CN115754077A

CN115754077A - 一种测定吡嗪酰胺中有关物质的方法

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Publication number: CN115754077A
Application number: CN202211497600.4A
Authority: CN
Inventors: 江永红; 陶冬梅; 刘蕾; 袁菊凤
Original assignee: Jiangsu Four Rings Biopharmaceutical Co ltd
Current assignee: Jiangsu Four Rings Biopharmaceutical Co ltd
Priority date: 2022-11-25
Filing date: 2022-11-25
Publication date: 2023-03-07

Abstract

本发明公开了一种测定吡嗪酰胺中有关物质的方法，包括如下步骤：(1)确定气相色谱条件；(2)配制对照品溶液、系统适用性溶液、供试品溶液、自身对照溶液；(3)进行方法学验证；(4)取稀释液以及配制的对照品溶液、系统适用性溶液、供试品溶液、自身对照溶液适量，注入液相色谱仪，记录液相色谱图，并根据液相色谱图分析测定吡嗪酸含量、2‑氰基吡嗪含量、未知单个杂质含量和总杂质含量。该方法专属性和针对性更强，对吡嗪酰胺中存在的特定杂质2‑氰基吡嗪和吡嗪酸可以进行准确的定量检测，并控制杂质限度，从而更有效地控制产品质量，为有关物质研究提供一定的基础。

Description

一种测定吡嗪酰胺中有关物质的方法

技术领域

本发明属于药物分析技术领域，特别涉及一种测定吡嗪酰胺中有关物质的方法。

背景技术

吡嗪酰胺为酰胺类抗结核药，常与其他抗结核药联合用于经一线抗结核药(如链霉素、异烟肼、利福平及乙胺丁醇)治疗无效的结核病，为我国和WHO推荐的抗结核基本药物，化学结构如下所示。

现有工艺合成吡嗪酰胺原料药主要以2-氰基吡嗪为起始原料，在碱性条件下水解得到吡嗪酰胺。未除尽的2-氰基吡嗪可能会引入最终产品中，而2-氰基吡嗪过度水解会产生吡嗪酸，因此，吡嗪酰胺中主要存在两种杂质：吡嗪酸和2-氰基吡嗪。

目前，欧美药典均将吡嗪酸作为吡嗪酰胺特异杂质进行检查。中国药典中吡嗪酰胺有关物质的检测方法比较简单，且限度宽泛，仅能控制总杂质≤0.2％，并不能对吡嗪酰胺中存在的特定杂质2-氰基吡嗪和吡嗪酸进行定量检测，因此产品质量控制存在一定隐患。因此，开发一种能够实现对吡嗪酸和2-氰基吡嗪的检测方法，对提高用药安全和吡嗪酰胺的质量控制具有重要意义。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种测定吡嗪酰胺中有关物质的方法。该方法专属性和针对性更强，对吡嗪酰胺中存在的特定杂质2-氰基吡嗪和吡嗪酸可以进行准确的定量检测，并控制杂质限度(2-氰基吡嗪≤0.1％、吡嗪酸≤0.1％、未知单个杂质≤0.05％、总杂质≤0.2％)，从而更有效地控制产品质量，为有关物质研究提供一定的基础。

为实现上述技术目的，达到上述技术效果，本发明通过以下技术方案实现：

一种测定吡嗪酰胺中有关物质的方法，包括如下步骤：

(1)确定气相色谱条件：

色谱柱：Kromasil C18，规格为4.6×250mm，5μm；

柱温：30℃；

流动相：体积比为92:8的水和甲醇；

流速：1.0mL/min；

检测波长：268nm；

进样量：20μl；

洗脱方式：等度洗脱；

(2)配制对照品溶液、系统适用性溶液、供试品溶液、自身对照溶液：

对照品溶液按照以下过程进行配制：取吡嗪酸对照品适量，加稀释液溶解并稀释，制成吡嗪酸对照品储备液；取2-氰基吡嗪对照品适量，加稀释液溶解并稀释，制成2-氰基吡嗪对照品储备液；精密量取吡嗪酸对照品储备液和2-氰基吡嗪储备液各适量，置于同一容器中，加稀释液稀释，制成对照品溶液；

