CN115819543A

CN115819543A - 转录因子Tbx20启动子区G4调控元件在害虫防治中的应用

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Publication number: CN115819543A
Application number: CN202211509284.8A
Authority: CN
Inventors: 王漫; 刘东颖; 吴昌文; 陈杰辉; 牛康康; 相辉; 冯启理
Original assignee: Guangdong Provincial Laboratory Of Lingnan Modern Agricultural Science And Technology; South China Normal University
Current assignee: Guangdong Provincial Laboratory Of Lingnan Modern Agricultural Science And Technology; South China Normal University
Priority date: 2022-11-29
Filing date: 2022-11-29
Publication date: 2023-03-21
Anticipated expiration: 2042-11-29
Also published as: CN115819543B

Abstract

本发明公开了转录因子Tbx20启动子区G4调控元件在害虫防治中的应用，所述转录因子Tbx20启动子区G4调控元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明公开了转录因子Tbx20启动子区G4调控元件在害虫防治中的应用，通过靶标基因筛选并结合CRISPR/Cas9技术敲除Tbx20启动子区的G4调控元件，得到Tbx20‑G4突变体，将其进行表型及遗传性能测定，发现Tbx20启动子区的G4敲除后严重影响害虫孵化率，羽化率：同时可导致幼虫期大量死亡，可有效用于害虫防治。

Description

转录因子Tbx20启动子区G4调控元件在害虫防治中的应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及转录因子Tbx20启动子区G4调控元件在害虫防治中的应用。

背景技术

草地贪夜蛾，夜蛾科，灰翅夜蛾属，学名为Spodoptera frugiperda。草地贪夜蛾是一类杂食性农业害虫，原产于美洲热带和亚热带地区。近年来，它广泛入侵并分布在非洲和亚洲等亚热带地区。草地贪夜蛾具适生区域广、寄主范围宽、增殖潜能强、扩散速度快、突发危害重等显著生物学优势，对农业生产造成了极大的危害，造成了巨大的经济损失，防控难度大。研究影响草地贪夜蛾生长发育的相关结构有利于为草地贪夜蛾的防治提供参考依据。

发明内容

本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出转录因子Tbx20启动子区G4调控元件，调控基因或其编码蛋白、或含有所述基因的生物材料的应用。

本发明还提出一种转录因子的抑制剂。

本发明还提出一种上述抑制剂的应用。

本发明还提出一种CRISPR/Cas9敲除的靶区域系统。

本发明还提出一种试剂盒。

本发明还提出一种防治有害昆虫的方法。

根据本发明的第一方面，提出了转录因子Tbx20启动子区G4调控元件，调控基因或其编码蛋白、或含有所述基因的生物材料，在以下任一项中的应用：

(1)制备降低害虫产卵量产品；

(2)制备用于降低害虫卵的孵化率的产品；

(3)制备用于阻止害虫变态发育的产品；

(4)制备用于阻止害虫羽化的产品；

(5)制备防治害虫的产品；

所述转录因子Tbx20启动子区G4调控元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的一些实施方式中，所述害虫为鳞翅目害虫。

在本发明的一些实施方式中，所述害虫为夜蛾。

在本发明的一些实施方式中，所述害虫为草地贪夜蛾。

在本发明的一些实施方式中，所述生物材料为质粒、表达载体或转基因细胞。

在本发明的第二方面，提出了一种转录因子Tbx20启动子区G4调控元件的抑制剂，所述抑制剂用于抑制调控转录因子Tbx20的蛋白表达。

在本发明的一些实施方式中，所述抑制剂为干扰分子或CRISPR/Cas9系统的抑制靶标或沉默靶标。

在本发明的一些实施方式中，所述干扰分子为靶向转录因子Tbx20启动子区G4调控元件的dsRNA、miRNA、核酶和shRNA中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述CRISPR/Cas9系统的抑制靶标或沉默靶标为靶向Tbx20启动子区G4调控元件的sgRNA。

