细胞(ATCC)按CFSE试剂(BioLegend)说明书进行荧光标记。将标记好的肿瘤细胞MCF-7和上述诱导成功巨噬细胞以1:1混合均匀，同时加入抗SIRPα抗体或同型对照抗体(Human IgG1(L234A/L235A)，百英生物)，浓度为30ug/mL和10ug/mL，5％CO₂、37℃培养3小时。PBS洗涤细胞后，加入抗CD14-APC荧光抗体(BioLegend)后4℃避光孵育30分钟。将细胞洗涤后进行流式细胞术分析，巨噬细胞对肿瘤细胞的吞噬作用以吞噬率(Phagocytosis,％)表示，计算公式：吞噬率(Phagocytosis,％)＝(APC+CFSE)阳性细胞比例/APC阳性细胞比例*100％。图(6)显示不同SIRPα抗体对巨噬细胞吞噬肿瘤细胞功能的影响。人源化抗体2A11-6和2E4-13m促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞功能需要Fc区L234A/L235A/N297G突变，人源化抗体2C3-17促吞噬功能不受Fc区氨基酸突变影响(与同型对照组对比，***P<0.001,*P<0.05；采用双因素方差分析，Dunnett多重比较检验)。

SIRPα抗体对不同类型巨噬细胞吞噬肿瘤细胞功能的影响：分别采用确定SIRPα基因表型的巨噬细胞作为效应细胞进行上述吞噬实验，结果如图(7)所示：当巨噬细胞只表达SIRPαV1变体时，SIRPα抗体2A11，2C3，2E4以及对照抗体18D5均可促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞，且效果相当；当巨噬细胞同时表达SIRPαV1和V2变体时，2C3促进巨噬细胞吞噬肿瘤细胞显著强于对照抗体18D5(***P<0.001,**P<0.01,*P<0.05；采用双因素方差分析，Dunnett多重比较检验)。

9.抗人SIRPα人源化抗体在小鼠模型中抑制肿瘤生长

采用B-NDG-hSIRPα小鼠(百奥动物)皮下接种LS174t(ATCC)肿瘤模型评价抗人SIRPα人源化抗体在小鼠模型中对肿瘤生长的抑制作用。将LS174t细胞皮下接种于小鼠右侧背部，肿瘤体积张到50～100mm³时，通过腹腔注射给予小鼠人源化抗体2A11、2C3、2E4以及对照抗体18D5，造模组腹腔注射PBS，每三天给药一次，测量并记录肿瘤体积【体积＝长径(mm)*短径(mm)*短径(mm)/2】。肿瘤生长曲线如图(8)所示，和PBS组相比，2A11、2C3、2E4以及对照抗体18D5单药可抑制肿瘤生长(与PBS组对比，***P<0.001,**P<0.01；采用双因素方差分析，Dunnett多重比较检验)。

序列信息：

抗体2A11

抗体2C3

抗体2E4

抗体2A11-6

抗体2C3-17

抗体2E4-13

抗体2E4-13m

HC(SEQ ID NO:57)：

LC(SEQ ID NO:58)：

LALANG HC(SEQ ID NO:59)：

SELF HC(SEQ ID NO:60)：

ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVEHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKAFPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK。

Claims

1.一种抗人SIRPα抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区序列VH，所述重链可变区序列VH包含VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3，其中所述VHCDR1、VHCDR2和VHCDR3为如下的氨基酸序列：

