CN115747114A - 分离培养牛种布鲁氏菌的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种分离培养牛种布鲁氏菌的方法。该方法涉及选择性双相培养瓶或选择性需氧血培养瓶，培养基组分包括酪蛋白胰酶消化物、大豆木瓜蛋白酶水解物、氯化钠、葡萄糖、磷酸氢二钾、聚茴香脑磺酸钠、盐酸吡哆醇、复合维生素、琼脂、柠檬酸和黄芩素等。本发明通过制作选择性双相培养瓶和选择性需氧血培养瓶，选择性培养疑似布鲁氏菌菌落的牛种布鲁氏菌，操作简单，无需较高的专业技能，通过观察菌落的有无即可判断是否为牛种布鲁氏菌感染，可应用于布鲁氏菌种型鉴定涉及的研究等，切实为我国布病防控提供技术保障。
Description
技术领域
本发明涉及微生物培养技术领域，具体地说，涉及一种分离培养牛种布鲁氏菌的方法。
背景技术
布鲁氏菌(Brucella)能够引起全球人畜共患流行病—布鲁氏菌病(简称布病)。近年来，布病的发病率逐年增高，已经严重影响公共卫生安全及经济发展。目前，布鲁氏菌已经被发现有12个种，常见引起人间布病感染的布鲁氏菌主要是羊种(B.melitensis)、牛种(B.abortus)、猪种(B.suis)和犬种(B.canis)。布病的感染人群主要为农牧民、兽医、屠宰工，特别是畜牧业发达的省市及自治区等感染和发病率较高。
布鲁氏菌的分离培养是布病诊断的金标准。现阶段，在获得疑似菌落后，研究人员需要利用传统的生化表型方法(包括CO2的需求试验、H2S试验、单项特异性血清凝集试验、染料抑菌试验以及噬菌体裂解试验等)和分子生物学方法(包括PCR、MLVA、MLST、RT-PCR等)鉴定布鲁氏菌的种型，耗时长，成本高，需要较高的专业技能，且对实验条件要求较高。
发明内容
本发明的目的是提供一种分离培养牛种布鲁氏菌的方法。
本发明构思如下：发明人利用牛种、羊种、猪种和犬种布鲁氏菌筛选2000多种小分子药物发现牛种布鲁氏菌对部分小分子药物存在抗性，通过对牛种8个亚型(1、2、3、4、5、6、7、9型)、羊种3个亚型(1、2、3型)、猪种5个亚型(1、2、3、4、5型)和犬种1个亚型的再次试验，确认牛种布鲁氏菌对部分小分子药物存在抗性。根据部分小分子药物制作牛种布鲁氏菌选择性双相培养瓶和选择性需氧血培养瓶，结合普通双相培养瓶和需氧血培养瓶的结果，可以判断是否为牛种布鲁氏菌感染。
为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种组合物在制备用于分离培养牛种布鲁氏菌的培养基中的应用，所述组合物由柠檬酸和黄芩素组成，各成分在培养基中的含量分别为：柠檬酸8-256ng/L和黄芩素16-256ng/L。
第二方面，本发明提供一种选择性双相培养基，由固体培养基和液体培养基两部分组成；
其中，所述固体培养基包含酪蛋白胰酶消化物15g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物5g/L、氯化钠5g/L、柠檬酸8-256ng/L、黄芩素16-256ng/L、琼脂15g/L。
所述液体培养基包含酪蛋白胰酶消化物15g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖2.5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、柠檬酸8-256ng/L、黄芩素16-256ng/L、聚茴香脑磺酸钠(SPS)35mg/L和复合维生素5mg/L。
第三方面，本发明提供所述选择性双相培养基的制备方法，包括以下步骤：
