CN115779137A - 一种互穿网络纤维蛋白凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种互穿网络纤维蛋白凝胶，是结构中同时存在三维立体的纤维蛋白交联网络和三维立体的温敏凝胶网络的固态水凝胶，且所述的纤维蛋白交联网络和温敏凝胶网络形成互穿网络结构。本发明还提供用于制备所述的互穿网络纤维蛋白凝胶的原料组合物和试剂盒。本发明所述原料组合物直接应用在出血伤口上时，可即刻形成纤维蛋白凝块，初步封堵伤口；同时高效促凝血；温敏材料接触体温时响应温度变化交联形成具有强湿组织粘附力的温敏凝胶，强化封闭伤口效果，从而可带来优异的快速凝止血效果。本发明还提供制备所述原料组合物及凝胶的方法。

Description

一种互穿网络纤维蛋白凝胶及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于生物医药材料领域，尤其涉及用于意外创伤和手术出血的互穿网络纤维蛋白凝胶粘合剂，及其制备方法和应用。

背景技术

创伤后或手术期间发生的无法控制的出血是全球死亡的主要原因，每年造成超过200万人死亡。手术和创伤环境中不受控制的出血通常会致并发症和不良的结果。因此，控制出血量是降低并发症和死亡率、改善患者预后的重要措施。

目前已经开发了一些局部止血材料来辅助控制手术过程中的出血。市面上常用的外科手术密封剂包括纤维蛋白胶和合成组织粘合剂。纤维蛋白胶是最广泛使用的止血剂，具有较好的生物相容性，可辅助各种外科手术中的止血，模拟凝血级联反应，在出血部位原位形成纤维蛋白凝块，封堵出血。然而纤维蛋白胶的黏附强度会受到持续的组织张力和血液的影响而下降，易被血流冲走，不利于发挥其止血性能，且因在湿态组织上的粘附差而限制了其止血效果。另一方面，合成的组织粘合剂如氰基丙烯酸酯粘合剂，尽管具有较好的粘合能力，但因其高细胞毒性和难去除性而限制了其应用。

近年来，温度敏感型聚合物作为组织修复的载体已成为功能材料和生物医学领域的研究热点。该类聚合物可以响应温度变化而发生体积相变或溶胶-凝胶转变，因此它们在室温下处于自由流动的溶胶状态，但在接近体温时处于凝胶状态。温敏水凝胶可用于注射，且能在体温作用下原位凝固，可避免创伤或外科手术过程中的高度创伤性，能加速伤口愈合、减少病人痛苦等。当此类水凝胶用于修复复杂形状的组织时，具备自适应性、可体温固化等一般水凝胶无可比拟的优势。但在目前的研究中，温敏凝胶多用于组织修复或注射给药系统的载体，在止血方向的研究很少。Ohya S等人将聚N-异丙基丙烯酰胺接枝到明胶上，用于止血研究(Ohya S,Sonoda H,et al.The potential of poly(N-isopropylacrylamide)(PNIPAM)-grafted hyaluronan and PNIPAM-grafted gelatin inthe control of post-surgical tissue adhesions.Biomaterials.2005.26(6):655-9.)。该论文中报道的止血时间为1分钟，止血时间长，且形成的弹性凝胶粘附性差，这必然导致止血效果差。Hou等人的研究通过复合的儿茶酚-Fe³⁺和N-异丙基丙烯酰胺-甲基丙烯酰基的整体交联，开发了一种多功能可注射明胶粘合的粘合剂互穿网络水凝胶，用于闭合皮肤切口、治愈感染伤口和促进组织再生(Hou M,Wang X,et al.Development of amultifunctional injectable temperature-sensitive gelatin-based adhesivedouble-network hydrogel.Biomater Adv.2022.134:112556.)。该论文中报道的止血时间为150s左右，止血时间长，止血效果差。止血效果差是因为，1)水凝胶不参与凝血反应，不具有促凝血功能；2)N-异丙基丙烯酰胺的温度响应速度慢，在N-异丙基丙烯酰胺完成凝胶转化之前，形成的儿茶酚-Fe³⁺交联不足以封堵伤口。因此难以满足手术中大量出血时的快速止血需求。

总之，现有技术中，虽然纤维蛋白胶具有很短的凝胶时间(1～2s内)，但机械强度差和在湿态组织上的粘附差而限制了其止血效果。基于温敏材料的水凝胶虽然具有强湿组织粘附力，但温度响应时间长，不能满足大出血时的快速凝血需求。

理想的止血材料应该不依赖于机体凝血机制，甚至当机体凝血障碍时亦可发挥止血作用，同时兼具较好的湿润组织粘附能力和理想的凝血止血速度。因此，发明一种可以解决现有止血材料所存在的湿态组织黏附差和止血效果局限的新型止血材料显得尤为重要。

发明内容

为了克服现有技术中存在的上述缺点，本发明的首要目的在于：提供一种可快速止血、快速凝胶化、具有高粘附性的粘合剂，以期可同时达到促凝血和强粘附效果。

本发明另一个目的在于：提供制备所述粘合剂的方法。

本发明再一个目的在于：提供使用所述粘合剂止血的方法。

为了实现上述目的，本发明采取以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种互穿网络纤维蛋白凝胶，即一种纤维蛋白粘合剂，它是一种由具有封闭功能的网络结构和具有粘附功能的网络结构组成的固态水凝胶；所述具有封闭功能的网络结构先于具有粘附功能的网络结构形成。所述的具有封闭功能的网络结构是三维立体的纤维蛋白网络，所述的具有粘附功能的网络结构是三维立体的温敏凝胶网络，且所述的纤维蛋白交联网络和温敏凝胶网络形成互穿网络结构。

本发明所述的互穿网络纤维蛋白凝胶中，所述的三维立体的纤维蛋白网络作为支架，可起到增强凝胶的强度的作用，并且其形成的过程可将血液中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白，从而起到初步封堵伤口的作用，随着纤维蛋白比例的升高，固态水凝胶的胶凝时间会缩短、组织粘附力会降低，但凝胶孔隙会变大、且促凝血功能会升高。所述的温敏凝胶网络主要起到提供凝胶的强度和组织粘附力的作用，随着温敏凝胶网络在所述固态水凝胶中比例的升高，固态水凝胶的组织粘附力也升高，但胶凝时间也会延长、凝胶的孔隙会变小、且促凝血功能会降低。鉴于上述两种网络对凝胶整体止血性能带来的影响不同，本发明通过实验进一步优化了凝胶中两种网络的比例，优选的互穿网络纤维蛋白凝胶中，所述的三维立体的纤维蛋白网络与所述的三维立体的温敏凝胶网络的体积比为0.5～3；优选0.5～2；最优选1。在这些优选的体积比下，两种网络能够为凝胶整体带来更优的止血性能，尤其是纤维蛋白网络和温敏凝胶网络的体积比到达1:1时，凝胶的止血性能可达到最佳，即可在提高凝胶强度和粘附力的同时实现快速促凝血。

