CN115768261A - 用于保存生物样品的毛细管辅助玻璃化工艺和材料 - Google Patents

用于保存生物样品的毛细管辅助玻璃化工艺和材料 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种用于储存来自生物样品的核酸的方法。该方法包括提供一种生物样品，该生物样品包含一个或多个其中含有核酸的细胞；使生物样品与包含玻璃化剂和裂解剂的玻璃化介质接触以形成玻璃化混合物；使玻璃化混合物玻璃化以产生储存稳定的样品。在各个方面，储存稳定的样品可以在高于深低温的温度下，例如在室温下，储存20天或更长时间。

Description

用于保存生物样品的毛细管辅助玻璃化工艺和材料
交叉引用相关申请
本申请基于2020年2月28日提交的美国临时申请62/982,856并要求其优先权，所述美国临时申请的全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本公开涉及生物样品的保存，特别是用于保存血液、唾液或组织样品或其部分的生物材料玻璃化。
背景技术
玻璃化是从液体直接转变为无定形玻璃态的过程，常用于通过以高冷却速率将生物材料冷却至深低温来保存生物材料。在深低温下，玻璃化技术避免了已知在常规深低温保存过程中形成的冰晶的破坏性作用。然而，为了避免冰核在冷却过程中形成，需要极高和潜在毒性浓度(6-8M)的冷冻保护剂(CPA)。最常用的CPA包括二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇(EG)和1,2-丙二醇(PROH)。结果，需要多个步骤和复杂的精巧方案来将CPA负载到细胞和从细胞卸载。
环境温度下的无水玻璃化可能是保存生物材料的替代策略。在自然界中，各种各样的生物都可以在极度脱水中存活下来，这在许多情况下与细胞内大量(多达其干重20％)玻璃形成糖(如海藻糖和蔗糖)的积累有关。然而，随着玻璃化溶液在细胞外空间中浓缩而出现的累积化学应力会导致生物材料降解，因此干燥保存在长期储存中受到很大限制。这导致在细胞和玻璃化溶液可以达到合适的低水分含量以变成玻璃状之前对细胞的不可逆损伤，包括对蛋白质和核酸的损伤。因此，需要改进的玻璃化方法，在通过快速干燥将生物材料玻璃化的同时保存蛋白质和核酸。
发明概述
为了便于理解本文所述的各个方面，提供以下概述，但其并不旨在作为全部描述。通过将整个说明书、权利要求、附图和摘要作为一个整体，可以获得对各个方面的全面理解。
本文的多个方面提供了用于储存来自生物体的细胞、血液、唾液、组织或其他样品的、以及生物样品中的蛋白质、特别是细胞内核酸或其他生物材料的方法。该方法包括：提供生物样品，该生物样品包括一个或多个其中含有核酸的细胞；使生物样品与包含玻璃化剂和裂解剂的玻璃化介质接触以形成玻璃化混合物；以及将玻璃化混合物玻璃化以产生储存稳定的样品。在多个方面，储存稳定的样品可以储存在高于深低温的温度下，例如室温或更高，并且任选地可以储存20天或更长时间。
本公开还提供了保存组织样品的方法，该方法提供结构支持并且不引入细胞损伤材料，从而更有效地保存细胞结构以用于随后的组织学或其他组织研究。一种方法包括使目标生物组织接触聚合物、玻璃化剂和任选地适于将聚合物连接到组织中细胞的细胞外结构的一种或多种组分上的交联剂和/或能量；将组织玻璃化以形成玻璃化的组织样品，并且任选地将组织(在玻璃化之前或之后)切片成一个或多个薄组织条。方法任选地进一步包括用从组织中释放聚合物的释放剂和/或能量使玻璃化组织再水化，从而使保存完好的活组织可用于随后的分析。
附图简述
附图不一定按比例绘制；某些特征可能会被放大或最小化以显示特定组件的细节。因此，本文公开的具体结构和功能细节不应被解释为限制性的，而仅作为教导本领域技术人员以各种方式使用本发明的代表性基础。从详细描述和附图中可以更充分地理解示例性方面，其中：
图1示意性地描述了可以根据本文所示和描述的一个或多个方面使用的示例性玻璃化方法；
图2示意性地描述了根据本文所示和描述的一个或多个方面的另一个示例性玻璃化方法，其举例了在用于玻璃化的膜中的血细胞生物样品和玻璃化介质；
图3示意性地描述了从根据本文所示和描述的一个或多个方面产生的储存稳定样品中提取RNA的示例方法；
图4描述了用于分离所需材料和任选地分离污染物如细菌或其他不希望的生物体的示例性系统；
图5是电泳凝胶的图像，显示了从比较例A-C(使用常规的核酸储存技术)以及实施例1(使用根据本文所示和描述的一个或多个方面的核酸储存方法)提取的RNA的降解；
图6A显示根据本文所示和描述的一个或多个方面的实施例B以及比较例D和E的GAPDH循环阈值；
图6B显示根据本文所示和描述的一个或多个方面的实施例B以及比较例D和E的GAPDH循环阈值倍数变化；和
图6C显示根据本文所示和描述的一个或多个方面的实施例B以及比较例D和E的VEGF mRNA倍数变化。
发明详述
本文所述的多个方面提供了一种使用包含玻璃化剂和任选的裂解剂的玻璃化介质来制备和储存细胞、组织或细胞材料例如蛋白质(示例性抗体或其他蛋白质材料)、核酸或其他细胞材料的方法。在多个方面，包括一个或多个含有核酸的细胞的生物样品，可以与玻璃化介质接触，并玻璃化以产生储存稳定的样品。具体而言，本发明的多个方面允许在高于深低温的温度，更具体地，在室温或更高温度下保存和储存核酸，并保持稳健、保存良好的生物材料。例如，这些方面可以通过消除冷藏或冷冻的需要来显著降低储存成本，并且可以简化为储存而进行的样品制备，而不会对核酸(例如，DNA和/或RNA)的质量产生不利影响。因此，之后，在重构后，可以使用高质量的组织、细胞、蛋白质、核酸，包括RNA和DNA。
此外，本文所述的多个方面可以允许以最低的预处理水平来进行唾液、血液、组织或其他生物样品的处理和储存，从而允许样品在储存后可以用于多种用途中的任何一种。例如，肿瘤的组织样品可以保存很长时间，然后根据合适的方案进行处理，例如用于之后的RNA作图分析。作为另一个例子，可以在不首先将血浆与红细胞和白细胞分离的情况下储存全血样品，从而使储存样品的任何一种或多种成分能够在之后使用。
本文使用的以下术语或短语具有以下结合至少一个方面列出的示例性含义：
“无定形”或“玻璃”是指原子位置不存在长程有序的非晶态材料，涉及0.3或更小的有序参数。在玻璃化转变温度Tg下，液体转变为玻璃状固体。在一些方面，玻璃化介质可以是或形成无定形材料。在其他方面，生物材料可以是无定形材料。
“玻璃化转变温度”是指，高于该温度，材料表现为类似液体；低于该温度，材料表现为类似于固相并进入无定形/玻璃态。其并不是一个固定的温度点，而是取决于所用测量的时间尺度而变化。在一些方面，玻璃态可指生物组合物在降至其玻璃化转变温度以下时进入的状态。在其他方面，玻璃态可以指玻璃化混合物和/或玻璃化剂在降至其玻璃化转变温度以下时进入的状态。在其他方面，玻璃态可具有晶体或凝胶的机械刚性，但具有液体特征性的分子随机无序排列。
“晶体”是指由周期性重复并称为晶格或晶胞的一个特定有序几何阵列组成的三维原子、离子或分子结构。
“结晶”是指由在原子水平上以有序结构排列的成分组成的物质形式，其与玻璃状或无定形不同。结晶固体的固化发生在结晶温度Tc。
如本文所用，“玻璃化”是将材料转化为无定形材料的过程。该无定形固体可以不含任何结晶结构。
如本文所用，“玻璃化混合物”是指(一种或多种)生物材料和包含一种或多种玻璃化剂、任选地裂解剂和任选地其他材料的玻璃化介质的异质混合物。