A、制备固体培养基：称取酪蛋白胰酶消化物15g、大豆木瓜蛋白酶水解物5g、氯化钠5g、琼脂15g，用1L去离子水加热溶解后，分装20-30mL置于双相培养瓶中，121℃高压灭菌15-20min；称取柠檬酸和黄芩素，用DMSO溶解，使其浓度分别80-2560mg/L和160-2560mg/L，过滤除菌后各取100μL加入冷却至约50℃未凝固的培养基中，混匀后平置至冷却凝固；
B、制备液体培养基：称取酪蛋白胰酶消化物15g、大豆木瓜蛋白酶水解物3g、氯化钠5g、磷酸氢二钾2.5g，用1L去离子水溶解后121℃高压灭菌15-20min，得到溶液I；称取柠檬酸和黄芩素，用DMSO溶解，使其浓度分别为80-2560mg/L和160-2560mg/L，称取葡萄糖、聚茴香脑磺酸钠、复合维生素用去离子水溶解，使其浓度分别为250g/L、35g/L、5g/L，过滤除菌后加入所述溶液中，使其终浓度分别为柠檬酸8-256ng/L、黄芩素16-256ng/L、葡萄糖2.5g/L、SPS 35mg/L和复合维生素5mg/L，即为液体培养基，添加到步骤A的含有固体培养基的双相培养瓶中，每瓶双相培养瓶中分装25-30mL。
第四方面，本发明提供所述选择性双相培养基在分离培养牛种布鲁氏菌中的应用(含非疾病诊断目的)。
第五方面，本发明提供一种分离培养牛种布鲁氏菌的方法(含非疾病诊断目的)，包括以下步骤：
(1)将待测液体样本分成两等份，一份注入选择性双相培养瓶中，另一份注入普通双相培养瓶中，将双相培养瓶放入37℃5-10％ CO2培养箱中培养，液相充分浸润固相4-12h后倾斜培养；
其中，所述选择性双相培养瓶装有所述选择性双相培养基；
所述普通双相培养瓶装有普通双相培养基，所述普通双相培养基不含有本发明所述的组合物；
(2)培养1-4周(优选培养1-2周)后，观察培养结果：
有细菌感染的情况：
a.双相培养瓶中可见液相部分浑浊，固相部分可见单菌落生长；
b.若单菌落呈圆形，直径1-2mm，边缘光滑，菌落呈光泽、半透明的浅黄色，此为疑似布鲁氏菌；
c.若选择性双相培养瓶及普通双相培养瓶中均有此单菌落生长，则为牛种布鲁氏菌；若选择性双相培养瓶无此单菌落生长而普通双相培养瓶有此单菌落生长，则为羊种、猪种或犬种布鲁氏菌；若选择性双相培养瓶有此单菌落生长而普通双相培养瓶无此单菌落生长，则试验失败，需重复进行验证。
无细菌感染的情况：若选择性双相培养基及普通培养基均液相部分清澈，固相部分无单菌落或菌苔生长，则样品中未有细菌感染；
第六方面，本发明提供一种选择性需氧血培养基，所述选择性需氧血培养基是包含酪蛋白胰酶消化物17g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3g/L、聚茴香脑磺酸钠35mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、柠檬酸8-256ng/L、黄芩素16-256ng/L、氨基酸复合物5mg/L、和复合维生素5mg/L的液体培养基。
第七方面，本发明提供所述选择性需氧血培养基的制备方法，所述方法包括：称取酪蛋白胰酶消化物17g、大豆木瓜蛋白酶水解物3g，用1L去离子水溶解后分装于血培养瓶中，121℃高压灭菌15-20min；称取氨基酸复合物、复合维生素、聚茴香脑磺酸钠、盐酸吡哆醇用去离子水溶解，过滤除菌后加入血培养瓶中，使其终浓度分别为5mg/L、5mg/L、35mg/L、1mg/L，称取柠檬酸和黄芩素利用DMSO溶解，使其终浓度分别为8-256ng/L和16-256ng/L，加入血培养瓶中。
第八方面，本发明提供所述选择性需氧血培养基在分离培养牛种布鲁氏菌中的应用(含非疾病诊断目的)。
