CN115725578A - 一种高效编辑smn2基因的单碱基编辑系统及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效编辑SMN2基因的单碱基编辑系统及其应用，涉及生物技术领域。该单碱基编辑系统，包括：第一质粒，包括第一插入序列，所述第一插入序列包括基因编辑蛋白的编码基因，和sgRNA；第二质粒，包括第二插入序列，所述第二插入序列包括脱氨酶的编码基因，和TALE识别蛋白的编码基因；所述TALE识别蛋白的结合位点与所述sgRNA的结合位点的正向距离为8bp‑12bp，或所述TALE识别蛋白的结合位点与所述sgRNA的结合位点的反向距离为9bp‑11bp。

Description

一种高效编辑SMN2基因的单碱基编辑系统及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种高效编辑SMN2基因的单碱基编辑系统及其应用。

背景技术

脊髓性肌萎缩症(spinal muscular atrophy，SMA)是一种常染色体隐性遗传性神经肌肉疾病，以脑干和脊髓运动神经元变性引起的进行性肌无力和肌萎缩为特征，被认为是2岁以下婴儿死亡的主要遗传原因之一。在遗传学上，超过98％的患者是由于运动神经元生存基因1(survival motor neuron 1，SMN1)的缺失，从而导致功能性全长SMN蛋白的缺失。没有足够的SMN蛋白，运动神经元就会皱缩并死亡，导致大脑无法控制身体的肌肉(手、腿部、头部和颈部等肌肉)，进而失去运动功能，影响行走、爬行、吞咽和呼吸等，重症患儿常死于呼吸衰竭。

SMA患者按疾病严重程度进行分型，由重至轻分为SMA 0型、SMA I型、SMA II型、SMA III型和SMA Ⅳ型，不同分型的SMN2基因的拷贝数差异较大。表型分析发现，一般情况下，SMN2拷贝数与疾病严重程度成反比。SMA 0型中SMN2拷贝数多为1，SMA Ⅰ型拷贝数多为1～2，Ⅱ型拷贝数多为3，大多数SMA Ⅲ型患者有3～4个拷贝SMN2基因，大多数SMAⅣ型患者有4～8个拷贝SMN2基因。

相关技术中，反义寡核苷酸、小分子药物、SMN1基因替代等均可以不同程度改善脊髓性肌萎缩症神经细胞或小鼠模型的疾病症状，部分方法还表现出较好的临床疗效。反义寡核苷酸通过鞘内给药来调节SMN2剪接；小分子化合物SMN2启动子激活剂，如组蛋白脱乙酰酶抑制剂(HDACI)丙戊酸(钠)、丁酸钠等调节SMN基因外显子7的剪接；SMN1基因替代疗法通过病毒载体将SMN1基因导入宿主体内，使SMN1基因在宿主细胞内表达目的蛋白，以纠正SMN1基因缺陷。然而，这些方法仍存在价格昂贵、给药方式困难、临床效果不明或无法持久治愈SMA等问题。因此，仍需提供一种比较高效、安全和精确修复SMN2基因的方法。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种单碱基编辑系统，能够对目标碱基进行高效、安全和精确的单碱基编辑。

本发明还提供一种生物材料。

本发明还提供上述单碱基编辑系统或上述生物材料在制备治疗基因突变相关疾病的药物中的应用。

本发明还提供上述单碱基编辑系统或上述生物材料在制备单碱基编辑试剂盒中的应用

本发明还提供一种治疗基因突变相关疾病的药物。

本发明还提供一种单碱基编辑试剂盒。

本发明还提供一种基于上述单碱基编辑系统修饰细胞的制备方法。

根据本发明的第一方面实施例的一种单碱基编辑系统，包括：

第一质粒，包括第一插入序列，所述第一插入序列包括基因编辑蛋白的编码基因，和sgRNA；

第二质粒，包括第二插入序列，所述第二插入序列包括脱氨酶的编码基因，和TALE识别蛋白的编码基因；

所述TALE识别蛋白的结合位点与所述sgRNA的结合位点的正向距离为8bp-12bp，或所述TALE识别蛋白的结合位点与所述sgRNA的结合位点的反向距离为9bp-11bp。

