CN115746957A - 一种诺丽精油在抑制奇异变形杆菌中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提出了一种诺丽精油在抑制奇异变形杆菌中的应用，包括诺丽精油在抑制奇异变形杆菌、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌或伤寒杆菌中的应用。通过将诺丽果实破碎，‑20～4℃贮藏3‑5d，浸泡提取，水蒸气蒸馏后，获得诺丽精油。本发明提取获得的诺丽精油对奇异变形杆菌、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌和伤寒杆菌均具有良好的抑菌活性，其最低抑菌浓度为0.391～1.563μL/mL，尤其对奇异变形杆菌具有较明显的抑制作用，其最低抑菌浓度可达0.391μL/mL，最小杀菌浓度可达1.563μL/mL，可将诺丽精油有效地应用于制备抑制奇异变形杆菌的抑菌产品或药物中。
Description
技术领域
本发明涉及植物精油领域，特别涉及一种诺丽精油在抑制奇异变形杆菌中的应用。
背景技术
植物精油作为一种天然、无危害的抑菌、抗氧化剂原材料，近年来受到广泛学者的关注。通过对植物精油的抑菌活性研究，寻找具备良好抑菌活性的植物精油，有利于在抑菌产品中的广泛应用。
诺丽为茜草科海滨木巴戟Morinda citrifolia L.的果实，具有滋补肝肾，强筋健骨，益气养阴的功效。用于肝肾不足，腰膝酸软，筋骨痿弱；气阴亏虚，疲倦口渴。普遍认为诺丽可用于延缓衰老、预防疾病、改善疼痛，对治疗糖尿病、肿瘤、关节炎、高血压、心脏病等慢性疾病有很好的疗效。临床研究证实，诺丽抗氧化、减轻骨质疏松症、改善关节疼痛及活动度、降血脂、降血糖、降压、提高耐力、抗癌、抗炎、保肝。诺丽中的挥发性成分大多具有芳香气味，这些化合物大多具有芳香气味，常被应用在食品和香料中，并且具有丰富的生物活性，诺丽果中最主要的挥发性化合物为辛酸，辛酸含量最高是诺丽成熟鲜果实中所谓“腐臭的奶酪”气味的主要来源。正辛酸是一种有机化合物，分子式为C8H16O2，为无色透明油状液体。又名羊脂酸，属于脂肪酸类，有汗臭气味，略有不舒适的气味，微溶于热水，溶于乙醇、苯、乙醚。用于制染料、药物、香料、增塑剂、润滑剂等。也可用作防腐剂、杀菌剂等。其对应的甲酯和乙酯具有良好的芳香气味和作用，其中辛酸甲酯具有强烈酒香、蜡香、蔬菜香、药草香、水果香和柑橘香气，可用来配制菠萝浆果和水果型食用香料和日化香精，以及合成化妆品和药物。辛酸乙酯具有白兰地酒香味，主要用于调味品、香料制造。
有研究表明，刘霭莎等(刘霭莎等，2017)对诺丽果发酵液以及李金霞等(李金霞等，2015)对浓缩诺丽果汁的抑菌实验，发现诺丽果发酵液以及浓缩诺丽果汁对铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌均有不同程度的抑菌活性，同时，诺丽发酵汁的乙酸乙酯和正丁醇萃取段对枯草芽孢杆菌具有明显抑制作用(龚敏等，2010)，且诺丽叶的正丁醇等有机溶剂提取物也有较好的抑菌效果。目前，李奕星等(李奕星等，2018)也有通过水蒸气蒸馏、正己烷萃取、真空浓缩获得的诺丽精油应用于水果保鲜，提高水果保鲜效果。
奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)，广泛存在于人和动物肠道中，以及水、土壤腐败的有机物里，是一种条件致病菌，可引起食物中毒、泌尿道感染、腹膜炎等疾病。近年来有报道，奇异变形杆菌的耐药性在不断增强。
目前，并未有记载或报道诺丽精油对奇异变形杆菌的抑制作用。提高诺丽精油良好的抑菌活性，对完善诺丽精油作为抑菌产品或药物的开发可提供参考基础。
发明内容
鉴于此，本发明的目的在于提出一种诺丽精油在抑制奇异变形杆菌中的应用，提高诺丽精油良好的抑菌活性，对完善诺丽精油作为抑菌产品或药物的开发可提供参考基础。
本发明的技术方案是这样实现的：
本发明提供一种诺丽精油的应用，所述诺丽精油在抑制奇异变形杆菌中的应用。
进一步的，所述诺丽精油还包括在抑制肠炎沙门氏菌或/和单增李斯特菌或/和伤寒杆菌中的应用。
