CN115813993A - 茶枝柑提取物在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及药物技术领域，具体涉及茶枝柑(柑皮与柑胎)提取物在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用，以茶枝柑提取物作为药物的有效成分。茶枝柑提取物具有显著的广泛抗炎作用，同时具有镇咳、化痰的作用，可以改善慢性阻塞性肺疾病慢性炎症，同时有效改善患者慢性咳嗽、慢性咳痰的症状，其中茶枝柑柑胎的效果优于柑皮。因此，将茶枝柑开发成用于治疗慢阻肺的产品具有广阔的应用前景以及良好的经济效益、社会效益。

Description

茶枝柑提取物在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用

技术领域

本发明涉及药物技术领域，具体涉及茶枝柑提取物在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。

技术背景

呼吸系统疾病有许多种，可分为感染性疾病和非感染性疾病两大类。各种类型的肺炎、支气管炎、肺结核以及新型冠状病毒等呼吸系统疾病均是由细菌、病毒等生物因素引起的，而慢性阻塞性肺疾病主要是由吸烟、空气污染、职业暴露等非生物性因素引起，常用于治疗生物因素引起的呼吸系统疾病的抗病毒、抗菌药物对治疗慢性阻塞性肺疾病几乎无效。

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD，以下简称慢阻肺)是一种常见、可预防、可治疗的疾病，一般是由长期接触有毒颗粒或气体引起的气道和(或)肺泡异常所致，并受到宿主因素(如肺发育异常)的影响，以气流受限及持续的呼吸道症状为主要特征。

世界卫生组织发布的相关数据显示，慢阻肺已成为继缺血性心脏病、中风之后的全球第三大死亡原因，占2019年全球死亡总人数的6％，其中90％的死亡发生在中低收入国家，与吸烟、空气污染、职业暴露等长期接触的有毒颗粒或气体息息相关。随着我国工业化经济迅速发展、吸烟率不断增加以及人口老龄化，我国慢阻肺患者不断增加，目前约有1亿慢阻肺患者，60岁以上人群患病率超过27％。由于慢阻肺患者的患病率和死亡率居高不下，严重影响患者的劳动力和生活质量，且反复发生与就诊，已造成巨大的社会和经济负担。

吸烟是慢阻肺主要致病因素，是诱发呼吸道和肺部炎症的重要危险因素，是全球导致人类死亡的可预防的重要危险因素。烟草烟雾目前有69种已知致癌物，其中，尼古丁、焦油、重金属、自由基等有害物质破坏呼吸道上皮的纤毛，削弱呼吸道粘液清除功能；使机体咳嗽反射的敏感性下降，呼吸道清除功能减弱；诱导肺上皮细胞和血管内皮细胞的活化，刺激分泌多种炎症细胞因子(如TNF-α、IL-1β)和趋化因子，诱导免疫细胞过度聚集在气道和肺组织中，进而引发慢性炎症，持续炎症反应使气道和肺实质损伤，进而导致持续气流受阻，形成慢阻肺等慢性疾病。

空气污染包括室内空气污染和室外空气污染。室内空气污染主要来源于吸烟和家庭燃料不完全燃烧，是慢阻肺患病和死亡的重要危险因素，也是造成全球经济负担的前十大危险因素之一。室内空气污染的一氧化碳、氮氧化物、含硫氧化物等有害物质，长期作用于肺上皮细胞和血管内皮细胞，造成气道和肺的持续性炎症损伤，增加慢阻肺的患病风险。室外空气污染主要包括PM₁₀、PM_2.5等气溶胶状态污染物和O₃、SO₂、NO₂、CO等气体状态污染物，是增加慢阻肺患病风险的另一重要因素，也是导致慢阻肺患者急性加重的重要原因。空气中颗粒物(PM)、二氧化硫等污染物浓度每增加一单位，慢阻肺的患病率随之增加约6％。空气污染物直接通过呼吸道进入人体，PM₁₀可沉积于上气道，PM_2.5可沉积于下气道，气态污染物直接作用于肺泡，通过激活氧化应激、促进抗炎反应、诱导细胞凋亡等途径引发呼吸系统慢性炎症，引起呼吸道症状和肺功能损害，增加慢阻肺的患病风险和急性加重的风险。空气污染越严重，慢阻肺的发病率越高，尤其是儿童时期过多接触空气污染，会对肺功能影响较大。