本发明所述的互穿网络纤维蛋白凝胶中，所述的温敏凝胶网络由温敏材料通过响应温度变化交联形成，所述的温敏材料可以是现有的多种具有热致凝胶化能力的聚合物，所述的聚合物具体可以选自以下任意一种或两种以上的混合物：聚N-异丙基丙烯酰胺、聚乙二醇-聚酯类共聚物、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物。这类聚合物的分子量范围在2～40kDa。所述的聚乙二醇-聚酯类共聚物中，聚乙二醇和聚聚酯类的摩尔比范围优选为1：5～5：1，更优选为1：2；所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中，聚氧乙烯和聚氧丙烯的摩尔比范围优选为1：10～10：1，更优选为7：3；所述的聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物中，聚氧乙烯和聚乳酸羟基乙酸的摩尔比范围优选为1：5～5：1，更优选为1：1。

本发明所述的互穿网络纤维蛋白凝胶中，所述的纤维蛋白网络可以由纤维蛋白原通过酶交联形成。所述的纤维蛋白原可以是人纤维蛋白原、牛纤维蛋白原或猪纤维蛋白原中的任意一种。

第二方面，本发明还提供一种用于制备权利要求1所述的互穿网络纤维蛋白凝胶的原料组合物，包括组合物A和组合物B；所述的组合物A包括温敏材料、酶和水溶性无机钙盐，所述的组合物B包括温敏材料和纤维蛋白原；所述的组合物A和组合物B中的温敏材料质量比为1～4:1；所述组合物B中的温敏材料质量与组合物B中的纤维蛋白原之间的质量比为40～150:30～50；更优选100～150:30～50。所述的组合物A和组合物B中的温敏材料总量与组合物B中的纤维蛋白原之间的质量比为60～300:10～30；更优选80～250:15～25；进一步优选140～225:15～25。

本发明优选的所述原料组合物中，所述的组合物A中温敏材料、酶和水溶性无机钙盐的质量比为50～300:0.14～0.28:1.11～8.88；进一步优选90～300:0.14～0.28:3.33～5.55；更优选130～300:0.14～0.28:3.33～5.55。

本发明优选的所述原料组合物中，所述的组合物A与所述的组合物B质量比为1.4:10～14:1；优选1.4:1～1.4:10；更优选1.4:1～1.4:5；最优选1.4:1。

本发明通过实验发现，所述的原料组合物中，所述的温敏材料和纤维蛋白原的质量比与互穿网络纤维蛋白凝胶的初步封堵伤口效果和粘附强度有关：当温敏材料与纤维蛋白原质量比在1.4:10～1.4:1的范围内时，随着组合物A的比例升高，互穿网络纤维蛋白凝胶的促凝血功能提高，初步封堵伤口效果升高，且粘附强度增大；当组合物A与组合物B质量比在1.4:1～14:1的范围内时，随着组合物A的比例升高，互穿网络纤维蛋白凝胶的促凝血功能、初步封堵伤口效果及粘附强度并未进一步升高。这意味着当组合物A与组合物B质量比为1.4:1时，可取得最佳止血效果，并达到材料最佳利用率。该比例下，交联产生的两种网络的体积比可以达到1:1左右，能够为制得的凝胶带来最优的促凝血功能和粘附强度。

本发明所述的原料组合物中，所述的温敏材料是具有温度响应性的水凝胶材料，可以是现有的多种具有热致凝胶化能力的聚合物，该类聚合物对环境温度十分敏感，当环境温度低于低临界相变温度时，聚合物可溶于水形成自由流动的液体，而当环境温度大于低临界相变温度时，聚合物水溶液形成半固体状态的物理交联凝胶，完成从溶胶到凝胶的相变。理想的温敏材料应具有良好的生物相容性和可降解性，同时兼具较好的机械性能和粘附性能。

本发明优选的原料组合物中，所述的温敏材料具体可以选自以下任意一种或两种以上的混合物：聚N-异丙基丙烯酰胺、聚乙二醇-聚酯类共聚物、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物。这类聚合物的分子量范围在2～40kDa。所述的聚乙二醇-聚酯类共聚物中，聚乙二醇和聚聚酯类的摩尔比范围优选为1：5～5：1，更优选为1：2；所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中，聚氧乙烯和聚氧丙烯的摩尔比范围优选为1：10～10：1，更优选为7：3；所述的聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物中，聚氧乙烯和聚乳酸羟基乙酸的摩尔比范围优选为1：5～5：1，更优选为1：1。

本发明优选的原料组合物中，所述的酶可以选自人凝血酶、重组人凝血酶、牛凝血酶、猪凝血酶或蛇毒血凝酶中的任意一种。

本发明优选的原料组合物中，所述的纤维蛋白原可选自人纤维蛋白原、牛纤维蛋白原或猪纤维蛋白原中的任意一种。

本发明优选的原料组合物中，所述的水溶性无机钙盐优选氯化钙、硝酸钙或硫酸钙；最优选氯化钙。

本发明所述的原料组合物，可以是制药或临床上可接受的多种具体形式，例如可以是冻干粉剂、注射剂、海绵或颗粒。

第三方面，本发明还提供一种制备本发明第一方面所述的互穿网络纤维蛋白凝胶的试剂盒，包括相互独立包装的第一前体试剂、第二前体试剂；按重量份计，所述的第一前体试剂含有50～300份温敏材料、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的第二前体试剂包括30～150份温敏材料和30～50份纤维蛋白原；所述的第一前体试剂与所述的第二前体试剂质量比为1.4:10～14:1；优选1.4:1～1.4:10；更优选1.4:1～1.4:5；最优选1.4:1。

本发明优选的所述试剂盒中，按重量份计，所述的第一前体试剂含有90～300份温敏材料、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的第二前体试剂含有50～150份温敏材料和30～50份纤维蛋白原。