系统适用性溶液按照以下过程进行配制：取吡嗪酰胺适量，加稀释液溶解并稀释，制成吡嗪酰胺溶液，然后精密量取吡嗪酰胺溶液、吡嗪酸对照品储备液和2-氰基吡嗪对照品储备液各适量，置于同一容器中，用流动相稀释，制成系统适用性溶液；其中，流动相为甲醇-水溶液；

供试品溶液按照以下过程进行配制：取吡嗪酰胺适量，加稀释液溶解并稀释，制成供试品溶液；

自身对照溶液按照以下过程进行配制：取供试品溶液适量，加稀释液稀释，制成自身对照溶液；

(3)进行方法学验证：

所述方法学验证包括专属性、检测限和定量限、线性关系、重复性、稳定性和耐用性；

(4)色谱分析测定

取稀释液以及配制的对照品溶液、系统适用性溶液、供试品溶液、自身对照溶液适量，注入液相色谱仪，记录液相色谱图，并根据液相色谱图分析测定吡嗪酸含量、2-氰基吡嗪含量、未知单个杂质含量和总杂质含量。

进一步的，吡嗪酸对照品储备液中的吡嗪酸对照品浓度为30～50μg/ml，2-氰基吡嗪对照品储备液中的2-氰基吡嗪对照品浓度为30～50μg/ml，对照品溶液中的吡嗪酸对照品浓度为0.3～0.5μg/ml，对照品溶液中的2-氰基吡嗪对照品浓度为0.3～0.5μg/ml。

进一步的，系统适用性溶液中的吡嗪酰胺浓度为30～50μg/ml，吡嗪酸对照品浓度为3～5μg/ml，2-氰基吡嗪对照品浓度为3～5μg/ml。

进一步的，供试品溶液中的吡嗪酰胺浓度为0.3～0.5mg/ml。

进一步的，所述步骤(2)中的稀释液均为纯化水。

进一步的，步骤(4)中，液相色谱图的记录时间为主成分峰保留时间的2倍。

进一步的，液相色谱图中的吡嗪酸峰与吡嗪酰胺峰的分离度均大于3.0，其余杂质与相邻峰的分离度大于1.5。

进一步的，该方法中，吡嗪酸在0.0801μg/mL～1.2013μg/mL的浓度范围内线性关系良好，吡嗪酰胺在0.0835μg/mL～1.2521μg/mL的浓度范围内线性关系良好，2-氰基吡嗪在0.1052μg/mL-1.5774μg/mL的浓度范围内线性关系良好。

本发明的有益效果是：本发明设计空白溶液(稀释液)、对照品溶液、系统适用性溶液、供试品溶液和自身对照溶液，通过配合，进行色谱分析测定，可以准确的测定吡嗪酰胺中有关物质的含量；通过方法学验证，本发明的检测方法专属性和针对性更强，灵敏度较高，线性关系良好，重复性、稳定性和耐用性良好，对吡嗪酰胺中存在的特定杂质2-氰基吡嗪和吡嗪酸可以进行准确的定量检测，并控制杂质限度(2-氰基吡嗪≤0.1％、吡嗪酸≤0.1％、未知单个杂质≤0.05％、总杂质≤0.2％)，从而更有效地控制产品质量，为有关物质研究提供一定的基础。

附图说明

图1为本发明实施例中的空白溶液的液相色谱图。

图2为本发明实施例中的系统适用性溶液的液相色谱图。

图3为本发明实施例中的对照品溶液的液相色谱图。

图4为本发明实施例中的供试品溶液的液相色谱图。

图5为本发明实施例中的自身对照溶液的液相色谱图。

具体实施方式

下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易于被本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。

