CN115725736A - 一种诊断和治疗肝癌的circRNA标志物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种肝癌circRNA标志物及其应用，属于生物技术领域。本发明首次发现了hsa_circ_0005524环状RNA与肝癌的发生相关，hsa_circ_0005524在肝癌患者的血清中表达显著降低，由此说明，这种环状RNA可作为肝癌诊断标志物，能很好的预测肝癌的发生。此外，这种标志物hsa_circ_0005524过表达后，可显著抑制肝癌细胞的增殖能力以及侵袭能力，由此可见环状RNA基因可以作为肝癌治疗的潜在靶点，具有很好的临床应用前景。

Description

一种诊断和治疗肝癌的circRNA标志物及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于肝癌诊断及治疗的circRNA标志物及其应用。

背景技术

人们普遍认为，准确、早期诊断肝癌可以显著提高临床疗效，减轻患者痛苦。然而，影像学和组织学等临床技术只能检测到处于相对晚期的肝癌患者。因此，迫切需要扩大肝癌早期检测的窗口和安全有效的抗癌新技术，以延长生存时间和提高生存质量。

发明内容

本发明的目的在于提供一种肝癌circRNA标志物及其应用，即 hsa_circ_0005524环状RNA基因，这种circRNA标志物既可以作为肝癌诊断的标志物，也可以作为肝癌治疗的潜在方式。

本发明的发明构思：

CircRNA是一类非常有趣的保守单恋RNA分子，通过前体mRNA反向剪接从外显子或内含子序列衍生而来。与典型线性RNA不同，circRNA形成共价闭合、连续的稳定环，没有5’端帽和3’端尾，因此具有更高的核酸酶稳定性，这使得它们成为临床应用新型生物标记具有很大的优势。大多数circRNA都非常丰富，并且在不同物种保守，具有组织或发育阶段特异性表达。CircRNA在各种人类疾病，尤其是癌症中发挥作用，并可能作为更好的预测性生物标记物和癌症治疗靶点发挥作用。

DROSHA (Drosha Ribonuclease III) 基因编码核糖核酸酶 (RNase) III 双链RNA 特异性核糖核酸酶和微处理器蛋白复合物的亚基，可催化microRNA(miRNA) 合成的初始加工步骤，具体而言：DROSHA从细胞核中的初级 microRNA (pri-miRNA) 切割茎环结构，产生前体 miRNA (pre-miRNA)，然后将其输出到细胞质进行进一步加工。研究发现DROSHAmRNA（蛋白）在多个肿瘤中表达升高，且促进肿瘤发生发展，如在乳腺癌中DROSHA调控肿瘤干细胞样表型和进展（Cell Res. 2021），胃癌中DROSHA通过EGFR-ERK1/2-MMP7信号通路促进肿瘤细胞侵袭，这些结果说明DROSHA肿瘤中促癌作用。

在对来源于DROSHA的circRNA开展的研究中，我们发现hsa_circ_0005524在肝癌中显著低表达，且过表达后显著抑制了肝癌细胞的增殖、侵袭和迁移表型，这一结果说明尽管hsa_circ_0005524与DROSHA mRNA来源于统一基因DROSHA，但由于其环状RNA的结构以及序列的不完全一致，使其发挥抑制肝癌的作用。hsa_circ_0005524在肿瘤显著低表达的现象使其具有肝癌诊断标志物的应用价值，而过表达后抑制肝癌进展的作用提示其可能作为核酸药物用于治疗肝癌。

本发明通过以下技术方案实现：

第一方面，本发明提供一种肝癌circRNA标志物，circRNA标志物为hsa_circ_0005524；

hsa_circ_0005524分子是由DROSHA基因的第27，28和29外显子首位相接连接而成的环状RNA分子。进行扩增后通过一代Sanger测序后确认hsa_circ_0005524的成环序列，hsa_circ_0005524的全长为309个碱基，全长序列为：

GACCTGCGCGAAGTCTGGCTCAATTATCCTCTCCACCCACTCCAACTACAAGAGCCAAATACTGATCGACAACTTATTGAAACTTCTCCAGTTCTACAAAAACTTACTGAGTTTGAAGAAGCAATTGGAGTAATTTTTACTCATGTTCGACTTCTGGCAAGGGCATTCACATTGAGAACTGTGGGATTTAACCATCTGACCCTAGGCCACAATCAGAGAATGGAATTCCTAGGTGACTCCATAATGCAACTGGTAGCCACAGAGTACTTATTCATTCATTTCCCAGATCATCATGAAGGACACTTAACT（SEQ ID No. 1）。