本发明更优选的所述试剂盒中，按重量份计，所述的第一前体试剂含有130～300份温敏材料、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的第二前体试剂含有100～150份温敏材料和30～50份纤维蛋白原。

本发明最优选的所述试剂盒中，按重量份计，所述的第一前体试剂含有200～300份温敏材料、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的第二前体试剂含有100～150份温敏材料和50份纤维蛋白原。

本发明所述的试剂盒中，所述第一前体试剂和第二前体试剂含有的温敏材料可以选自以下任意一种或两种以上的混合物：聚N-异丙基丙烯酰胺、聚乙二醇-聚酯类共聚物、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物。这类聚合物的分子量范围在2～40kDa。所述的聚乙二醇-聚酯类共聚物中，聚乙二醇和聚聚酯类的摩尔比范围优选为1：5～5：1，更优选为1：2；所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中，聚氧乙烯和聚氧丙烯的摩尔比范围优选为1：10～10：1，更优选为7：3；所述的聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物中，聚氧乙烯和聚乳酸羟基乙酸的摩尔比范围优选为1：5～5：1，更优选为1：1。

本发明优选的试剂盒中，所述的第一前体试剂含有的酶可以选自人凝血酶、重组人凝血酶、牛凝血酶、猪凝血酶或蛇毒血凝酶中的任意一种。

本发明优选的所述试剂盒中，第一前体试剂含有的所述的水溶性无机钙盐可选自氯化钙、硝酸钙或硫酸钙；最优选氯化钙。

本发明优选的试剂盒中，所述的第二前体试剂含有的纤维蛋白原可选自人纤维蛋白原、牛纤维蛋白原或猪纤维蛋白原中的任意一种。

本发明优选的试剂盒中，所述的第一前体试剂和/或第二前体试剂中还包含辅料和/或添加剂。所述的辅料选自甘氨酸、盐酸精氨酸、枸橼酸钠、蔗糖、氯化钠中的一种或两种以上。所述的添加剂选自生长因子、白细胞介素、维生素、银离子中的一种或两种以上；所述的生长因子可进一步选自血小板生长因子、表皮生长因子或成纤维细胞生长因子中的一种或多种；所述的白细胞介素可进一步选自白细胞介素2、白细胞介素6或白细胞介素8中的一种或多种；所述的维生素可进一步选自维生素B、维生素C、维生素E或维生素K中的一种或多种。

本发明所述的试剂盒中，所述的第一前体试剂和/或第二前体试剂可以是制药或临床上可接受的多种具体剂型，可以是冻干粉剂、海绵或颗粒。

本发明所述的试剂盒中，还可以进一步包括独立包装的配置用溶剂，所述的配置用溶剂可选为磷酸缓冲盐溶液、HEPES生物缓冲液、0.9％氯化钠溶液、氯化钙溶液或去离子水中的任意一种或几种的混合物。所述配置用溶剂的剂型优选注射剂。

本发明所述的试剂盒中，还可以进一步包括说明书，用于说明所述试剂盒的使用方法。

第四方面，本发明还提供制备本发明第一方面所述的互穿网络纤维蛋白凝胶的方法，包括：制备溶剂中溶解有温敏材料的温敏材料溶液，将温敏材料溶液与含有凝血酶和钙离子的溶液混合得到第一前体溶液，将温敏材料溶液与含有纤维蛋白原的溶液混合得到第二前体溶液，将所述的第一前体溶液和所述的第二前体溶液以1:10～10:1的体积比混合，控制混合后溶液中温敏材料浓度不低于4％(w/v)、纤维蛋白原浓度不低于1％(w/v)、酶活性不低于100IU/ml；将混合后溶液暴露于高于低临界溶解温度条件下，即可得到本发明第一方面所述的互穿网络纤维蛋白凝胶。

本发明优选的制备方法中，控制第一前体溶液和第二前体溶液混合后的溶液中温敏材料浓度不低于8％(w/v)、纤维蛋白原浓度不低于1.5％(w/v)、酶活性不低于250IU/ml；更优选控制温敏材料浓度不低于14％(w/v)、纤维蛋白原浓度不低于1.5％(w/v)、酶活性不低于500IU/ml；更优选控制温敏材料浓度在14～25％(w/v)、纤维蛋白原浓度在1.5～2.5％(w/v)、酶活性不低于500IU/ml。

本发明优选的制备方法中，控制第一前体溶液和第二前体溶液混合后的溶液中温敏材料和纤维蛋白原的浓度比为60～300:10～30；更优选80～250:15～25；进一步优选140～225:15～25。

本发明优选的制备方法中，所述的温敏溶液的制备方法包括：将温敏材料溶于低于低临界溶解温度的溶剂中，控制所得溶液中温敏材料浓度为4％～30％(w/v)。

本发明所述的制备方法中，所述的含有酶和钙离子的溶液，优选按照以下方法制备：将溶剂和水溶性无机钙盐溶液加入酶中，完全溶解后得到含Ca²⁺的酶溶液，控制所得溶液中酶活力为500IU～2000IU/ml、Ca²⁺浓度为60～100mmol/L。

本发明优选的制备方法中，控制所述的第一前体溶液中温敏材料浓度不低于3％(w/v)，更优选不低于6％(w/v)，进一步优选6～30％(w/v)。

本发明优选的制备方法中，控制所述的第一前体溶液中酶活力不低于200IU/ml，优选不低于500IU/ml；更优选不低于1000IU/ml。

本发明优选的制备方法中，控制所述的第一前体溶液中钙离子浓度不低于20mmol/L，优选不低于30mmol/L，更优选不低于40mmol/L。

本发明所述的制备方法中，所述的含有纤维蛋白原的溶液中，纤维蛋白原的浓度优选为5％～10％(w/v)。

本发明优选的制备方法中，控制所述的第二前体溶液中温敏材料浓度不低于2％(w/v)，更优选不低于4％(w/v)，进一步优选4～15％(w/v)。

本发明优选的制备方法中，控制所述的第二前体溶液中纤维蛋白原浓度不低于3％(w/v)，更优选3％-5％(w/v)。

本发明优选的制备方法中，将第一前体溶液与第二前体溶液按照1:5-5:1的体积比混合；更优选按照1:3-3:1的体积比混合；最优选按照1:1的体积比混合。

本发明优选的制备方法中，所述的低临界溶解温度优选15～37℃，更优选为30～37℃。

本发明优选的制备方法中，温敏材料可以选自以下任意一种或两种以上的混合物：聚N-异丙基丙烯酰胺、聚乙二醇-聚酯类共聚物、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物。这类聚合物的分子量范围在2～40kDa。所述的聚乙二醇-聚酯类共聚物中，聚乙二醇和聚聚酯类的摩尔比范围优选为1：5～5：1，更优选为1：2；所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中，聚氧乙烯和聚氧丙烯的摩尔比范围优选为1：10～10：1，更优选为7：3；所述的聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物中，聚氧乙烯和聚乳酸羟基乙酸的摩尔比范围优选为1：5～5：1，更优选为1：1。