第九方面，本发明提供一种分离培养牛种布鲁氏菌的方法(含非疾病诊断目的)，包括以下步骤：
1)血清学检测布病阳性样品进行需氧血培养瓶分离培养布鲁氏菌：将待测液体样本分成两等份，一份注入选择性需氧血培养瓶中，另一份注入普通需氧血培养瓶中，将血培养瓶放入全自动血培养仪中培养；
其中，所述选择性需氧血培养瓶装有所述选择性需氧血培养基；
所述普通需氧血培养瓶装有普通需氧血培养基，所述普通需氧血培养基不含有本发明所述的组合物；
2)培养1-4周(优选培养1-2周)后，通过观察生长曲线判断样本中是否存在牛种布鲁氏菌：若选择性血培养瓶及普通血培养瓶中均有菌株生长曲线，则为牛种布鲁氏菌；若选择性血培养瓶无生长曲线而普通血培养瓶有生长曲线，则为羊种、猪种或犬种布鲁氏菌；若选择性血培养瓶及普通血培养瓶均无生长曲线，则样品中未培养出细菌；若选择性血培养瓶有生长曲线而普通血培养瓶无生长曲线，则试验失败，需重复进行验证。有生长曲线的需氧血培养瓶建议转移5-10mL液体至双相培养瓶中培养，用于获得单菌落。
本发明中，所述待测液体样本选自血液、血清、奶样、组织匀浆、气溶胶液体等液体样本中的任意一种，且为血清学检测布病阳性样本。
借由上述技术方案，本发明至少具有下列优点及有益效果：
本发明通过制作选择性双相培养瓶和选择性需氧血培养瓶，选择性培养疑似布鲁氏菌菌落的牛种布鲁氏菌，操作简单，无需较高的专业技能，通过观察菌落的有无即可判断是否为牛种布鲁氏菌感染，可应用于布鲁氏菌种型鉴定涉及的研究、诊断等，切实为我国布病防控提供技术保障。
附图说明
图1为本发明较佳实施例中利用双相培养瓶选择性培养牛种布鲁氏菌。其中，瓶身标记有试验日期，“B.abortus、B.melitensis、B.suis和B.canis”为添加不同种布鲁氏菌的双相培养瓶。A为添加牛种布鲁氏菌，左为普通双相培养瓶，右为选择性双相培养瓶，标记为ART+，两者皆液相浑浊，固相有菌苔生长；B为添加羊种布鲁氏菌，左为选择性双相培养瓶，标记为ART+，右为普通双相培养瓶，右瓶液相浑浊，固相有菌苔生长；C为添加猪种布鲁氏菌，左为选择性双相培养瓶，标记为ART+，右为普通双相培养瓶，右瓶液相浑浊，固相有菌苔生长；D为犬种布鲁氏菌，左为普通双相培养瓶，右为选择性双相培养瓶，标记为ART+，左瓶液相浑浊，固相有菌苔生长。
图2为本发明较佳实施例中利用需氧血培养瓶选择性培养牛种布鲁氏菌的生长曲线。纵坐标为仪器自动输出的吸光度值，横坐标为培养时间。A为普通需氧血培养瓶牛种布鲁氏菌生长曲线，B为选择性需氧血培养瓶牛种布鲁氏菌生长曲线，C为普通需氧血培养瓶羊种布鲁氏菌生长曲线，D为选择性需氧血培养瓶羊种布鲁氏菌生长曲线，E为普通需氧血培养瓶猪种布鲁氏菌生长曲线，F为选择性需氧血培养瓶猪种布鲁氏菌生长曲线，G为普通需氧血培养瓶犬种布鲁氏菌生长曲线，H为选择性需氧血培养瓶犬种布鲁氏菌生长曲线。
图3为本发明较佳实施例中选择性双相培养瓶混合培养多种布鲁氏菌后单菌落荧光定量扩增曲线。
具体实施方式
本发明旨在提供一种快速、简便、有效的方法用于鉴别布鲁氏菌感染样品中的牛种布鲁氏菌感染，用于解决布病临床和防控过程中快速种型鉴定的问题，该方法能够快速、直观地鉴别牛种布鲁氏菌感染。本发明涉及仪器常见，无需经过复杂的鉴定试验，目测即可确定是否为牛种布鲁氏菌感染，此法可应用于临床感染样品鉴别。
本发明采用如下技术方案：
本发明涉及选择性双相培养瓶和选择性需氧血培养瓶，分别如下：