粉尘、有毒气体等职业暴露亦如吸烟、空气污染一样，是慢阻肺的重要致病因素。长期吸入粉尘会在患者呼吸系统沉积，造成呼吸道上皮纤毛损伤、咳嗽敏感性降低，使得呼吸道清除功能逐渐减弱。有研究表明，粉尘、有毒气体等职业暴露人员患慢阻肺的风险是非暴露者的1.6倍。长期的职业暴露，导致呼吸系统持续受到刺激，引起呼吸系统及机体的慢性炎症，增加慢阻肺的患病风险。

慢阻肺是一种严重危害健康的慢性呼吸系统疾病，发病机制复杂，目前对于发病机制的研究主要集中在慢性炎症。有害气体或颗粒进入气道和肺组织后触发模式识别受体(Pattern recognition receptor，简称PRR)活化巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞等固有免疫细胞和上皮细胞、内皮细胞、成纤维细胞气道内结构细胞，直接或间接激活炎症相关损伤分子模式，导致各种细胞因子、趋化因子、急性期反应蛋白等释放。如巨噬细胞的增加，促进炎症因子和趋化因子的释放，包括TNF-α、IL-1β等介质，这些介质促进中性粒细胞和单核细胞等炎症细胞募集到肺部并促进巨噬细胞的成熟，肺泡巨噬细胞分泌弹性蛋白水解酶，促进炎症增强，同时活化的中性粒细胞数量增加，释放弹性蛋白酶、组织蛋白酶G、MMP-8、MMP-9、半胱氨酸蛋白酶等，促进粘液高分泌、肺泡间质及肺实质破坏，导致气道和肺部持续炎症反应，促进慢阻肺的进展。

茶枝柑(Citrus reticulata‘Chachi’)是芸香科柑橘属植物橘Citrusreticulata Blanco的栽培变种，是广陈皮的基原植物。茶枝柑柑皮(CRC)是茶枝柑成熟果皮，采收期是每年的11-12月份，其中柑皮陈化三年或三年以上者为广陈皮或新会陈皮，而茶枝柑柑胎(CRCI)是茶枝柑组织未分化的幼果，采收期是每年的6-7月份。茶枝柑柑胎中黄酮类(如橙皮苷、柚皮苷)与多甲氧基黄酮类化合物含量均高于柑皮含量。一个药材的药理作用、功效主治与其化学成分含量的高低或者这些化合物成分的组合有关联，茶枝柑柑胎和柑皮尽管基原相同，但属于茶枝柑不同的器官，化学成分有别，其药理作用与功效主治也有较大不同，因此，柑胎与柑皮是两种不同的药材。从中药学角度讲，柑皮(包括存放三年的陈皮)性苦、辛，温，归肺、脾经，有理气健脾、燥湿化痰之功效，常用于脘腹胀满、食少吐泻、咳嗽痰多。而柑胎药性苦、辛，温，归肝、胆、胃经，有疏肝破气、消积化滞的功效，常用于胸胁胀痛、疝气疼痛、乳癖、乳痈、食积气滞、脘腹胀痛。

长期以来，对于柑皮(包括陈皮、广陈皮)的现代药理学研究报道很多，相关产品也是丰富多彩，但鲜有茶枝柑柑胎的研究报道，其产品开发利用也很少。

慢性阻塞性肺疾病主要由吸烟、空气污染、职业暴露等非生物性因素引起，常用的用于治疗生物因素引起的呼吸系统疾病的抗病毒、抗菌药物对治疗慢性阻塞性肺疾病几乎无效。由于工业化的发展、交通污染、吸烟率不断升高等原因，空气污染越来越严重，无论在室内还是室外，人们面临着空气中的有毒气体或颗粒持续刺激呼吸系统，刺激气道和肺部产生慢性炎症，进而会发展为慢性阻塞性肺疾病。