如本文所用，“生物材料”或“生物样品”是指可以从活的生物体中分离或衍生的材料。生物材料的例子包括但不限于蛋白质、细胞、组织、器官、基于细胞的构建体、血液或其级分、核酸、或其组合。在一些方面，生物材料可以指哺乳动物细胞。在其他方面，生物材料可以指人间充质干细胞、鼠成纤维细胞、白细胞、红细胞、血小板、细菌、病毒、哺乳动物细胞、脂质体、酶、组织(例如肠、肝、神经元或其他)，或它们的组合。在其他方面，生物材料可以指生殖细胞，包括精细胞、精母细胞、卵母细胞、卵子、胚胎、胚泡，或它们的组合。在其他方面，生物材料可以指全血、红细胞、白细胞、血小板、血浆、血清、藻类、真菌或其组合。
如本文所用，“玻璃化剂”是在玻璃化剂和其他材料的混合物冷却或干燥时形成无定形结构或抑制其他材料中晶体形成的材料。玻璃化剂还可以提供渗透保护或以其他方式使细胞在脱水过程中存活。在一些方面，玻璃化剂可以是任何水溶性溶液，其产生适用于生物材料储存的无定形结构。在其他方面，玻璃化剂可以被吸收在细胞、组织或器官内。
如本文所用，“可储存”、“储存”或“储存稳定”是指生物材料能够被保存并保持存活以备后续使用。
如本文所用，“高于深低温”是指高于-80℃的温度。如本文所用，室温是指从大于或等于18℃到小于或等于37℃的温度范围。
如本文所用，“亲水”是指吸引水分子或优先与水分子缔合。对水具有特定亲和力的亲水材料，与水的接触最大化，并且与水具有较小的接触角。
如本文所用，“疏水”是指对水缺乏亲和力。疏水性材料自然排斥水，导致形成液滴，并且与水具有小的接触角。
如本文所用，“环境温度”是指大于或等于约16℃且小于或等于约30℃的温度。
本文描述的多个方面提供了用于存储来自生物样品的生物材料的方法。根据各个方面，其中包含一个或多个细胞的生物样品与玻璃化介质接触以形成玻璃化混合物。如以下将更详细描述的，玻璃化介质至少包含玻璃化剂和任选地裂解剂。玻璃化混合物被玻璃化以产生可储存直至进一步使用的储存稳定的样品。储存稳定的样品随后可以再水化和处理以提取或表征生物材料或其部分，然后可以用于定量、定性和/或临床分析。
在多个方面，玻璃化介质至少包括玻璃化剂和裂解剂。玻璃化剂的示例性例子包括但不限于，二甲亚砜、甘油、糖(例如海藻糖等)、多元醇、甲胺类化合物、甜菜碱类化合物、防冻蛋白、合成的抗成核剂、聚乙烯醇、环己三醇、环己二醇、无机盐、有机盐、离子液体或它们的组合。在一些方面，玻璃化介质中包括1、2、3、4或更多种玻璃化剂。
玻璃化剂以取决于玻璃化剂的特性的浓度包含在玻璃化介质中。在一些方面，玻璃化剂的浓度低于对被玻璃化的生物样品有毒的浓度。如本文所用，“有毒”是指在后续样品使用时不能实现功能性的或生物学的活力，或生物样品不适合后续分析。在多个方面，玻璃化剂的浓度大于或等于500微摩尔(μM)且小于或等于6摩尔(M)，或它们之间的任何值或范围。作为一个实例，海藻糖以大于或等于1毫摩尔(mM)且小于或等于6M，任选地大于或等于150mM且小于或等于6M的浓度包含在各个方面。在一些方面，当组合时所有玻璃化剂的总浓度大于或等于1mM且小于或等于6M，任选地大于或等于1mM且小于或等于6M。
本文提供的玻璃化介质任选地包括裂解剂。裂解剂包含在玻璃化介质中，以便使细胞膜和任选地细胞核部分或完全穿孔或以其他方式使其产生更多孔，从而促进玻璃化剂进入细胞和水分离开细胞，由此实现快速玻璃化。裂解剂可以是例如但不限于洗涤剂。适用的洗涤剂可包括十二烷基硫酸钠(SDS)、2-[4-(2,4,4-三甲基戊-2-基)苯氧基]乙醇(例如，Triton X-100)、CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐)、盐酸胍、其他类似试剂及其组合。其他裂解剂也是可能的，只要它们不干扰玻璃化过程或对期望的生物材料无毒。在多个方面，裂解剂在玻璃化介质中的存在量为0.01重量％(wt％)至5wt％或更大。裂解剂的具体量可以根据具体方面，更具体地，所需的细胞膜通透水平而变化。例如，在一些方面，裂解剂可以完全裂解细胞，而在其他方面，裂解剂可以仅仅在细胞膜上造成穿刺或穿孔以促进玻璃化剂的改进跨膜转移。
可以考虑，在一些方面，玻璃化介质可以进一步包括其他组分，例如但不限于，水或其他溶剂、缓冲剂、一种或多种盐、RNase或DNAse抑制剂、或其组合。缓冲剂是在25℃时pKa为6至8.5的任何试剂。缓冲剂的举例说明性例子包括胆碱、甜菜碱、HEPES、TRIS、PIPES、MOPS等。在一些方面，缓冲剂是含有大的有机离子(大于120kDa)的缓冲剂，例如胆碱、甜菜碱或HEPES。在包括缓冲剂的方面，缓冲剂以适于将玻璃化介质的pH稳定在所需水平的浓度提供。
盐可以包括，例如但不限于，钠盐、钾盐、氯盐或它们的组合。当包括在玻璃化介质中时，盐可以以大于或等于1毫摩尔(mM)至小于或等于500mM的浓度提供。例如，盐可以以如下浓度存在：大于或等于1mM到小于或等于500mM、大于或等于1mM到小于或等于400mM、大于或等于1mM到小于或等于300mM、大于或等于1mM到小于或等于250mM、大于或等于1mM到小于或等于200mM、大于或等于1mM到小于或等于150mM、大于或等于1mM到小于或等于100mM、大于或等于1mM到小于或等于75mM、大于或等于1mM到小于或等于50mM、大于或等于1mM到小于或等于25mM、大于或等于25mM到小于或等于500mM、大于或等于25mM到小于或等于400mM、大于或等于25mM到小于或等于300mM、大于或等于25mM到小于或等于250mM,大于或等于25mM到小于或等于200mM、大于或等于25mM到小于或等于150mM、大于或等于25mM到小于或等于100mM、大于或等于25mM到小于或等于75mM、大于或等于25mM到小于或等于50mM、大于或等于50mM到小于大于或等于500mM、大于或等于50mM到小于或等于400mM、大于或等于50mM到小于或等于300mM、大于或等于50mM到小于或等于250mM、大于或等于50mM到小于或等于200mM、大于或等于50mM到小于或等于150mM、大于或等于50mM到小于或等于100mM、大于或等于50mM到小于或等于75mM、或其中包括的任何和所有范围或子范围。
在一些方面，RNase和/或DNase抑制剂可以包含在玻璃化介质中以防止核酸降解。可以使用本领域已知和使用的任何已知的RNase和/或DNase抑制剂，只要它们不干扰玻璃化。然而，应当理解，在多个方面，RNase和/或DNase抑制剂可能不是保存核酸所必需的。
在一些方面，例如当玻璃化介质将与血液样品结合使用时，玻璃化介质可以进一步包括至少一种抗凝剂。或者，可以将血液样品收集到一种或多种抗凝剂中，然后与玻璃化介质接触。合适的抗凝剂可包括，例如但不限于，乙二胺四乙酸(EDTA)、双草酸盐、肝素、柠檬酸钠、氟化钠及其组合。当包括在内时，抗凝剂以0.1mg/mL至5mg/ml的量存在于玻璃化介质中或以其他方式使用。在一些方面，抗凝剂的量取决于所选择的具体抗凝剂而变化。例如，可以以1-2mg/mL血液的量包含EDTA，可以以0.2mg/mL血液的量包含肝素，可以以1-2mg/mL血液的量包含草酸盐，可以以2mg/mL血液的量包含氟化钠。作为另一个例子，可以以1:9的比例包含柠檬酸钠，其中9份是血液，1份是柠檬酸钠。如本领域技术人员将理解的，抗凝剂可以考虑以其他量存在，以防止血液样品凝结。
根据多个方面，其中包含一种或多种生物材料的生物样品与玻璃化介质接触以形成玻璃化混合物。在一些方面，在玻璃化之前孵育玻璃化混合物。例如，玻璃化混合物可以孵育大于或等于5分钟且小于或等于60分钟、大于或等于5分钟且小于或等于45分钟、大于或等于5分钟且小于或等于30分钟，或大于或等于5分钟且小于或等于20分钟。孵育可以在任何合适的温度下进行，并且在多个方面，可以是室温(即，从大于或等于18℃至小于或等于37℃，任选地约25℃)。在孵育之后，包括生物样品和玻璃化介质的玻璃化混合物，被玻璃化以产生储存稳定的样品。可以根据任何已知的玻璃化方法进行玻璃化。