选择性双相培养瓶由固体培养基和液体培养基两部分组成，每瓶中含有20-30mL固相培养基及25-30mL液相培养基，其中，固相培养基包含酪蛋白胰酶消化物15g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物5g/L、氯化钠5g/L、柠檬酸8-256ng/L、黄芩素16-256ng/L、琼脂15g/L；液相培养基包含酪蛋白胰酶消化物15g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖2.5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、柠檬酸8-256ng/L、黄芩素16-256ng/L、聚茴香脑磺酸钠(SPS)35mg/L、复合维生素5mg/L。
选择性需氧血培养瓶每瓶中含有30mL液体培养基，包含酪蛋白胰酶消化物17g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3g/L、SPS 35mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、柠檬酸8-256ng/L、黄芩素16-256ng/L以及其他复合氨基酸(即氨基酸复合物)5mg/L和复合维生素5mg/L。
本发明用于对照的普通双相培养瓶和普通需氧血培养瓶分别为：普通双相培养瓶由固体培养基和液体培养基两部分组成，每瓶中含有20mL固相培养基及25mL液相培养基，其中，固相培养基包含酪蛋白胰酶消化物15g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物5g/L、氯化钠5g/L、琼脂15g/L；液相培养基包含酪蛋白胰酶消化物15g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖2.5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、聚茴香脑磺酸钠(SPS)35mg/L、复合维生素5mg/L。
普通需氧血培养瓶每瓶中含有30mL液体培养基，包含酪蛋白胰酶消化物17g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3g/L、SPS 35mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L，以及其他复合氨基酸(即氨基酸复合物)5mg/L和复合维生素5mg/L。
本发明提供一种分离培养牛种布鲁氏菌的方法(涉及选择性双相培养瓶)，包括如下步骤：
(1)无菌取10mL全血等待检液体注入选择性双相培养瓶中，同时，无菌取10mL注入普通双相培养瓶中，双相培养瓶放入37℃二氧化碳培养箱中培养(CO2含量为5-10％)，液相充分浸润固相4h后倾斜培养。
(2)隔日观察培养瓶的生长情况，同时轻摇培养瓶，使得液相均匀铺满固相表面。
(3)结果判定：
有细菌感染的情况：
双相培养瓶中，培养1-2周内可见液相部分浑浊，固相部分可见单菌落生长。如单菌落呈圆形，直径1-2mm，边缘光滑，菌落呈光泽、半透明的浅黄色，此为疑似布鲁氏菌。若选择性双相培养瓶及普通双相培养瓶中均有此单菌落生长，则为牛种布鲁氏菌；若选择性双相培养瓶无此单菌落生长而普通双相培养瓶有此单菌落生长，则为羊种、猪种或犬种等布鲁氏菌；若选择性双相培养瓶有此单菌落生长而普通双相培养瓶无此单菌落生长，则试验失败，需重复进行验证。
无细菌感染的情况：若选择性双相培养基及普通培养基均液相部分清澈，固相部分无单菌落/菌苔生长，则样品中未有细菌感染。
本发明提供一种分离培养牛种布鲁氏菌的方法(涉及选择性需氧血培养瓶)，包括如下步骤：