在本发明的一些实施方式中，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

在本发明的一些实施方式中，用于扩增上述sgRNA的引物序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示。

在本发明的第三方面，提出了抑制剂的应用，所述应用为在害虫防治中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备用于降低害虫产卵量产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备用于降低害虫卵的孵化率的产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备用于阻止害虫变态发育的产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述应用为在制备用于阻止害虫羽化的产品中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述害虫为鳞翅目害虫。

在本发明的一些实施方式中，所述害虫为夜蛾。

在本发明的一些实施方式中，所述害虫为草地贪夜蛾。

在本发明的第四方面，提出了一种防治有害昆虫的方法，所述方法包括以下步骤：敲除启动子区G4调控元件，下调有害昆虫体内转录因子Tbx20的表达或活性，所述转录因子Tbx20启动子区G4调控元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明的第五方面，提出了一种CRISPR/Cas9系统，包括Cas9和特异性靶向转录因子Tbx20启动子区G4调控元件的sgRNA；其中，特异性靶向转录因子Tbx20启动子区G4调控元件的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

在本发明的第六方面，提出了一种用于害虫防治的试剂盒，所述试剂盒包括权利要求9所述的CRISPR/Cas9系统。

根据本发明的一些实施方式，至少具有如下有益效果：本发明首次公开了转录因子Tbx20启动子区G4调控元件在害虫防治中的应用，通过靶标基因筛选并结合CRISPR/Cas9技术敲除Tbx20启动子区的G4，得到的Tbx20-G4突变体，将其进行表型及遗传性能测定，发现Tbx20启动子区的G4敲除后严重影响害虫孵化率，羽化率：同时可导致幼虫期大量死亡，可有效用于害虫防治，证明了转录因子Tbx20启动子区G4调控元件对害虫生长发育的重要性。在制备防治虫害药剂中使用昆虫转录因子Tbx20抑制剂(降低转录因子Tbx活性的物质、或降解转录因子Tbx的物质、或降低转录因子Tbx20表达水平的物质)，使得害虫在卵期，蛹期就大量死亡以及求偶期交配率降低，对病虫害可以达到持久性的控制，并且在防治过程中，不会产生抗药性、对人畜没有危害，且对环境没有污染。

附图说明

下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：

图1为本发明实施例1中的夜蛾科物种中Tbx20同源基因up2k核苷酸序列分析图；

图2为本发明实施例2中的CRISPR/Cas9敲除Tbx20基因上游G4序列靶位点的选择图例；

图3为本发明实施例2中的CRISPR/Cas9敲除Tbx20基因上游G4序列后筛选到的突变类型结果图；

图4为本发明实施例2中的草地贪夜蛾Tbx20基因上游G4序列敲除后基因表达量结果图；

图5为本发明实施例3中的草地贪夜蛾Tbx20基因上游G4序列敲除后的突变体和野生型胚胎发育比较图；

图6为本发明实施例3中的草地贪夜蛾Tbx20基因上游G4序列敲除后的突变体和野生型产卵量和孵化率统计结果图；其中A为产卵量统计结果图，B为孵化率统计结果图，*为p＜0.05；

图7为本发明实施例3中的草地贪夜蛾Tbx20基因上游G4序列敲除后的突变体和野生型的蛹的比较结果图；

图8为本发明实施例3中的草地贪夜蛾Tbx20基因上游G4序列敲除后的突变体和野生型的羽化受阻比较图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到的试剂和材料。

实施例1夜蛾科物种中Tbx20同源基因up2k核苷酸序列分析

对11个物种中Tbx20同源基因up2k核苷酸序列进行了进化保守性分析(如图1所示)。这些物种包括鳞翅目：球菜夜蛾(Agrotis ipsilon)、丫纹夜蛾(Autographa gamma)、女贞首夜蛾(Craniophora ligustri)、棉铃虫(Helicoverpa armigera)、烟芽夜蛾(Heliothis virescens)、披肩粘虫(Mamestra configurata)、模夜蛾(Noctua pronuba)、甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)、Autographa pulchrina、Phlogophora meticulosa。利用MEGA7软件进行蛋白序列分析物种间Tbx20同源基因up2k核苷酸相似度，发现11种夜蛾科昆虫中Tbx20同源基因up2k启动子区G4序列在进化上高度保守。这些数据为支撑Tbx20同源基因up2k启动子区G4调控元件作为害虫防治的靶标提供了理论依据。