根据本发明实施例的单碱基编辑系统，至少具有如下有益效果：

实施例的单碱基编辑系统能够高效、安全和精确修复SMN2基因，对多种细胞(包括HEK293T细胞、HeLa细胞和U2OS细胞)均具有较好的编辑效果，无可检测的DNA脱靶现象，编辑效率可达70％以上，能够有效提高SMN蛋白表达水平。

根据本发明的一些实施例，所述第一插入序列依次包括第一启动子、所述sgRNA、第二启动子、所述基因编辑蛋白的编码基因。

根据本发明的一些实施例，所述第二插入序列依次包括第三启动子、第一脱氨酶的编码基因、所述TALE识别蛋白的编码基因、第二脱氨酶的编码基因。

根据本发明的一些实施例，所述基因编辑蛋白包括nCas9、spCas9、saCas9、nmCas9、cjCas9以及Cas9变体XCas9、Cas9-NG、SpRY Cas9中的至少一种。优选为nCas9。

根据本发明的一些实施例，所述第一启动子或所述第二启动子或所述第三启动子选自真核生物启动子。可以为CMV、EF-1α、β肌动蛋白基因启动子、SV40、PGK1、Ubc、CAG、TRE、UAS、U6或SP6。

根据本发明的一些实施例，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

根据本发明的一些实施例，所述TALE识别蛋白的编码核苷酸序列如SEQ ID No.8所示；

根据本发明的一些实施例，所述TALE识别蛋白的结合位点与所述sgRNA的结合位点的正向距离为8bp、9bp、10bp或12bp。

根据本发明的一些实施例，所述第一脱氨酶的编码基因和所述第二脱氨酶的编码基因选自胞嘧啶核苷脱氨酶的编码基因或腺嘌呤脱氨酶的编码基因。所述腺嘌呤脱氨酶包括ABE8e、Tada*-TadaWT和ABE8s中的至少一种。优选为ABE8e。

根据本发明的一些实施例，所述第一插入序列还包括第一筛选标记基因。

根据本发明的一些实施例，所述第二插入序列还包括第二筛选标记基因。

根据本发明的一些实施例，所述第一筛选标记基因包括抗性标记基因和荧光标记基因中的至少一种。所述第一筛选标记基因通过连接元件与所述Cas9蛋白的编码基因相连接。所述连接元件选自P2A、E2A、F2A、T2A。优选为T2A。

根据本发明的一些实施例，所述第二筛选标记基因包括抗性标记基因和荧光标记基因中的至少一种。所述第二筛选标记基因通过连接元件与所述第二脱氨酶的编码基因。所述连接元件选自P2A、E2A、F2A、T2A。优选为T2A。

根据本发明的一些实施例，所述抗性标记基因包括但不限于嘌呤霉素抗性基因、潮霉素B抗性基因、安普霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、卡那霉素抗性基因、四环素抗性基因或新霉素磷酸转移酶基因。

根据本发明的一些实施例，所述荧光标记基因包括但不限于EGFP、GFP、CFP、YFP、RFP或BFP。

根据本发明的一些实施例，所述第一质粒还包括第一骨架序列。所述第一骨架序列的来源为pX330、pX260、pX334、pX335、pX458、pX459、pX461、pX462、pX551或pX552。优选为pX459。

根据本发明的一些实施例，所述第二质粒还包括第二骨架序列。所述第二骨架序列的来源包括pE。

根据本发明的一些实施例，所述单碱基编辑系统用于对SMN2基因进行单碱基编辑。

根据本发明的一些实施例，所述单碱基编辑系统用于将SMN2基因的7号外显子的T6替换为C6。

根据本发明的第二方面实施例的一种生物材料，包括含有所述第一质粒、所述第二质粒中的至少一种的重组细胞。

根据本发明的一些实施例，所述重组细胞包括真核细胞或原核细胞。

根据本发明的一些实施例，所述真核细胞包括但不限于哺乳动物细胞、植物细胞、真菌细胞或昆虫细胞。所述哺乳动物细胞包括非人类哺乳动物细胞、人类细胞。所述真菌细胞包括酵母。