现代药理研究表明，茶枝柑柑皮(如陈皮、广陈皮)具有预防和治疗由病毒、细菌等生物因素引起的呼吸系统疾病的药效或潜在应用价值。XU J等研究显示广陈皮具有抗呼吸道合胞病毒的活性(XU J,WU X,LI M,et al.Antiviral activity of polymethoxylatedflavones from“Guangchenpi”,the edible and medicinal pericarps of citrusreticulata‘Chachi’.Journal of Agricultural and Food Chemistry,2014,62(10):2182-2189)，WU C等发现广陈皮与新型冠状病毒(SERS-CoV-2)某些靶点相互作用，具有治疗新冠的潜在应用价值(WU C,LIU Y,YANG Y,et al.Analysis of therapeutic targetsfor SARS-CoV-2and discovery of potential drugs by computational methods.ActaPharmaceutica Sinica Sinica B,2020,10(5):766-788.)，汝绍明等发明了一种治疗支气管、肺结核、早期肺癌的中药配方，该专利涉及广陈皮用于治疗结核分支杆菌引起的肺结核(汝绍明,汝强.一种治疗支气管炎、肺结核及早期肺癌的中药配方.黑龙江省：CN113368192A,2021-09-10.)。

然而，目前市场上还没有将茶枝柑开发应用于治疗吸烟、空气污染非生物因素引起的慢阻肺的相关产品，也没有相关文献报道，茶枝柑柑皮或/和柑胎其药用价值尚未得到充分的发挥。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中的技术问题，提供了茶枝柑提取物在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。

茶枝柑提取物在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。

优选地，所述应用中所述茶枝柑提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1.将茶枝柑粉碎，过20目筛；

S2.用质量分数为65％～75％的乙醇水溶液对步骤S1的茶枝柑进行超声提取三次，每次提取60～100min，提取液的体积为茶枝柑粉末体积的8～15倍，超声频率为35～50kHz，超声功率为80～150W，提取温度为40～55℃。

优选地，所述应用中所述茶枝柑提取物包括柑皮提取物和柑胎提取物。

更优选地，所述应用中所述茶枝柑提取物为茶枝柑柑胎提取物。

优选地，所述应用中所述药物包括茶枝柑提取物以及一种或多种药学上可接受的辅料。

优选地，所述应用中所述药物用量为单剂量中含有茶枝柑提取物0.1～500g。

更优选地，所述应用中所述药物用量为单剂量中含有茶枝柑提取物0.5～100g。

更优选地，所述应用中所述药物用量为单剂量中含有茶枝柑提取物1～50g。

优选地，所述应用中所述辅料包括：淀粉、可溶性淀粉、微晶纤维素、硬脂酸镁、乳糖、糊精、羟丙基甲基纤维素、滑石粉。

优选地，所述应用中所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液、冲剂、丸剂。

与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：

本发明公开的茶枝柑(柑皮与柑胎)提取物在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用，以茶枝柑提取物作为药物的有效成分。茶枝柑提取物具有显著的广泛抗炎作用，同时具有镇咳、化痰的作用，可以改善慢性阻塞性肺疾病慢性炎症，同时有效改善患者慢性咳嗽、慢性咳痰的症状，其中茶枝柑柑胎的效果优于柑皮。因此，将茶枝柑开发成一种药味成分少且疗效明确，用于治疗慢阻肺的产品具有广阔的应用前景和良好的经济效益和社会效益，同时具有重要理论和现实意义。

附图说明

图1为茶枝柑柑皮提取物与茶枝柑柑胎提取物细胞毒性测定结果；

图2为茶枝柑柑皮提取物与茶枝柑柑胎提取物体外抗炎活性对比结果；

图3为小鼠咳嗽潜伏期结果；

图4为小鼠5min内咳嗽次数结果；

图5为小鼠镇咳实验中血清TNF-α测定结果；

图6为小鼠镇咳实验中血清IL-1β测定结果；

图7为苯酚红标准曲线测定结果；

图8为小鼠排痰量测定结果；

图9为小鼠祛痰实验中血清TNF-α测定结果；

图10为小鼠祛痰实验中血清IL-1β测定结果；

图11为小鼠耳肿胀程度测定结果；

图12为小鼠抗炎实验中血清TNF-α测定结果；

图13为小鼠抗炎实验中血清IL-1β测定结果；

(ns表示P＞0.05，*表示P＜0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001，****表示P<0.0001)。

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面结合具体实施例和对比例将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

