CN115814085A - Appl1在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于医药技术领域，公开了一种APPL1在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的应用。本发明在体外细胞实验显示，通过干预APPL1的水平，发现APPL1对人间充质干细胞的成脂分化具有负调控作用，而对成骨分化具有正调控作用。在动物试验发现APPL1过表达能有效提高骨质疏松症的骨量，APPL1过表达组骨小梁与脂肪数量恢复至接近正常水平。与现有治疗骨质疏松症技术相比，本发明的新靶点能缓解骨质疏松患者骨量丢失的情况，对控制骨量进行性减少及防止病理性骨折的发生具有良好的效果。为以APPL1为靶点研制治疗骨质疏松症的新药打下基础。
Description
技术领域
本发明涉及医药技术领域，具体涉及APPL1在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的应用。
背景技术
骨质疏松是一种常见的退行性疾病，其特征为骨量减少与骨脆性增加。随着疾病的进展，患者发生脆性骨折的概率显著增加，严重影响患者的生存预后和生活质量。骨质疏松的治疗包括非药治疗与药物治疗。非药物治疗主要以营养干预、体育锻炼为主；药物治疗对于改善骨量和减少骨折风险是必要的，是骨质疏松治疗的主要途径。治疗骨质疏松的药物可分为抗骨吸收药物和促骨形成药物，抗骨吸收药物主要有双膦酸盐类、雌激素及选择性雌激素受体调节剂、核因子-κB受体活化因子配体(RANKL)抑制剂、降钙素，促骨形成药物主要有甲状旁腺素和甲状旁腺素相关肽。
然而，目前仍无法证实骨质疏松症发生的确切病因，现有治疗方法仍无法从根本上上预防或治疗。随着疾病的进展，骨质疏松症患者脆性骨折发生的概率大大提高，更容易出现跌倒，导致脆性骨折，致残，甚至死亡。
因此，针对现有治疗方法的缺点，亟需寻找治疗骨质疏松症的新靶点，以控制骨量进行性减少及防止病理性骨折的产生。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种APPL1在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
第一方面，本发明将APPL1在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中应用。
本发明在体外细胞实验显示，通过干预APPL1的水平，发现APPL1对人间充质干细胞(hMSC)的成脂分化具有负调控作用，而对成骨分化具有正调控作用。动物模型中，骨质疏松APPL1过表达组相比于骨质疏松对照组，骨量明显增加而骨髓腔脂肪含量明显减少，即APPL1过表达能有效提高骨质疏松症的骨量，APPL1过表达组骨小梁与脂肪数量恢复至接近正常水平。说明APPL1表达水平与骨量呈正相关。且均未见实验动物异常死亡或感染等副作用。因此，APPL1是治疗骨质疏松症的重要靶点。本发明的新靶点能缓解骨质疏松患者骨量丢失的情况，对控制骨量进行性减少及防止病理性骨折的发生具有良好的效果。
作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述APPL1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述药物为注射剂或口服制剂。
作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述注射剂为溶液、悬浮液、乳剂或者无菌粉末形式的制剂。
本发明为以APPL1为靶点研制治疗骨质疏松症的新药打下基础。以实现临床预防或治疗骨质疏松症中骨量进行性减少及防止病理性骨折的产生。
第二方面，本发明提供了一种过表达APPL1的腺病毒，包括穿梭载体Pshuttle-CMV和APPL1基因序列。
第三方面，本发明提供了所述的过表达APPL1的腺病毒的制备方法，包括以下步骤：
(1)扩增APPL1基因序列；克隆至所述穿梭载体上；得携带APPL1基因的穿梭质粒；
(2)将所述携带APPL1基因的穿梭质粒线性化后与腺病毒大骨架质粒共转入大肠杆菌中同源重组；通过抗性变化筛选出腺病毒载体骨架重组子；
(3)将所述腺病毒载体骨架重组子转染到人胚胎肾细胞中，倍比扩增，富集病毒颗粒，即成。