本发明提供了一种测定吡嗪酰胺中有关物质的方法，包括如下步骤：

(1)确定气相色谱条件：

色谱柱：Kromasil C18，采用十八烷基硅烷键合硅胶作为填充剂；规格为：长度250mm，内径4.6mm，粒径5μm；

柱温：30℃；

流动相：体积比为92:8的水和甲醇；

流速：1.0mL/min；

检测波长：268nm；

进样量：20μl；

洗脱方式：等度洗脱；

(3)进行方法学验证：

(4)色谱分析测定

步骤(2)中，吡嗪酸对照品储备液中的吡嗪酸对照品浓度为30～50μg/ml，2-氰基吡嗪对照品储备液中的2-氰基吡嗪对照品浓度为30～50μg/ml，对照品溶液中的吡嗪酸对照品浓度为0.3～0.5μg/ml，对照品溶液中的2-氰基吡嗪对照品浓度为0.3～0.5μg/ml。

步骤(2)中，系统适用性溶液中的吡嗪酰胺浓度为30～50μg/ml，吡嗪酸对照品浓度为3～5μg/ml，2-氰基吡嗪对照品浓度为3～5μg/ml。

步骤(2)中，供试品溶液中的吡嗪酰胺浓度为0.3～0.5mg/ml。

步骤(2)中的稀释液均为纯化水。

步骤(4)中，液相色谱图的记录时间为主成分峰保留时间的2倍。

在本发明的方法中，液相色谱图中的吡嗪酸峰与吡嗪酰胺峰的分离度均大于3.0，其余杂质与相邻峰的分离度大于1.5。

在本发明的方法中，吡嗪酸在0.0801μg/mL～1.2013μg/mL的浓度范围内线性关系良好，吡嗪酰胺在0.0835μg/mL～1.2521μg/mL的浓度范围内线性关系良好，2-氰基吡嗪在0.1052μg/mL～1.5774μg/mL的浓度范围内线性关系良好。

实施例1

1.试剂与材料

采用的试剂和材料包括纯化水、甲醇(MeOH)-色谱级或同等级别、冰醋酸(HAC)-分析级或同等级别、吡嗪酰胺、吡嗪酸对照品、2-氰基吡嗪对照品。

2.仪器设备

液相色谱仪；

色谱柱：Kromasil C18，4.6×250mm，5μm或性能相近；

纯水制备仪；

分析天平；

超声仪；

pH计。

3.色谱条件

色谱柱	Kromasil C18，4.6×250mm，5μm
		柱温	30℃
流动相	水(用冰醋酸调节pH值至3.0)-甲醇(92:8)
		流速	1.0mL/min
检测波长	268nm
		进样量	20μl
洗脱方式	等度洗脱

4.配制溶液

4.1对照品储备液

吡嗪酸对照品储备液：取吡嗪酸对照品20mg，精密称定，置50mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5mL，置50mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，制成每1mL约含吡嗪酸对照品40μg的吡嗪酸对照品储备液；

2-氰基吡嗪对照品储备液：取2-氰基吡嗪对照品20mg，精密称定，置50mL量瓶中，用水溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取5mL，置50mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，制成每1mL约含2-氰基吡嗪40μg的2-氰基吡嗪对照品储备液。

4.2对照品溶液

分别精密量取吡嗪酸对照品储备液和2-氰基吡嗪对照品储备液各1mL，置100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，制成每1mL约含吡嗪酸对照品0.4μg和2-氰基吡嗪对照品0.4μg的对照品溶液。

4.3系统适用性溶液

取吡嗪酰胺约40mg，加水溶解并定量稀释至100mL，制成每1mL中约含吡嗪酰胺0.4mg的吡嗪酰胺溶液，精密量取1mL，置10mL量瓶中，分别加入吡嗪酸对照品储备液和2-氰基吡嗪对照品储备液各1mL，用流动相稀释至刻度，摇匀，制成每1mL约含吡嗪酰胺40μg、吡嗪酸对照品4μg和2-氰基吡嗪对照品4μg的系统适用性溶液。

