CN115785233A - 奇异变形杆菌的抗原组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于分子生物领域，具体涉及一种奇异变形杆菌的抗原组合物及其应用。本发明通过对被抗血清识别的奇异变形杆菌分离株膜蛋白进行质谱分析和免疫保护评价，鉴定出了具有良好免疫保护性的外膜蛋白(Outer membrane protein，Omp)F、丝氨酸水解酶(Serinehydrolase，SH)，这对于研发奇异变形杆菌多亚单位疫苗具有积极意义。

Description

奇异变形杆菌的抗原组合物及其应用

技术领域

本发明属于分子生物领域，具体涉及一种奇异变形杆菌的抗原组合物及其应用。

背景技术

奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)是一种的革兰氏阴性多态性细菌，广泛分布于自然界，多存在于污染的水、土壤、空气以及人或动物的排泄物之中，能引起机会性致病菌，通常会导致导管相关的尿路感染、伤口感染、胃肠炎，在某些情况下还会导致菌血症。作为一种机会性病原体，奇异变形杆菌是仔猪腹泻的潜在病原菌，是山羊体表淋巴结脓肿的常见分离菌。此外，奇异变形杆菌是常见的食源性病原体。在人口稠密的发展中国家，奇异变形杆菌是引起食物中毒的主要细菌。

多重耐药奇异变形杆菌菌株在全球范围内不断增加，是一种值得关注的公共卫生问题。多重耐药病原菌可能通过食物链或与受感染动物的直接接触传播给人类，其感染难以治疗。疫苗接种是减少奇异变形杆菌感染的有效途径。目前，已有几种奇异变形杆菌抗原得到鉴定。但细菌抗原的时相变化，迫使需要继续寻找针对该菌的新靶点。另外，细菌感染并不依赖于特定的毒力因子，在大多数情况下，单一抗原接种不能引发良好的保护性免疫反应。

因此，作为开发疫苗的基础和前提，开展抗原鉴定及免疫保护研究是很有必要的。

发明内容

本发明通过对被抗血清识别的奇异变形杆菌分离株膜蛋白进行质谱分析和免疫保护评价，鉴定出了具有良好免疫保护性的外膜蛋白(Outer membrane protein，Omp)F、丝氨酸水解酶(Serine hydrolase，SH)，这对于研发奇异变形杆菌多亚单位疫苗具有积极意义。

本发明的目的之一，在于提供一种Proteus mirabilis的抗原组合物，该抗原组合物能诱导机体产生高水平的抗体。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

所述抗原组合物的氨基酸如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

进一步，确定用于表达的OmpF的氨基酸为SEQ ID NO.1。

进一步，确定用于表达的SH的氨基酸为SEQ ID NO.2。

进一步，作为一种优化在SH的表达序列前引入DYKDDDDKGGGGSGGGGS以提高其表达水平。

本发明的目的之二，在于提供一种编码上述抗原组合物的基因。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

所述基因的核苷酸如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示。

进一步，所述的基因为根据大肠杆菌密码子偏好性优化上述氨基酸序列的编码基因。

进一步，编码OmpF的核苷酸为SEQ ID NO.3。

进一步，编码SH的核苷酸为SEQ ID NO.4。

本发明的目的之三，在于提供一种含有上述基因的表达载体。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

所述表达载体为质粒载体或病毒载体。

进一步，所述质粒载体选自pETET-28a。

本发明的目的之四，在于提供一种含有上述的基因或上述的表达载体的基因工程菌。

进一步，所述基因工程菌选自Escherichia coli BL21(DE3)。

本发明的目的之五，在于提供一种上述的基因工程菌株产生的重组蛋白，该重组蛋白具有很强的免疫原性。

进一步，所述重组蛋白以包涵体形式表达。

本发明的目的之六，在于提供一种用上述的重组蛋白制备的抗原。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

所述抗原由所述重组蛋白和铝胶佐剂混合制成。

本发明的目的之七，在于提供一种上述的抗原在制备ELISA试剂盒中的应用。

本发明的有益之处在于：

本发明的提供的重组蛋白免疫原性强，很有希望成为制备奇异变形杆菌疫苗的新靶点。

附图说明

图1为SDS-PAGE分析提取的奇异变形杆菌膜蛋白。

图2为免疫印迹分析奇异变形杆菌抗血清与所提取的奇异变形杆菌膜蛋白的反应性。

图3为OmpF蛋白质跨膜螺旋预测结果。

图4为SH蛋白质跨膜螺旋预测结果。

图5为OmpF蛋白质信号肽预测结果。

图6为SH蛋白质信号肽预测结果。

图7为奇异变形杆菌抗血清识别的重组蛋白。

图8为重组蛋白的纯化结果。

具体实施方式

以下将对本发明的优选实施例进行详细描述。优选实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

本发明实施例中所用的奇异变形杆菌分离株由重庆畜牧科学院兽医兽药研究所保存和提供。

本发明实施例中所用的细菌膜蛋白分离试剂盒购自贝博公司；碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体购自EarthOx LifeSciences；Ni Sepharose High Performance购自GE Healthcare；Quick Start Bradford购自伯乐生命医学产品(上海)有限公司；BCTP/NBT购自上海生工生物工程有限公司；TMB单组分显色液购自索莱宝生物科技有限公司；酶标板购自康宁生命科学(吴江)有限公司；明胶购自广州赛国生物科技有限公司。