实施例2CRISPR/Cas9系统敲除草地贪夜蛾转录因子Tbx20基因启动子区G4元件

1.sgRNA的设计与选择

根据Tbx20基因的启动子区序列(SEQ ID NO：1)，以GG(19N)GG的选择原则选择合适的位点；对靶点进行选择后，将其设计在G4序列

CCCGGGGAGGCGGCCCCGCCTGCCCGGCCCGCCCCGCGCGCCGCGCCC(SEQ ID NO：2)的下游，如图2所示，本申请中sgRNA作用的靶点序列为(CCG)

CGCTCAGTCCGCGCTCAGC(SEQ ID NO：3)。Tbx20基因up2k启动子区序列为:TATCTATGTTAGATATTTAACTATATAACATTACCTAGTGGGTTCCATCCTTAGCCAAAAATATTTTTTTCAAATTTTCAGTACAATACCTGAATTAACGAGATAAAAAATCACAAGATCTAATATCTAATCTAATTATTGAGATTTACTGGCTTATTTTCAAAAAATTTGTGACACATATTTTACACCGTAACGTAGTCCCCCATCTCGTACAAAATTTGTAGAAAAGTACCTTCCTAACTTAGGTAGGTTGAATAACTTCTTTACATAGAATCATTCAATGATTAGGTACTTAGACTTTGGATTTGTTTTCGGAACGAAATTGTTTCTAAGGAATAGTTTAAGTAATCATTCAAACGTCTCTGATTACGGCAGTTAGGGGTGAATTTTGCATCGTCTGATAATTAATTTGAAGGAATAATTAATTTTTGACAGTCATTTTGCCACAGAGCAACTGTTAGATGTCTAAAAAGTGTAGTCTAGAAAAATATAGACCATTTATGTCGTTGAAATTTAAATAGTTTTTTACTTTAAAATGTAAACAAAGTTTTTTGTAGTTTATTCTTCAATTAAATGGCTCTGAACTTTTAACGTTAGAAGGATATTTAGGAAAATTATGTGAAAGTACTTATTTAGCCATAGAGCAACTGTTAGATGTCTAAAAAAGTCTAGTCTGGAAAAATGTAGACAATTTATGTTGTTGAAATTATTTAATCAATTAATTTAATTTTTACTTTAAAATGTAGACAAAGTTTTTTCTAAGTAGTTTATTCTTCTACGGTTTTAAGGTTCGAATGATATTAATGTGAAAGTACTTATTTATTTTGTTTAAGTTATAAAAAGTAACCCCTTATTAAATAACATTAATTCGTGGGAGAATATTCAGCTACCTAATTTAGAGTTATTAAACTCGTCAATATTTCTGAGAAAGTTTGAATTATTCACCTTCAAATGTCTTTTTGCAAATGCATTTTTGATTGATAAATCGTAAACACGAAAGGTCCCATTTATCGCCTTTAACGGACAAAACGTGAACTAACTATAATTACTTAGGTACTTAAAAAAATAATAACTTCGCTTTGTTAAGTTTCACTAATAATATTTGTAAGTAAAGTTACGTCTTTGAACGTAGTTCGTTGTACGTAATAAATCCTTTCGACTCTGTCTAACGCATGCGCACGCCCACTGTTGTGTAGTGCCGTCTCGCTCTAATCTACGGATCTGTGTTTATGGGCGGCGCACTCACGCGGTGACTGCGCGCACGTTTTCACTTGACACAATTTGCCTGAAAAATCATTTCAATATAAAGCAAATTTTTAAAACATCTGGTCTACTATTTAAGATATAAAACTATAACCGTTTCATAAATTAGTGAAGGAAAGAATCATGTGGGATGTGATTAATTGTTTTATTGAAACAACCGATGACTATAAAAGCTGAATTTTATTTCAACCACGATGACACATGCACAATTGAAGAGAGCAAATATAGGATTAATATTATTATTTTTATTGTTATTGAAAAGCTTAGTGGTCGGGGTCGGGTGCGCGGGGAGGGGAGGAGGTATCGGTGACAGCGGGTAGCGCGGCCAGTGGTTGCCCGGGGAGGCGGCCCCGCCTGCCCGGCCCGCCCCGCGCGCCGCGCCCGCGCCGCGCTCAGTCCGCGCTCAGCCGCCGTACCGCTTTCGCTTGTGTTACACCACGGACTATTT CCACTGCTATTTCAATACGCGGTTAACGATCGTCCTATAACATAATTGATTTATAATTGTGATAATACGCGGTTTTGACTCAAAGTGATTTTTTGATAACGTATTTTTTATTTTATTTTATAAAAAATGTTAATTGTATCGTAAAAGTTATTTCTTCGGAAAATAAATTCGGTGTAAACATTTTTTTTTTATTCGAAAGAAAATGCATAAACGGAAACCATGTAGGGGCCGGTTTCGGTGAGATGTTGGGTGAAGATTAGTGTTGGACTGAGGTACTGAGAGTTGTTTC(SEQ ID NO：1)