4.4供试品溶液

取吡嗪酰胺约40mg，置100mL量瓶中，加水溶解并稀释制成每1mL中约含吡嗪酰胺0.4mg的供试品溶液。

4.5自身对照溶液

精密量取供试品溶液5mL，置50mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，再精密量取1mL，置100mL量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀，作为自身对照溶液。

5.色谱测定，包括以下步骤：

取空白溶液(稀释液)、对照品溶液、系统适用性溶液、供试品溶液、自身对照溶液各20μl，分别注入液相色谱仪，记录液相色谱图，并根据液相色谱图按照外标法以峰面积测定吡嗪酸含量、2-氰基吡嗪含量、未知单个杂质含量和总杂质含量。

图1-5为所得到的各个液相色谱图。

将上述吡嗪酰胺有关物质的检测方法的色谱条件进行方法学验证。

1、专属性考察

取上述空白溶液、对照品溶液和系统适用性溶液；按照上述检测条件进行分析，记录色谱图。空白溶液色谱图见图1；对照品溶液的色谱图见图3；系统适用性溶液的色谱图见图2。从附图可知，在此色谱条件下，溶剂和样品中其他杂质不干扰检测，吡嗪酸峰与吡嗪酰胺峰的分离度为8.02，有关物质的分离度符合要求，该方法专属性良好。

2、检测限和定量限考察

定量限溶液：移取2mL实施例1制备的杂质对照品溶液至10mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为定量限溶液。采用液相色谱法对上述定量限溶液进行检测，连续进样6次，液相色谱的具体条件如实施例1的表格所述。

检测限溶液：移取7mL上述定量限溶液至20mL容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，作为检测限溶液。采用液相色谱法对上述定量限溶液进行检测，连续进样3次，液相色谱的具体条件如实施例1的表格所述。

表1定量限检测限结果

从表中数据可知本发明提供的检测方法检测吡嗪酰胺中有关物质的检测限和定量限低，对吡嗪酰胺中有关物质的检测具有高灵敏度的特点。

表2定量限重复性试验结果

成分	1	2	3	4	5	6	RSD
								吡嗪酸	4.02	4.12	4.35	4.25	4.31	4.15	2.98％
2-氰基吡嗪	6.84	7.03	6.97	6.85	6.95	7.17	1.76％

从表中可以看出，6份分析重复性溶液中吡嗪酸、2-氰基吡嗪的含量的RSD值分别为2.98％、1.76％，均小于10％，表明本发明的检测方法的重复性良好。

3、线性关系

精密称取吡嗪酰胺、吡嗪酸和2-氰基吡嗪的对照品，分别配制6个浓度级别的标准溶液混合液，将上述标准溶液混合液按照上述色谱条件进样，测定峰面积，以标准溶液混合液中各组分的浓度为横坐标，峰面积为纵坐标，绘制标准工作曲线并建立线性方程。

表3各成分的线性试验结果

从结果中可以看出，吡嗪酸在0.0801μg/mL～1.2013μg/mL的浓度范围内线性关系良好，吡嗪酰胺在0.0835μg/mL～1.2521μg/mL的浓度范围内线性关系良好，2-氰基吡嗪在0.1052μg/mL～1.5774μg/mL的浓度范围内线性关系良好。

4、重复性考察

平行配制6份添加100％限度水平的已知杂质的模拟样品溶液，并按照上述色谱条件下进样测定，计算检测吡嗪酰胺中各有关物质含量的重复性。

表4重复性结果

成分	1	2	3	4	5	6	平均值	RSD
									吡嗪酸	0.155	0.155	0.159	0.163	0.163	0.161	0.159	2.35
2-氰基吡嗪	0.107	0.108	0.108	0.107	0.107	0.109	0.108	0.78