本发明优选的制备方法中，所述的第一前体溶液含有的酶可以选自人凝血酶、重组人凝血酶、牛凝血酶、猪凝血酶或蛇毒血凝酶中的任意一种。

本发明优选的所述的制备方法中，所述的第一前体溶液含有的所述的水溶性无机钙盐可选自氯化钙、硝酸钙或硫酸钙；最优选氯化钙。

本发明优选的所述制备方法中，所述的第二前体溶液含有的纤维蛋白原可选自人纤维蛋白原、牛纤维蛋白原或猪纤维蛋白原中的任意一种。

第五方面，本发明还提供制备本发明第三方面所述的试剂盒的方法，包括：将第四方面制备的第一前体溶液和第二前体溶液分别进行冷冻干燥，得到第一前体试剂和第二前体试剂；将第一前体试剂和第二前体试剂以1.4:10～14:1，优选1.4:1的质量比，分别独立包装；将配置用溶剂独立包装；最后将独立包装的第一前体试剂、第二前体试剂和配置用溶剂组合包装得到本发明第三方面所述的试剂盒。

本发明所述的制备方法中，所述的第一前体试剂和/或第二前体试剂是冻干剂、海绵或颗粒；所述的配置用溶剂为注射剂。

第六方面，本发明还提供本发明所述的原料组合物或试剂盒在制备原位快凝止血材料中的应用。

所述的原料组合物的应用包括：将所述的原料组合物中的组合物A和组合物B分别制备成可注射溶液状，然后同时均匀的注射或喷涂于出血伤口部位，在高于低临界溶解温度条件下，可在出血伤口部位原位快速形成固态水凝胶。

所述的试剂盒的应用包括：利用配置用溶剂将所述的第一前体试剂和第二前体试剂分别制备成可注射溶液状，然后同时均匀的注射或喷涂于出血伤口部位，在高于低临界溶解温度条件下，可在出血伤口部位原位快速形成固态水凝胶。

本发明所述的应用中，所述的出血伤口包括由于意外创伤导致或手术中发生的器官出血；所述的器官可以是肝脏、脾脏、肾脏、胃肠、心脏或皮肤。

本发明所述的应用中，在出血伤口注射所述的试剂盒时，(1)可瞬间(1s左右)在伤口表面形成纤维蛋白凝块，起到初步封堵伤口的作用，阻挡血液流出，从而弥补温敏材料在凝胶转化完成前的弱封堵作用；(2)同时，纤维蛋白凝块中的酶将血液中的纤维蛋白原转化为凝块，起到高效促凝血功能；(3)同时，温敏材料响应温度变化，快速发生溶胶-凝胶的转化，提供强粘附。温敏凝胶具有较快的凝胶转化能力和较强的粘附力，可以抵挡血流的冲击并保护纤维蛋白交联免被血液冲走。因此本发明结合纤维蛋白交联的即刻发生和温敏凝胶的强粘附力，设计了一种双组分纤维蛋白凝胶，该双组分纤维蛋白凝胶具有纤维蛋白网络交联和温敏凝胶结构，且所述的纤维蛋白交联网络和温敏凝胶网络形成互穿网络结构。

相对于现有技术，本发明的优点在于：快速凝胶化、固化速度快、强湿组织粘附力、止血效果佳：

(1)本发明的互穿网络纤维蛋白凝胶可即刻(1s左右)发生纤维蛋白交联，起到初步封堵作用，阻挡血流冲击。

(2)本发明的互穿网络纤维蛋白凝胶中的酶可将血液中的纤维蛋白原转化为纤维蛋白交联，具有高效促凝血能力。

(3)本发明互穿网络纤维蛋白凝胶中的温敏材料在体温作用下，可在20秒内发生溶胶-凝胶转化，形成温敏水凝胶，提供强湿组织粘附力，可保护纤维蛋白交联免被血流冲走；

正是由于本发明提供的互穿网络纤维蛋白凝胶具有很好的促凝血功能、固化速度、湿组织粘附力和快速止血效果，因此可用于意外创伤或手术中的肝脏、脾脏、肾脏、心脏、胃肠和皮肤出血的止血应用。

附图说明

图1是对比例1的纤维蛋白交联的SEM图。

图2是对比例2的前体溶交联后的SEM图。

图3是实施例1的互穿网络纤维蛋白凝胶的SEM图。

图4体现了实施例1及对比例1～4在止血时间上的比较。

图5体现了实施例1及对比例1～4在失血量上的比较。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明要解决的技术问题、技术方案和有益效果进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前体下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。

本发明提供一种互穿网络纤维蛋白凝胶，它是一种纤维蛋白粘合剂，是结构中同时存在三维立体的纤维蛋白交联网络和三维立体的温敏凝胶网络的固态水凝胶，所述的纤维蛋白交联网络和温敏凝胶网络形成互穿网络结构。所述的三维立体的纤维蛋白网络与所述的三维立体的温敏凝胶网络的体积比为0.5～3；优选0.5～2；最优选1。

所述的温敏凝胶网络是由温敏材料通过响应温度变化交联形成，温敏材料是具有温度响应性的水凝胶材料，可以是现有的多种具有热致凝胶化能力的聚合物，该类聚合物对环境温度十分敏感，当环境温度低于低临界相变温度时，聚合物可溶于水形成自由流动的液体，而当环境温度大于低临界相变温度时，聚合物水溶液形成半固体状态的物理交联凝胶，完成从溶胶到凝胶的相变。

所述的纤维蛋白网络是由纤维蛋白原在酶的作用下通过酶交联反应形成。

所述的互穿网络纤维蛋白凝胶原料组合物可按照以下方法制备得到：

(1)组合物A溶液的制备：将含钙离子的酶溶液加入溶解有温敏材料的溶液中，均匀混合后，得到组合物A溶液，包含温敏材料和酶；控制所得组合物A溶液中温敏材料浓度不低于3％(w/v)，优选不低于6％(w/v)，更优选6％-30％(w/v)；同时控制酶活力不低于200IU/mL，优选不低于500IU/mL，更优选不低于1000IU/mL。

