CN115725581A - 抑制VEGF基因的siRNA及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抑制VEGF基因的siRNA及其应用，本发明的siRNA能够特异性敲降VEGF表达水平。相比于其它siRNA在几分钟到几小时内降解完相比，该条裸序列自身能较强的抵抗酶水解。本发明还通过合适的化学修饰方法，在没有明显增加细胞毒性的基础上，进一步提高了siRNA在血清中抵抗酶水解的能力，延长作用时间，为治疗血管增生异常或黑色素沉积引起的皮肤病，尤其是黄褐斑皮肤病，带来重要的应用价值。

Description

抑制VEGF基因的siRNA及其应用

技术领域

本发明涉及一种抑制VEGF基因的siRNA及其应用，属于生物医药技术领域。

背景技术

黄褐斑是生活中常见、多发的皮肤病。许多研究认为黄褐斑的发病与黑色素合成、皮肤屏障、炎症因素、血管因素四方面有关，而血管因素与黑色素合成，被更多文献验证为主要原因。最近研究表明，许多黄褐斑皮肤处的血管血流和血管直径大于正常皮肤；也有研究发现，黄褐斑皮肤在毛细血管镜下可见密集血管。文献研究，角质形成细胞中血管内皮生长因子表达的增加可能是黄褐斑血管改变的主要血管生成因子。

血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)属于分泌型蛋白，是一种促血管内皮细胞生长因子，在新生血管的生成和内皮细胞的生长中具有生长因子活性。VEGF广泛分布于多种人体细胞，包括视网膜色素上皮细胞、血管内皮细胞、神经细胞等。人类VEGF基因位于6号染色体，基因全长28kb，编码基因长14kb，包含8个外显子和7个内含子。其家族包括7个成员，人体可表达其中5种：VEGF-A、B、C、D和胎盘生长因子(PLacental growth factor，PLGF)，其中被研究最多的就是VEGF-A，通常VEGF指的就是VEGF-A。VEGF-A的主要作用包括促进内皮细胞生长和增殖、增强细胞迁移能力、抑制细胞凋亡以及诱导血管通透化。一般情况下，VEGF表达稳定，在病理状态下，VEGF表达和分泌就会失衡。研究发现，VEGF在人体内的表达失调与多种疾病息息相关，包括新生血管性青光眼(NVG)、急性肾损伤(AKI)、非小细胞肺癌(NSCLC)、类风湿关节炎(rheumatoid arthritis,RA)、子宫内膜异位症(EMS)、强直性脊柱炎(ankylosing spondylitis，AS)、年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration,AMD)、重度炎症性肠病(IBD)、脑卒中(cerebral stroke)等。可见，VEGF是包括眼科疾病、恶性肿瘤、脑血管疾病以及皮肤类疾病在内多种疾病治疗的重要靶点，开发抗VEGF药物具有潜在的应用前景。

目前市场上有多种针对VEGF表达失衡的药物，如Macugen、Avastin、康柏西普等。其中Macugen由辉瑞和Eyetech共同合作研发，用于VEGF过表达导致的眼科疾病的治疗，是一款聚乙二醇化的修饰性寡核苷酸药物，给药方式为玻璃体内注射，Macugen能够特异性与VEGF-A结合，将其生物活性阻断。而Avastin是罗氏公司和基因技术公司合作开发的一种单抗药物，由鼠源性抗体和人类IgG组成，它能够干扰VEGF与内皮细胞表面VEGFR1和VEGFR2的结合，从而使VEGF失去生物活性；此外，它通过抑制内皮细胞的分裂能力，而对新生血管的生成起到阻碍作用，因此Avastin被广泛用在血管增生性疾病和一些恶性肿瘤疾病的治疗应用中。康柏西普(conbercept)是一种新型抗VEGF重组融合蛋白药物，也是我国首个自主研发的抗VEGF药物；康柏西普利用中国仓鼠卵巢(CHO)细胞表达系统生产,通过注射方式将其导入体内，该重组蛋白能够竞争性抑制VEGF与VEGFR结合并且阻止受体的激活,来达到抑制血管内皮细胞的异常增生和阻断病理性血管形成的目的；康伯西普主要应用在一些由角膜血管异常生成的一些疾病中，如糖尿病视网膜病变、黄斑水肿等。