进一步的，上述诺丽精油的提取方法包括：取诺丽果实，破碎，-20～4℃贮藏3-5d，浸泡提取，水蒸气蒸馏，得诺丽精油。
更进一步的，所述0～4℃贮藏3-5d。
进一步的，所述浸泡提取为：按料液比1:3-4，加入水或氯化钠溶液浸泡2-3h；所述氯化钠溶液的质量浓度为0.8-1.2％。
更进一步的，所述浸泡提取后还包括超声浸提，超声频率为50-70kHz、超声功率为350-370W、超声温度为45-55℃。
本发明还提供一种诺丽精油的制备方法，包括如下制备步骤：取诺丽果实，破碎，-20～4℃贮藏3-5d，按料液比1:3-4，加入水或氯化钠溶液浸泡提取2-3h，水蒸气蒸馏，得诺丽精油。
更进一步的，所述氯化钠溶液的质量浓度为0.8-1.2％；所述浸泡提取后还包括超声浸提，超声频率为50-70kHz、超声功率为350-370W、超声温度为45-55℃。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提取获得的诺丽精油对奇异变形杆菌、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌和伤寒杆菌均具有良好的抑菌活性，其最低抑菌浓度为0.391～1.563μL/mL，尤其对奇异变形杆菌具有较明显的抑制作用，其最低抑菌浓度可达0.391μL/mL，最小杀菌浓度可达1.563μL/mL，可将诺丽精油有效地应用于制备抑制奇异变形杆菌的抑菌产品或药物中。
本发明通过对诺丽果进行冷冻或冷藏的预处理方式，有助于提高诺丽精油的提取率，充分提取诺丽果的有效成分，进而提高诺丽精油的抑菌活性，可有效抑制奇异变形杆菌、肠炎沙门氏菌、单增李斯特菌和伤寒杆菌的生长，尤其是对奇异变形杆菌具有较明显的抑制作用。
附图说明
图1为本发明实施例6诺丽精油挥发性成分GC-MS总离子流色谱图。
具体实施方式
为了更好理解本发明技术内容，下面提供具体实施例，对本发明做进一步的说明。
本发明实施例所用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
本发明实施例所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
本发明的诺丽精油的获取如下：
实施例1
(1)预处理：取新鲜成熟的诺丽果实，使用细胞破壁机搅拌果肉成果泥状，在-20℃下冷冻3-5d。
(2)浸提：直接加入3倍果肉质量的水浸泡提取2h。
(3)蒸馏：在230℃的温度下水蒸气蒸馏3h。
实施例2
(1)预处理：取新鲜成熟的诺丽果实，使用细胞破壁机搅拌果肉成果泥状，在0℃下冷藏3-5d。
(2)浸提：直接加入3倍果肉质量的水浸泡提取2h。
(3)蒸馏：在230℃的温度下水蒸气蒸馏3h。
实施例3
(1)预处理：取新鲜成熟的诺丽果实，使用细胞破壁机搅拌果肉成果泥状，在4℃下冷藏3-5d。
(2)浸提：直接加入3倍果肉质量的水浸泡提取2h。
(3)蒸馏：在230℃的温度下水蒸气蒸馏3h。
实施例4
(1)预处理：取新鲜成熟的诺丽果实，使用细胞破壁机搅拌果肉成果泥状，在0℃下冷冻3-5d。
(2)浸提：加入3倍果肉质量的水浸泡2h后，在温度为50℃，功率为360W，超声频率为60kHz的条件下超声浸提30min，得到诺丽粗提液。
(3)蒸馏：在230℃的温度下水蒸气蒸馏3h。
实施例5
(1)预处理：取新鲜成熟的诺丽果实，使用细胞破壁机搅拌果肉成果泥状，在4℃下冷藏3-5d。
(2)浸提：加入3倍果肉质量的水浸泡2h后，在温度为50℃，功率为360W，超声频率为60kHz的条件下超声浸提30min，得到诺丽粗提液。
(3)蒸馏：在230℃的温度下水蒸气蒸馏3h。
实施例6
(1)预处理：取新鲜成熟的诺丽果实，使用细胞破壁机搅拌果肉成果泥状，在0℃下冷冻3-5d。
(2)浸提：加入3倍果肉质量的水和NaCl浸泡，NaCl的质量百分浓度为1％，浸泡2h后，在温度为50℃，功率为360W，超声频率为60kHz的条件下超声浸提30min，得到诺丽粗提液。
(3)蒸馏：在230℃的温度下水蒸气蒸馏3h。
对比例1
