CN115778951B - 阿莫西林在增强自然杀伤细胞的抗肿瘤活性中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医药技术领域，具体公开了阿莫西林在增强自然杀伤细胞的抗肿瘤活性中的用途。阿莫西林在较低的浓度条件下即可增强NK细胞的抗肿瘤活性，通过增强NK细胞的抗肿瘤活性实现抗肿瘤的效果；首先，针对的肿瘤细胞不局限于特定的肿瘤细胞，具有广谱性；其次，阿莫西林对NK细胞的杀伤活性的增强作用不依赖于效靶比。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，尤其涉及阿莫西林在增强自然杀伤细胞的抗肿瘤活性中的用途。
背景技术
阿莫西林Amoxicillin是(2S,5R,6R)-3,3-二甲基-6-[(R)-(-)-2-氨基-2-(4-羟基苯基)乙酰氨基]-7-氧代-4-硫杂-1-氮杂双环[3.2.0]庚烷-2-甲酸三水合物，是一种最常用的半合成青霉素类广谱β-内酰胺类抗生素。
自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)是机体固有免疫系统发挥主要作用的效应细胞，不需要抗原提呈或抗原激活就可以实现对肿瘤细胞的有效杀伤。NK细胞的杀伤活性以及瘤内浸润数量与患癌风险和癌症治疗预后显著相关，因此，增加NK细胞数量、提高NK细胞的抗肿瘤活性始终是NK细胞免疫治疗策略的研究重点之一。
增强NK细胞抗肿瘤活性的策略主要是通过细胞因子、单抗及多功能抗体介导NK细胞活化，通过调节抑制性信号和活化性信号间的传递加强NK细胞活性，或者通过免疫药物刺激以及基因修饰提高NK细胞杀伤功能等。这些策略有一定的局限性，比如，研究发现IL-2给药的治疗性抗肿瘤潜力是有限的，尤其是在高剂量使用时具有相关的毒性；而低剂量的IL-2除了激活NK细胞，还同时诱导CD4+调节性T细胞(Tregs)的选择性扩增，CD4+Tregs水平升高通常存在于人类肿瘤中，被认为与不良预后有关。
NK细胞可通过肿瘤细胞表面表达的NK细胞活化配体，有效识别和杀死肿瘤细胞。但是，肿瘤在长期进化过程中发展出了一系列的免疫逃逸策略，如下调其细胞表面NK细胞活化配体的表达，从而抑制NK细胞的抗肿瘤活性。因此，恢复肿瘤细胞表面NK细胞活化配体的表达将是一种具有战略意义的治疗手段。抗癌药物可以通过不同的机制完成这一目标。抗肿瘤药物模拟DNA合成和复制，在细胞周期的各个阶段起作用，可用于治疗多种肿瘤类型。表柔比星，新一代的蒽环类肝癌化疗药物，可诱导肝癌细胞系中NK细胞活化受体NKG2D的配体主要组织相容性复合体Ι类同源物(MHC class I-related chain A，MICA)表面表达并抑制可溶性MICA的分泌，同时增加NK细胞的细胞毒性。亚致死剂量的阿霉素可启动DNA损伤反应，以Chk1/2依赖性和p53非依赖性方式控制多发性骨髓瘤细胞系和患者来源的恶性浆细胞上的配体上调，触发NK细胞产生有效的IFN-γ以杀伤肿瘤。所以，探索特异性药物对NK细胞的细胞毒性的影响并将其运用于NK细胞免疫治疗将具有重要的意义。
发明内容
本发明人发现阿莫西林可用于提高NK细胞的抗肿瘤活性，该发现令人惊讶，因为阿莫西林作为一种抗生素，被广泛用于治疗细菌感染疾病，且阿莫西林作为抗生素的使用的浓度对癌细胞没有药物毒性，因此无法预测阿莫西林能够增强NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力即抗肿瘤活性；更加令人惊讶的是，阿莫西林的增强NK细胞抗肿瘤活性的实现并不依赖过高的浓度。