通常通过快速冷却液体材料或将少量生物材料直接浸入液氮中来制备玻璃化材料。冷却降低材料分子的运动性，然后它们可以堆积成更热力学有利的结晶状态。干扰主要成分的结晶能力的添加剂，可产生无定形/玻璃化材料。在存在适当的玻璃形成剂的情况下，可以在高于深低温的温度将生物材料储存在玻璃化基质中，并且可以通过脱水来实现玻璃化。
一些动物和许多植物能够在完全脱水的情况下幸存下来。这种在干燥(脱水)状态下生存的能力取决于几种复杂的细胞内生理化学和遗传机制。在这些机制中，糖类(例如碳水化合物、二糖、寡糖)在细胞内积累，这些糖在干燥过程中充当保护剂，海藻糖是耐干燥生物中天然产生的二糖的一个例子。
诸如海藻糖这样的糖可以通过几种不同的方式为耐干燥生物体提供保护。由于海藻糖分子上羟基的独特位置，海藻糖分子可以有效地从折叠蛋白质的表面取代与氢键合的水分子，而不改变其构象几何形状和折叠。糖分子还可以通过与脂质双层的磷脂头部结合来防止再水化过程中的细胞质泄漏。此外，许多糖具有较高的玻璃化转变温度，这使它们能够在低含水量下形成高于深低温的玻璃或室温玻璃。高粘性的“玻璃”状态降低了分子的运动性，从而防止了导致细胞功能恶化和死亡以及蛋白质和核酸降解的降解性生化反应。
在一些方面，生物样品的玻璃化包括在玻璃形成糖——海藻糖——的存在下脱水，例如在N Chakraborty等人，Biopreservation and Biobanking,2010,8(2),107-114中已经公开的。参考图1所示，系统10是对生物材料进行脱水的最常用方法。固着液滴11放置在基底12上并在具有低湿度环境13的壳体16中蒸发干燥。壳体内的湿度、压力和温度可以通过控制装置17可操作地控制。然而，使用系统10对固着液滴进行蒸发干燥的脱水干燥在本质上是缓慢且不均匀的。当生物材料在玻璃形成介质中干燥时，在样品的液体/蒸汽界面14处形成玻璃状表皮。这种玻璃状表皮会减慢并最终阻止样品进一步干燥超过一定的干燥水平，并导致在样品中水分的显著空间不均匀性。结果，被困在玻璃状表皮下的部分干燥样品中的细胞可能不会玻璃化，而是由于高分子运动性而发生降解。
在其他方面，生物样品的玻璃化包括在玻璃形成糖海藻糖存在下使用毛细管辅助干燥进行脱水，例如在美国专利No.10,433,540中公开的。用于执行此类过程的示例装置在图2中示出。
玻璃化过程可以通过在膜上或膜内进行玻璃化，膜内可以包括一个或多个毛细管通道，任选地连续的毛细管通道。毛细管可以为快速蒸发提供界面。膜可以由多数个毛细管通道形成，任选地由多数个连续的毛细管通道形成。由诸如膜的多孔材料形成的毛细管网络可以由对生物材料或生物样品无毒且无反应并且不与玻璃化介质发生化学或物理反应的材料制成。膜可由亲水的或已被改性为亲水的材料制成。在一些方面，任选地使用如下所述的支撑结构，膜在玻璃化混合物或重构溶液中可以是部分可溶的或具有时间/刺激依赖性的溶解度。膜材料可以是合适的聚合物、金属、陶瓷、玻璃或它们的组合。在一些方面，连续的毛细管网络由聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚碳酸酯、聚氨酯、聚醚砜(PES)、聚酯(例如聚对苯二甲酸乙二醇酯)等材料形成。在本文提供的装置和方法中适合作为表面的含毛细管通道膜的举例说明性实例，包括亲水性过滤膜，例如由EMD Millipore，Bellerica，MA出售的那些。在某些方面，多孔材料基本上不结合或改变生物样品和/或玻璃化介质的组分、或以其他方式与之产生化学或物理缔合。多孔材料可选地不被衍生化。可选地，毛细管通道可以通过PDMS形成技术、激光钻孔或本领域已知的其他钻孔形成技术，在具有所需材料和厚度的基底(例如干燥室壁)中形成。
在一些方面，由多孔材料提供的毛细管网络包括横截面尺寸为约100μm或更小、任选20μm或更小的孔，由此所述孔可以提供下方的毛细管以帮助玻璃化。当毛细管网络被用于玻璃化组织时，可以任选地使用较大的孔径，例如约100μm或更小的横截面尺寸。当在一些方面使用细胞样品(而非组织)时，可以使用约20μm或更小的横截面尺寸。在一些方面，孔的平均开口可为约100μm至约0.1μm，包括约90、80、70、60、50、40、30、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2、1.0、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3和0.2μm。毛细管通道可以具有任选地由形成通道的基底的厚度定义的长度、或由一个或多个单独的通道本身定义的长度。毛细管通道长度可选地为约一毫米或更小，但不应被解释为限于这些尺寸。任选地，毛细管通道长度为约0.1微米至约1000微米，或它们之间的任何值或范围。可选地，毛细管通道长度为约5至约100微米，可选地为约1至约200微米，和/或可选地为约1至约100微米。毛细管通道长度任选地为约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100微米。在一些方面，毛细管通道的长度在多个毛细管通道中变化，可选地非均匀变化。
毛细管通道的横截面积可以为约8000μm2或更小，可选地为2000μm2或更小。任选地，横截面积为约0.01μm2至约8000μm2，任选地为约100μm2至约2000μm2，或它们之间的任何值或范围。可选地，(一个或多个)毛细管通道的横截面积为约100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000μm2或更小。
如图2所示，毛细管辅助玻璃化装置20包括放置在壳体28内的毛细管板/膜22。生物样品举例显示在膜孔内。可选地，在一些方面，毛细管膜可以替换为几个过滤层或不具有多数个明确通道的其他膜。在其他方面，多数个膜可以用于生物样品，其中生物样品夹在膜之间或以其他方式容纳在多数个膜内，其中所述多数个膜层叠在一起时形成适用于生物样品玻璃化的玻璃化膜。板/膜22任选地包括多数个毛细管通道，任选地基本上平行的毛细管通道，每个毛细管通道具有第一开口23和第二开口25。玻璃化混合物24放置在第一开口23上，其可以找到路径进入毛细管通道中，进一步地玻璃化混合物24的表面通过第二开口25暴露于周围大气29。在多个方面，周围大气29具有低于玻璃化混合物的湿度。玻璃化通过毛细作用使玻璃化混合物脱水干燥直至玻璃化混合物进入玻璃态来完成。壳体28中的化学、湿度、压力和温度通过一个或多个控制机制21来控制。
仅为了举例说明目的，简化了控制机制21；为获得最有利的用于干燥和玻璃化的条件，所述控制机制21可以具有多个系统和机制。在一些方面，玻璃化混合物24任选地夹在类似于22的两个板/膜之间，以得益于在玻璃化混合物24的上表面和下表面处的毛细管辅助干燥方法。
在一些方面，经毛细管板/膜的第二开口25或膜的玻璃化介质相对侧，提供低湿度(小于30％相对湿度)气体流，以增强毛细管效应。惰性或相对惰性的气体，例如氮气、氩气、氙气或其他气体可以用作低湿度气体。在一些方面，在壳体28内保持减压或真空。在一些方面，经第二开口25提供吸力/压力以实现增加的干燥速度。需要注意的是，保持低湿度环境(可选5％相对湿度或更低)对于防止干燥后的再水化至关重要。关于毛细管辅助干燥的更多细节可在美国专利号10,433,540中找到。
玻璃化方法可以在-80℃至+60℃的温度下进行。温度范围任选地是使得样品中水分子的运动性高并且温度不会损害生物材料的健康和活力的温度范围。这可以因材料以及玻璃化介质的组成而异。在一些方面，玻璃化温度为0.1℃至40℃。可选地，玻璃化温度为4℃至26℃。任选地，玻璃化温度为约25℃。