除特殊说明，本实施例中所用的设备均为常规设备，所用的材料、试剂若无特殊说明均为市售得到，无特殊说明的实验方法也为常规实验方法。

实施例1：茶枝柑提取物的制备

茶枝柑提取物在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。

所述茶枝柑提取物的制备方法，包括：取茶枝柑药材(柑皮或柑胎)粉碎，过20目筛，用70％乙醇水溶液对药材超声提取三次，每次80min，溶液用量为药材量的10倍(体积比)，超声波频率为40kHz，功率为100W，提取温度为50℃，收集提取液，真空干燥后粉碎得到茶枝柑柑皮提取物或茶枝柑柑胎提取物，其得率分别茶枝柑柑皮提取物(CRC)是27.56％。，茶枝柑柑胎提取物(CRCI)是28.04％。

以羧甲基纤维素钠为辅料与上述提取物制备成口服液，茶枝柑提取物的剂量为0.15g/kg、1.5g/kg、7.5g/kg。

实施例2：体外抗炎实验

茶枝柑柑皮提取物(CRC)与茶枝柑柑胎提取物(CRCI)体外抗炎活性对比研究。

(1)细胞培养

RAW264.7细胞置于DMEM完全培养基中培养，DMEM完全培养基以DMEM培养基为主，加入10％胎牛血清和1％双抗(100U/mL青霉素和0.1mg/mL链霉素)。培养箱保持37℃、CO₂含量为5％，充分潮湿。

(2)细胞毒性测定

给药组和阴性对照组将RAW264.7细胞按照5×10⁵/孔的密度接种在含DMEM完全培养基的96孔板上，空白组仅加入等体积的完全培养基，不加入细胞，培养24小时后，给药组加入不同浓度的茶枝柑柑皮提取物(CRC)和茶枝柑柑胎提取物(CRCI)，阴性对照组仅加入等体积的DMEM完全培养基，空白组加入等体积的DMEM完全培养基，再处理24小时。每组3个平行孔。处理后，避光加入10μL的MTT溶液，将细胞于37℃二氧化碳培养箱中继续培养4小时。吸走上清液，重新每孔加入100μL的DMSO使MTT与活细胞形成的甲臜结晶溶解。用酶标仪在490nm波长处测定每孔的吸光度。阴性对照组中细胞形成的甲臜的光密度认定含有100％的细胞活力。

(3)细胞上清液NO含量测定

通过Griess反应测定培养基中存在的亚硝酸盐。给药组、模型组和阴性对照组将RAW264.7细胞按照5.5×10⁴/孔的密度接种在含DMEM完全培养基的96孔板上，培养24小时后，给药组加入不同浓度的含LPS的茶枝柑柑皮提取物(CRC)和茶枝柑柑胎提取物(CRCI)，模型组加入含LPS的DMEM完全培养基，阴性对照组加入等体积的DMEM完全培养基，每组3个平行孔，再处理24小时。处理后，取50μL的培养基上清到新的96孔板中，每孔加入50μLGriess试剂Ⅰ混合，再每孔加入50μLGriess试剂Ⅱ，用酶标仪在540nm波长处测定每孔的吸光度。

(4)实验结果

如图1CRC和CRCI细胞毒性测定结果所示，与阴性对照组相比，给药处理24小时后，细胞存活率没有显著降低(p＞0.05)。说明CRC和CRCI没有细胞毒性，可在此给药浓度下进行体外抗炎活性分析。

如图2所示，CRC和CRCI均有体外抗炎活性，相较而言，CRCI(茶枝柑柑胎提取物)的体外抗炎活性更好，因此，后续实施例均采用CRCI进行。

实验例3：镇咳实验

(1)动物分组及给药

取SPF级4周龄ICR雄性小鼠30只，由中山大学(实验动物中心东校园)提供，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2021-0029。将ICR小鼠分为5组，分别为CRCI-L(低剂量)、CRCI-M(中剂量)、CRCI-H(高剂量)、阳性药物对照组(喷托维林，PV)、阴性对照组(0.5％羧甲基纤维素钠，CMC-Na)，CRCI-L、CRCI-M、CRCI-H给药剂量分别为0.15g/kg/d、1.5g/kg/d、7.5g/kg/d(相当于生药量1g、10g、50g)，阳性药喷托维林给药剂量为50mg/kg。所有药物均先溶解于0.5％羧甲基纤维素钠溶液中，根据剂量稀释成所需浓度。给药方式为灌胃给药。