本发明实施例中所用的体质量约为25g的雌性SPF昆明小鼠购自重庆腾鑫生物技术有限公司。

实施例1.小鼠感染模型的建立

将奇异变形杆菌单菌落分别接种于LB培养基，37℃振摇培养过夜。将新鲜培养的细菌用PBS进行10倍倍比连续稀释后涂布于平板上，置于37℃培养箱中培养，长成可见菌落后进行平板菌落计数。将不同稀释度的细菌接种小鼠腹腔，测定细菌致死剂量和亚致死剂量。将上述培养物以在注射部位出现组织病变的亚致死剂量接种小鼠，接种途径为腹腔注射。接种后15d采集小鼠血液，分离血清，即为奇异变形杆菌抗血清。血清于-20℃保存。

腹腔注射不同稀释度的奇异变形杆菌，随着细菌数量的降低，小鼠从死亡、注射部位出现化脓及皮肤坏死到不表现出明显症状。注射1×10⁹CFU(Colony-forming unit，菌落形成单位)以上细菌，小鼠死亡率为100％，且在接种后1周内死亡。6×10⁷～7×10⁸CFU对小鼠无致死性，所有小鼠注射部位出现皮肤坏死。5×10⁵CFU以下，所有小鼠注射部位未出现皮肤坏死及死亡。灭菌培养基注射小鼠未出现化脓和皮肤坏死症状，也无死亡。

实施例2.膜蛋白分离提取

使用细菌膜蛋白分离试剂盒分离提取新鲜培养的奇异变形杆菌膜蛋白，具体操作按说明书要求进行。采用SDS-PAGE检测提取的膜蛋白，采用免疫印迹技术分析提取的膜蛋白与奇异变形杆菌抗血清(1:100稀释)的识别反应。

SDS-PAGE显示提取到蛋白质，结果如图1所示，M代表蛋白质相对分子质量标准，1代表膜蛋白。免疫印迹显示所提取的蛋白能与奇异变形杆菌抗血清发生反应，结果如图2所示，M代表蛋白质相对分子质量标准，1代表膜蛋白，呈现多条条带。

实施例3.质谱鉴定与序列分析

切下与奇异变形杆菌抗血清反应的聚丙烯酰胺凝胶上对应的条带，采用LC-MS/MS方法对样品进行质谱分析，将获得的多肽信息进行BLST搜索以获取蛋白质序列信息。将获得的蛋白质进行跨膜螺旋和信号肽预测。

经BLAST搜索，质谱鉴定得到的多肽序列分别与奇异变形杆菌的OmpF或孔道蛋白(Porin)、SH有高同源性，与APB87305(OmpF)、WP_004247605(SH)的同源性为100％，具体信息见表1。如图3、4、5和图6所示，跨膜螺旋和信号肽预测显示这两种蛋白均含有信号肽，为非细胞质蛋白。对表1所示的两种蛋白质的膜外部分进行分析，确定用于表达的OmpF序列为SEQ ID NO.1，确定用于表达的SH序列为SEQ ID NO.2。另外，在SH的表达序列前引入DYKDDDDKGGGGSGGGGS以提高表达水平。

表1蛋白质信息

实施例4.重组蛋白的诱导表达与反应原性分析

根据大肠杆菌密码子偏好性优化蛋白质序列的编码基因，如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。在基因的5’和3’端分别加入BamHⅠ和XhoⅠ限制性内切酶识别位点。采用化学合成法合成基因，将其克隆至pETET-28a构建重组表达载体，转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株中。37℃下振摇培养至菌体浓度达OD600约为1时，加入终浓度0.1mmol/L IPTG，37℃下诱导表达3h。培养物4℃下5 000×g离心10min，沉淀用Tris-HCl(pH8.0)洗涤3次后用Tris-HCl悬浮，冰水浴中超声裂解菌体(超声功率为300W，工作4s间歇5s，超声裂解15min)。取1mL菌体裂解液，12 000×g离心1min，上清和沉淀分别加入SDS-PAGE上样缓冲液，沸水浴10min，进行SDS-PAGE和免疫印迹分析。免疫印迹具体操作为：样品经SDS-PAGE后转印至硝酸纤维素膜上，采用5％脱脂奶粉封闭2h，TBST洗3次后与奇异变形杆菌抗血清(1:100稀释)孵育1h，TBST洗3次后与碱性磷酸酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体(1:3000稀释)孵育1h，TBST洗3次后置BCTP/NBT中显色。预计重组蛋白的分子量约为40和44。两种重组菌株经IPTG诱导表达被超声破碎，其沉淀均能被奇异变形杆菌抗血清识别，如图7所示，M代表蛋白质相对分子质量标准，1代表OmpF，2代表SH，结果表明两种蛋白均以包涵体形式表达，且具有反应原性。