(1)分别为SEQ ID NO:1、2和3；或

(2)VHCDR1为DYALH或SEQ ID NO:9，VHCDR2和VHCDR3为SEQ ID NO:10和11；或

(3)VHCDR1为NYGVH或SEQ ID NO:17，VHCDR2和VHCDR3为18和19；或

(4)VHCDR1为NYGVH或SEQ ID NO:49，VHCDR2和VHCDR3为50和51；

上述序列基于Kabat系统，其中SEQ ID NO：9、17、49基于Kabat和Chothia组合编号系统；

优选的，所述抗体或其抗原结合片段具备如下任一或组合的性质：

a)对三种主要的SIRPα多态变体(SIRPαV1、V2和V8)表现出特异性结合并可阻断SIRPα多态变体与CD47结合；

b)促进人源巨噬细胞吞噬肿瘤细胞；

c)不阻断或弱阻断SIRPγ和CD47的相互作用，不抑制T细胞激活。

2.根据权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含轻链可变区VL，所述轻链可变区VL包含VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3，其中所述VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3为如下的氨基酸序列：

(5)分别为SEQ ID NO:4、5和6；或

(6)分别为SEQ ID NO:12、13和14；或

(7)分别为SEQ ID NO:20、21和22；或

(8)分别为SEQ ID NO:52、53和54；

上述序列基于Kabat系统。

3.如权利要求2所述的抗体或其抗原结合片段，其重链可变区序列VH和轻链可变区VL包含如下CDR组合：

组合I：

组合II：

片段名称 SEQ ID NO: 序列 2C3VHCDR1 DYALH或GYRFTDYALH(SEQ ID NO:9) 2C3VHCDR2 10 VISTYYDNTNYNQKFKG 2C3VHCDR3 11 KVYDYHYFDY 2C3VLCDR1 12 RASQDISNYLN 2C3VLCDR2 13 YTSRLHS 2C3VLCDR3 14 QQGYTLPFT

组合III：

片段名称 SEQ ID NO: 序列 2E4VHCDR1 NYGVH或GFSLTNYGVH(SEQ ID NO:17) 2E4VHCDR2 18 VIWSDGSITYNSALRS 2E4VHCDR3 19 HWGYDYWYFDV 2E4VLCDR1 20 SASSSISSSKLY 2E4VLCDR2 21 GTSNLAS 2E4VLCDR3 22 QQWSSYPLT

组合IV：

片段名称 SEQ ID NO: 序列 2E4-13mVHCDR1 NYGVH或GFSLTNYGVH(SEQ ID NO:49) 2E4-13mVHCDR2 50 VIWSDASITYNSALRS 2E4-13mVHCDR3 51 HWGYDYWYFDV 2E4-13mVLCDR1 52 SASSSISSSKLY 2E4-13mVLCDR2 53 GTSNLAS 2E4-13mVLCDR3 54 QQWSSYPLT

4.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链可变区VH，所述重链可变区VH包含与SEQ ID NO:7、15、23、31、39、47或55具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

5.根据权利要求1或2所述的抗体或其抗原结合片段，其包含轻链可变区VL，所述轻链可变区VL包含与SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48或56有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

6.根据权利要求4所述的抗体或其抗原结合片段，其进一步包含轻链可变区VL，所述轻链可变区VL包含与SEQ ID NO:8、16、24、32、40、48或56具有至少80％、85％、90％、95％、98％、99％或100％同一性的氨基酸序列。

7.根据权利要求6所述的抗体或其抗原结合片段，其包含如下重链可变区VH和轻链可变区VL的组合：

抗体2A11：

或抗体2C3：

或抗体2E4：

或抗体2A11-6：

或抗体2C3-17：

或抗体2E4-13：

或抗体2E4-13m：

8.根据权利要求1-7任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其满足以下二项中至少一项：

(2)所述抗体为小鼠、嵌合或人源化抗体或全人源抗体。

9.根据权利要求1-8任一项所述的抗体或其抗原结合片段，其包含重链和轻链，其中所述重链包含重链恒定区(CH)，所述轻链包含轻链恒定区(CL)，所述重链恒定区和轻链恒定区的至少之一的至少一部分来自于鼠源抗体、人源抗体或灵长目源抗体的至少之一。

10.根据权利要求9所述的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或抗原结合片段的重链恒定区和轻链恒定区均来自于人源IgG抗体。

11.根据权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段，所述重链恒定区包含如SEQ IDNO:57、59或60所示的氨基酸序列；所述轻链恒定区包含如SEQ ID NO:58所示的氨基酸序列。