根据本发明的一些实施例，所述原核细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草杆菌、沙门氏菌、梭菌或链霉菌。

根据本发明的第三方面实施例的上述单碱基编辑系统或上述生物材料在制备基因突变相关疾病的药物中的应用。

根据本发明的一些实施例，所述基因突变相关疾病包括脊髓性肌萎缩疾病。

根据本发明的一些实施例，所述单碱基编辑系统或所述生物材料用于将SMN2基因的7号外显子的T6替换为C6。

根据本发明的第四方面实施例的上述单碱基编辑系统或上述生物材料在制备单碱基编辑试剂盒中的应用。

根据本发明的一些实施例，所述单碱基编辑试剂盒用于对SMN2基因进行单碱基编辑。

根据本发明的第五方面实施例的一种治疗基因突变相关疾病的药物，药物包括上述的单碱基编辑系统或上述的生物材料。

根据本发明的第六方面实施例的一种单碱基编辑试剂盒，包括上述单碱基编辑系统。

根据本发明的一些实施例，所述单碱基编辑试剂盒用于对SMN2基因进行单碱基编辑。

根据本发明的第七方面实施例的一种基于上述单碱基编辑系统修饰细胞的制备方法，包括以下步骤：将上述单碱基编辑系统导入目标细胞中；所述目标细胞中含所述sgRNA针对的基因。

根据本发明实施例的制备方法，至少具有如下有益效果：

实施例的制备方法，具有方法操作简单、成本低廉的优势，且能够对细胞中SMN2基因准确地进行单碱基编辑。

根据本发明的一些实施例，所述导入的方法包括电穿孔法或脂质体转染法。

根据本发明的一些实施例，所述制备方法还包括对经所述导入操作后的目标细胞进行筛选和鉴定，得到修饰后的细胞。

根据本发明的一些实施例，所述筛选包括通过抗性筛选、流式分选筛选中的至少一种。所述筛选的对象为单克隆细胞。

根据本发明的一些实施例，所述鉴定包括PCR鉴定、测序鉴定中的至少一种。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。

附图说明

图1是本发明实施例1的质粒PX459-gMSA-nCas9、质粒PX459-gMSA-CP1028-nCas9和质粒pE-ABE8e-TALE-2aGFP的结构示意图；

图2是本发明实施例1的不同spacer的设计示意图；

图3是本发明实施例1的不同质粒组合在HEK293T细胞中的编辑效率(A为ABE8e-TALE-T4与sgRNA的设计示意图；B为TALE表达载体与PX459-gMSA-nCas9的组合的单碱基编辑效率；C为TALE表达载体与PX459-gMSA-CP1028-nCas9的组合的单碱基编辑效率；图例中的T3、T4、T5和T6分别指7号外显子第3、4、5、6个核苷酸T)；

图4是本发明实施例2的不同质粒组合在HeLa细胞中的编辑效率(图例中的T3、T4、T5和T6分别指7号外显子第3、4、5、6个核苷酸T)；

图5是本发明实施例3的不同质粒组合在U2OS细胞中的编辑效率(图例中的T3、T4、T5和T6分别指7号外显子第3、4、5、6个核苷酸T)；

图6是本发明实施例4的sgRNA1和sgRNA2的设计示意图；

图7是本发明实施例4的SMA-iPSCs的基因型鉴定的电泳结果图；

图8是本发明实施例4的6#-SMA-iPSCs、28#-SMA-iPSCs与野生型(NILB-hiPSCsSMN1)的序列比对结果；

图9是本发明实施例4的对6#-SMA-iPSCs和28#-SMA-iPSCs的整体修复结果(A为6#-SMA-iPSCs、28#-SMA-iPSCs修复前后的序列比对结果；B为6#-SMA-iPSCs的单碱基编辑效率；C为28#-SMA-iPSCs的单碱基编辑效率；T3、T4、T5和T6分别指7号外显子第3、4、5、6个核苷酸T)；