作为本发明所述的制备方法的优选实施方式，所述引物的碱基序列如如SEQ IDNo.2和/或SEQ ID No.3所示。
第四方面，本发明将所述的腺病毒、所述的制备方法在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中应用。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明在体外细胞实验显示，通过干预APPL1的水平，发现APPL1对人间充质干细胞(hMSC)的成脂分化具有负调控作用，而对成骨分化具有正调控作用。在动物试验发现骨质疏松APPL1过表达组相比于骨质疏松对照组，骨量明显增加而骨髓腔脂肪含量明显减少，即APPL1过表达能有效提高骨质疏松症的骨量，APPL1过表达组骨小梁与脂肪数量恢复至接近正常水平。说明APPL1表达水平与骨量呈正相关。通过对骨质疏松小鼠动物模型进行尾静脉注射APPL1过表达腺相关病毒，发现其能有效缓解骨质疏松小鼠动物模型中骨量丢失的情况，提示APPL1是治疗骨质疏松症的重要靶点。且未见小鼠异常死亡或感染等副作用。
本发明的新靶点能缓解骨质疏松患者骨量丢失的情况，对控制骨量进行性减少及防止病理性骨折的发生具有良好的效果。为以APPL1为靶点研制治疗骨质疏松症的新药打下基础。以实现临床预防或治疗骨质疏松症中骨量进行性减少及防止病理性骨折的产生。
附图说明
图1为qRT-PCR检测hMSC成脂分化标志物的mRNA水平统计图。
图2为检测hMSC成脂分化标志物的蛋白水平Western blot电泳图。
图3为图2中蛋白水平的统计分析图。
图4为油红O检测成脂分化染色图。
图5为图4中分化细胞的统计分析图。
图6为检测hMSC成骨分化标志物的蛋白水平Western blot电泳图。
图7为图6中蛋白水平的统计分析图。
图8为碱性磷酸酶检测成骨分化染色图。
图9为图8中分化细胞的统计分析图。
图10为茜素红检测成骨分化染色图。
图11为图10中分化细胞的统计分析图。
图1～6、8、9、11中，Si组均表示SiRNA敲减，OE组均表示慢病毒过表达。
图12为小鼠股骨Micro-CT扫描图；
图13为小鼠股骨骨小梁和骨皮质重建图；
图14为小鼠股骨骨小梁和骨皮质分析图；
图15为小鼠股骨切片HE和Masson染色图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1：细胞水平试验
(1)人间充质干细胞(hMSC)细胞的APPL1水平干预
将0.6×105的hMSC种于12孔板中，种板后第二天舍弃原培养基，对hMSC进行APPL1敲减SiRNA转染与慢病毒转染(慢病毒购于和元生物技术有限公司)，SiRNA在转染6h后更换诱导培养基，慢病毒在转染24h后更换诱导培养基。
APPL1 SiRNA的序列为：
sense 5’-CCGAAAGGCUGGAUACCUUTT-3’；
antisense 5’-AAGGUAUCCAGCCUUUCGGTT-3’。
对照SiRNA序列为：
sense 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’；
antisense 5’-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3’。
(2)hMSC的成脂分化/成骨分化诱导
对进行敲减或过表达处理后的细胞进行相应的分化诱导。
成脂分化诱导采用成脂分化诱导培养基(10％FBS DMEM，1μM地塞米松，10μg/mL胰岛素，0.5Mmibmx，0.2mM吲哚美辛，100IU/mL青霉素-链霉素)，每隔3天更换成脂分化培养基。
成骨分化诱导采用成骨分化诱导培养基(10％FBS DMEM，0.1μM地塞米松，10mM磷酸甘油，50μM维生素C，100IU/mL青霉素-链霉素)，每隔3天更换成骨分化培养基。
(3)hMSC成脂分化/成骨分化水平检测
成脂分化水平在成脂分化诱导的第6天进行检测。油红O染色被用来检测细胞的成脂分化情况。此外，通过qRT-PCR与Western blot对成脂分化相关标志物PPAR-γ、C/EBP-α、FABP4的mRNA水平和蛋白水平分别进行检测。
成骨分化水平在成骨分化诱导的第14天进行检测。碱性磷酸酶和茜素红染色被用来检测细胞的成骨分化的情况。通过Western blot对成骨分化相关标志物OCN、SP7、OPN的蛋白水平分别进行检测。