需要说明的是，本申请所述NK细胞对肿瘤细胞的杀伤能力即抗肿瘤活性(antitumor activity)指的通过抑制肿瘤细胞增殖或组织生长而导致肿瘤细胞生长停滞或死亡的能力。且本申请所述NK细胞抗肿瘤活性不同于NK细胞的细胞毒性；NK细胞抗肿瘤活性增强属于NK细胞毒性增强的其中一种表现；NK的细胞毒性指的是由NK细胞所造成的靶细胞的死亡、溶解和细胞生长抑制，此处的靶细胞不局限于肿瘤细胞。
因此，根据本发明，提供了阿莫西林在增强NK细胞的抗肿瘤活性中的用途；待增强抗肿瘤活性的自然杀伤细胞为体外培养的细胞；采用阿莫西林增强NK细胞的抗肿瘤活性只需将阿莫西林加入到含有自然杀伤细胞的溶液、悬浮液或培养基中，使阿莫西林浓度维持在10-40ng/ml；所述的肿瘤是能被自然杀伤细胞识别的肿瘤；所述肿瘤包括但不仅限于MCF-7细胞和HeLa细胞；
所述NK细胞包括但不限于NK-92mi细胞，所述NK-92mi是一种依赖白细胞介素-2(IL-2)的人类自然杀伤细胞(NK)细胞系，全称为人恶性非霍奇金淋巴瘤患者的自然杀伤细胞；
进一步的，在上述10ng/ml-40ng/ml浓度范围内调整阿莫西林浓度可以调整NK-92mi细胞对肿瘤细胞的杀伤力，优选的，用于处理NK细胞的阿莫西林的终浓度在5ng/ml到20ng/ml之间，NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力能够达到较高的水平；进一步优选的，用于处理NK细胞的阿莫西林的终浓度为10ng/ml时，NK细胞对肿瘤细胞的杀伤力达到一个最佳的水平，且10ng/ml这个浓度对正常细胞无毒副作用；
进一步的，调整效靶比以可以调整NK-92mi细胞对肿瘤细胞的杀伤力；效靶比指的是效应细胞即NK-92mi细胞与靶细胞的数量比，在本发明中具体指的是NK细胞数量与肿瘤细胞的数量比；效靶比从(1：1)～(40：1)，阿莫西林都表现出了对NK-92mi的抗肿瘤活性的增强效果，优选的效靶比为(5：1)～(10：1)，在此范围内的效靶比，采用阿莫西林处理后，NK细胞的杀伤力的增强效率较高。
本发明还提供了阿莫西林在制备用于抗肿瘤药物组合物中的用途；所述的肿瘤是能被人自然杀伤细胞识别的肿瘤；所述药物组合物包括：阿莫西林、人自然杀伤细胞以及药学上可接受的载体；或者所述药物组合物包括：以阿莫西林处理的人自然杀伤细胞，以及药学上可接受的载体。
本发明还提供了一种用于抑制肿瘤的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中包括：上述药物组合物；其中所述的肿瘤是能被人自然杀伤细胞识别的肿瘤。
基于本发明，阿莫西林在较低的浓度条件下即可增强NK细胞的抗肿瘤活性，通过增强NK细胞的抗肿瘤活性实现抗肿瘤的效果；首先，针对的肿瘤细胞不局限于特定的肿瘤细胞，具有广谱性；其次，阿莫西林对NK细胞的杀伤活性的增强作用不依赖于效靶比。
附图说明
附图用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本发明的实例一起用于解释本发明，并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为具体实施方式中不同浓度的阿莫西林对MCF-7细胞生长活性的影响；
图2为具体实施方式中不同浓度的阿莫西林对HeLa细胞生长活性的影响；
图3为具体实施方式中不同浓度的阿莫西林对NK-92mi细胞生长活性的影响；
图4为具体实施方式中经浓度10ng/ml的阿莫西林处理后，NK-92mi细胞杀伤MCF-7细胞的杀伤率与效靶比的对应关系图；
图5为具体实施方式中经浓度10ng/ml的阿莫西林处理后，NK-92mi细胞杀伤HeLa细胞的杀伤率与效靶比的对应关系图；
图6为具体实施方式中5:1的效靶比的前提下，不同浓度的阿莫西林对NK-92mi细胞杀伤MCF-7细胞活性的影响图；