(1)血清学检测布病阳性进行需氧血培养瓶分离培养布鲁氏菌。无菌取10mL全血等待检液体注入选择性需氧血培养瓶中，同时，无菌取10mL注入普通需氧血培养瓶中，需氧血培养瓶放入全自动血培养仪中培养。
(2)观察全自动血培养仪对应位置的生长曲线。一般培养1-2周，最长观察4周。
(3)结果判定：血培养瓶中，通过观察生长曲线判断样品中是否存在牛种布鲁氏菌。若选择性血培养瓶及普通血培养瓶中均有菌株生长曲线，则为牛种布鲁氏菌；若选择性血培养瓶无生长曲线而普通血培养瓶有生长曲线，则为羊种、猪种或犬种等布鲁氏菌；若选择性血培养瓶及普通血培养瓶均无生长曲线，则样品中未培养出细菌；若选择性血培养瓶有生长曲线而普通血培养瓶无生长曲线，则试验失败，需重复进行验证。
本发明提供的分离培养牛种布鲁氏菌的方法，其直接目的是鉴别牛种布鲁氏菌感染，而非获取疾病诊断结果。
本发明提供一种能够快速、有效、直观地判断是否为牛种布鲁氏菌感染，可应用于布鲁氏菌种型鉴定涉及的研究、诊断等。本发明涉及仪器常见，无需较高的专业技能，通过观察菌落的有无即可判断是否为牛种布鲁氏菌感染，可应用于布鲁氏菌种型鉴定涉及的研究、诊断等，该方法完全可以推广应用，有助于推动布病的诊断和防控。
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例所用试验材料及试验仪器如下：
1.试验材料
羊种1型标准菌株16M、牛种1型标准菌株2308、猪种1型标准菌株1330、犬种标准菌株RM6/66均由中国农业科学院北京畜牧兽医研究所动物生物安全与公共卫生防控团队保存，其复苏、传代及接种均在北京市动物疫病预防控制中心生物安全三级实验室(BSL-3)内完成。
制备培养基用的酪蛋白胰酶消化物、大豆木瓜蛋白酶水解物、琼脂购自BD公司；氯化钠、葡萄糖、聚茴香脑磺酸钠(SPS)、磷酸氢二钾、盐酸吡哆醇购自国药公司；复合维生素、柠檬酸、黄芩素、复合氨基酸购自索莱宝公司；培养瓶按照仪器所需定制，配置所需双蒸水经高压灭菌。其他生化试剂均为进口分装或国产分析纯；布鲁氏菌牛种、羊种、猪种核酸检测试剂盒(探针法)购自青岛中创汇科公司。
2.试验仪器
CO2培养箱(Thermo Fisher公司)，全自动血培养仪(梅里埃公司)，细菌比浊仪(梅里埃公司)，荧光定量检测仪(BioRad公司)。
实施例1双相培养瓶的制备
(1)普通双相培养瓶的制备
a.高压灭菌固相培养基。称取酪蛋白胰酶消化物15g、大豆木瓜蛋白酶水解物5g、氯化钠5g、琼脂15g，利用1L去离子水加热溶解后，分装20mL置于双相培养瓶中，121℃高压灭菌20min，平置至冷却凝固。
b.高压灭菌液相培养基。称取酪蛋白胰酶消化物15g、大豆木瓜蛋白酶水解物3g、氯化钠5g、磷酸氢二钾2.5g，利用1L去离子水溶解后121℃高压灭菌20min；称取葡萄糖、聚茴香脑磺酸钠(SPS)、复合维生素利用去离子水溶解，使其浓度分别为250g/L、35g/L、5g/L，过滤除菌后加入液体培养基中，使其终浓度分别为葡萄糖2.5g/L、SPS 35mg/L和复合维生素5mg/L，每瓶双相培养瓶中分装25mL。
(2)选择性双相培养瓶的制备
a.高压灭菌固相培养基。称取酪蛋白胰酶消化物15g、大豆木瓜蛋白酶水解物5g、氯化钠5g、琼脂15g，利用1L去离子水加热溶解后，分装20mL置于双相培养瓶中，121℃高压灭菌20min；称取柠檬酸和黄芩素，利用DMSO溶解，使其浓度分别80mg/L和160mg/L，过滤除菌后各取100μL加入冷却至约50℃左右未凝固的培养基中，混匀后平置至冷却凝固。