(1)预处理：取新鲜成熟的诺丽果实，使用细胞破壁机搅拌果肉成果泥状，在室温27℃下贮藏1d。
(2)浸提：加入3倍果肉质量的水浸泡2h后，在温度为50℃，功率为360W，超声频率为60kHz的条件下超声浸提30min，得到诺丽粗提液。
(3)蒸馏：在230℃的温度下水蒸气蒸馏3h。
对比例2
(1)预处理：取新鲜成熟的诺丽果实，切成厚度为3～5mm的均匀的薄片，在室温27℃下贮藏1d。。
(2)浸提：直接加入3倍果肉质量的水浸泡提取2h。
(3)蒸馏：在230℃的温度下水蒸气蒸馏3h。
一、精油得率
表1各处理组提取工艺参数和精油提取率
注：“—”表示无处理。
由上表可知，诺丽果经过实施例6的处理之后，精油得率明显高于其他处理组。对比实施例1～3和对比例2，经过0℃冷藏并充分搅碎的果肉更有利于精油的获取，温度过高可能使精油在未提取阶段有部分挥发，温度过低反而会起保护作用，果肉细胞不易破裂，影响精油的获取。实施例1～3和实施例4～6对比可看出，经过超声处理后，果肉细胞被破坏，精油得率明显高于未经超声的处理组，1％的NaCl有辅助破坏果肉细胞和加速析出精油的作用，所以实施例6的精油得率明显高于其他处理组。
二、诺丽精油的抑菌活性的测定
(1)诺丽精油对奇异变形杆菌的抑菌活性的测定
1材料
诺丽精油，阳性对照药：左氧氟沙星。
细菌菌种：奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)购自北京北纳创联生物技术研究院。
2实验方法
2.1抑菌圈的测定
采用滤纸片琼脂平板扩散法，在无菌环境下，用移液枪吸取20μL诺丽精油滴在d＝6mm的无菌滤纸片上，待纸片充分吸收后贴在已涂涂布的各菌液的马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)平板上，并标记好各药液的名称，每个菌重复3次，菌液浓度为107CFU/mL，菌液涂布量为60μL。设3次重复并标记好编号。阴性对照为无菌水，阳性对照为左氧氟沙星(浓度为15μg/mL)，培养条件为恒温培养箱37℃下培养24h。培养结束后观察并记录抑菌圈的有无，采用十字交叉法测量抑菌圈直径大小，取平均值作为测定结果。
抑菌圈测定标准为：抑菌圈直径大于20m为极敏，直径在15-20mm之间为高敏，在10-15mm之间为中敏，抑菌圈直径小于10mm为低敏。
2.2最低抑菌浓度(MIC)的测定
在96孔培养板上采用微量二倍稀释法进行MIC实验，将精油溶于无水乙醇配置成200μL/mL的精油溶液。将96孔板上的A1孔作为起始孔，从左到右11个孔分别加入浓度为107CFU/mL的菌悬液100μL，第11孔加入100μl培养基与菌悬液混合均匀，作为菌液空白，第12孔加入200μL培养基，作为培养基空白。每个板只能加1种菌，每个板均做3个空白、阳性对照和阴性对照。
起始孔加入100μL精油溶液，充分混匀至乳化，依次对1～10孔做梯度稀释，使其精油浓度分别为100、50、25、12.5、6.25、3.125，1.563、0.781、0.391、0.195μL/mL，充分混匀，每个菌重复3次，在培养箱37℃中培养24h后，使用酶标仪测定样品的吸光值，抑菌率达到80％的样品浓度为诺丽精油对奇异变形杆菌的最低抑菌浓度MIC。
2.3最低杀菌浓度(MBC)的测定
采用琼脂培养基平板法，吸取60μL步骤2中各样品MIC值所对应的溶液均匀涂布于琼脂培养基中，培养条件为恒温培养箱37℃培养24h，而后观察培养基中有无菌株生长，诺丽精油的MBC为菌落数低于5个的平板所对应孔中的最低浓度。
3结果
其结果如下表：
表2诺丽精油对奇异变形杆菌抑菌活性
注：“—”表示无MIC、MBC值。
由上表可知，诺丽精油对奇异变形杆菌具有明显的抑菌活性，其平均抑菌圈直径超过10mm，其抑菌浓度最低可达0.391μL/mL，最小杀菌浓度为1.563μL/mL。由实施例1～6与对比例1～2对比可以看出，本发明采用适宜的冷藏温度预处理诺丽果肉，用NaCl和超声浸提可进一步破坏果肉细胞，实现诺丽精油的有效提取，提高其抑菌活性，其对奇异变形杆菌具有较明显的抑制作用，可将诺丽精油有效地应用于制备抑制奇异变形杆菌的抑菌产品或药物中。