qRT-PCR检测hMSC成脂分化标志物的mRNA水平如图1所示，Western blot检测hMSC成脂分化标志物的蛋白水平如图2和图3所示，结果显示，在APPL1敲减的hMSC中，成脂分化的标志物PPAR-γ、C/EBP-α、FABP4的mRNA与蛋白表达水平均显著增加；在APPL1过表达的hMSC中，成脂分化的标志物PPAR-γ、C/EBP-α、FABP4的mRNA与蛋白表达水平均显著降低；即APPL1水平与成脂分化标志物呈负相关，说明APPL1负调控成脂分化。
油红O染色检测成脂分化如图4和图5所示，结果显示在APPL1敲减的hMSC中，APPL1敲减后油红O染色强度增强，而在APPL1过表达的hMSC中，APPL1过表达后染色强度减弱，说明APPL1抑制hMSC的成脂分化。
Western blot检测hMSC成骨分化标志物的蛋白水平如图6和图7所示，结果显示，在APPL1敲减的hMSC中，成骨分化的标志物OCN、SP7、OPN的蛋白水平显著降低，在APPL1过表达的hMSC中，成骨分化的标志物OCN、SP7、OPN的蛋白水平显著增加；即APPL1水平与成骨分化标志物呈正相关，说明APPL1正调控成骨分化。
碱性磷酸酶染色检测成骨分化如图8和图9所示，茜素红染色检测成骨分化如图10和图11所示，结果显示，在APPL1敲减的hMSC中，碱性磷酸酶染色与茜素红染色强度在APPL1敲减后降低，而在APPL1过表达的hMSC中，碱性磷酸酶染色与茜素红染色强度在APPL1过表达后升高，说明APPL1促进hMSC的成骨分化。
以上体外细胞实验显示，通过干预APPL1的水平，发现APPL1对人间充质干细胞(hMSC)的成脂分化具有负调控作用，而对成骨分化具有正调控作用。
实施例2：构建骨质疏松小鼠动物模型
选取6～8周龄雌性C57BL/6J小鼠构建绝经后骨质疏松小鼠模型，具体模型构建过程为：
小鼠用异氟烷气体吸入麻醉后摆成仰卧位，腹部脱毛备皮；在无菌条件下于腹股沟水平沿腹中线剪开皮肤及肌层，暴露腹腔；分离子宫并摘除卵巢，清理伤口后分两层缝合皮肤及基层，待小鼠清醒后，将其放回洁净笼具后放回饲养室饲养，定期观察小鼠状态及死亡情况并做好记录；术后3天，每只小鼠每天注射4万单位青霉素，防止感染；对照组仅摘除卵巢周围约1g脂肪，而保留卵巢，其余处理相同；小动物CT测量各组小鼠骨密度，评估造模情况。
通过HE染色、Masson染色，观察小鼠股骨骨量，见图12～图15中假手术组与骨松对照组。从小鼠股骨Micro-CT扫描图(如图12所示)的Micro-CT水平面和冠状面扫描中可看出各组骨量之间的差异，与假手术组相比，骨质疏松对照组的骨量明显降低，说明骨质疏松小鼠模型的造模是成功的。通过骨切皮及染色在组织结构层次上证实了骨质疏松对照组骨小梁减少、骨髓脂肪增加。说明成功造模骨质疏松小鼠模型。
实施例3：动物试验
(1)构建APPL1过表达腺病毒
具体构建过程为：
1)基因调取与腺病毒穿梭质粒的构建
从文库中获取目的基因CDS区序列并设计引物；克隆至腺病毒系统穿梭载体(Pshuttle-CMV)；
APPL1的氨基酸序列为：
MPGIDKLPIEETLEDSPQTRSLLGVFEEDATAISNYMNQLYQAMHRIYDAQNELSAATHLTSKLLKEYEKQRFPLGGDDEVMSSTLQQFSKVIDELSSCHAVLSTQLADAMMFPITQFKERDLKEILTLKEVFQIASNDHDAAINRYSRLSKKRENDKVKYEVTEDVYTSRKKQHQTMMHYFCALNTLQYKKKIALLEPLLGYMQAQISFFKMGSENLNEQLEEFLANIGTSVQNVRREMDSDIETMQQTIEDLEVASDPLYVPDPDPTKFPVNRNLTRKAGYLNARNKTGLVSSTWDRQFYFTQGGNLMSQARGDVAGGLAMDIDNCSVMAVDCEDRRYCFQITSFDGKKSSILQAESKKDHEEWICTINNISKQIYLSENPEETAARVNQSALEAVTPSPSFQQRHESLRPAAGQSRPPTARTSSSGSLGSESTNLAALSLDSLVAPDTPIQFDIISPVCEDQPGQAKAFGQGGRRTNPFGESGGSTKSETEDSILHQLFIVRFLGSMEVKSDDHPDVVYETMRQILAARAIHNIFRMTESHLLVTCDCLKLIDPQTQVTRLTFPLPCVVLYATHQENKRLFGFVLRTSSGRSESNLSSVCYIFESNNEGEKICDSVGLAKQIALHAELDRRASEKQKEIERVKEKQQKELNKQKQIEKDLEEQSRLIAASSRPNQASSEGQFVVLSSSQSEESDLGEGGKKRESEA。