b.高压灭菌液相培养基。称取酪蛋白胰酶消化物15g、大豆木瓜蛋白酶水解物3g、氯化钠5g、磷酸氢二钾2.5g，利用1L去离子水溶解后121℃高压灭菌20min；称取柠檬酸和黄芩素，利用DMSO溶解，使其浓度分别为80mg/L和160mg/L，称取葡萄糖、SPS、复合维生素利用去离子水溶解，使其浓度分别为250g/L、35g/L、5g/L，过滤除菌后加入液体培养基中，使其终浓度分别为柠檬酸为8ng/L、黄芩素为16ng/L、葡萄糖2.5g/L、SPS 35mg/L和复合维生素5mg/L，每瓶双相培养瓶中分装25mL。
实施例2需氧血培养瓶的制备
(1)普通需氧血培养瓶的制备
称取酪蛋白胰酶消化物17g、大豆木瓜蛋白酶水解物3g，利用1L去离子水溶解后每瓶30mL分装121℃高压灭菌20min；称取氨基酸复合物、复合维生素、SPS、盐酸吡哆醇、用去离子水溶解，过滤除菌后加入血培养瓶中，使其终浓度分别为5mg/L、5mg/L、35mg/L、1mg/L。
(2)选择性需氧血培养瓶的制备
称取酪蛋白胰酶消化物17g、大豆木瓜蛋白酶水解物3g，利用1L去离子水溶解后每瓶30mL分装121℃高压灭菌20min；称取氨基酸复合物、复合维生素、SPS、盐酸吡哆醇用去离子水溶解，过滤除菌后加入血培养瓶中，使其终浓度分别为5mg/L、5mg/L、35mg/L、1mg/L，称取柠檬酸和黄芩素，利用DMSO溶解，使其终浓度分别为8ng/L和16ng/L，加入血培养瓶中。
实施例3选择性培养牛种布鲁氏菌(涉及选择性双相培养瓶)
(1)菌液制备
划线培养不同种布鲁氏菌菌株96h后，利用比浊仪调整菌株比浊度为0.5McF(约为1×108CFU/mL)。
(2)布鲁氏菌标准菌株培养
制备的菌液100倍稀释后取100μL菌液加入普通和选择性双相培养瓶中。双相培养瓶放入37℃二氧化碳培养箱中培养(CO2含量为5-10％)，液相充分浸润固相4-12小时后倾斜培养。隔日观察培养瓶的生长情况，同时轻摇培养瓶，使得液相均匀铺满固相表面。一般培养1-2周，最长观察4周。
(3)结果判定
有细菌感染的情况：
双相培养瓶中，培养1-2周内可见液相部分浑浊，固相部分可见单菌落生长。如单菌落呈圆形，直径1-2mm，边缘光滑，菌落呈光泽、半透明的浅黄色，此为疑似布鲁氏菌。若选择性双相培养瓶及普通双相培养瓶中均有此单菌落生长，则为牛种布鲁氏菌；若选择性双相培养瓶无此单菌落生长而普通双相培养瓶有此单菌落生长，则为羊种、猪种或犬种等布鲁氏菌；若选择性双相培养瓶有此单菌落生长而普通双相培养瓶无此单菌落生长，则试验失败，需重复进行验证。
无细菌感染的情况：若选择性双相培养基及普通培养基均液相部分清澈，固相部分无单菌落/菌苔生长，则样品中未有细菌感染。
利用双相培养瓶选择性培养牛种布鲁氏菌见图1。
实施例4选择性培养牛种布鲁氏菌(涉及选择性需氧血培养瓶)
(1)菌液制备
划线培养不同种布鲁氏菌菌株96h后，利用比浊仪调整菌株比浊度为0.5McF(约为1×108CFU/mL)。
(2)布鲁氏菌标准菌株培养
制备的菌液100倍稀释后取100μL菌液加入普通和选择性需氧血培养瓶中。将需氧血培养瓶放入全自动血培养仪中培养。对于血培养瓶而言，观察全自动血培养仪对应位置的生长曲线。一般培养1-2周，最长观察4周。
(3)结果判定
血培养瓶中，通过观察生长曲线判断样品中是否存在牛种布鲁氏菌。若选择性血培养瓶及普通血培养瓶中均有菌株生长曲线，则为牛种布鲁氏菌；若选择性血培养瓶无生长曲线而普通血培养瓶有生长曲线，则为羊种、猪种或犬种等布鲁氏菌；若选择性血培养瓶及普通血培养瓶均无生长曲线，则样品中未培养出细菌；若选择性血培养瓶有生长曲线而普通血培养瓶无生长曲线，则试验失败，需重复进行验证。
利用需氧血培养瓶选择性培养牛种布鲁氏菌的生长曲线见图2。
实施例5选择性双相培养瓶培养布鲁氏菌