2.转录模板的扩增

(1)引物：引物序列如表7所示，将设计好的正向和反向引物送公司合成，经过PCR程序互为引物扩增，合成完整的sgRNA序列转录模板。用于合成Tbx20基因上游G4序列靶点sgRNA所用的引物序列如下所示(SEQ ID NO：4～5)。

正向引物F(SfTbx-sgRNA-F)：

TAATACGACTCACTATAGGCTGAGCGCGGACTGAGCGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCC(SEQ ID NO：4)。

反向引物R(SfTbx-sgRNA-R)：

AAAAGCACCGACTCGGTGCCACTTTTTCAAGTTGATAACGGACTAGCCTTATTTTAACTTGCTATTTCTAGCTCTAAAA(SEQ ID NO：5)。

(2)模板Tbx20-up2k sgRNA模板短链的延伸

反应体系如表1所示：

表1

组分	用量
		10×Ex Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>)	2μL
dNTP Mixture(各dNTP浓度均为2.5mM)	1μL
		正向引物F	1μL
反向引物R	1μL
		TaKaRa Ex Taq(5U/μL)	0.2μL
Add ddH<sub>2</sub>O to	20μL

反应程序：95℃、3min；95℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，30个循环；72℃、10min。

(3)阳性质粒构建

将上步PCR产物回收目的DNA片段，连接至PMD-18T载体中，连接体系如表2所示：

表2

组分	用量
		pMD18-T载体	0.5μL
目的DNA片段	0.5μL
		Solution I	5μL
Total	10μL

连接液置于16℃制冷仪3小时后，将10μL连接液加入装有感受态大肠杆菌的离心管内，轻轻吹匀，放置冰上静置30min，接着42℃水浴90s，立马拿出，放置于冰上5-10min，加入无抗LB培养基1mL，放摇床培养箱培养1h后3000转离心5min，留100μL重悬菌液。用氨苄抗性平板培养基筛选阳性菌落，进行单克隆菌落PCR检测和测序验证，测序结果无核苷酸突变的菌落为所需的阳性菌落。