(2)诺丽精油对不同细菌菌株的抑菌活性的测定
1材料
诺丽精油，阳性对照药：左氧氟沙星。
细菌菌种：肠炎沙门氏菌(Salmonellaenteritidis)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、伤寒杆菌(Salmonella enterica)购自北京北纳创联生物技术研究院。
2实验方法
实验方法根据上述(1)中的抑菌圈、最低抑菌浓度(MIC)和最低杀菌浓度(MBC)的测定方法，测定实施例6和对比例2的诺丽精油的抑菌活性变化情况。
3结果
其结果如下表：
表3诺丽精油对不同细菌菌株的抑菌活性
由上表可知，不同提取条件下的诺丽精油的抑菌活性存在较大差异，实施例6和对比例2均对供试菌种有抑制作用，其中，由实施例6的诺丽精油对奇异变形杆菌、肠炎沙门氏菌、伤寒杆菌均具有显著的抑制作用，而对于单增李斯特菌的抑制作用相较于对比例2而言，其抑制活性下降，其抑菌的最低浓度和最低杀菌浓度增加。
三、GC-MS测定精油中挥发性成分含量
采用Agilent Technologies 7890B-5977A气相色谱-质谱联用仪对诺丽精油的挥发性成分进行测定。
1实验步骤
1.1色谱条件(FF5)
采用VF-WAXms色谱柱(0.25mm×30mm，0.25μm)。以60℃为起始温度，保持1min；以4℃/min升温至150℃，再以6℃/min升温至230℃；进样口温度为230℃；进样量为1.0μL，分流比为8:1。
1.2质谱条件
离子源为EI源，离子源温度230℃，四极杆温度150℃，电子能量70eV，接口温度230℃，倍增管电压1043V，采集类型为全扫描，质量范围30-400amu。
1.3.样品处理：
制备的精油各取50μL，用异丙醇溶解配制成浓度为2.5％的溶液后，再进行GC-MS分析。
2结果
诺丽精油挥发性成分分析及其相对含量的结果如表1。
表4诺丽精油挥发性成分分析及其相对含量
由上表可知，诺丽精油共鉴定出23个挥发性成分，酸类是相对含量最高的化合物，其中，辛酸含量高达69.869％，其次己酸含量为12.846％，正癸酸含量为6.013％，辛酸和己酸是诺丽精油挥发性成分的关键物质。
本发明对诺丽果提取精油的方法，有利于提高诺丽精油中的辛酸等物质含量，可提高诺丽精油对奇异变形杆菌、肠炎沙门氏菌、伤寒杆菌等致病菌的抑菌活性，对提高诺丽精油作为防腐剂、杀菌剂等产品的杀菌防腐功效具有重要的意义。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种诺丽精油的应用，其特征在于，所述诺丽精油在抑制奇异变形杆菌中的应用。
2.根据权利要求1的一种诺丽精油的应用，其特征在于，所述诺丽精油还包括在抑制肠炎沙门氏菌或/和单增李斯特菌或/和伤寒杆菌中的应用。
3.根据权利要求1或2的一种诺丽精油的应用，其特征在于，所述诺丽精油的提取方法包括：取诺丽果实，破碎，-20～4℃贮藏3-5d，浸泡提取，水蒸气蒸馏，得诺丽精油。
4.根据权利要求3的一种诺丽精油的应用，其特征在于，所述0～4℃贮藏3-5d。
5.根据权利要求3的一种诺丽精油的应用，其特征在于，所述浸泡提取为：按料液比1:3-4，加入水或氯化钠溶液浸泡2-3h；所述氯化钠溶液的质量浓度为0.8-1.2％。
6.根据权利要求3的一种诺丽精油的应用，其特征在于，所述浸泡提取后还包括超声浸提，超声频率为50-70kHz、超声功率为350-370W、超声温度为45-55℃。
7.一种诺丽精油的制备方法，其特征在于，包括如下制备步骤：取诺丽果实，破碎，-20～4℃贮藏3-5d，按料液比1:3-4，加入水或氯化钠溶液浸泡提取2-3h，水蒸气蒸馏，得诺丽精油。
8.根据权利要求7的一种诺丽精油的制备方法，其特征在于，所述氯化钠溶液的质量浓度为0.8-1.2％；所述浸泡提取后还包括超声浸提，超声频率为50-70kHz、超声功率为350-370W、超声温度为45-55℃。
9.一种如权利要求7或8所述的诺丽精油的制备方法制备得到的诺丽精油。
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