玻璃化方法可以在干燥的气氛或环境中进行。干燥环境是湿度水平低于饱和的环境。在一些方面，环境的湿度水平，例如毛细管第二侧的环境，是30％或更低的相对湿度，可选地20％或更低，可选地10％或更低，可选地5％或更低。干燥环境的湿度任选地在1％和30％之间或是介于其间的任何值或范围，任选地1％至5％。
玻璃化方法可以在低压环境(小于1atm(760mmHg))中进行。低压环境将对玻璃化速率产生有利影响。环境压力可选择为100mmHg或0.1atm。可选地，环境压力为10mmHg至760mmHg，或者其间的任何值或范围。可选地，环境压力为10mmHg至200mmHg。
玻璃化方法可以以干燥时间进行。干燥时间是足以促进适宜的干燥以使玻璃化介质玻璃化的时间。干燥时间任选地为1秒至1小时。可选地，干燥时间为1秒至50分钟，可选地5秒至60分钟。干燥时间可因样品类型或物理特性以及毛细管通道的细节而异。
在其他方面，玻璃化可以在膜或滤纸上或之间进行。取决于特定方面，可以使用其他玻璃化方法。
玻璃化后，样品是储存稳定的，可在高于深低温的温度下储存，同时保持存活且对于后续使用而言不发生显著降解。在一些方面，在玻璃化之后，玻璃化混合物可以以玻璃状态封装在不透水和空气的保护性壳体中并储存。在一些方面，储存稳定的样品，在使用前，可以在大于或等于-196℃至小于或等于+60℃或更高的温度、大于或等于16℃至低于或等于60℃或更高的温度、或大于或等于18℃至小于或等于60℃或更高的温度，储存一段时间。在一些方面，储存时间大于或等于1天、大于或等于5天、大于或等于10天、大于或等于20天、大于或等于30天、大于或等于45天、大于或等于60天、或更长。
在多个方面，当储存稳定的样品准备好使用时，根据使用样品的特定方案对其进行再水化(或重构)和处理。在一些方面，可使用用于沉淀蛋白质或一种或多种类型的核酸的再水化溶液，对储存稳定的样品进行再水化。在一些方面，使用裂解缓冲液重构储存稳定的样品，例如可以在用于处理储存稳定的样品的提取和/或纯化试剂盒中包括裂解缓冲液以完全裂解细胞材料。
尽管样品可用于多种方案，但在一些方面，处理样品以提取核酸，例如DNA和/或RNA。例如，再水化后，可以根据所采用的特定提取方法，沉淀、结合、洗涤、洗脱、干燥和/或溶解DNA和/或RNA。
在一些方面，根据基于GITC的方法，提取RNA。因此，将储存稳定的样品再水化，进行相分离，并将丙醇添加到上清液中。然后将混合物离心以形成包含RNA的沉淀。接下来，洗涤、干燥和溶解RNA沉淀以供分析。
在一些方面，根据TRIspin方法，提取RNA。因此，将储存稳定的样品再水化，进行相分离，并将乙醇添加到上清液中。结合、洗涤、洗脱RNA，然后可用于分析。
在一些方面，使用基于柱的方法，提取RNA。在这方面，将储存稳定的样品再水化，并加入乙醇。结合、洗涤和洗脱RNA，然后可用于分析。
其他提取方法在考虑之列。因此，无论采用何种特定的提取方法，在一些方面，可以在如上文所述的玻璃化过程中进行细胞裂解步骤(其通常是任何此类提取方法的第一步)，并可以在再水化后进行剩余的步骤。因此，本文所述的方面可以实现更快的玻璃化，同时提供可以在储存之后用于多种过程中任一种的储存稳定的样品。
在一些方面，可以从玻璃化细胞中提取DNA或RNA。例如，许多市售DNA或RNA提取试剂盒或类似方法中的任何一种都可用于从储存稳定的样品中提取DNA或RNA。在多个方面，提取试剂盒中使用的裂解缓冲液可用于重构样品。
此外，本文所述的多个方面可以允许全血或其部分在深低温以上的温度保存和储存。例如，可以将全血、血清、血浆、红细胞、血小板和/或淋巴细胞收集在试管中(任选使用抗凝剂)或膜上，与玻璃化介质接触，在环境温度孵育5-20分钟，并玻璃化。样品可以在环境温度下储存直到使用。DNA、RNA和/或蛋白质的提取可以通过用trizol处理样品来进行。因此，可以降低存储成本，并且保存的血液样品可以在存储之后用于多种过程中的任何一种，从而为样品提供更大的灵活性。例如，可以将储存稳定的样品再水化并且可以在裂解缓冲液中提取白细胞裂解物。可以用乙醇将裂解物转移到离心柱并用洗涤缓冲液洗涤。然后可用无RNase的水洗脱总RNA，并可以对RNA进行定量、定性和临床分析。
在一些方面，可以收集、离心全血，并且可以将一层或多层(例如，血浆层、血沉棕黄层或红细胞层)转移到玻璃化介质的基质中并进行玻璃化。储存后，样品可以用稀释剂(例如PBS液体，有或没有蛋白酶抑制剂)重构，并进行定性和/或定量分析。
虽然本文已经就全血形式的生物样品的使用而言描述了各个方面，但可以进一步考虑使用其他类型的生物样品，如本文一般描述的。在一些方面，生物样品可以是组织的形式。在一些这样的方面，可以使用裂解溶液将组织均质化、粉碎或进行酶消化。在替代方面，组织可接受可以根据各个方面使用的冷冻切片方法。
在一些方面，生物样品是异质的。异质样品是包含一种或多种外来生物体(非受试生物来源)的样品，该外来生物体也包括核酸，其可能与生物样品同时储存并可能污染样品的下游分析结果。因此，可能需要额外的制备步骤以相对于不希望的污染物选择性地分离所需的生物样品组分。作为非限制性示例，生物样品可以是唾液。众所周知，唾液既包括来自宿主生物体的细胞，也包括污染细菌或病毒。
可以对异质样品进行预处理步骤以去除或减少样品中外来生物(任选地细菌、病毒、酵母或其他)的量。预处理步骤可以与玻璃化步骤组合，但在一些方面，预处理步骤发生在实际玻璃化之前。预处理步骤可以是使生物样品与分离介质接触，所述分离介质任选地为颗粒或膜形式，所述分离介质包含对一种或多种外来生物体(任选地细菌、病毒、酵母和/或其他非受试生物体)具有选择性的分子或与这样的分子结合。在一些方面，放置样品以与分离介质的表面接触，该分离介质包括对一种或多种非受试生物具有特异性的分离剂，任选地甘露糖结合性凝集素(MBL)，任选地具有NCBI参考序列：NP_000233的序列。MBL是一种C型凝集素，可与细菌、酵母和一些寄生虫和病毒上的N-乙酰氨基葡萄糖残基和甘露糖结合。通过使生物样品与包括MBL的表面接触，可以选择性地将非受试生物体与受试细胞隔离开，从而提高该方法选择性地分离和任选地玻璃化生物样品中的受试细胞的能力。
现在参考图4，在一些方面，将样品应用于膜系统，其中至少一个分离膜32用于去除外来生物。图4示出了多数个颗粒36，其包括结合在其表面的分离剂。颗粒可以与玻璃化混合物和/或生物样品温育。颗粒选择性地与外来生物结合，其中颗粒上结合有一种或多种分离剂，任选地甘露糖结合性凝集素(MBL)。将样品与颗粒放置在具有足够孔径的分离膜32上，以允许生物样品通过，同时将颗粒保留在其表面上。
备选地或额外地，分离膜本身包括一种或多种与其结合的分离剂，由此生物样品或玻璃化混合物与该分离膜接触，外来生物结合到分离膜上，而生物样品中的期望材料通过所述分离膜以与玻璃化膜接触用于生物样品的后续玻璃化。分离膜可以是实质上多孔的任何膜系统，由此细胞材料可以通过膜而不被其中或上面的分离剂结合。
分离介质可以是合适的聚合物(例如聚偏二氟乙烯(PVDF))、金属、陶瓷、玻璃或它们的组合。在一些方面，分离介质可由PVDF、纤维素酯、硝化纤维素或其他期望材料制成。一种或多种分离剂可以与合适的分离介质结合或以其他方式缔合。当生物样品然后与分离介质接触时，外来细胞/生物可以选择性地结合到分离剂上，由此受试细胞可以通过该系统进行捕获或收集以及随后的玻璃化，如本文另外提供的。