(2)组合物B溶液的制备：将纤维蛋白原溶液加入溶解有温敏材料的溶液中，均匀混合后，得到组合物B溶液：包含温敏材料和纤维蛋白原。控制所得组合物B溶液中温敏材料浓度不低于2％(w/v)，优选不低于4％(w/v)，更优选4％-15％(w/v)；同时控制纤维蛋白原浓度不低于3％(w/v)，优选3％-5％(w/v)。

(3)储存方法：将得到的组合物A溶液和组合物B溶液按体积比为1：10～10：1分别进行冷冻干燥，成为海绵状后进行储存。

(4)使用上述冻干海绵制备互穿网络纤维蛋白凝胶：将海绵状A组分和海绵状B组分分别溶于溶剂中，得到可注射溶液状A组分和B组分。将等体积的A组分溶液和B组分溶液均匀的注射/喷涂于出血部位，在高于低临界溶解温度条件下，可在出血部位原位快速形成固态水凝胶。作为优选方案，所述的可注射溶液在使用时的注射工具为双联注射器、注射器、巴氏吸管。

上述制备方案中，所述的溶剂可选为磷酸缓冲盐溶液、HEPES生物缓冲液、0.9％氯化钠溶液、氯化钙溶液或去离子水中任意一种或几种的组合，且其使用量没有特别限制，可以根据实际需要浓度进行配制。

基于上述实施方式，本发明进一步列举以下实施例予以说明。

实施例1

制备一种互穿网络纤维蛋白凝胶，即一种可注射温敏纤维蛋白凝胶，具体原料及步骤如下：

(1)聚N-异丙基丙烯酰胺溶液的制备：将聚N-异丙基丙烯酰胺在室温下溶解于0.9％氯化钠溶液中，得到两种质量体积百分比(w/v)的聚N-异丙基丙烯酰胺溶液：26％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺、12％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺；

(2)凝血酶溶液的制备：将所需体积和所需浓度的氯化钙溶液注射入凝血酶中，完全溶解后，得到凝血酶活力为2000IU/mL的凝血酶溶液，其中Ca²⁺浓度为80mmol/L；

(3)纤维蛋白原溶液的制备：取所需重量的纤维蛋白原，缓慢置于预热的0.9％氯化钠溶液中，完全溶解后，得到质量体积百分比(w/v)为10％(w/v)的纤维蛋白原溶液。

(4)A组分溶液的制备：将步骤(2)得到的凝血酶溶液加入步骤(1)得到的26％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺溶液中，均匀混合后，得到A组分溶液：13％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺-1000IU/mL凝血酶的混合溶液；

(5)B组分溶液的制备：将步骤(3)得到的纤维蛋白原溶液加入步骤(1)得到的12％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺溶液中，均匀混合后，得到B组分溶液：6％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺-5％(w/v)纤维蛋白原的混合溶液；

(6)储存：将得到的A组分溶液和B组分溶液按照体积比为1：1的比例分别进行冷冻干燥，以海绵状进行储存；

(7)使用方法：将海绵状A组分和B组分按照1：1的体积份额比例分别溶于含有0.9％氯化钠的溶液中，得到可注射溶液状的A组分和B组分。将A组分溶液和B组分溶液等体积的装入双联注射器，A组分溶液和B组分溶液通过喷头注射/喷涂在出血部位，在高于低临界溶解温度条件下(体温)，可在出血部位原位快速形成固态水凝胶。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联与温敏材料交联的体积比例为1：1。

本实施例所得的固态水凝胶微观结构如图3所示：具有纤细丝网状的纤维蛋白交联网络结构和类似蜂窝状的聚N-异丙基丙烯酰胺的多孔网络结构，且纤维蛋白交联网络中和聚N-异丙基丙烯酰胺交联的多孔结构互相穿插。所述的纤维蛋白网络先于聚N-异丙基丙烯酰胺的多孔网络结构形成，并起支架作用；后面形成的聚N-异丙基丙烯酰胺的多孔网络结构包裹在纤维蛋白网络上。

实施例2

制备浓度为9％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺-1000IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备6％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处在于：A组分溶液的聚N-异丙基丙烯酰胺浓度为9％(w/v)。

实施例3

制备浓度为6％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺-1000IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备6％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处在于：A组分溶液的聚N-异丙基丙烯酰胺浓度为6％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联与温敏材料交联的体积比例为2：1。

实施例4

制备浓度为13％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺-1000IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备4％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处在于：B组分溶液的聚N-异丙基丙烯酰胺浓度为4％(w/v)。

实施例5

制备浓度为13％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺-500IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备6％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处在于：A组分溶液的凝血酶活力为500IU/mL。

实施例6

制备浓度为13％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺-1000IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备6％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺-3％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处在于：B组分溶液的纤维蛋白原浓度为3％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联和温敏材料交联的体积比为1：2。

实施例7

制备浓度为20％(w/v)聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物-1000IU/mL凝血酶溶液的混合溶液作为A组分溶液，制备10％(w/v)聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处在于：A和B组分中的温敏材料为聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物，且A组和B组中的温敏材料浓度分别为20％(w/v)和10％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联和温敏材料交联的体积比为1：1。

实施例8

制备浓度为15％(w/v)聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物-1000IU/mL凝血酶溶液的混合溶液作为A组分溶液，制备10％(w/v)聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液。其制备方法和使用方法与实施例7大体相同，不同之处在于：A组分溶液的聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物浓度为15％(w/v)。

实施例9

制备浓度为10％(w/v)聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物-1000IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备10％(w/v)聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液。其制备方法和使用方法与实施例7大体相同，不同之处在于：A组分溶液的聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物浓度为10％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联与温敏材料交联的体积比例为2：1。

实施例10

制备浓度为20％(w/v)聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物-1000IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备5％(w/v)聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例7大体相同，不同之处在于：B组分溶液的聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物浓度为5％(w/v)。

实施例11

制备浓度为20％(w/v)聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物-500IU/ml凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备10％(w/v)聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例7大体相同，不同之处在于：A组分溶液的凝血酶活力为500IU/ml。