目前研究较多的是VEGF-A。2011年，一位医生门诊收集黄褐斑患者皮肤，通过免疫组化染色发现，与正常皮肤相较，VEGF的表达显著提高。这些研究表明，VRGF过表达在黄褐斑的形成中发挥着重要的作用。如图1，免疫组化实验，用VEGF特异性抗体孵育组织，表达VEGF的部位就会显示出褐色。右图中，皮肤基底层(真皮层往下)，有强烈的黄褐色斑点，表示VEGF表达量很高，并且分布面积较大(王银娟，“黄褐斑相关发病机制的研究”，昆明医科大学硕士学位论文，2014)。VEGF因其具有促内皮增殖、血管生成之用，可增强血管通透性，VEGF的高表达可促使受体激活花生四烯酸、磷脂酶A2，加速黑色素合成形成色斑。(孙子宁，现代临床医学，2020)。

中心法则里，DNA分子中的遗传信息转录到RNA分子，其中mRNA翻译生成体内各种蛋白质。可成药的蛋白质靶点选择较少。蛋白只占了基因组信息的极少部分，人类的基因组中，仅1.5％的序列编码了蛋白质，其中和疾病相关的蛋白占10-15％，而在这些疾病相关的致病蛋白中，超过80％的蛋白质不能被目前常规的小分子及大分子药物所靶向，属于不可成药蛋白，因此药物靶点的选择范围较窄。

siRNA治疗是作用于蛋白质上游的创新机制药物，从mRNA水平上调控蛋白质的表达，解决多数蛋白靶点尚未发现的问题。siRNA药物作用机理如下：双链的siRNA分子在细胞质中被组装进RNA诱导的沉默复合体(RISC)，紧接着siRNA中的一条链(正义链)被降解，另外一条链(反义链)指导RISC识别与结合到与其碱基互补的mRNA的相应位点，从而通过复合体中的核糖核酸酶II剪切靶mRNA，从而达到调节靶基因。siRNA治疗的优势至少包括：不宜产生耐药性、治疗领域更广、效果持久，因此，小核酸药物的独特优势使其有望为现代生物医药产业开辟一个全新的开发方向，进一步填补现有疗法的治疗空白，并且具备治愈疾病的潜力。截止目前，全球已上市5款siRNA疗法，这些疗法均由Alnylam开发或参与开发，主要针对的遗传病和代谢性疾病，在皮肤病治疗中还没有上市药物。siRNA在生物医药领域中的应用解决两大难点：一个序列特异性的筛选和修饰，另一个是siRNA避免被核酸酶降解，并实现有效递送。通常siRNA序列若出现3个及以上错配时，脱靶概率明显增加，而且随着错配碱基的出现，其对靶基因敲降水平明显下降，siRNA干扰效率降低。即首先要解决的是如何设计一条特异性强的siRNA序列，其次，解决siRNA在体内的稳定递送问题。当体外递送siRNA进入体内，siRNA由于体内丰富的核酸酶，极易被降解代谢，或者产生不被期望的免疫刺激反应。将siRNA的序列进行化学修饰，能提高siRNA的稳定性，减轻负面的免疫刺激。基于黄褐斑形成关键信号通路中多集中于微量邻苯二甲酸相关转录因子(Microphthalmia-associated transcription factor，MITF)和酪氨酸酶的表达相关研究，在研究制品中利用siRNA序列筛选未见对序列进行修饰(CN103705392)，未修饰的siRNA片段通常会被核酸酶很快降解代谢，不稳定效果已是学界共识。VEGF作为治疗黄褐斑的重要基因靶点，可以利用siRNA对其表达进行干扰而抑制色斑形成，也可在感染、肿瘤和代谢疾病治疗中发挥巨大的作用。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种能够特异性敲降VEGF表达水平的siRNA。相比于其它siRNA在几分钟到几小时内降解完相比，该条裸序列自身能较强的抵抗酶水解。本发明还通过合适的化学修饰方法，在没有明显增加细胞毒性的基础上，进一步提高了siRNA在血清中抵抗酶水解的能力，延长作用时间，为治疗血管增生异常或黑色素沉积引起的皮肤病，尤其是黄褐斑皮肤病，带来重要的应用价值。

本发明的第一个目的是提供一种抑制VEGF基因的siRNA，所述的siRNA的正义链的序列为5’-GAAA GAUA GAGC AAGA CAA GA-3’(SEQ ID NO.1)，反义链的序列为5’-UUGUCUUG CUCU AUCU UUC UU-3’(SEQ ID NO.2)。

进一步地，所述的siRNA特异性靶向VEGF基因(GeneID：7424)的mRNA。

进一步地，所述的mRNA的NCBI编号为NM_001025366.3、NM_001025368.3、NM_001204385.2、NM_001025370.3、NM_003376.6、NM_001033756.3、NM_001025369.3、NM_001025367.3、NM_001287044.2或NM_001317010.1。