第二方面，本发明提供一种检测如权利要求1的肝癌circRNA标志物的试剂在制备诊断肝癌的试剂盒中的应用。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述试剂包括特异性扩增hsa_circ_0005524的引物组。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述hsa_circ_0005524的引物组包括正向引物和反向引物；

正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述试剂还包括：反转录PCR试剂和荧光定量PCR试剂。

进一步地，在本发明较佳的实施例中，上述反转录PCR试剂包括：2X RT Mix、RTEnzyme Mix、RNA free ddH2O；

优选地，将RNA逆转录成cDNA反应体系和条件如下;

反应条件为：37℃10min，42℃20min，85℃5min，4℃2min。

进一步地，荧光定量PCR试剂包括：2X PCR Master Mix、RNA free ddH2O。

优选地，荧光定量PCR扩增检测的反应体系及反应条件如下：

荧光定量PCR反应条件为：95℃5分钟变性；95℃10秒，60℃35秒；40个循环。

第三方面，本发明提供一种肝癌诊断试剂盒，包括针对权利要求1中的circRNA标志物的特异性引物组。

第四方面，本发明提供一种如权利要求1的肝癌circRNA标志物的表达促进剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。

第五方面，本发明提供一种治疗肝癌的药物，其活性成分包括hsa_circ_0005524的表达促进剂。

与现有技术相比，本发明至少具有如下技术效果：

本发明首次发现了hsa_circ_0005524环状RNA与肝癌的发生相关，hsa_circ_0005524在肝癌患者的血清中表达显著降低，由此说明，这种环状RNA可作为肝癌诊断标志物，能很好的预测肝癌的发生。采用荧光定量PCR法可以对这种circRNA标志物进行定量检测，实现肝癌的诊断。采用这种circRNA标志物对肝癌进行诊断，特异性强、灵敏度高，结果稳定，且不会出现假阳性，具有很好的临床应用前景。

此外，这种标志物 hsa_circ_0005524过表达后，可显著抑制肝癌细胞的增殖能力以及侵袭能力，由此说明，该两种环状RNA基因可以作为肝癌治疗的潜在靶点，即利用其表达促进剂来开发治疗肝癌的药物，有利于实现肝癌的有效治疗。

附图说明

图1为本发明实施例1的中的环状hsa_circ_0005524的鉴定图。

图2为本发明实施例2中hsa_circ_0005524的荧光定量PCR检测结果；

图3为本发明实施例2中hsa_circ_0005524在肝癌血清中具有良好的标志物表现的图示；

图4为本发明实施例3中hsa_circ_0005524在多个细胞系的荧光定量PCR检测结果；

图5为本发明实施例4中hsa_circ_0005524对肝癌细胞增殖的实验结果图；

图6为本发明实施例5中hsa_circ_0005524对细胞迁移能力的实验结果图。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围，实施例中未注明的具体条件，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。

实施例1

hsa_circ_0005524的鉴定

1.RNA提取(Trizol方法)