实施例12

制备浓度为20％(w/v)聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物-1000IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备10％(w/v)聚乙二醇-聚乳酸-羟基乙酸共聚物-3％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例7大体相同，不同之处在于：B组分溶液的纤维蛋白原浓度为3％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联和温敏材料交联的体积比例为1：2。

实施例13

制备浓度为30％(w/v)泊洛沙姆-1000IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备15％(w/v)泊洛沙姆-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处在于：A和B组分中的温敏材料为泊洛沙姆，且A组和B组中的温敏材料浓度分别为30％(w/v)和15％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联和温敏材料交联的体积比为1：1。

实施例14

制备浓度为25％(w/v)泊洛沙姆-1000IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备15％(w/v)泊洛沙姆-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液。其制备方法和使用方法与实施例13大体相同，不同之处在于：A组分溶液的泊洛沙姆浓度为25％(w/v)。

实施例15

制备浓度为20％(w/v)泊洛沙姆-1000IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备15％(w/v)泊洛沙姆-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液。其制备方法和使用方法与实施例13大体相同，不同之处在于：A组分溶液的泊洛沙姆浓度为20％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联与温敏材料交联的体积比例为2：1。

实施例16

制备浓度为30％(w/v)泊洛沙姆-1000IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备10％(w/v)泊洛沙姆-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例13大体相同，不同之处在于：B组分溶液的泊洛沙姆浓度为10％(w/v)。

实施例17

制备浓度为30％(w/v)泊洛沙姆-500IU/ml凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备15％(w/v)泊洛沙姆-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例13大体相同，不同之处在于：A组分溶液的凝血酶活力为500IU/ml。

实施例18

制备浓度为30％(w/v)泊洛沙姆-1000IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备15％(w/v)泊洛沙姆-3％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例13大体相同，不同之处在于：B组分溶液的纤维蛋白原浓度为3％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联和温敏材料交联的体积比例为1：2。

实施例19

制备浓度为18％(w/v)聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物-1000IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备10％(w/v)聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例1大体相同，不同之处在于：A和B组分中的温敏材料为聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物，且A组和B组中温敏材料的浓度分别为18％(w/v)和10％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联和温敏材料交联的体积比为1：1。

实施例20

制备浓度为12％(w/v)聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物-1000IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备10％(w/v)聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液。其制备方法和使用方法与实施例19大体相同，不同之处在于：A组分溶液的聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物浓度为12％(w/v)。

实施例21

制备浓度为6％(w/v)聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物-1000IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备10％(w/v)聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液。其制备方法和使用方法与实施例19大体相同，不同之处在于：A组分溶液的聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物浓度为6％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联与温敏材料交联的体积比例为2：1。

实施例22

制备浓度为18％(w/v)聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物-1000IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备5％(w/v)聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例19大体相同，不同之处在于：B组分溶液的聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物浓度为5％(w/v)。

实施例23

制备浓度为18％(w/v)聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物-500IU/ml凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备10％(w/v)聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物-5％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例19大体相同，不同之处在于：A组分溶液的凝血酶活力为500IU/ml。

实施例24

制备浓度为18％(w/v)聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物-1000IU/mL凝血酶的混合溶液作为A组分溶液，制备10％(w/v)聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物-3％(w/v)纤维蛋白原混合溶液作为B组分溶液，其制备方法和使用方法与实施例19大体相同，不同之处在于：B组分溶液的纤维蛋白原浓度为3％(w/v)。且此时得到的凝胶中，纤维蛋白交联和温敏材料交联的体积比例为1：2。

对比例1

外用冻干纤维蛋白粘合剂(护固莱士，购于上海莱士)，包括酶试剂和纤维蛋白原试剂。将酶试剂和纤维蛋白原试剂按其说明书分别配制成溶液，混合后约1s完成酶交联得到纤维蛋白粘合剂，该粘合剂微观结构如图1所示。

对比例2

10％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺溶液，其制备方法与实施例1的步骤(1)基本相同。

对比例3

13％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺-1000IU/mL凝血酶溶液，其制备方法与实施例1的步骤(4)相同。

对比例4

6％(w/v)聚N-异丙基丙烯酰胺-5％(w/v)纤维蛋白原溶液，其制备方法与实施例1的步骤(5)相同。

性能测试

为验证实施例1～24得到的互穿网络纤维蛋白凝胶及对比例1～4水凝胶的性能，下面分别对其进行胶凝时间性能测试、粘附强度测试和动物止血实验。

胶凝时间测试

检测对象：

本发明实施例1～24，以及对比例1-4；

检测方法：

对实施例1～24及对比例1～4采用试管倒置法检测凝胶相变时间，来比较其胶凝时间，其结果见表1。取2ml与液体状态的水凝胶至西林瓶中，并将西林瓶置于30-37℃恒温水浴锅中，观察混合液的变化。将西林瓶倒置后，溶液不再流动，则认为该溶液形成水凝胶，所需的最短时间为凝胶化时间。

粘附强度测试

本发明实施例1～24，以及对比例1～4；

检测方法：

具体操作：将猪皮切成40毫米×20毫米的长方形，两片猪皮间用500μl的实施例1～24及对比例1～4进行粘合，粘合时将实施例1～24及对比例2～4置于30～37℃的温度中。之后以1mm/min的应变速率进行粘合强度的测试。记录凝胶从猪皮脱落时的读数，即为粘附强度(Kpa)。检测结果见表1。

止血效果测试

检测对象：

本发明实施例1、实施例7、实施例13、实施例19，以及对比例1～4；

检测方法：

兔肝表面1cm切口出血模型：将新西兰大白兔麻醉后，暴露腹部，固定在手术台，腹部正中切口，暴露肝脏，在肝脏上造1cm*0.5cm的出血模型；分别用已称重的滤纸、本发明各实施例(实施例1、7、13、19)的A组分和B组分的混合溶液、以及对比例1～4的前体溶液作为止血材料覆盖在出血部位，直至出血停止，记录出血时间(n＝5)和失血量(n＝5)，其结果见表1、图4和图5。

表1

止血时间和失血量的数值用(均值±标准差)来表示。

结果分析：

对比例1交联后形成的凝胶微观结构如图1所示；对比例2的前体溶液交联后形成的凝胶微观结构如图2所示；实施例1的A组分溶液和B组分溶液混合交联后形成的凝胶微观结构如图3所示。