上述菌落PCR检测所用引物为PMD-T-F和sgRNA-R，PCR产物大小约为530bp，菌落PCR检测引物的具体序列如下：

PMD-T-F:CGGTGATGACGGTGAAAACCTC(SEQ ID NO：6)，

sgRNA-R:AAAAAAAGCACCGACTCGGTGCC(SEQ ID NO：7)。

(4)转录模板的扩增

以上述送测序结果无核苷酸突变的阳性菌落质粒为模板，用引物扩增转录模板(根据

Kit的说明书进行操作)，反应体系如表3所示：

表3

组分	用量
		质粒模板	30ng(1μL)
10×Ex Taq Buffer(Mg<sup>2+</sup>)	5μL
		dNTP Mixture(各dNTP浓度均为2.5mM)	2μL
PMD-T-F	2μL
		sgRNA-R	2μL
TaKaRa Ex Taq(5U/μL)	0.5μL
		Add ddH<sub>2</sub>O to	50μL

反应程序：95℃、3min；95℃、30s，55℃、30s，72℃、30s，34个循环；72℃、10min。

以上体系重复6管，反应结束后将反应液合并，共300μL，加入等体积酚氯仿异戊醇纯化，纯化后终浓度定到1000ng/μL，以作为sgRNA合成的模板。

3.sgRNA合成

将其核苷酸置于冰上，而10X Reaction Buffer请置于常温。(

Kit试剂盒)参照

Kit试剂盒说明书进行sgRNA合成操作。

反应体系如表4所示：

表4

组分	用量
		ATP solution	1μL
CTP solution	1μL
		GTP solution	1μL
UTP solution	1μL
		转录模板DNA	1000ng
Enzyme Mix	1μL
		10×Reaction Buffer	1μL
Add Nuclease-free Water to	10μL

反应程序：37℃水浴过夜(约16h)。

将10μL反应溶液用RNA free water补齐至300～400μL，并且加入等体积酚氯仿异戊醇纯化sgRNA，纯化后终浓度定到500～1000ng/μL，最后注射浓度按自己所需而定。4.虫卵显微注射进行Tbx启动子区G4序列的敲除和阳性个体筛选

将草地贪夜蛾事先进行昼夜颠倒，使其在白天产卵方便注射，放在涂有浆糊的牛皮纸上产卵，产下卵后将卵带纸剪下放流动水中冲洗，先用水轻轻冲刷掉覆盖在表面的绒毛，再用毛笔轻轻扫掉表面残留在卵表面的绒毛，将虫卵打湿后转移到载玻片上，打散成单个虫卵，用毛笔沾水保持载玻片上的卵能沾上水干掉后就能粘在载玻片上。显微注射时将已经混合好的Cas9蛋白和sgRNA混合物溶液约40-80nL(均可，每颗卵的注射量相同)(sgRNA浓度约为500ng/μL，Cas9浓度约为300ng/μL)，总共注射了约300颗卵，孵化约80头。

5.突变检测和稳定性遗传分析

在基因靶点上下游150bp的位置，设计并合成正、反向引物(SfTbx-promoter-F、SfTbx-promoter-R，序列如表7所示)，以突变体基因组DNA为模板进行PCR扩增反应，进行碱基测序，测序获得的结果通过SnapGene软件进行碱基序列比对分析(如图3所示)，并确认不同的序列碱基突变情况，经过检测，筛到了确实34个碱基的G4序列的突变体基因型，在基因的cds序列上设计并合成qPCR正、反向引物(SfTbx-qpcr-F、Sf Tbx-qpcr-R，序列如表7所示)，提取突变体RNA并反转录成cDNA，用

qPC R Master Mix(2X)试剂盒进行mRNA相对含量的测定。具体如下：

(1)总RNA提取

(A)在灭菌的DEPC-ddH₂O中解剖取材，取适量组织加入400μL Trizol，充分研磨后，再加Trizol补至1mL体积，冰上静置5min；

(B)加入200μL氯仿:异戊醇(24:1)，剧烈振荡15s混匀，冰上静置10min；

(C)12000rpm，4℃离心15min，取上清，加入等体积异丙醇，颠倒混匀后，冰上放置15min；

(D)12000rpm，4℃离心l5min，弃上清，加入1mL 75％乙醇(由灭菌的DEPC-ddH2O配制)洗涤RNA沉淀。12000rpm，4℃离心5min，弃上清；