(2)模型建立与评价

先适应环境3天，灌胃给药7天，最后一天给药前12h禁食不禁水，最后一天给药1h后，将小鼠放入1000ml玻璃钟罩内，用超声雾化器以最大流速将0.3mL浓氨水均匀地喷入玻璃钟罩30s，观察和记录小鼠的咳嗽潜伏期(从喷入氨水到第一次咳嗽之间的时长)和5min内的咳嗽次数(腹肌收缩，张大口，伴随咳嗽声)。摘眼球取血，脱颈处死，血液静置后离心取血清，用于血液炎症因子表达量的检测。以咳嗽潜伏期时间长短和咳嗽次数作为镇咳药效的评价指标，血清炎症因子表达量作为广泛抗炎的评价指标。

(3)实验结果

如图3小鼠咳嗽潜伏期结果所示，与CMC-Na(9.83±2.17)s相比，PV(62.17±2.17)s、CRCI-H(97.33±6.83)s、CRCI-M(55.33±3.43)s、CRCI-L(24.00±0.89)s，咳嗽潜伏期分别延长了532.42％(P＜0.0001)，890.17％(P＜0.0001)，462.90％(P＜0.0001)，144.15％(P＜0.05)，具有统计学意义，显著延长小鼠的咳嗽潜伏期。

如图4小鼠5min内咳嗽次数结果所示，与CMC-Na(233.83±14.37)次相比，PV(46.83±2.33)次、CRCI-H(50.83±3.44)次、CRCI-M(108.83±7.96)次、CRCI-L(176.50±2.95)次，咳嗽次数分别减少了79.97％(P＜0.0001)，78.26％(P＜0.0001)，53.46％(P＜0.0001)，24.53％(P＜0.05)，具有统计学意义，PV和CRCI组显著减少小鼠的咳嗽次数。

TNF-α和IL-1β是炎症的关键调节因子。如图5小鼠血清TNF-α测定结果所示，与CMC-Na(1456.44±173.83)pg/mL相比，PV(552.00±79.39)pg/mL、CRCI-H(634.22±44.04)pg/mL、CRCI-M(816.44±25.92)pg/mL、CRCI-L(1200.89±127.54)pg/mL，血清中抗炎因子TNF-α的含量分别减少了62.10％(P＜0.0001)，56.45％(P＜0.0001)，43.94％(P＜0.001)，17.55％(P＞0.05)，PV、CRCI-H、CRCI-M显著减少血清中TNF-α的含量，具有统计学意义，CRCI-L与CMC-Na无显著性差异。

如图6小鼠血清IL-1β测定结果所示，与CMC-Na(324.27±31.04)pg/mL相比，PV(168.20±5.66)pg/mL、CRCI-H(168.59±9.59)pg/mL、CRCI-M(242.12±5.28)pg/mL、CRCI-L(272.71±9.81)pg/mL，血清中抗炎因子IL-1β的含量分别减少了48.13％(P＜0.0001)，48.01％(P＜0.0001)，25.33％(P＜0.001)，15.90％(P＞0.05)，PV、CRCI-H、CRCI-M显著减少血清中IL-1β的含量，具有统计学意义，CRCI-L与CMC-Na无显著性差异。

实验例4：祛痰实验

(1)动物分组及给药

取SPF级4周龄ICR雄性小鼠30只，由中山大学(实验动物中心东校园)提供，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2021-0029。将ICR小鼠分为5组，分别为CRCI-L、CRCI-M、CRCI-H、阳性药物对照组(盐酸氨溴索，AM)、阴性对照组(0.5％羧甲基纤维素钠，CMC-Na)，CRCI-L、CRCI-M、CRCI-H给药剂量分别为0.15g/kg/d、1.5g/kg/d、7.5g/kg/d(相当于生药量1g、10g、50g)，阳性药物对照组给予盐酸氨溴索(AM)15mg/kg，阴性药物对照组给予0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)。所有药物均先溶解于0.5％羧甲基纤维素钠溶液中，根据剂量稀释成所需浓度。给药方式为灌胃给药。