进一步地，所述的siRNA还包括对其正义链和/或反义链进行化学修饰。

进一步地，所述的化学修饰包括甲氧基修饰、磷酸骨架修饰、核糖修饰或碱基修饰。

进一步地，所述的化学修饰是将其正义链从5’端起第7、12、17位碱基及其反义链从5’端起第1和21位碱基中核糖C-2’的羟基甲基化为甲氧基戊糖。

本发明的第二个目的是提供所述的siRNA在制备治疗血管增生异常或黑色素沉积引起的皮肤病的药物中的应用。

进一步地，所述的血管增生异常或黑色素沉积引起的皮肤病为黄褐斑皮肤病。

进一步地，所述的siRNA通过递送载体包裹制备成药物。

进一步地，所述的药物通过皮肤给药或静脉注射进行给药。

进一步地，所述的皮肤给药包括皮下注射、皮内注射、微针。

本发明的有益效果是：

本发明的siRNA能够特异性敲降VEGF表达水平。相比于其它siRNA在几分钟到几小时内降解完相比，该条裸序列自身能较强的抵抗酶水解。本发明还通过合适的化学修饰方法，在没有明显增加细胞毒性的基础上，进一步提高了siRNA在血清中抵抗酶水解的能力，延长作用时间，为治疗血管增生异常或黑色素沉积引起的皮肤病，尤其是黄褐斑皮肤病，带来重要的应用价值。

附图说明：

图1是VEGF的表达：左图正常皮肤基底层弱阴性表达；右图为黄褐斑皮损基底层强阳性表达(DAB染色×200)；

图2是VEGF siRNA细胞里的验证结果；

图3是mode2化学修饰的结构图；

图4是mode1、mode2细胞里的验证结果；

图5是mode1、mode2在血清中抗酶解能力的验证；

图6是mode1、mode2细胞毒性的验证。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好地理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

下述实施例中所用的方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1：设计VEGF的siRNA

siRNA序列在‘siRNA Target Finder’在线设计得到，设计时不以5’非翻译区(5’UTR)和3’非翻译区(3’UTR)及起始密码子附近的序列作为设计siRNA的模板，也要避开外显子与外显子的交界区域。从靶基因起始密码子AUG下游100bp的核苷酸开始搜寻理想的siRNA。VEGF在NCBI上的geneID是：7424，其有多个转录本。我们针对NM_001025366.3、NM_001025368.3、NM_001204385.2、NM_001025370.3、NM_003376.6、NM_001033756.3、NM_001025369.3、NM_001025367.3、NM_001287044.2、NM_001317010.1的序列，设计了VEGF的siRNA。通过NCBI上的比对，这条siRNA序列特性靶向VEGF的上述转录本，特异性强，且基本靶向这些转录本的CDS区(Coding sequence)。

实施例2：细胞上验证siRNA的有效性

1.1细胞转染

①定量siRNA，DEPC水稀释到20uM。

②HaCat细胞传代至12孔板，第二天转染前密度达到约50％。

③转染时，2.5ul siRNA加入到50ul DMEM培养基中作为A管，5ul lip3000加入到50ul DMEM培养基中作为B管，A管加入B管中，充分混匀，室温静置15min。滴加到12孔板中。设置对照NC组，每个实验组做3个平行。

④48h时，按照天根试剂盒‘RNA prep Pure Cell/Bacteria Kit，货号为DP430’提取RNA基因组。

⑤逆转录得到cDNA。

⑥Q-PCR检测VEGF的mRNA表达量。

1.2结果

图2是细胞转染siVEGF的结果。由图2得到，转染siVEGF 50pmol时，mRNA敲降剩余约53％，100pmol时，mRNA敲降剩余约39％，该条siRNA特异性敲降VEGF的mRNA。

2.1对siRNA序列中的部分核苷酸化学修饰，修饰位置见图3，核酸链中部分RNA核糖C-2’的羟基被甲基化成为甲氧基戊糖。

2.2细胞转染

①同‘1.1’的方法转染mode1、mode2，序列信息见下表：

表1

②48h时，按照天根试剂盒‘RNA prep Pure Cell/Bacteria Kit，货号为DP430’提取RNA基因组。

③逆转录得到cDNA。

④Q-PCR检测VEGF的mRNA表达量。

⑤72h时，收细胞，提蛋白质，westernblot实验检测VEGF的蛋白表达量。

2.3结果

图4是细胞转染mode1、mode2的结果。由图4中A得到，转染mode1 50pmol时，mRNA敲降剩余约5.3％，100pmol时，mRNA敲降剩余约43.8％；转染mode2 50pmol时，mRNA敲降剩余约62.6％，100pmol时，mRNA敲降剩余约59.6％；mode1、mode2特异性敲降VEGF mRNA的效果明显。