(E)加入200μL 75％乙醇重复上述步骤，弃上清。通风橱内打开离心管盖，室温干燥直至沉淀呈透明状；

(D)用适量无菌DEPC-ddH₂O或RNase-free water溶解RNA沉淀，测浓度后置于-80℃保存；

(2)逆转录PCR

(A)在200μL离心管中按照表5所示系列体系加样：

表5

组分	用量
		RNA模板	1μg
5×M-mLV buffer	2μL
		RNase Inhibitor(40U/μL)	0.25
dNTP mix(10mM)	0.5μL
		DNase I	0.25μL
RNase-free water Up to	8μL

加样完成后混匀，置于PCR仪，设置程序：37℃，30min；75℃，10min，4℃for ever。

(B)与此同时，配制混合体系如表6所示：

表6

oligo-DT	1μL
		mLV-酶	0.5μL
DEPC-ddH<sub>2</sub>O	0.5μL
		Total	2μL

混匀后离心，待上一步PCR结束样品降温至4℃后，将该混合溶液加入离心管，混匀后离心，然后置于PCR仪中，设置程序：37℃1h，75℃5min，4℃，forever，热盖94℃，体积10μL。

(C)反应结束后，向反应体系中加50μL ddH₂O稀释，-20℃保存备用。

表7引物序列

(3)实时荧光定量PCR

用

qPCR Master Mix(2X)试剂盒进行mRNA相对含量的测定。反应体系如表8所示：

表8

两步法PCR标准扩增程序如表9所示：

表9

每组反应取三个生物学重复进行，以草地贪夜蛾ribosomal protein 49(Sfrp49)为内参。所有数据用Sfrp49的值进行校正后，用GraphPad Prism version进行作图。

分别对头、精巢和卵巢三个组织的野生型和筛选到的突变体的Tbx20的表达量进行检测，qPCR结果如图4所示，显突变体表达量在头部显著降低，在精巢和卵巢均有所升高(可能与该G4序列在不同组织形成G4结构有关)。该结果说明G4序列被破坏均会影响Tbx20基因的表达。

实施例3草地贪夜蛾Tbx基因启动子区G4调控元件敲除(采用CRISPR/Cas9系统敲除)的表型

1、产卵量减少和孵化率降低

分别对实施例2制备得到的突变体SfTbx20-G4^-/-纯合子和野生型所产卵块的发育过程(产卵后0.5、1、1.5、2、2.5、3day)进行连续观察，结果如图5所示，从图中可以看出，野生型产卵后3天内发育情况正常，在胚胎发育后期胚胎颜色变深，最后可正常孵出幼虫，纯合子胚胎则无任何发育迹象，直至萎缩最后全部未能孵化。

SfTbx20-G4^-/-突变体相对于野生型，突变表型主要表现在产卵和孵化活性上。产卵量和孵化率统计结果图如图6所示，从图中可以看出，相对于野生型单蛾产卵量平均为605个，而突变体则显著降低(p<0.05,t-test)，仅为89。卵孵化率则差异更为明显。相对于野生型50％以上的孵化率，突变体孵化率则低至0。该结果说明Tbx20启动子区的G4序列的敲除能有效抑制草地贪夜蛾后代个体数。

2、变态发育受阻

变态发育检测结果如图7和图8所示，从图中可以看出，SfTbx20-G4^-/-突变体G0代相对于野生型出现化蛹异常(图7)和羽化受阻(图8)，后代突变体基因型(-34)较野生型不同程度影响变态发育。该结果说明Tbx20启动子区的G4序列的敲除能有效抑制草地贪夜蛾变态发育。