12.一种人源化抗人SIRPα抗体，其特征在于将下述序列片段的组合依据VHCDR1、VHCDR2、VHCDR3、VLCDR1、VLCDR2和VLCDR3的次序插入来源自人种系IgG重链可变区和轻链可变区的框架区(FR)：

组合I：

片段名称 SEQ ID NO: 序列 2A11VHCDR1 1 DYVIS 2A11VHCDR2 2 EIYPGSGTTYYNEKFKG 2A11VHCDR3 3 TGYDGYYADYVMDY 2A11VLCDR1 4 TVSSSISSSNLH 2A11VLCDR2 5 GTSNLAS 2A11VLCDR3 6 QQWSSYPWT

组合II：

片段名称 SEQ ID NO: 序列 2C3VHCDR1 9 GYRFTDYALH 2C3VHCDR2 10 VISTYYDNTNYNQKFKG 2C3VHCDR3 11 KVYDYHYFDY 2C3VLCDR1 12 RASQDISNYLN 2C3VLCDR2 13 YTSRLHS 2C3VLCDR3 14 QQGYTLPFT

组合III：

组合IV：

片段名称 SEQ ID NO: 序列 2E4-13mVHCDR1 49 GFSLTNYGVH 2E4-13mVHCDR2 50 VIWSDASITYNSALRS 2E4-13mVHCDR3 51 HWGYDYWYFDV 2E4-13mVLCDR1 52 SASSSISSSKLY 2E4-13mVLCDR2 53 GTSNLAS 2E4-13mVLCDR3 54 QQWSSYPLT

。

13.如权利要求12所述的一种人源化抗人SIRPα抗体，优选的人种系IgG重链分别为IGHV1-69*08，IGHV1-3*04和IGHV4-4*08，优选的人种系IgG轻链分别为IGKV1D-16*01，IGKV1-39*01和IGKV3-20*01。

14.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1-13任一所述的抗体或其抗原结合片段。

15.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求14所述的核酸分子。

16.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞含有权利要求15所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求14所述的核酸分子或表达权利要求1-13任一所述的抗体或其抗原结合片段。

17.一种药物组合物，其包含权利要求1-13任一项所述的抗体或其抗原结合部分，以及药学上可接受的佐剂。

18.权利要求1-13任一所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求14所述的核酸分子、权利要求15所述的载体、或权利要求16所述的细胞的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

19.如权利要求18所述的用途，其中所述癌症或肿瘤选自肺癌、黑色素瘤、NSCLC、经典霍奇金淋巴瘤、HNSCC、肾细胞癌、尿路上皮癌、头颈部癌、胃癌、血液恶性肿瘤、前列腺癌、子宫颈癌、脑癌、肝细胞癌和结直肠癌。

20.如权利要求19所述的用途，其中所述癌症或肿瘤是炎性癌症和具有浸润的髓样细胞(特别是浸润的树突状细胞和/或髓源性抑制细胞(MDSC)和/或肿瘤相关的巨噬细胞(TAM))的癌症。

21.一种治疗癌症的方法，其包括以有效治疗癌症的量向需要其的对象施用权利要求1至13中任一项所述的抗体分子或其结合片段或者权利要求17所述的药物组合物。

22.如权利要求21所述的用途，其中所述癌症或肿瘤选自肺癌、黑色素瘤、NSCLC、经典霍奇金淋巴瘤、HNSCC、肾细胞癌、尿路上皮癌、头颈部癌、胃癌、血液恶性肿瘤、前列腺癌、子宫颈癌、脑癌、肝细胞癌和结直肠癌。

23.如权利要求22所述的用途，其中所述癌症或肿瘤是炎性癌症和具有浸润的髓样细胞(特别是浸润的树突状细胞和/或髓源性抑制细胞(MDSC)和/或肿瘤相关的巨噬细胞(TAM))的癌症。