如本文另外提供的，可将(任选具有分离剂)的分离膜层叠在适用于生物样品玻璃化的玻璃化膜上。玻璃化膜可以是包括或定义毛细管网络的任何材料。可选地，这种多孔材料膜可由对生物材料或生物样品无毒且不反应并且不与玻璃化介质发生化学或物理反应的材料制成。该材料可以是合适的聚合物、金属、陶瓷、玻璃或它们的组合。在一些方面，连续的毛细管网络由聚二甲基硅氧烷(PDMS)、聚碳酸酯、聚氨酯、聚醚砜(PES)、聚酯(例如聚对苯二甲酸乙二醇酯)等材料形成。对于在本文提供的装置和方法中适合作为表面的包含毛细管通道的膜，其举例说明性实例包括亲水性过滤膜，例如由EMD Millipore，Bellerica，MA出售的那些。在某些方面，多孔材料基本上不结合或改变生物样品和/或玻璃化介质的组分、或以其他方式与之产生化学或物理缔合。多孔材料可选地不被衍生化。可选地，毛细管通道可以通过PDMS形成技术、激光钻孔或本领域已知的其他钻孔形成技术，在具有所需材料和厚度的基底(例如干燥室壁)中形成。
在生物样品已经通过带有分离剂的分离膜以分离或去除非受试细胞材料后，剩余的细胞材料被收集在膜内或膜上用于随后的玻璃化和任选的储存。分离膜可以层叠在玻璃化膜的顶部。在与生物样品接触后，分离膜可被移除用于分析或丢弃并且剩余的生物样品通过本文所述的方法在玻璃化膜上或玻璃化膜内玻璃化。或者，分离膜可以保持与玻璃化膜相关联，并且整个膜系统如本文所述进行玻璃化。然后可以在重构玻璃化膜中的生物材料之前，将分离膜从玻璃化膜上剥离或以其他方式去除。预处理步骤的结果是实质性地去除非受试细胞材料，从而改进受试生物样品材料的分离和储存。
任选地，分离剂可以结合到珠子或颗粒上。在一些方面，在将玻璃化混合物倾倒在膜系统上之前，可以将具有结合的分离剂的珠子与生物样品和玻璃化混合物混合。可以理解，该步骤将在珠子和玻璃化混合物之间提供足够的接触时间以捕获期望的污染病原体。现在参考图4，在将玻璃化混合物倾倒在膜系统上时，带有捕获的病原体的珠子将与玻璃化混合物分离并保留在膜系统的上表面上。为了实现这一点，膜系统的孔径应小于珠子尺寸，并大于必须进入玻璃化膜的细胞的尺寸。珠子的尺寸可以在6微米和500微米之间，任选地10微米和500微米之间。珠子可以由聚合物制成，例如聚苯乙烯或氧化铁，例如官能化以结合分离剂的磁铁矿(Fe3O4)。
在本文还提供的多个方面，生物样品可以是生物体的组织或其他部分。在非深低温条件下储存组织样品通常是困难的。由于不均匀干燥或缺乏组织结构的维护，组织样品的简单玻璃化无法实现组织材料的足够稳定性。因此，提供了用于玻璃化组织的方法，该方法不仅保存了组织的分子材料，而且还保持了整个组织本身的结构和其他特性，从而显著提高了执行后续组织分析的有效性和能力。可在本文提供的方法中用作生物样品的组织包括但不限于来自以下来源的组织：神经元、肝脏、心脏、肾脏、血管、肾脏、肺、喉、胃、食道、胰腺、甲状腺、肌肉、上皮、毛发、或任何其他公认的生物组织类型。
在本文提供的玻璃化过程中，组织样品可以用玻璃化剂(任选糖)渗透并与聚合物或聚合物形成剂(例如PEG水凝胶)接触。例如，可以向组织注射海藻糖-PEG水凝胶前体和适合于将组织或其部分与聚合物以共价的、离子的或其他方式缔合在一起的附着剂。
聚合物可以是可用作或产生适于在高于深低温的温度下储存组织的聚合物的任何分子，包括但不限于：聚烷基醇和二醇，例如聚氧乙烯或聚氧乙烯衍生物；新苯二醇二丙烯酸酯(NPGDA)、聚环氧乙烷(PEO)、聚丙烯酰胺(PAAm)、聚甲基丙烯酸羟乙酯(PHEMA)、聚丙烯酸(PAA)、聚乙烯醇(PVA)、聚(N-异丙基丙烯酰胺)(PNIPAM)、聚乙烯吡咯烷酮(PVP)、聚乳酸(PLA)、聚乙醇酸(PGA)、聚己内酯(PCL)、明胶、海藻酸盐、角叉菜胶、壳聚糖、羟烷基纤维素、烷基纤维素、聚硅氧烷、橡胶、琼脂、羧乙烯共聚物、聚二氧戊环、聚丙烯酸乙酸酯、聚氯乙烯、马来酸酐、苯乙烯和苯乙烯聚合物；葡聚糖；肝素和肝素聚合物；谷氨酸、天冬氨酸或其组合的多肽。
聚合物任选地是线性的、分支的、受约束的(liable)或它们的组合。聚合物任选地是均聚的或异聚的。聚合物部分的示例性例子包括碳水化合物或聚氧乙烯(也称为聚乙二醇或“PEG”)的一个或多个分子。
聚合物任选地是聚乙二醇。聚乙二醇任选地包括2至20000个乙二醇单元。任选地，乙二醇单元的数目为2至10000，任选地2至5000，任选地2至2000。在多个方面，聚乙二醇(PEG)是聚乙二醇的衍生物，包括但不限于聚乙二醇-乙烯基砜。PEG可以是直链或支链PEG分子。任选地，支链PEG可以是2、4、6、8或其他臂PEG分子。
在一些方面，一种方法进一步包括添加交联剂与聚合物形成剂。交联剂是适用于将两种或更多种单体/聚合物连接在一起的任何试剂。交联剂任选地具有一个或多个丙烯酸酯或甲基丙烯酸酯官能团。示例性交联剂包括但不限于甲基丙烯酸2-羟乙酯(HEMA)、丙烯酸和甲基丙烯酸、己二酸酰肼二酰胺丙烯酸酯、丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺、烷基-(甲基)丙烯酰胺、N-单(甲基)丙烯酰胺，N,N-二-C1-C4烷基-(甲基)丙烯酰胺(N,N-二-C1-C4烷基-(甲基)丙烯酰胺)，N-丁基(甲基)丙烯酸酯，(甲基)丙烯酸N-丁酯、(甲基)丙烯酸甲酯、(甲基)丙烯酸乙酯、(甲基)丙烯酸异冰片酯、(甲基)丙烯酸环己酯、丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、丙烯酸羟丁酯、N-(2-羟乙基)丙烯酰胺[N-(2-羟乙基)丙烯酰胺]、N-甲基丙烯酰胺、N-丁氧基甲基丙烯酰胺、N-甲氧基甲基丙烯酰胺、N-甲氧基甲基甲基丙烯酰胺、2-丙烯酰胺基乙醇酸和2-羧乙基2-羧乙基丙烯酸酯、2-羟基-5-甲氧基苯乙酮、2-羟乙基纤维素和2-羟乙基二硫化物等，或它们的组合。
一种方法任选地进一步包括一种或多种附着剂存在于玻璃化混合物中。任选地，附着剂是硼酸。不受限于一种特定理论，据信硼酸可以将聚合物共价结合到组织细胞的膜蛋白上。因此，水凝胶在组织的细胞之间形成并为细胞和组织提供支撑以防止在玻璃化和切片期间收缩或塌陷。水凝胶形成后，可以将组织玻璃化。如果需要，然后玻璃化后的样品可以被有效地切片。组织切片后，可以添加葡萄糖和水的混合物以解偶联硼酸，从而使水凝胶与膜蛋白解偶联。然后可以将硼酸和水凝胶洗掉，留下组织样品，包括其在玻璃化过程中保存的原始结构。
这些方面可以使样品的组织学分析成为可能。用于组织学的常规组织处理包括，在对组织样品进行切片之前，将低熔点石蜡或琼脂糖注入组织中并之后进行样品冷冻或玻璃化处理。尽管石蜡提供了维持细胞结构所需的硬度，但它会导致组织污染。琼脂糖影响RNA提取，并粘在组织壁上。因此，使用海藻糖-PEG水凝胶(作为本文提供的一个例子)可以实现组织的玻璃化，同时为细胞结构提供支撑，而不会污染或不利地影响下游加工，因为水凝胶可以通过葡萄糖-水洗步骤洗脱和洗掉。其他优点对于本领域技术人员将是显而易见的。
任选地，玻璃化介质包括可转换的支撑材料，其能够在由两种不同的刺激触发的相对高粘度状态和低粘度状态之间转换。在施加刺激之前，可转换材料将表现为具有优异流动性的低粘度液体，允许通过本文提供的方法原位灌注到组织基质中。一旦施加第一个刺激，材料将从低粘度液体(sol状态)转变为屈服应力流体(gel状态)，从而提供足够的刚性和支撑，以在玻璃化过程中基本保持组织和/或膜结构的构象。当施加第二个刺激时，支撑材料将从刚性材料转换回低粘度液体，从而可以轻松去除。