实施例5.重组蛋白质纯化

提取与奇异变形杆菌抗血清有反应的重组蛋白。根据SDS-PAGE分析重组蛋白主要以包含体形式表达。12 000×g离心10min，从菌体裂解液中收集包含体沉淀，用含0.5mol/LNaCl、0.01mol/L EDTA和2％Triton X-100的0.05mol/L Tris-HCl(pH8.0)洗涤后，加入8mol/L尿素以溶解包含体沉淀。12 000×g离心10min，收集上清，上清经0.22μm滤膜过滤后加入至处理好的Ni Sepharose介质以吸附重组蛋白，用含20mmol/L咪唑、0.5mol/L NaCl、8mol/L尿素的0.02mol/L Tris-HCl(pH8.0)洗杂蛋白，用含150mmol/L咪唑、0.5mol/LNaCl、8mol/L尿素的0.02mol/L Tris-HCl(pH8.0)洗脱结合的重组蛋白。纯化产物进行SDS-PAGE检测。

SDS-PAGE显示，采用Ni Sepharose介质从重组菌株培养物中纯化得到OmpF和SH，结果如图8所示，M代表蛋白质相对分子质量标准，1代表OmpF，2代表SH。

实施例6.小鼠免疫试验

将纯化的重组蛋白与铝胶佐剂混合均匀，制备抗原。腿部肌肉注射，0.2mL/只小鼠，蛋白剂量为10μg/只，每间隔2周免疫1次，共免疫3次。每种重组蛋白免疫15只小鼠。对照组小鼠15只，肌肉注射PBS，0.2mL/只。第3次免疫15天后，采集眶前静脉血液，分离血清，采用间接ELISA方法测试特异性抗体水平。

制备重组蛋白包被的酶标板。具体方法为：采用pH9.6的碳酸盐缓冲液稀释抗原至0.2μg/mL，将抗原稀释液加入96孔酶标板孔中，每孔100μL；4℃包被过夜；弃去包被液，每孔加入200μL PBST洗涤3次，拍尽孔中残留液体，每孔加入200μL 2％明胶溶液，37℃封闭2h；弃去封闭液，每孔加入200μL PBST洗涤3次，拍尽孔中残留液体，备用。

将免疫小鼠、对照小鼠血清进行1:100稀释，加入包被酶标板孔中，每孔100μL，37℃孵育1h。弃去血清稀释液，每孔加入200μL PBST洗涤3次，拍尽孔中残留液体，每孔加入100μL辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG抗体(1:20 000)稀释液，37℃孵育1h。弃去酶标抗体稀释液，每孔加入200μL PBST洗涤3次，拍尽孔中残留液体，每孔加入100μL TMB单组分显色液，室温反应10min，每孔加入50μL 2mol/L硫酸溶液以终止反应，使用酶标仪测定波长450nm孔中吸光度(A_450nm)。

在第3次免疫15天后，采用间接ELISA方法测试免疫小鼠特异性抗体水平，结果显示，所有免疫小鼠均产生针对OmpF或SH的高水平抗体，结果如表2所示。

表2间接ELISA测得的小鼠血清抗体的A_450nm

实施例7.免疫保护作用测定

产生抗体的小鼠被腹腔接种致死剂量的奇异变形杆菌，计算小鼠存活率以评估抗原的免疫保护率。

在接种后1个月内，对照组小鼠全部死亡；15只OmpF免疫小鼠无死亡，其中9只在细菌接种部位出现皮肤坏死，保护率为100％；15只SH免疫小鼠死亡2只，其中5只在细菌接种部位出现皮肤坏死，保护率为86.67％。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.Proteus mirabilis的抗原组合物,其特征在于，所述抗原组合物的氨基酸如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。

2.编码权利要求1所述的抗原组合物的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸如SEQ IDNO.3和SEQ ID NO.4所示。

3.含有权利要求2所述的基因的表达载体，其特征在于，所述表达载体为质粒载体或病毒载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于，所述质粒载体选自pETET-28a。

5.含有权利要求2所述的基因或权利要求3-4所述的表达载体的基因工程菌。

6.根据权利要求5所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌选自Escherichiacoli BL21(DE3)。

7.权利要求5-6所述的基因工程菌株产生的重组蛋白。

8.根据权利要求7所述的重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白以包涵体形式表达。

9.用权利要求7-8所述的重组蛋白制备的抗原，其特征在于，所述抗原由所述重组蛋白和铝胶佐剂混合制成。

10.权利要求9所述的抗原在制备用于检测Proteus mirabilis的ELISA试剂盒中的应用。

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