由于选择性血培养瓶无法观察到单菌落，因此混合培养鉴定以选择性双相培养瓶为例进行。
(1)菌液制备
划线培养不同种布鲁氏菌菌株48h后，利用比浊仪调整菌株比浊度为0.5McF(约为1×108CFU/mL)。将各个菌株倍比稀释成为100CFU/mL。
(2)布鲁氏菌培养
不同种布鲁氏菌各取100μL菌液混匀后加入加入普通和选择性双相培养瓶中。双相培养瓶放入37℃二氧化碳培养箱中培养(CO2含量为5-10％)，液相充分浸润固相4-12小时后倾斜培养。隔日观察培养瓶的生长情况，同时轻摇培养瓶，使得液相均匀铺满固相表面。
(3)荧光定量检测
取固相生长的单菌落加入100μL生理盐水中制成菌悬液，取2μL菌悬液利用荧光定量试剂盒检测，按试剂盒说明配置体系，进行布鲁氏菌种鉴定。
(4)结果判定
双相培养瓶中，培养5d内可见液相部分浑浊，固相部分可见7个单菌落生长。单菌落呈圆形，直径1-2mm，边缘光滑，菌落呈光泽、半透明的浅黄色。
7个单菌落荧光定量检测VIC通道均有扩增曲线，按试剂盒说明，均为牛种布鲁氏菌，阳性对照为牛种标准菌株菌落，VIC通道也有扩增曲线，其余种通道均无扩增曲线。扩增曲线见图3，共检测7个待测单菌落及1个牛种标准菌株菌落，扩增曲线为牛种布鲁氏菌曲线，与预期结果一致。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.组合物在制备用于分离培养牛种布鲁氏菌的培养基中的应用，所述组合物由柠檬酸和黄芩素组成，各成分在培养基中的含量分别为：柠檬酸8-256ng/L和黄芩素16-256ng/L。
2.选择性双相培养基，其特征在于，由固体培养基和液体培养基两部分组成；
其中，所述固体培养基包含酪蛋白胰酶消化物15g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物5g/L、氯化钠5g/L、柠檬酸8-256ng/L、黄芩素16-256ng/L、琼脂15g/L；
所述液体培养基包含酪蛋白胰酶消化物15g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3g/L、氯化钠5g/L、葡萄糖2.5g/L、磷酸氢二钾2.5g/L、柠檬酸8-256ng/L、黄芩素16-256ng/L、聚茴香脑磺酸钠35mg/L和复合维生素5mg/L。
3.权利要求2所述选择性双相培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
A、制备固体培养基：称取酪蛋白胰酶消化物15g、大豆木瓜蛋白酶水解物5g、氯化钠5g、琼脂15g，用1L去离子水加热溶解后，分装20-30mL置于双相培养瓶中，121℃高压灭菌15-20min；称取柠檬酸和黄芩素，用DMSO溶解，使其浓度分别为80-2560mg/L和160-2560mg/L，过滤除菌后各取100μL加入冷却至50℃未凝固的培养基中，混匀后平置至冷却凝固；
B、制备液体培养基：称取酪蛋白胰酶消化物15g、大豆木瓜蛋白酶水解物3g、氯化钠5g、磷酸氢二钾2.5g，用1L去离子水溶解后121℃高压灭菌15-20min，得到溶液I；称取柠檬酸和黄芩素，用DMSO溶解，使其浓度分别为80-2560mg/L和160-2560mg/L，称取葡萄糖、聚茴香脑磺酸钠、复合维生素用去离子水溶解，使其浓度分别为250g/L、35g/L、5g/L，过滤除菌后加入所述溶液I中，使其终浓度分别为柠檬酸8-256ng/L、黄芩素16-256ng/L、葡萄糖2.5g/L、SPS 35mg/L和复合维生素5mg/L，即为液体培养基，添加到步骤A的含有固体培养基的双相培养瓶中，每瓶双相培养瓶中分装25-30mL。