在一些方面，不同波长的光可以用作刺激物。可选地，紫外(UV)和可见光将用作转换刺激。在一些方面，光可转换的水凝胶支持物在可见光下将表现出刚性，但在紫外辐射下将能够完全解离成溶液状态。示例性的光可转换材料是由偶氮苯(azo)和环糊精(CD)主客体复合物形成的超分子水凝胶，任选如Vapaavuori,et al.,J.Mat.Chem.C.,2018；6:2168-2188或Rosales,et al.,Bioconjugate Chem.,2018；29:905-913中所述。有三种主要的具有不同空腔尺寸的环糊精：α-CD、β-CD和γ-CD。它们分别包括六个、七个和八个相连的吡喃葡萄糖亚单位，形成一个锥形结构。羟基基团位于锥体外，使其具有亲水性。然而，锥体内部是疏水的，因此它可以在水溶液中容纳偶氮苯等疏水分子，形成主-客体复合物。偶氮苯(azo)是一种众所周知的光响应分子。在可见光(～520nm)下，它处于热力学稳定的反式状态。当用紫外线(～375nm)照射时，它可以光异构化为顺式异构体。反式-偶氮的几何结构允许它在水溶液中进入CD腔(由疏水相互作用驱动)，形成主-客体复合物。当被光异构化为顺式-偶氮时，其几何形状不再适合容纳在CD锥中，导致复合物解离。使用光可逆的偶氮-CD复合物作为交联剂，可以制备在可见光下凝胶化但在紫外线辐射下容易分解成液体(sol)的光可转换水凝胶。这种溶液-凝胶转换是可逆的，可以在两分钟内完成。用于形成可转换支撑材料的其他方法和材料可见于Koopmans和Ritter，Macromolcules，2008；41:7418-7422。
因此，本文提供的方法任选地进一步包括在玻璃化介质内的可转换支撑材料，以及施加刺激将可转换支撑材料转变为粘性状态，任选地随后玻璃化介质接受本文提供的真空玻璃化过程，从而将组织或其他细胞材料储存在具有足够支撑以保持生物样品的其他物理和/或化学特性的玻璃化状态。
实施例
提供以下实施例以举例说明各个方面，但不旨在限制权利要求的范围。下面针对各种工作实施例、比较实施例以及工作实施例和比较实施例中使用的材料，提供了近似的特性、特性、参数等。
实施例1
细胞培养：LINTERNA Jurkat T细胞(稳定表达tGFP，具有G418抗性基因)获自西班牙Innoprot。细胞在37℃和5％ CO2下在RPMI 1640(Gibco)、10％热灭活胎牛血清(Hyclone)、1X Glutamax(Gibco)和G418(Gibco)中培养。将培养物在25cm2 T型烧瓶(Corning Incorporated,NY)中保持在37℃，并用10％ CO2–90％空气平衡。每三天更换一次新鲜培养基以维持细胞。
对于实施例A，将5X106Jurkat T细胞的样品在含有600mM海藻糖、5％甘油、0.01％Triton X-100的250μl玻璃化介质中温育10-15分钟。然后将样品夹在两个孔径为1.2微米的PES膜支架之间，并在-29mmHg的真空中玻璃化约6分钟，以达到0.01的水分残留率(MRR)。然后在提取RNA之前将样品在25℃或55℃下储存3天。
使用PureLink RNA Mini Kit(Invitrogen)提取RNA。玻璃化后的细胞用0.6ml含有1％2-巯基乙醇的裂解缓冲液再水化，并在室温下孵育15分钟。通过使裂解物通过21号注射器针头10次，使裂解物均质化。将等体积的70％乙醇添加到裂解物中。然后，通过离心(在室温下12,000x g 15秒)提取裂解物/上清液，并通过在室温下以12,000x g离心15秒，使其通过RNA结合离心柱。接下来，通过在柱(PureLink DNase Set，Invitrogen)上进行DNase消化，去除DNA污染，然后用700μl洗涤缓冲液-I和500μl洗涤缓冲液-II以及乙醇进行两步洗涤(12,000×g离心15秒)去除污染物和抑制剂。将结合有RNA的离心柱干燥2分钟，然后将50μl无RNase的水加入离心柱并孵育2分钟。通过室温以12,000×g离心，将纯RNA洗脱在新试管中。
作为对照，使用与玻璃化细胞相同的技术，从具有相同数量的新鲜细胞的样品，提取RNA(比较例A)。
对于比较例B，将含有相同数量细胞的样品深低温冷冻并在-80℃下储存2小时。解冻细胞，并使用与实施例A相同的RNA提取方法提取RNA。
对于比较例C，5X106Jurkat T细胞在含有600mM海藻糖和5％甘油的250μL玻璃化介质中孵育10-15分钟，该玻璃化介质不包括Triton X-100。将样品玻璃化约6分钟以达到0.01的MRR。然后将样品在室温下储存3天。然后将细胞在裂解缓冲液中再水化，并使用与玻璃化细胞相同的技术提取RNA。
实施用于实施例A和比较例C的相同玻璃化方案，细胞在25℃或55℃下储存三天，然后提取RNA。
对于所有样品，每孔5μg RNA上样到1.2％琼脂糖凝胶(Native Sybr-safe)上并进行电泳以实现分离。凝胶图像如图5所示。在变性凝胶上运行的完整总RNA将具有清晰的28S和18S rRNA条带(真核样品)。28S rRNA条带的强度应约为18S rRNA条带的两倍。这个2:1的比例(28S:18S)是RNA完整性的良好指标。部分降解的RNA将呈现弥散外观，缺乏清晰的rRNA条带，或者不会表现出2:1的比例，如在比较例A(泳道1)和比较例C(泳道3)中所见。完全降解的RNA将显示为分子量非常低的弥散物(比较例B；泳道2)。如图5A所示，根据本文所述的各个方面玻璃化和储存的实施例A，在55℃储存1周(泳道4)，具有清晰的28S和18S rRNA条带，具有良好的强度比，表明在玻璃化和室温储存后RNA是完整的。
通过RNA量化获得了类似的结果。如上针对每个样品制备的RNA用分光光度法定量，结果如表1所示。
表1:
样品 名称 260/280 ng/μL
比较例A 新鲜Jurkat细胞 2.07 378.353
比较例B Jurkat细胞[1-2h@-80℃] 1.889 22.833
比较例C 细胞+VM玻璃化 2.111 122.273
实施例A 细胞+VM+TRITON玻璃化 2.113 202.033
相对于在不存在裂解剂的情况下玻璃化的细胞，在裂解剂Triton-X100存在下的玻璃化显示了在RNA完整性上的明显改善。比较例B几乎完全降解。当玻璃化介质包含裂解剂时，不论是在25℃储存还是在55℃的高温下储存3天，均观察到改进的RNA质量，说明如本文所述制备的细胞样品的稳健储存能力。
实施例2
如实施例1获得和培养LINTERNA Jurkat T细胞。
将5X106个Jurkat T细胞样品在含有600mM海藻糖、5％甘油、0.01％ Triton X-100的250μl玻璃化介质中孵育10-15分钟。然后将样品玻璃化约6分钟以达到0.01的MRR。然后在提取RNA之前，将样品在25℃或55℃下储存3天。如实施例1进行RNA提取。
作为比较，从新鲜细胞样品中提取RNA，所述细胞样品在按照玻璃化细胞相同的方式进行RNA提取和分析之前储存在4℃。
然后使用VEGF(PDGF/VEGF生长因子家族成员)或GAPDH的RNA模板，对从每个样品中提取的RNA进行RT-PCR。图6A显示来自各种制备和储存技术的细胞的GADPH mRNA的循环阈值(Ct)。图6B显示来自各种制备和储存技术的细胞的GADPH mRNA的Ct值倍数变化。图6C显示来自各种制备和储存技术的细胞的VEGF mRNA倍数变化。如图6A和6B所示，对于GAPDH基因，在两种储存温度下，新鲜细胞和玻璃化细胞的Ct值之间没有显著变化。此外，观察到稳健的VEGF mRNA(图6C)。因此，得出结论，本文所述的玻璃化方法可用于玻璃化和储存细胞而不降解VEGF mRNA。
实施例3:
获得各种动物组织并进行玻璃化。通过批准的动物方案，人道地收集小鼠肠道和肝脏的样品。将组织切成小块(约1mm厚，重15mg)并在包含600mM海藻糖、5wt％甘油、0.5wt％Triton X-100的玻璃化介质中温育20分钟。按照实施例1将样品玻璃化5分钟以达到0.01的MRR，并在25℃或55℃下储存一周。