G4是由一段富含串联重复鸟嘌呤(G)的DNA或RNA折叠形成的高级结构，G-四链体的结构单元是G-四分体(G-quartet)，四个鸟嘌呤(G)通过Hoogsteen氢键连接形成环状平面，2层或以上的四分体通过π-π堆积形成四链体。近年来，越来越多的研究发现G4在生物体内广泛存在，这类结构能够与一些蛋白特异性结合，在DNA复制、基因转录、RNA翻译和端粒保护等多种过程中发挥重要作用，相关研究发现在草地贪夜蛾精巢组织和一系列无脊椎动物和脊椎动物细胞中存在G-四链体高级结构，其形成受细胞pH和细胞周期等因素的影响。研究G4对草地贪夜蛾关联基因的调控机制和生长发育的影响，有利于揭示G4对草地贪夜蛾的生物学意义。本发明研究G4对Tbx20基因的调控机制及草地贪夜蛾生长发育的影响，将为理解G4对于生命现象的生物学意义提供新的溶索，为生物害虫防治作出巨大贡献。

转录因子Tbx20基因对脊椎动物和节肢动物的肢体发育至关重要。果蝇基因组编码8个T-box基因，其中6个在肢体发育中表达。Tbx20相关基因对midline和H15对果蝇腿的背腹轴至关重要。三个Tbx6相关的背交叉基因是翅膀发育过程中上皮重塑所必需的。果蝇基因视运动盲(omb)是果蝇Tbx2亚家族的唯一成员，主要参与翅膀发育。Omb对翅膀发育至关重要，足以促进第二对翅膀的发育。Omb基因表达的针对性操作表明，翅膀发育对大量Omb的需求可以解构为许多单独的功能。尽管Omb在翅成虫盘中的表达与前部的/后部的(A/P)细胞分群形成的隔间对称，但前部和后部敲除具有不同的后果：前Omb是维持A/P谱系限制边界所必需的；后Omb抑制沿A/P边界的顶端上皮褶皱的形成。果蝇T-box基因的表达并不局限于外胚层衍生的成虫盘上皮细胞。Doc和Omb均在足成虫盘的肌肉前体细胞中显著表达。Omb也在侵入翅成虫盘的细胞外基质的气管分支中强烈表达。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.转录因子Tbx20启动子区G4调控元件表达基因或其编码蛋白、或含有所述基因的生物材料，在以下任一项中的应用：

(1)制备降低害虫产卵量产品；

(2)制备用于降低害虫卵的孵化率的产品；

(3)制备用于阻止害虫变态发育的产品；

(4)制备用于阻止害虫羽化的产品；

(5)制备防治害虫的产品；

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述害虫为鳞翅目害虫；优选地，所述害虫为夜蛾；更优选地，所述害虫为草地贪夜蛾。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述生物材料为质粒、表达载体或转基因细胞。

4.一种转录因子Tbx20启动子区G4调控元件的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂用于抑制转录因子Tbx20的蛋白表达。

5.根据权利要求4所述的抑制剂，其特征在于，所述抑制剂为干扰分子或CRISPR/Cas9系统的抑制靶标或沉默靶标；优选地，所述干扰分子为靶向转录因子Tbx20启动子区G4调控元件的dsRNA、miRNA、核酶和shRNA中的至少一种；优选地，所述CRISPR/Cas9系统的抑制靶标或沉默靶标为靶向Tbx20启动子区G4调控元件的sgRNA。

6.根据权利要求5所述的抑制剂，其特征在于，所述sgRNA的的核苷酸序列如SEQ IDNO：3所示。

7.权利要求4-6任一项所述的抑制剂在如下1)-5)中至少一种中的应用：

1)制备降低害虫产卵量产品；

2)制备用于降低害虫卵的孵化率的产品；

3)制备用于阻止害虫变态发育的产品；

4)制备用于阻止害虫羽化的产品；

5)制备防治害虫的产品。

8.一种防治有害昆虫的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：敲除启动子区G4调控元件，下调有害昆虫体内转录因子Tbx20的表达，所述转录因子Tbx20启动子区G4调控元件的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

9.一种CRISPR/Cas9系统，其特征在于，包括Cas9和特异性靶向转录因子Tbx20启动子区G4调控元件基因的sgRNA；其中，特异性靶向转录因子Tbx20启动子区G4调控元件的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示。

10.一种用于害虫防治的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求9所述的CRISPR/Cas9系统。