4.权利要求2所述选择性双相培养基在分离培养牛种布鲁氏菌中的应用；所述应用为非疾病诊断目的。
5.分离培养牛种布鲁氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将待测液体样本分成两等份，一份注入选择性双相培养瓶中，另一份注入普通双相培养瓶中，将双相培养瓶放入37℃5-10％CO2培养箱中培养，液相充分浸润固相4-12h后倾斜培养；
其中，所述选择性双相培养瓶装有权利要求2所述的选择性双相培养基；
所述普通双相培养瓶装有普通双相培养基，所述普通双相培养基不含有权利要求1所述的组合物；
(2)培养1-4周后，观察培养结果：
有细菌感染的情况：
a.双相培养瓶中可见液相部分浑浊，固相部分可见单菌落生长；
b.若单菌落呈圆形，直径1-2mm，边缘光滑，菌落呈光泽、半透明的浅黄色，此为疑似布鲁氏菌；
c.若选择性双相培养瓶及普通双相培养瓶中均有此单菌落生长，则为牛种布鲁氏菌；若选择性双相培养瓶无此单菌落生长而普通双相培养瓶有此单菌落生长，则为羊种、猪种或犬种布鲁氏菌；若选择性双相培养瓶有此单菌落生长而普通双相培养瓶无此单菌落生长，则试验失败，需重复进行验证；
无细菌感染的情况：若选择性双相培养基及普通培养基均液相部分清澈，固相部分无单菌落或菌苔生长，则样品中未有细菌感染；
所述方法为非疾病诊断目的。
6.选择性需氧血培养基，其特征在于，所述选择性需氧血培养基是包含酪蛋白胰酶消化物17g/L、大豆木瓜蛋白酶水解物3g/L、聚茴香脑磺酸钠35mg/L、盐酸吡哆醇1mg/L、柠檬酸8-256ng/L、黄芩素16-256ng/L、氨基酸复合物5mg/L和复合维生素5mg/L的液体培养基。
7.权利要求6所述选择性需氧血培养基的制备方法，其特征在于，所述方法包括：称取酪蛋白胰酶消化物17g、大豆木瓜蛋白酶水解物3g，用1L去离子水溶解后分装于血培养瓶中，121℃高压灭菌15-20min；称取氨基酸复合物、复合维生素、聚茴香脑磺酸钠、盐酸吡哆醇用去离子水溶解，过滤除菌后加入血培养瓶中，使其终浓度分别为5mg/L、5mg/L、35mg/L、1mg/L，称取柠檬酸和黄芩素，利用DMSO溶解，使其终浓度分别为8-256ng/L和16-256ng/L，加入血培养瓶中。
8.权利要求6所述选择性需氧血培养基在分离培养牛种布鲁氏菌中的应用；所述应用为非疾病诊断目的。
9.分离培养牛种布鲁氏菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)将待测液体样本分成两等份，一份注入选择性需氧血培养瓶中，另一份注入普通需氧血培养瓶中，将血培养瓶放入全自动血培养仪中培养；
其中，所述选择性需氧血培养瓶装有权利要求6所述的选择性需氧血培养基；
所述普通需氧血培养瓶装有普通需氧血培养基，所述普通需氧血培养基不含有权利要求1所述的组合物；
2)培养1-4周后，通过观察生长曲线判断样本中是否存在牛种布鲁氏菌：若选择性血培养瓶及普通血培养瓶中均有菌株生长曲线，则为牛种布鲁氏菌；若选择性血培养瓶无生长曲线而普通血培养瓶有生长曲线，则为羊种、猪种或犬种布鲁氏菌；若选择性血培养瓶及普通血培养瓶均无生长曲线，则样品中未培养出细菌；若选择性血培养瓶有生长曲线而普通血培养瓶无生长曲线，则试验失败，需重复进行验证；
所述方法为非疾病诊断目的。
10.根据权利要求5或9所述的方法，其特征在于，所述待测液体样本选自血液、血清、奶样、组织匀浆、气溶胶液体，且为血清学检测布病阳性样本。
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