由图1可知，对比例1的纤维蛋白胶粘合剂原料只能获得纤维蛋白交联后的网状结构。由图2可知，对比例2的前体溶液得到的凝胶中只有聚N-异丙基丙烯酰胺的交联形成的多孔网络结构。由图3可知，实施例1制得的温敏纤维蛋白凝胶具有纤维蛋白交联的网状结构和聚N-异丙基丙烯酰胺交联的多孔结构，且这两种交联结构相互穿插。

由表1可知，实施例1～24的胶凝时间范围为1～2s，在温敏材料种类相同的情况下，凝胶的胶凝时间随着纤维蛋白交联比例的降低、温敏材料浓度升高而延长，但实施例1～24所选择的所有种类的温敏材料在特定的混合比例下，胶凝时间均显著低于对比例2-4的胶凝时间(对比例2的胶凝时间为20s，对比例3的胶凝时间为17s，对比例4的胶凝时间为28s)。

由表1可知，实施例1～24的粘附强度范围为23～46kPa，在温敏材料种类相同的情况下，凝胶的粘附强度会随着温敏材料浓度的降低而减小，但实施例1～24所选择的所有种类的温敏材料在特定的混合比例下，粘附强度均高于各对比例1、2、4的粘附强度(对比例1的粘附强度为6kPa，对比例2的粘附强度为20kPa，对比例4的粘附强度为16kPa)，虽然本发明部分实施例的粘附强度可能与对比例3的粘附强度28kPa相当，但是对应的胶凝时间显著低于对比例3。

由表1和图4、图5可知，本发明实施例1、实施例7、实施例13和实施例19制备的凝胶的止血时间为13～32s，均显著低于各对比例的44s以上的止血时间。实施例1、实施例7、实施例13和实施例19制备的凝胶的平均失血量在26～70mg，均显著低于对比例的80～160mg的平均失血量。

总之，本发明的互穿网络纤维蛋白凝胶，应用在出血伤口时，可即刻(1s左右)形成纤维蛋白凝块，起到“初步”封堵伤口作用，阻挡血液流出；同时，纤维蛋白凝块中的酶将血液中的纤维蛋白原转化凝块，起到高效的促凝血效果；同时，温敏材料响应温度变化形成温敏凝胶，温敏凝胶具有强湿组织粘附力，起到“强”封闭伤口效果。纤维蛋白交联和温敏材料交联结构相互作用，兼具初步封堵伤口和强组织粘附功能，从而达到优异的止血效果。

以上对本发明的具体实施例进行了详细介绍。需要理解的是，本发明并不局限于特定实施方式，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何变形或修改、等同替换和改进等，并不影响本发明的实质内容，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims (31)

1.一种互穿网络纤维蛋白凝胶，它是一种由具有封闭功能的网络结构和具有粘附功能的网络结构组成的固态水凝胶；所述的具有封闭功能网络结构是三维立体的纤维蛋白网络，所述的具有粘附功能网络结构是三维立体的温敏凝胶网络，且所述的纤维蛋白网络和温敏凝胶网络形成互穿网络结构。

2.权利要求1所述的互穿网络纤维蛋白凝胶，其特征在于：所述的纤维蛋白网络先于温敏凝胶网络形成，并起支架作用；后面形成的温敏凝胶包裹在纤维蛋白网络上。

3.权利要求1所述的互穿网络纤维蛋白凝胶，其特征在于：所述的三维立体的纤维蛋白网络与所述的三维立体的温敏凝胶网络的体积比为0.5～3；优选0.5～2；最优选1。

4.权利要求1所述的互穿网络纤维蛋白凝胶，其特征在于：所述的温敏凝胶网络由温敏材料通过响应温度变化交联形成，所述的温敏材料选自以下任意一种或两种以上的混合物：聚N-异丙基丙烯酰胺、聚乙二醇-聚酯类共聚物、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物；优选的所述聚乙二醇-聚酯类共聚物中，聚乙二醇和聚聚酯类的摩尔比为1：5～5：1，更优选为1：2；优选的所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中，聚氧乙烯和聚氧丙烯的摩尔比为1：10～10：1，更优选为7：3；优选的所述的聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物中，聚氧乙烯和聚乳酸羟基乙酸的摩尔比为1：5～5：1，更优选为1：1。

5.权利要求1所述的互穿网络纤维蛋白凝胶，其特征在于：所述的纤维蛋白网络可以由纤维蛋白原通过酶交联形成；所述的纤维蛋白原是人纤维蛋白原、牛纤维蛋白原或猪纤维蛋白原中的任意一种；所述的酶选自人凝血酶、重组人凝血酶、牛凝血酶、猪凝血酶或蛇毒血凝酶中的任意一种。

6.一种用于制备权利要求1-5任意一项所述的互穿网络纤维蛋白凝胶的原料组合物，包括组合物A和组合物B；所述的组合物A包括温敏材料、酶和水溶性无机钙盐，所述的组合物B包括温敏材料和纤维蛋白原；所述的组合物A和组合物B中的温敏材料质量比为1～4:1；所述组合物B中的温敏材料质量与组合物B中的纤维蛋白原之间的质量比为40～150:30～50；优选100～150:30～50；所述的组合物A和组合物B中的温敏材料总量与组合物B中的纤维蛋白原之间的质量比为60～300:10～30；优选80～250:15～25；进一步优选140～225:15～25。

7.权利要求6所述的原料组合物，其特征在于：所述的组合物A中温敏材料、酶和水溶性无机钙盐的质量比为50～300:0.14～0.28:1.11～8.88；优选90～300:0.14～0.28:3.33～5.55；更优选130～300:0.14～0.28:3.33～5.55。

8.权利要求6所述的原料组合物，其特征在于：所述的组合物A与所述的组合物B质量比为1.4:10～14:1；优选1.4:1～1.4:10；更优选1.4:1～1.4:5；最优选1.4:1。

9.权利要求6～8任意一项所述的原料组合物，其特征在于：所述的温敏材料具体选自以下任意一种或两种以上的混合物：聚N-异丙基丙烯酰胺、聚乙二醇-聚酯类共聚物、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物或聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物；优选的所述的聚乙二醇-聚酯类共聚物中，聚乙二醇和聚聚酯类的摩尔比为1：5～5：1，更优选为1：2；优选的所述的聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物中，聚氧乙烯和聚氧丙烯的摩尔比为1：10～10：1，更优选为7：3；优选的所述的聚氧乙烯-聚乳酸羟基乙酸共聚物中，聚氧乙烯和聚乳酸羟基乙酸的摩尔比为1：5～5：1，更优选为1：1；所述的酶选自人凝血酶、重组人凝血酶、牛凝血酶、猪凝血酶或蛇毒血凝酶中的任意一种；所述的纤维蛋白原选自人纤维蛋白原、牛纤维蛋白原或猪纤维蛋白原中的任意一种；所述的水溶性无机钙盐选自氯化钙、硝酸钙、或硫酸钙；最优选氯化钙。