图4中B是westernblot实验检测VEGF的蛋白表达水平，其中1、2是转染50pmol的mode1；3、4是转染100pmol的mode2，1、3一抗是VEGF，2、4一抗是GAPDH，5、7、9、11是不同的siNC，6、8、10、12是不同的siVEGF；图4中C是灰度统计图。mode1、mode2降低了VEGF的蛋白表达量。

由图4得到，mode1、mode2有效敲降了VEGF的蛋白。

实施例3：mode1、mode2在血清中抗酶解能力的验证

3.1 10ug的siRNA粗产物，与1ul胎牛血清混匀，纯水补足至10ul，37℃放置规定的时间。

3.2实验结果

图5中A中，1～4是siMITF；5～8是mode1；9～12是mode2；1、5、9是0h；2、6、10是8h；3、7、11是24h；4、8、12是48h。由图5中A得知，10ug的siRNA粗产物，mode1和mode2比siMITF条带更亮，指示所含siRNA纯度相对较高，则mode1、mode2在粗产物中更不容易降解。在48h时，siMITF和mode2依然清楚看见条带，而mode1几乎看不到条带，说明mode1抵抗酶水解能力比siMITF较差，而mode2抗酶水解能力较强。

图5中B是图5中A的条带强度统计图，横坐标是时间，纵坐标是siRNA相较于0h时的剩余百分比。mode2无论是0h初始siRNA的抗降解能力，还是48h时抵抗血清降解的能力，都展现出较好的水平。

所以mode2是非常适合siMITF的化学修饰方法。

实施例4：mode1、mode2细胞毒性的验证

4.1有文献报道，化学修饰siRNA后增加序列的细胞毒性。我们用HaCat细胞(人永生化角质形成细胞)验证本发明中mode1、mode2的细胞毒性。使用试剂盒检测，具体操作步骤如下：

①第一天，细胞传代至96孔板，使第二天加siRNA时，细胞密度在50％。

②第二天，每孔转染100pmol的mode1或mode2。

③5％ CO2，37℃孵育过夜。

④酶标仪在450nm处测量吸光值。

4.2实验结果

图6得知，mode1在6h时有轻微毒性，16h恢复细胞活力；mode2在2h时有轻微毒性，随后逐渐恢复细胞活力。24h时，mode1、mode2均没有明显的影响细胞活力，基本没有毒性。

综上所述，本发明提供未修饰的siVEGF有效敲降VEGF的mRNA水平。相比于其它siRNA在几分钟到几小时内降解完相比，该条裸序列自身能较强的抵抗酶水解。经过化学修饰后，mode2不仅能有效降低mRNA和蛋白水平的表达，还显著的提高在血清中抵抗酶降解的能力，并且几乎没有细胞毒性。这也说明只有合适的化学修饰方法才能进一步提高siRNA序列的使用效果。带本发明提供的序列可以用于体外、体内实验。为治疗血管增生异常或黑色素沉积引起的皮肤病，尤其是黄褐斑皮肤病，带来潜在的临床应用价值。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (10)

1.一种抑制VEGF基因的siRNA，其特征在于，所述的siRNA的正义链的序列为5’-GAAAGAUA GAGC AAGA CAA GA-3’(SEQ ID NO.1)，反义链的序列为5’-UUGU CUUG CUCU AUCUUUC UU-3’(SEQ ID NO.2)。

2.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA特异性靶向VEGF基因的mRNA。

3.根据权利要求2所述的siRNA，其特征在于，所述的mRNA的NCBI编号为NM_001025366.3、NM_001025368.3、NM_001204385.2、NM_001025370.3、NM_003376.6、NM_001033756.3、NM_001025369.3、NM_001025367.3、NM_001287044.2或NM_001317010.1。

4.根据权利要求1所述的siRNA，其特征在于，所述的siRNA还包括对其正义链和/或反义链进行化学修饰。

5.根据权利要求4所述的siRNA，其特征在于，所述的化学修饰包括甲氧基修饰、磷酸骨架修饰、核糖修饰或碱基修饰。

6.根据权利要求4所述的siRNA，其特征在于，所述的化学修饰是将其正义链从5’端起第7、12、17位碱基及其反义链从5’端起第1和21位碱基中核糖C-2’的羟基甲基化为甲氧基戊糖。

7.权利要求1～6任一项所述的siRNA在制备治疗血管增生异常或黑色素沉积引起的皮肤病的药物中的应用。

8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的血管增生异常或黑色素沉积引起的皮肤病为黄褐斑皮肤病。

9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的siRNA通过递送载体包裹制备成药物。

10.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述的药物通过皮肤给药或静脉注射进行给药。

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