引物序列为：
Forward:5’-ACTTGGGTACATGCAAGCTCA-3’；
Reverse:5’-TCCCTGCGAACATTCTGAACG-3’。
2)腺病毒骨架质粒的同源重组
将携带目的基因片段的穿梭质粒线性化后与腺病毒大骨架质粒共转入在特定的大肠杆菌中进行同源重组，由于腺病毒骨架质粒是氨苄抗性，而与穿梭质粒同源重组后，氨苄抗性丢失，同时表达卡那霉素抗性，因此，通过抗性的变化可筛选出腺病毒载体骨架重组子，挑取重组子进行酶切鉴定，挑选酶切鉴定正确的克隆，进行下一步腺病毒载体的包装。
3)腺病毒载体的包装与扩增
将筛选到的重组腺病毒运用脂质体法转染到HEK 293细胞中，通过倍比扩增，富集病毒颗粒。
(2)试验分组
将假手术小鼠和构建的骨质疏松小鼠模型分为三组，包括假手术组、骨质疏松对照组、骨质疏松APPL1过表达组。在手术后的7天后，三组分别予相同体积生理盐水、5×1011空载体和APPL1过表达腺病毒尾静脉注射，每2周一次。
(3)检测小鼠股骨骨量
术后的第9周开始，采用颈椎脱臼法处死三组中的小鼠。处死后取小鼠股骨，进行Micro-CT扫描，分析股骨骨小梁及骨皮质相关指标(骨体积分数、骨皮质厚度、骨表面积/骨体积、骨小梁厚度、骨小梁数量、骨小梁分离度)。并依次固定、脱钙、石蜡包埋、切片，通过HE染色、Masson染色，观察小鼠股骨骨量。
小鼠股骨Micro-CT扫描记过如图12所示，小鼠股骨骨小梁、骨皮质重建如图13所示；小鼠股骨骨小梁、骨皮质分析如图14所示；小鼠股骨切片HE、Masson染色如图15所示。如图12至图15所示，骨质疏松APPL1过表达组相比于骨质疏松对照组，骨量明显增加而骨髓腔脂肪含量明显减少，即APPL1过表达能有效提高骨质疏松症的骨量，APPL1过表达组骨小梁与脂肪数量恢复至接近正常水平。说明APPL1表达水平与骨量呈正相关。且三组均未见小鼠异常死亡或感染等副作用。
综上，本发明发现骨质疏松患者APPL1表达减少是导致骨量减少、骨髓脂肪含量增加的重要原因，通过对骨质疏松小鼠动物模型进行尾静脉注射APPL1过表达腺相关病毒，发现其能有效缓解骨质疏松小鼠动物模型中骨量丢失的情况，提示APPL1是治疗骨质疏松症的重要靶点。与现有治疗骨质疏松症技术相比，本发明的新靶点能缓解骨质疏松患者骨量丢失的情况，对控制骨量进行性减少及防止病理性骨折的发生具有良好的效果。为以APPL1为靶点研制治疗骨质疏松症的新药打下基础。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。
Claims (8)
1.一种APPL1在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述APPL1的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物为注射剂或口服制剂。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述注射剂为溶液、悬浮液、乳剂或者无菌粉末形式的制剂。
5.一种过表达APPL1的腺病毒，其特征在于，包括穿梭载体Pshuttle-CMV和APPL1基因序列。
6.权利要求5所述的过表达APPL1的腺病毒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)扩增APPL1基因序列；克隆至所述穿梭载体上；得携带APPL1基因的穿梭质粒；
(2)将所述携带APPL1基因的穿梭质粒线性化后与腺病毒大骨架质粒共转入大肠杆菌中同源重组；通过抗性变化筛选出腺病毒载体骨架重组子；
(3)将所述腺病毒载体骨架重组子转染到人胚胎肾细胞中，倍比扩增，富集病毒颗粒，即成。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述引物的碱基序列如如SEQ IDNo.2和/或SEQ ID No.3所示。
8.权利要求5所述的腺病毒、权利要求6或7所述的制备方法在制备预防和/或治疗骨质疏松药物中的应用。
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