图7为具体实施方式中5:1的效靶比的前提下、不同浓度的阿莫西林对NK-92mi细胞杀伤HeLa细胞活性的影响图。
具体实施方式
为了更好的理解上述技术方案，下面将结合说明书附图以及具体实施方式对上述技术方案进行详细的说明。
以下所有实验数据使用均值±标准误差(mean±SE)表示，使用Origin(9.8)进行数据绘图。数据分析使用SPSS软件(SPSSStatistics27)，采用Student’sT检验进行两组间显著性分析，多组间显著性分析使用单因素方差分析。P>0.05不具有统计学差异(nosignificant，ns)，P<0.05具有统计学差异(*)，P<0.01具有显著性差异(**)，P<0.001具有极显著差异(***)。
试剂来源：阿莫西林购自罗恩1g，99％；NK-92mi细胞购自普诺赛；CCK-8购自凯基500assays；乳酸脱氢酶细胞毒性检测试剂盒购自上海碧云天500assays。
试验一：阿莫西林对MCF-7细胞、HeLa细胞或NK-92mi细胞的细胞毒性
用CCK-8(CellCountingKit-8)试剂测定阿莫西林对MCF-7细胞、HeLa细胞或NK-92mi细胞的细胞毒性，步骤如下:
步骤S101铺板。将处于对数生长期的细胞重悬，并调节细胞浓度至5×104/mL，每个孔100μL进行铺板，过夜；
步骤S102加药。对于贴壁细胞吸去培养液，用PBS液洗涤一次。悬浮细胞则省略这一步。对应孔分别加入终浓度为10ng/ml、100ng/ml、1000ng/ml的阿莫西林，随后于37℃，5％体积浓度的CO2培养箱中继续培养24h。在96孔平底培养板中，组别设置为：只含培养基的空白对照组、不加药的细胞组和加药组；每组6个平行样；
步骤S103检测。每个孔加入CCK-8试剂20μL，于震荡器上混匀后置于37℃，5％体积浓度的CO2培养箱中继续培养2h。使用酶标仪在450nm处开始测定吸光度(OD值)。
按下列方法计算阿莫西林对MCF-7细胞、HeLa细胞或NK-92mi细胞的细胞毒性：细胞活力(％)＝(加药组OD-空白对照组OD)/(不加药组OD-空白对照组OD)×100％。
结果
如图1和图2分别为阿莫西林对MCF-7细胞、HeLa细胞的细胞生长活性图，可以看出，阿莫西林对癌细胞的细胞毒性有浓度依赖。10ng/ml终浓度的阿莫西林对癌细胞的细胞活力均在90％以上，而1000ng/ml终浓度的阿莫西林对癌细胞的细胞活力在80％以下。
图3为阿莫西林对NK-92mi细胞的细胞生长活性图，可以看出，阿莫西林对NK-92mi细胞几乎没有细胞毒性。
试验二：阿莫西林对NK-92mi细胞的细胞杀伤活性的影响
用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒测定阿莫西林对NK-92mi细胞的细胞杀伤活性的影响，步骤如下:
步骤S201，制备靶细胞。分别取处于对数生长期的癌细胞进行重悬，本试验具体采用的癌细胞为MCF-7细胞和HeLa细胞，分别调整癌细胞浓度至1×105/ml，每个孔100μL进行铺板，过夜；
步骤S202，制备效应细胞。取生长状态良好的NK-92mi细胞重悬，调整细胞浓度至5×l05/ml，备用。
步骤S203，效-靶细胞作用。当癌细胞的细胞密度在80-90％满时，吸去培养液，用PBS液洗涤一次。加入终浓度为10ng/ml的阿莫西林，随后每个孔加入100μLNK-92mi细胞，以满足效靶比为5：1的条件，并置于37℃，5％体积浓度的CO2培养箱中培养24h。
具体的，本试验在96孔平底培养板中，组别设置为：效应细胞自然释放组、未经药物处理的靶细胞自然释放组、未经药物处理的靶细胞最大酶活性组、未经药物处理的效应细胞杀伤癌细胞组、药物处理的靶细胞释放组、药物处理的靶细胞最大酶活性组、药物处理的效应细胞杀伤癌细胞组。每组6个平行样。