(1)肝癌患者与健康人血浆加入1 ml trizol；

(2)加入200μL氯仿，剧烈振荡10秒，室温静置10min；

(3)4℃下，12,000g离心10min，溶液分为三层，RNA溶解在水相中，转移水相至另一个新的RNase free EP管；

(4)加入1倍体积异丙醇，涡旋充分混匀；

(5)4℃下，12,000g离心15min，离心后管底出现RNA沉淀，弃去上清；

(6)加入1ml 75％乙醇，用手轻轻颠倒，12,000g离心5min，弃去上清；

(7)室温晾干，加入20μL DEPC水溶解沉淀。

2.基因组DNA去除

去除总RNA中的基因组DNA的残留，采用DNA消化酶，具体反应体系和条件如下，反应液总体积为10μL，如下组分组成：

反应液中于37℃消化40min后，85℃3min灭活DNA消化酶。

3.RNA逆转录成cDNA

将RNA逆转录成cDNA反应体系和条件如下

反应条件为：37℃10min，42℃20min，85℃5min，4℃2min。

4.设计反向扩增PCR引物扩增circ-ERBB2接口及侧翼序列DNA测序验证

根据Circbase数据库中提供部分参考序列，设计识别反向PCR扩增引物，扩增hsa_circ_0005524的接口及侧翼序列引物序列为：

引物扩增环状RNA hsa_circ_0005524部分序列的大小为309bp；以cDNA为模板，PCR扩增环状RNAhsa_circ_0005524的环化接口两侧的部分序列，经1.2％浓度核酸琼脂糖电泳分离，PCR产物纯化后经DNA测序验证。结果显示环状RNA hsa_circ_0005524分子是由DROSHA基因的第27、28和29外显子首位相接连接而成的环状RNA分子。进行扩增后通过一代Sanger测序后确认hsa_circ_0005524的成环序列，如图1所示，hsa_circ_0005524的全长为309个碱基，全长序列为：

GACCTGCGCGAAGTCTGGCTCAATTATCCTCTCCACCCACTCCAACTACAAGAGCCAAATACTGATCGACAACTTATTGAAACTTCTCCAGTTCTACAAAAACTTACTGAGTTTGAAGAAGCAATTGGAGTAATTTTTACTCATGTTCGACTTCTGGCAAGGGCATTCACATTGAGAACTGTGGGATTTAACCATCTGACCCTAGGCCACAATCAGAGAATGGAATTCCTAGGTGACTCCATAATGCAACTGGTAGCCACAGAGTACTTATTCATTCATTTCCCAGATCATCATGAAGGACACTTAACT（SEQ ID NO.1）。

实施例2

hsa_circ_0005524的荧光定量PCR检测

荧光定量PCR扩增检测环状RNA hsa_circ_0005524分子在肝癌患者与健康人血浆表达情况的方法为：

按照实施例1所述方法提取总RNA，并用DNA酶除去提取的RNA中残留的基因组DNA，将RNA逆转录成cDNA；最后采用荧光定量PCR扩增进行检测，荧光定量PCR的引物序列如SEQID NO.2-5所示。

荧光定量PCR扩增检测环状RNA hsa_circ_0005524分子在肝癌患者与健康人血浆的表达情况反应体系及反应条件如下：

荧光定量PCR反应条件为：95℃ 5分钟变性；95℃ 10秒，60℃ 35秒；40个循环。

荧光定量PCR检测环状RNA hsa_circ_0005524在肝癌患者与健康人血浆中的表达，结果如图2所示：

由图2可见，相比于正常的健康人，hsa_circ_0005524在肝癌患者的血浆中的表达显著降低。

由图3可见，这种环状RNA可很好的预测肿瘤发生：hsa_circ_0005524 AUC=0.8980，说明hsa_circ_0005524可作为肿瘤诊断标志物，很好的预测肝癌的发生。

同时，本实施例的荧光定量PCR检测方法能够理想的检测RNA hsa_circ_0005524在生物体中的表达情况。

实施例3 hsa_circ_0005524仅在肝癌细胞系表达显著降低

为了探索hsa_circ_0005524在各细胞系中的表达情况，我们通过荧光定量PCR检测环状RNA hsa_circ_0005524在293T细胞、肺、肝、胰腺、宫颈以及胃细胞的表达，如图4所示。

结果发现hsa_circ_0005524仅在肝癌中表达显著降低，与正常细胞LO2相比，但hsa_circ_0005524在HepG2，SMMC7721和Huh7的表达分别为44.53%,69.89%和73.59%，但该表达降低的现象未在其它肿瘤中见到，因此hsa_circ_0029426可以作为肝癌的特异性诊断标志物。

实施例4

CCK8实验检测hsa_circ_0005524对细胞增殖的影响

请对这个实验的过程做较为详尽、完整的阐述

（1）取处于对数生长期的转染后的HEPG2及SMMC-7721细胞，用0.25％的胰酶溶液消化后并离心获得细胞沉淀，用培养基重悬细胞后通过细胞计数板进行细胞计数；

（2）根据细胞计数的结果，将细胞悬液的浓度稀释成约5000个／100 μL，然后在96孔板中的每个孔加入稀释后的细胞悬液；

（3）构建hsa_circ_0005524过表达载体，以有效地上调此环状RNA在肝癌细胞系HEPG2及SMMC-7721中的表达。对照组（Control）转染空载质粒；