(2)苯酚红标准曲线的配制

精密称取苯酚红0.05g于50mL容量瓶中，用1mol/L氢氧化钠溶液和0.9％氯化钠溶液按照1:15的比例配制成A溶液溶解，定容，作为储备液。用A液稀释成1.75μg/mL、1.50μg/mL、1.25μg/mL、1.00μg/mL、0.75μg/mL、0.50μg/mL、0.25μg/mL、0μg/mL，在紫外-可见光分光光度计上于558.5nm处测定吸光度(A),每次浓度平行测3次，取其平均值，以A的平均值对质量浓度(C)进行线性回归，得到苯酚红标准曲线y＝0.1543x，R²＝0.9998，如图5所示。

(3)模型建立与评价

先适应环境3天，灌胃给药7天，最后一天给药前12h禁食不禁水，最后一天给药0.5h后，以0.2mL/20g剂量腹腔注射5％的苯酚红(w/v生理盐水)，0.5h后，摘眼球取血，脱颈处死，分离气管(自甲状腺软骨下缘处和气管分叉处剪取)至于A液中浸泡超声10min(558.5nm处测吸光度)，血液静置后离心取血清，用于血清炎症因子表达量的检测。苯酚红排泌浓度以苯酚红标准曲线换算得到，祛痰指数为苯酚红排除浓度增加率(Increasingrate％，IR％)。以苯酚红排泌浓度、祛痰指数作为评价祛痰活性效果的指标，血清炎症因子表达量作为广泛抗炎的评价指标。

(3)实验结果

如图8小鼠排痰量测定结果所示，与CMC-Na(0.23±0.05)μg/mL相比，AM(1.79±0.26)μg/mL、CRCI-H(1.11±0.19)μg/mL、CRCI-M(1.06±0.14)μg/mL，祛痰指数分别为678.02％(P＜0.0001)，383.09％(P＜0.05)，361.65％(P＜0.05)，具有统计学意义，AM、CRCI-H、CRCI-M显著增加小鼠的排痰量；CRCI-L(0.90±0.11)μg/mL祛痰指数为292.30％(P＞0.05)，与CMC-Na无显著性差异。

如图9小鼠血清TNF-α测定结果所示，与CMC-Na(344.56±30.15)pg/mL相比，AM(98.19±19.40)pg/mL、CRCI-H(81.39±12.95)pg/mL、CRCI-M(138.78±11.94)pg/mL、CRCI-L(229.11±11.61)pg/mL，血清中抗炎因子TNF-α的含量分别减少了71.50％(P＜0.0001)，76.38％(P＜0.0001)，59.72％(P＜0.0001)，33.51％(P＜0.001)，AM和CRCI-H、CRCI-M、CRCI-L显著减少血清中TNF-α的含量，具有统计学意义。

如图10小鼠血清IL-1β测定结果所示，与CMC-Na(404.58±8.88)pg/mL相比，AM(188.87±7.47)pg/mL、CRCI-H(154.58±20.93)pg/mL、CRCI-M(170.90±29.82)pg/mL、CRCI-L(335.00±11.36)pg/mL，血清中抗炎因子IL-1β的含量分别减少了53.32％(P＜0.01)，61.79％(P＜0.001)，57.76％(P＜0.01)，17.20％(P＞0.05)，AM和CRCI-H、CRCI-M显著减少血清中IL-1β的含量，具有统计学意义，CRCI-L与CMC-Na无显著性差异。

实验例5：抗炎实验

(1)动物分组及给药

取SPF级4周龄ICR雄性小鼠30只，由中山大学(实验动物中心东校园)提供，实验动物生产许可证号：SCXK(粤)2021-0029。将ICR小鼠分为5组，分别为CRCI-L、CRCI-M、CRCI-H、阳性药物对照组(地塞米松，DEXA)、阴性对照组(0.5％羧甲基纤维素钠，CMC-Na)，CRCI-L、CRCI-M、CRCI-H给药剂量分别为0.15g/kg/d、1.5g/kg/d、7.5g/kg/d(相当于生药量1g、10g、50g)，阳性药物对照组给予地塞米松(DEXA)10mg/kg，阴性药物对照组给予0.5％羧甲基纤维素钠(CMC-Na)。所有药物均先溶解于0.5％羧甲基纤维素钠溶液中，根据剂量稀释成所需浓度，给药方式为灌胃给药。