第二组样品在进一步包括海藻糖聚合物的相同玻璃化介质中玻璃化。通过将偶氮二异丁腈(AIBN)(5.28mg,3.22x10-2mmol)和苯乙烯基醚海藻糖单体(634mg,1.38mmol)溶解在二甲基甲酰胺(DMF)(2.31mL)和H2O(4.61mL)的混合物中合成该海藻糖聚合物。通过三个冷冻-泵抽-解冻循环去除氧气，并在75℃开始聚合。8.5小时后通过将小瓶浸入液氮中停止聚合。
第三组样品在玻璃化介质中玻璃化，该玻璃化介质包括如上所述600mM海藻糖、5wt％甘油和0.5wt％Triton X-100，还包括与硼酸结合的8-臂聚乙二醇。该聚合物是通过将8臂PEG胺(400mg，10kDa，4×10-2mmol)和4-甲酰基苯基硼酸(96mg，6.40×10-1mmol)溶解在2.8ml的MeOH中合成的。然后加入NaBH3CN(37.7mg,6.00×10-1mmol)并在25℃下搅拌。其余的玻璃化和储存方案是相同的。
储存后，将组织样品在裂解缓冲液中重构并如实施例1中所述分离mRNA。通过使用Synergy H1 Hybrid MF的Take3 Plate(BioTek Instrument)，通过光谱法定量和分析RNA。简而言之，将2μl/孔的每个样品添加到Take3中，并使用无RNase的超纯水作为空白。使用Gen5软件根据A260读数计算总RNA浓度(1.0相当于～40μg/ml ssRNA)，A260/A280比率用于RNA质量(A260/A280比率为1.8-2.1+指示高度纯化的RNA)。表2显示的结果证明完整mRNA的稳健产量。
表2:
样品 260/280比值 ng/μl 总产量(ng)
肝脏 2.168 97.12 6318
小肠 2.099 108.48 7051
使用与硼酸结合的聚乙二醇或海藻糖聚合物孵育的样品，预计会得到更可靠的结果。
实施例4:
当储存从非无菌环境中获得的生物样品时，来自非供体生物源的污染可能性始终存在。为了解决这个问题，开发了一种方案来选择性地分离生物体样品并排除不期望的细菌污染。在如实施例1中用于玻璃化的PES膜的上方放置两层8微米的硝酸纤维素膜，组装成一个三层系统，其中该硝酸纤维素膜结合有甘露糖结合性蛋白(MBL)或按供应的方式使用。
为了测试该组装的系统选择性自细菌核酸分离期望核酸的能力，形成了三个具有不同细菌菌株的样品。测试了大肠杆菌(E.coli)、表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)和铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)。每种细菌在培养基中稀释至104个菌落形成单位(CFU)。添加100微升细菌材料至沉淀含有每种细菌各106个，并重新悬浮细菌沉淀。然后将再悬浮液添加到组装好的三层膜系统的硝酸纤维素膜表面，并在室温下孵育30分钟。然后分开三层膜并用PBS洗涤。然后将洗涤溶液进行细胞计数并铺板在琼脂板上，然后在37℃培养两天。表3的结果为针对大肠杆菌的两个实验的平均值，每个实验一式三份进行。
表3:
样品 ％CFU StDev SEM
MBL包被 35.69 11.47 8.11
阴性对照 93.08 2.34 1.66
无过滤 100 0 0
表4的结果为针对表皮葡萄球菌的两个实验的平均值，每个实验一式三份进行。
表4:
样品 ％CFU StDev SEM
MBL包被 21.57 7.22 5.11
阴性对照 48.89 27.42 19.39
无过滤 100 0 0
结果表明，结合有MBL的过滤器从样品中选择性地且稳健地结合了细菌，这表明该系统能够从含有mRNA的样品中选择性地去除细菌污染。
还分析了PES膜中的细胞计数。在PBS中洗涤PES膜，对细胞进行细胞计数。表5中结果是两个实验的平均值，每个实验一式三份进行。
表5:
Figure BDA0003909013730000201
在所有情况下，PES膜包括大于84％回收率的最初加载的细胞，并且Jurkat细胞的数量与硝酸纤维素层上MBL的存在或不存在无关。这些结果表明稳健过滤系统，该系统对细菌细胞具有选择性，可用于生物细胞的选择性储存。
其他实施方案
1.一种用于储存生物样品的方法，该方法包括：
提供其中包含一个或多个细胞的生物样品；
使生物样品与包含玻璃化剂和裂解剂的玻璃化介质接触以形成玻璃化混合物；
将玻璃化混合物玻璃化以产生储存稳定的样品。
2.根据实施方案1的方法，还包括：
在大于或等于16℃至小于或等于30℃、任选地大于30℃、任选地大于50℃的温度下储存该储存稳定的样品。
3.实施方案1-2中任一项的方法，其中所述生物样品包含核酸，任选地RNA。
4.实施方案1-3中任一项的方法，其中所述生物样品包括全血、血浆或血清。
5.根据实施方案4的方法，所述生物样品包含全血、血清或血浆，其中所述玻璃化混合物进一步包含抗凝剂。
6.实施方案1-5中任一项的方法，其中玻璃化混合物进一步包含缓冲剂。
7.根据实施方案1-6的方法，其中玻璃化剂包括二甲亚砜、甘油、糖、多元醇、甲胺类化合物、甜菜碱类化合物、防冻蛋白、合成的抗成核剂、聚乙烯醇、环己三醇、环己二醇、无机盐、有机盐、离子液体或其组合。
8.根据实施方案7的方法，其中玻璃化剂包含海藻糖。
9.根据实施方案1-8中任一项的方法，其中裂解剂包含洗涤剂。
10.根据实施方案9的方法，其中洗涤剂包含十二烷基硫酸钠(SDS)、2-[4-(2,4,4-三甲基戊-2-基)苯氧基]乙醇(例如Triton X-100)、CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐)、盐酸胍或其组合。
11.根据实施方案1-10中任一项的方法，还包括：将所述储存稳定的样品封装在不透水和空气的保护性壳体中，并且将所述保护性壳体储存在-196℃至+60℃之间的温度，储存时间为20天或更长时间。
12.根据实施方案1-11中任一项的方法，其中玻璃化所述玻璃化混合物包括，在高于深低温的温度，干燥所述玻璃化混合物，直到所述玻璃化混合物进入玻璃态。
13.根据实施方案12的方法，其中玻璃化介质在一个或多数个毛细管通道内。
14.根据实施方案1-13中任一项的方法，其中玻璃化进行1秒至1小时、任选10分钟或更短的干燥时间。
15.根据实施方案1-14中任一项的方法，还包括在玻璃化之前将玻璃化混合物孵育大于或等于5分钟且小于或等于30分钟。
16.根据实施方案15所述的方法，其中所述孵育在大于或等于18℃至小于或等于37℃的温度下进行。
17.根据实施方案1-16中任一项的方法，其中所述生物样品通过与其中包含有一种或多种分离剂的分离介质接触而被预处理。
18.根据实施方案17的方法，其中所述分离剂是甘露糖结合性凝集素。
19.根据实施方案17的方法，其中所述分离介质包括硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯。
20.根据实施方案1-19中任一项所述的方法，其中所述生物样品包含组织并且其中所述玻璃化混合物进一步包含支撑材料，任选地聚合物支撑材料。
21.根据实施方案20的方法，其中所述聚合物适用于形成水凝胶。
22.根据实施方案20的方法，其中所述聚合物是聚乙二醇。
23.根据实施方案20-22中任一项所述的方法，其中所述玻璃化介质还包括一种或多种附着剂。
24.根据实施方案23的方法，其中所述附着剂是硼酸。
25.根据实施方案20-24中任一项所述的方法，其中所述支撑材料是可转换支撑材料，所述方法还包括使所述玻璃化混合物接受刺激以将所述可转换支撑材料转换成凝胶状态。