（4）将96孔板放在37°Ｃ的恒温培养箱中孵育一段适当的时间（0、24、48和72小时）；

（5）在96孔板上的每孔加入100 μL 10％CCK8溶液（即90 μL的基础培养基10 μL的CCK8溶液）；

（6）将96孔板置于37℃的恒温培养箱中继续培养1-4h；

（7）最后，将SPECTRmaxPLUS34连续光谱分光光度计调至450nm波长处，测定并记录好每个孔的吸光度值，并进行对比分析。

（8）绘制细胞生长曲线，评估hsa_circ_0005524过表达对HEPG2和SMMC-7721细胞增殖的影响。

（9）对hsa_circ_0005524在肝癌细胞系HEPG2和SMMC-7721进行过表达后，通过CCK8实验检测细胞增殖能力，结果如图5所示，由此说明肝癌细胞的生长被显著抑制，抑制率分别为：肝癌细胞系HEPG2为33%；肝癌细胞系SMMC-7721为23%。

实施例5

细胞划痕-愈合实验检测hsa_circ_0005524对细胞迁移能力的影响

（1）将 1×106个HEPG2或SMMC-7721细胞铺入60mm培养皿中，分加入3mL 1640完全培养基，置于37℃、5% CO2细胞培养箱培养。

（2）24h后镜下观察细胞汇合度达到95%以上，用200uL黄色枪头在6孔板背后以0.5~1cm一道划线，横穿过孔。每孔至少穿过5条线。然后将hsa_circ_0005524过表达慢病毒感染的肿瘤细胞接种到6孔板中，第二天用枪头比着直尺，尽量垂至于背后的横线划痕，枪头要垂直，不能倾斜。

（3）弃去培养基，加入2mL无菌PBS洗去残留细胞碎片，再加入3mL含0.5%FBS的RPMI1640完全培养基。

（4）在显微镜下观察并拍照记录细胞初始位置，计为0h时间点。

（5）24h后再次拍照记录细胞迁移位置。

（6）0，24小时取样，使用ImageJ软件计算细胞迁移面积并作统计图。细胞迁移率计算公式为（1－24h划痕面积/0h划痕面积）×100%。

结果如图6所示，发现细胞迁移被显著抑制，抑制率分别为：肝癌细胞系HEPG2中hsa_circ_0005524抑制率为60%；肝癌细胞系SMMC-7721中hsa_circ_0005524抑制率为60%。

综上所述，本发明提供一种肝癌circRNA标志物，即hsa_circ_0005524环状RNA基因。发明人通过荧光定量PCR检测，该环状RNA基因在肝癌患者的血浆中表达量相比于健康人显著降低，由此说明，该circRNA标志物可以预测肝癌的发生，可作为肝癌的诊断标志物。进一步地，通过CCK8实验检测该肝癌circRNA标志物对细胞增殖的影响研究，结果发现hsa_circ_0005524在肝癌细胞系HEPG2和SMMC-7721进行过表达后，肝癌细胞的生长被明显抑制。通过细胞划痕-愈合实验检测hsa_circ_0005524对细胞迁移能力的影响研究，结果发现hsa_circ_0005524在肝癌细胞系HEPG2和SMMC-7721进行过表达后，细胞迁移能力被显著抑制。由此说明，hsa_circ_0005524既可以作为肝癌诊断的标志物，也可以作为肝癌治疗的潜在靶点。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (9)

1.一种肝癌circRNA标志物，其特征在于，所述circRNA标志物为hsa_circ_0005524；

所述hsa_circ_0005524的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.一种检测如权利要求1所述的肝癌circRNA标志物的试剂在制备诊断肝癌的试剂盒中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括特异性扩增所述hsa_circ_0005524。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述hsa_circ_0005524的引物组包括正向引物和反向引物；

所述正向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述反向引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述试剂还包括：反转录PCR试剂和荧光定量PCR试剂。

6.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述反转录PCR试剂包括：2X RT Mix、RTEnzyme Mix、RNA free ddH₂O；

优选地，所述荧光定量PCR试剂包括：2X PCR Master Mix、RNA free ddH₂O。

7.一种肝癌诊断试剂盒，其特征在于，包括针对权利要求1中所述的circRNA标志物的特异性引物组。

8.一种如权利要求1所述的肝癌circRNA标志物的表达促进剂在制备治疗肝癌的药物中的应用。

9.一种治疗肝癌的药物，其特征在于，其活性成分包括hsa_circ_0005524的表达促进剂。

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