从表中数据可知本发明提供的检测方法检测吡嗪酰胺中有关物质，相对标准偏差(RSD)为0.78％、2.35％，表明本方法的重复性良好。

5、稳定性考察

精密称取吡嗪酰胺及有关物质的各成分对照品，按上述对照品溶液、自身对照溶液的配制方法制备，分别于0h、24h、36h下，在上述色谱条件下进行检测，溶液的稳定性结果见下表。

表5溶液稳定性结果

对照品溶液、自身对照溶液在24h、36h下，峰面积与0h峰面积的比值在95.0％-105.0％之间，表明本方法的稳定性良好。

6、耐用性考察

精密称取吡嗪酰胺有关物质的各成分对照品，按上述对照品溶液的配制方法制备，分别改变流动相起始比例、柱温和流速进行检测，其他检测条件不变。耐用性结果见下表。

表6不同流动相比例下耐用性结果

表7不同柱温下耐用性结果

表8不同流速下耐用性结果

从上述表中数据可知，通过改变流动相起始比例、柱温和流速三个因素检测吡嗪酰胺有关物质，吡嗪酸峰与吡嗪酰胺峰分离度均大于3.0，其余杂质与相邻峰的分离度大于1.5，符合有关物质研究杂质分离度的要求，表明本方法的耐用性良好。

从图1-5及上述6个方面的方法学考察可见，本发明提供的检测方法能快速有效地分离测定吡嗪酰胺的有关物质，从而达到对吡嗪酰胺纯度和有关物质含量的有效检测。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的修改或等效变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims

1.一种测定吡嗪酰胺中有关物质的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)确定气相色谱条件：

色谱柱：Kromasil C18，规格为4.6×250mm，5μm；

柱温：30℃；

流动相：体积比为92:8的水和甲醇；

流速：1.0mL/min；

检测波长：268nm；

进样量：20μl；

洗脱方式：等度洗脱；

(3)进行方法学验证：

(4)色谱分析测定

2.根据权利要求1所述的一种测定吡嗪酰胺中有关物质的方法，其特征在于，吡嗪酸对照品储备液中的吡嗪酸对照品浓度为30～50μg/ml，2-氰基吡嗪对照品储备液中的2-氰基吡嗪对照品浓度为30～50μg/ml，对照品溶液中的吡嗪酸对照品浓度为0.3～0.5μg/ml，对照品溶液中的2-氰基吡嗪对照品浓度为0.3～0.5μg/ml。

3.根据权利要求1所述的一种测定吡嗪酰胺中有关物质的方法，其特征在于，系统适用性溶液中的吡嗪酰胺浓度为30～50μg/ml，吡嗪酸对照品浓度为3～5μg/ml，2-氰基吡嗪对照品浓度为3～5μg/ml。

4.根据权利要求1所述的一种测定吡嗪酰胺中有关物质的方法，其特征在于，供试品溶液中的吡嗪酰胺浓度为0.3～0.5mg/ml。

5.根据权利要求1所述的一种测定吡嗪酰胺中有关物质的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的稀释液均为纯化水。

6.根据权利要求1所述的一种测定吡嗪酰胺中有关物质的方法，其特征在于，步骤(4)中，液相色谱图的记录时间为主成分峰保留时间的2倍。

7.根据权利要求1所述的一种测定吡嗪酰胺中有关物质的方法，其特征在于，液相色谱图中的吡嗪酸峰与吡嗪酰胺峰的分离度均大于3.0，其余杂质与相邻峰的分离度大于1.5。

8.根据权利要求1所述的一种测定吡嗪酰胺中有关物质的方法，其特征在于，该方法中，吡嗪酸在0.0801μg/mL～1.2013μg/mL的浓度范围内线性关系良好，吡嗪酰胺在0.0835μg/mL～1.2521μg/mL的浓度范围内线性关系良好，2-氰基吡嗪在0.1052μg/mL～1.5774μg/mL的浓度范围内线性关系良好。