本文公开了各个方面；然而，应当理解，所公开的方面仅仅是本发明的示例，本发明可以以各种和替代的形式体现。因此，本文公开的具体细节不应被解释为限制性的，而仅作为本发明任何方面的代表性基础和/或作为教导本领域技术人员以各种方式采用本文公开教导的代表性基础。此外，本文使用的术语仅用于描述本发明的特定方面的目的，并不旨在以任何方式进行限制。
应当理解，尽管术语“第一”、“第二”、“第三”等可以在本文中用于描述各种元件、组件、区域、层和/或部分，但这些元件、组件、区域、层和/或部分不应受这些术语的限制。这些术语仅用于将一个元素、组件、区域、层或部分与另一个元素、组件、区域、层或部分区分开来。因此，下面讨论的“第一元件”、“组件”、“区域”、“层”或“部分”可以被称为第二(或其他)元件、组件、区域、层或部分而不背离此处的教导。
本文使用的术语仅出于描述特定方面的目的，并不旨在进行限制。如本文所用，单数形式“a”、“an”和“the”旨在包括复数形式，包括“至少一个”，除非内容另有明确说明。“或”的意思是“和/或”。如本文所用，术语“和/或”包括相关列出的项目中的一个或多个的任何和所有组合。还应理解的是，当在本说明书中使用时，术语“包括”和/或“包含”是指存在所述特征、区域、整数、步骤、操作、元素和/或组件，但不排除存在或添加一个或多个其他特征、区域、整数、步骤、操作、元件、组件和/或它们的组。术语“或其组合”是指包括至少一种前述要素的组合。
除非另有定义，否则本文使用的所有术语(包括技术和科学术语)具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。还应理解，诸如在常用词典中定义的术语，应被解释为具有与其在相关领域和本公开的上下文中的含义一致的含义，并且除非在本文中有明确定义，否则不应作理想化或过于正式的解释。
在整个本申请中，在引用出版物的情况下，这些出版物的公开内容在此通过引用整体并入本申请中，以更全面地描述本公开内容所属领域的状况。
虽然已经举例说明和描述了本发明的方面，但这些方面并不旨在说明和描述本发明的所有可能形式。相反，说明书中使用的词语是描述性词语而不是限制性词语，并且应当理解，在不脱离本发明的精神和范围的情况下可以对其进行各种修改和替换。

Claims (36)

1.一种用于储存生物样品的方法，该方法包括：
提供其中包含一个或多个细胞的生物样品；
使生物样品与包含玻璃化剂和裂解剂的玻璃化介质接触以形成玻璃化混合物；
将玻璃化混合物玻璃化以产生储存稳定的样品。
2.根据权利要求1的方法，还包括：
在大于或等于16℃至小于或等于30℃、任选地大于30℃、任选地大于50℃的温度下储存该储存稳定的样品。
3.根据权利要求1的方法，其中所述生物样品包含核酸，任选地RNA。
4.根据权利要求1的方法，其中所述生物样品包括全血、血浆或血清。
5.根据权利要求4的方法，其中所述生物样品包含全血，其中所述玻璃化混合物还包含抗凝剂。
6.根据权利要求1的方法，其中玻璃化混合物进一步包含缓冲剂。
7.根据权利要求1的方法，其中玻璃化剂包括二甲亚砜、甘油、糖、多元醇、甲胺类化合物、甜菜碱类化合物、防冻蛋白、合成的抗成核剂、聚乙烯醇、环己三醇、环己二醇、无机盐、有机盐、离子液体或其组合。
8.根据权利要求7的方法，其中玻璃化剂包含海藻糖。
9.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中裂解剂包含洗涤剂。
10.根据权利要求9的方法，其中洗涤剂包含十二烷基硫酸钠(SDS)、2-[4-(2,4,4-三甲基戊-2-基)苯氧基]乙醇(例如Triton X-100)、CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐)、盐酸胍或其组合。
11.根据权利要求1-8中任一项的方法，还包括：将所述储存稳定的样品封装在不透水和空气的保护性壳体中，并且将所述保护性壳体储存在-196℃至+60℃之间的温度，储存时间为20天或更长时间。
12.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中玻璃化所述玻璃化混合物包括，在高于深低温的温度，干燥所述玻璃化混合物，直到所述玻璃化混合物进入玻璃态。
13.根据权利要求12的方法，其中玻璃化介质在一个或多数个毛细管通道内。
14.根据权利要求12的方法，其中玻璃化进行1秒至1小时、任选10分钟或更短的干燥时间。
15.根据权利要求1-8中任一项的方法，还包括在玻璃化之前将玻璃化混合物孵育大于或等于5分钟且小于或等于30分钟。
16.根据权利要求15的方法，其中所述孵育在大于或等于18℃至小于或等于37℃的温度下进行。
17.根据权利要求1-8中任一项的方法，其中所述生物样品通过与其中包含有一种或多种分离剂的分离介质接触而被预处理。
18.根据权利要求17的方法，其中所述分离剂是甘露糖结合性凝集素。
19.根据权利要求17的方法，其中所述分离介质包括硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯。
20.一种在高于深低温的温度储存组织的方法，包括：
提供包含一个或多个细胞的生物组织；
使生物组织与玻璃化介质接触，该玻璃化介质包含玻璃化剂和支撑材料，任选地聚合物支撑材料，以形成玻璃化混合物；
使玻璃化混合物玻璃化以产生储存稳定的样品。
21.根据权利要求20的方法，其中所述聚合物适用于形成水凝胶。
22.根据权利要求20的方法，其中所述聚合物是聚乙二醇。
23.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中，所述玻璃化介质还包括一种或多种附着剂。
24.根据权利要求23的方法，其中所述附着剂是硼酸。
25.根据权利要求20-22中任一项的方法，其中所述支撑材料是可转换支撑材料，所述方法还包括使所述玻璃化混合物接受刺激以将所述可转换支撑材料转换成凝胶状态。
26.根据权利要求20-22中任一项的方法，其中所述玻璃化混合物还包含缓冲剂。
27.根据权利要求20-22中任一项所述的方法，其中所述玻璃化剂包括二甲亚砜、甘油、糖、多元醇、甲胺类化合物、甜菜碱类化合物、防冻蛋白、合成的抗成核剂、聚乙烯醇、环己三醇、环己二醇、无机盐、有机盐、离子液体或其组合。
28.根据权利要求27的方法，其中玻璃化剂包含海藻糖。
29.根据权利要求20-22中任一项的方法，其中还包括：将所述储存稳定的样品封装在不透水和空气的保护性壳体中，并且将所述保护性壳体储存在-196℃至+60℃之间的温度，储存时间为20天或更长时间。
30.根据权利要求20-22中任一项的方法，其中玻璃化所述玻璃化混合物包括，在高于深低温的温度，干燥所述玻璃化混合物，直到所述玻璃化混合物进入玻璃态。
31.根据权利要求20-22中任一项的方法，其中玻璃化化合物在一个或多数个毛细管通道内。
32.根据权利要求20-22中任一项的方法，其中玻璃化进行1秒至1小时、任选10分钟或更短的干燥时间。
33.根据权利要求20-22中任一项的方法，还包括在玻璃化之前将玻璃化混合物孵育大于或等于5分钟且小于或等于30分钟。
34.根据权利要求33的方法，其中所述孵育在大于或等于18℃至小于或等于37℃的温度下进行。
35.根据权利要求20-22中任一项的方法，其中玻璃化混合物还包括裂解剂。
36.根据权利要求35的方法，其中裂解剂包含十二烷基硫酸钠(SDS)、2-[4-(2,4,4-三甲基戊-2-基)苯氧基]乙醇(例如Triton X-100)、CHAPS(3-[(3-胆酰胺丙基)二甲基铵]-1-丙磺酸盐)、盐酸胍或其组合。
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