(2)模型建立与评价

先适应环境3天，灌胃给药7天，最后一天给药前12h禁食不禁水，最后一天给药0.5h后，在小鼠右耳前后两侧各涂抹10μL二甲苯，左耳作为对照。0.5h后，摘眼球取血，脱颈处死。将小鼠两耳沿耳廓基线剪掉，用6mm耳打孔器打耳片，称取耳片重量。血液静置后离心取血清，用于血液炎症因子表达量的检测。以耳肿胀程度、炎症抑制率情况作为抗炎药效的评价指标，血清炎症因子表达量作为广泛抗炎的评价指标。

(3)实验结果

如图11为小鼠耳肿胀程度测定结果所示，与CMC-Na(88.80±13.85)％相比，DEXA(47.84±5.14)％、CRCI-H(24.32±4.53)％、CRCI-M(47.92±6.15)％，耳肿胀程度分别减轻了46.13％(P＜0.01)，72.62％(P＜0.0001)，46.04％(P＜0.01)，DEXA和CRCI-H、CRCI-M显著减轻小鼠的耳肿胀程度。CRCI-L(82.02±8.78)％，耳肿胀程度减轻了7.64％(P＞0.05)，无显著性差异。

如图12小鼠血清TNF-α测定结果所示，与CMC-Na(202.19±29.96)pg/mL相比，DEXA(54.33±5.21)pg/mL、CRCI-H(56.67±6.25)pg/mL、CRCI-M(91.33±5.38)pg/mL、CRCI-L(127.33±11.33)pg/mL，血清中抗炎因子TNF-α的含量分别减少了73.13％(P＜0.0001)，71.97％(P＜0.0001)，54.83％(P＜0.0001)，37.02％(P＜0.01)，DEXA和CRCI显著减少血清中TNF-α的含量，具有统计学意义。

如图13小鼠血清IL-1β测定结果所示，与CMC-Na(172.00±20.39)pg/mL相比，DEXA(76.96±1.00)pg/mL、CRCI-H(89.67±6.06)pg/mL、CRCI-M(137.89±9.20)pg/mL、CRCI-L(161.46±5.35)pg/mL，血清中抗炎因子IL-1β的含量分别减少了55.26％(P＜0.0001)，47.86％(P＜0.0001)，19.83％(P＞0.05)，6.13％(P＞0.05)，DEXA和CRCI-H显著减少血清中IL-1β的含量，具有统计学意义，CRCI-M、CRCI-L与CMC-Na无显著性差异。

最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细地说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (10)

1.茶枝柑提取物在制备治疗慢性阻塞性肺疾病药物中的应用。

2.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述茶枝柑提取物的制备方法，包括以下步骤：

S1.将茶枝柑粉碎，过20目筛；

S2.用质量分数为65％～75％的乙醇水溶液对步骤S1的茶枝柑进行超声提取三次，每次提取60～100min，提取液的体积为茶枝柑粉末体积的8～15倍，超声频率为35～50kHz，超声功率为80～150W，提取温度为40～55℃。

3.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述茶枝柑提取物为茶枝柑柑皮提取物或茶枝柑柑胎提取物，其中茶枝柑柑胎提取物效果优于茶枝柑柑皮提取物。

4.柑橘权利要求3所述应用，其特征在于，所述茶枝柑提取物为茶枝柑柑胎提取物。

5.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物包括茶枝柑提取物以及一种或多种药学上可接受的辅料。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述药物用量为单剂量中含有茶枝柑提取物0.1～500g。

7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述药物用量为单剂量中含有茶枝柑提取物0.5～100g。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述药物用量为单剂量中含有茶枝柑提取物1～50g。

9.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述辅料包括：淀粉、可溶性淀粉、微晶纤维素、硬脂酸镁、乳糖、糊精、羟甲基纤维素钠、滑石粉。

10.根据权利要求1所述应用，其特征在于，所述药物为片剂、胶囊剂、颗粒剂、散剂、口服液、冲剂、丸剂。

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