步骤S204，检测。到预定检测时间点的前1个小时，在未经药物处理的靶细胞最大酶活性组和药物处理的靶细胞最大酶活性组中加入20μLLDH释放试剂，并反复吹打数次混匀，继续置于37℃，5％体积浓度的CO2培养箱中孵育。提前配置好LDH检测工作液。到达预定时间后，将细胞培养板用多孔板离心机400g离心5min。分别取各孔的上清液120μl，加入到一新的96孔板相应孔中，各孔再分别加入60μLLDH检测工作液，混匀，室温避光，于水平摇床孵育30min。使用酶标仪在490nm处开始测定OD值。
按下列方法计算NK对癌细胞的杀伤率:NK-92mi对癌细胞的杀伤率(％)＝(未经药物处理的效应细胞杀伤癌细胞组OD-未经药物处理的靶细胞释放组OD-效应细胞自然释放组OD)/(未经药物处理的靶细胞最大酶活性组OD-未经药物处理的靶细胞自然释放组OD)×100％。
按下列方法计算阿莫西林对NK细胞活性的影响:NK-92mi对癌细胞的杀伤率(％)＝(药物处理的效应细胞杀伤癌细胞组OD-药物处理的靶细胞释放组OD-效应细胞自然释放组OD)/(药物处理的靶细胞最大酶活性组OD-药物处理的靶细胞自然释放组OD)×100％。
结果
图4和图5分别为阿莫西林对NK-92mi细胞杀伤MCF-7细胞、HeLa细胞的杀伤活性的影响图。可以看出，首先，阿莫西林对NK-92mi细胞的杀伤活性的增强作用不局限于一种癌细胞，具有广谱性。其次，阿莫西林对NK-92mi细胞的杀伤活性的增强作用不依赖于效靶比。不过，效靶比为5:1或10:1，阿莫西林对NK-92mi细胞的杀伤活性的增强效果更显著。
试验三：阿莫西林对NK细胞杀伤活性的增强作用的浓度优化试验
与试验二采用相同的操作步骤，同样的选取5:1的效靶比，区别仅在于：分别设置阿莫西林终浓度为0、5ng/ml、10ng/ml、20ng/ml、40ng/ml，其余步骤与试验二中的步骤S201-步骤S204相同。
结果
图6和图7分别为不同浓度的阿莫西林对NK-92mi细胞杀伤MCF-7细胞、HeLa细胞的影响。可以看出，阿莫西林对NK-92mi细胞的杀伤活性的增强作用依赖于浓度。浓度为10ng/ml的阿莫西林显著提高了NK-92mi细胞对肿瘤细胞的杀伤作用。
Claims (8)
1.阿莫西林在制备增强自然杀伤细胞的抗肿瘤活性药物中的用途，其特征在于，所述阿莫西林终浓度范围10ng/ml~40ng/ml，所述肿瘤为宫颈癌细胞或乳腺癌细胞形成的肿瘤。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述自然杀伤细胞即NK细胞为NK-92mi。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述肿瘤为MCF-7细胞或HeLa细胞。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述阿莫西林的终浓度在5 ng/ml~20 ng/ml。
5.如权利要求4所述的用途，其特征在于，所述阿莫西林终浓度为10 ng/ml。
6.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述自然杀伤细胞与肿瘤细胞的数量比即效靶比为（1：1）~（40：1）。
7.如权利要求6所述的用途，其特征在于，所述效靶比为（5：1）~（10：1）。
8.阿莫西林在制备用于抗肿瘤药物组合物中的用途，其特征在于，所述药物组合物包括：阿莫西林、人自然杀伤细胞以及药学上可接受的载体；或者所述药物组合物包括：以阿莫西林处理的人自然杀伤细胞，以及药学上可接受的载体；所述肿瘤为宫颈癌细胞或乳腺癌细胞形成的肿瘤。
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