10.权利要求6～8任意一项所述的原料组合物，其特征在于：所述的组合物A和组合物B是冻干粉剂、注射剂、海绵或颗粒。

11.一种制备权利要求1-5任意一项所述的互穿网络纤维蛋白凝胶的试剂盒，包括相互独立包装的第一前体试剂、第二前体试剂；按重量份计，所述的第一前体试剂含有50～300份温敏材料、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的第二前体试剂包括30～150份温敏材料和30～50份纤维蛋白原；所述的第一前体试剂与所述的第二前体试剂质量比为1.4:10～14:1；优选1.4:1～1.4:10；更优选1.4:1～1.4:5；最优选1.4:1。

12.权利要求11所述的试剂盒，其特征在于：按重量份计，所述的第一前体试剂含有90～300份温敏材料、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的第二前体试剂含有50～150份温敏材料和30～50份纤维蛋白原；优选的所述试剂盒中，按重量份计，所述的第一前体试剂含有130～300份温敏材料、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的第二前体试剂含有100～150份温敏材料和30～50份纤维蛋白原；最优选的所述试剂盒中，按重量份计，所述的第一前体试剂含有200～300份温敏材料、0.14～0.28份酶和1.11～8.88份水溶性无机钙盐，所述的第二前体试剂含有100～150份温敏材料和50份纤维蛋白原。

13.权利要求14-15任意一项所述的试剂盒，其特征在于：所述的第一前体试剂和/或第二前体试剂是冻干粉剂、海绵或颗粒。

14.权利要求14-15任意一项所述的试剂盒，其特征在于：还包括独立包装的配置用溶剂，所述的配置用溶剂为磷酸缓冲盐溶液、HEPES生物缓冲液、0.9％氯化钠溶液、氯化钙溶液、去离子水中的任意一种或几种的混合物。

15.制备权利要求1-5任意一项所述的互穿网络纤维蛋白凝胶的方法，包括：制备溶剂中溶解有温敏材料的温敏材料溶液，将温敏材料溶液与含有凝血酶和钙离子的溶液混合得到第一前体溶液，将温敏材料溶液与含有纤维蛋白原的溶液混合得到第二前体溶液，将所述的第一前体溶液和所述的第二前体溶液以1:10～10:1的体积比混合得到混合溶液，控制混合后溶液中温敏材料浓度不低于4％(w/v)、纤维蛋白原浓度不低于1％(w/v)、酶活性不低于100IU/ml；将混合后溶液暴露于高于低临界溶解温度条件下，即得到所述的互穿网络纤维蛋白凝胶。

16.权利要求15所述的方法，其特征在于：所述的混合后溶液中，控制温敏材料浓度不低于8％(w/v)、纤维蛋白原浓度不低于1.5％(w/v)、酶活性不低于250IU/ml；优选控制温敏材料浓度不低于14％(w/v)、纤维蛋白原浓度不低于1.5％(w/v)、酶活性不低于500IU/ml；更优选控制温敏材料浓度在14～25％(w/v)、纤维蛋白原浓度在1.5～2.5％(w/v)、酶活性不低于500IU/ml。

17.权利要求15所述的方法，其特征在于：控制所述的混合溶液中温敏材料和纤维蛋白原的浓度比为60～300:10～30；更优选80～250:15～25；进一步优选140～225:15～25。

18.权利要求15所述的方法，其特征在于，所述的温敏材料溶液的制备方法包括：将温敏材料溶于低于低临界溶解温度的溶剂中，控制所得溶液中温敏材料浓度为4％～30％(w/v)。

19.权利要求15所述的方法，其特征在于：控制所述的第一前体溶液中温敏材料浓度不低于3％(w/v)，优选不低于6％(w/v)，进一步优选6～30％(w/v)。

20.权利要求15所述的方法，其特征在于：控制所述的第一前体溶液中酶活力不低于200IU/ml，优选不低于500IU/ml；更优选不低于1000IU/ml。

21.权利要求15所述的方法，其特征在于：控制所述的第一前体溶液中钙离子浓度不低于20mmol/L，优选不低于30mmol/L，更优选不低于40mmol/L。

22.权利要求15所述的方法，其特征在于：所述的含有纤维蛋白原的溶液中，纤维蛋白原的浓度优选为5％～10％(w/v)。

23.权利要求15所述的方法，其特征在于：控制所述的第二前体溶液中温敏材料浓度不低于2％(w/v)，优选不低于4％(w/v)，进一步优选4～15％(w/v)。

24.权利要求15所述的方法，其特征在于：控制所述的第二前体溶液中纤维蛋白原浓度不低于3％(w/v)，更优选3％-5％(w/v)。

25.权利要求15所述的方法，其特征在于：将第一前体溶液与第二前体溶液按照1:5-5:1的体积比混合；优选按照1:3-3:1的体积比混合；最优选按照1:1的体积比混合。

26.权利要求15所述的方法，其特征在于：所述的低临界溶解温度为15～37℃，优选为30～37℃。

27.权利要求6-10任意一项所述的原料组合物在制备原位快凝止血材料中的应用。

28.权利要求27所述的应用，其特征在于：将权利要求6-10任意一项所述的原料组合物中的组合物A和组合物B分别制备成可注射溶液状，然后同时均匀的注射或喷涂于出血伤口部位，在高于低临界溶解温度条件下，在出血伤口部位原位快速形成固态水凝胶。

29.权利要求11～14任意一项所述的试剂盒在制备原位快凝止血材料中的应用。

30.权利要求29所述的应用，其特征在于：利用配置用溶剂将权利要求14～22任意一项所述的第一前体试剂和第二前体试剂分别制备成可注射溶液状，然后同时均匀的注射或喷涂于出血伤口部位，在高于低临界溶解温度条件下，在出血伤口部位原位快速形成固态水凝胶。

31.权利要求28或30任意一项所述的应用，其特征在于：所述的出血伤口包括由于意外创伤导致或手术中发生的器官出血；所述的器官是肝脏、脾脏、肾脏、胃肠、心脏或皮肤。

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