图10是本发明实施例4的修复后SMA-iPSCs的基因型鉴定的电泳结果图；

图11为本发明实施例4的9#-SC-SMA^T6C-iPSCs与10#-SC-SMA^T6C-iPSCs的序列比对结果；

图12为本发明测试例1的9#-SC-SMA^T6C-iPSCs的细胞免疫荧光实验结果；

图13为本发明测试例1的NILB-iPSCs的细胞免疫荧光实验结果；

图14为本发明测试例1的6#-SMA-iPSCs的细胞免疫荧光实验结果；

图15为本发明测试例1的28#-SMA-iPSCs的细胞免疫荧光实验结果；

图16为本发明测试例2的碱性磷酸酶检测结果；

图17为本发明测试例3的神经元标记物TUJ1和HB9的免疫荧光染色结果；

图18为本发明测试例3的SMN1和HB9双胞体共定位结果。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

在本发明的描述中，如果有描述到第一、第二等只是用于区分技术特征为目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量或者隐含指明所指示的技术特征的先后关系。

在本发明的描述中，术语“包括”和“具有”以及他们的任何变形，意图在于覆盖不排他的包含，例如，包含了一系列步骤或单元的过程、方法、系统、产品或设备不必限于清楚地列出的那些步骤或单元，而是可包括没有清楚地列出的或对于这些过程、方法、产品或设备固有的其它步骤或单元。

下述实施例中所用的细胞裂解液的配方为：0.5％NP40(Solarbio)和20mg/mLProteinase K(TIANGEN)。

人类有两种高度同源的SMN基因，分别为SMN1和SMN2。虽然SMN1与SMN2这两个基因高度相似，但是由于7号外显子上的第6个碱基的不同，导致SMN2产生的多为不含7号外显子的截短型转录本，最终产生功能不全、容易降解的截短型SMN蛋白。

术语“T6C”指SMN2外显子7上第6个碱基T转换为C。

术语“正向距离”指TALE识别序列与sgRNA非靶向链方向相同。

术语“反向距离”指TALE识别序列方向与sgRNA非靶向链方向相反。

实施例1

1.1质粒的设计

本实施例设计了三种质粒，分别命名为PX459-gMSA-nCas9，PX459-gMSA-CP1028-nCas9和pE-ABE8e-TALE-2aGFP，各质粒的结构如图1所示。

质粒PX459-gMSA-nCas9包括依次连接的U6启动子、sgRNA、鸡β肌动蛋白启动子(Promotor)、nCas9、T2A连接元件和嘌呤霉素蛋白puro。

质粒PX459-gMSA-CP1028-nCas9包括依次连接的U6启动子、sgRNA、鸡β肌动蛋白启动子(Promotor)、nCas9c、nCas9n、T2A连接元件和嘌呤霉素蛋白puro。其中，nCas9c、nCas9n分别指cas9蛋白第1028位氨基酸前后两段碱基序列。

质粒pE-ABE8e-TALE-2aGFP包括依次连接的短延伸因子1α(EF-1α)、SP6启动子、腺嘌呤脱氨酶ABE8e、TALE识别蛋白、腺嘌呤脱氨酶ABE8e、绿色荧光蛋白EGFP。

TALE识别蛋白的核苷酸序列为：5'-CTCACACCGGATCAAGTTGTCGCTATTGCTTCTMACRDTGGTGGGAAGCAGGCATTGGAAACCGTCCAGAGACTCCTTCCCGTGCTTTGCCAAGCTCATGGACTGACTCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCMACRDTGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTCACCCCCGATCAGGTCGTTGCAATCGCATCCMACRDTGGCGGAAAACAAGCCCTGGAGACAGTGCAACGATTGCTGCCGGTCCTGTGTCAAGCACACGGC-3'；其中，MACRDT指代AACAAT或AACATT或AACGGT或CACGAT。

工作原理如下：

nCas9与特异性靶向人SMN2基因的sgRNA连接(见质粒PX459-gMSA-nCas9和质粒PX459-gMSA-CP1028-nCas9)，而腺嘌呤脱氨酶ABE8e与另一个具有导航作用的类转录激活效应器(TALE)相连接(见质粒pE-ABE8e-TALE-2aGFP)。nCas9在sgRNA引导下，结合到目标DNA位点，打开并切割双链靶DNA形成单链DNA；同时，腺嘌呤脱氨酶ABE8e在TALE引导下结合到相同的靶位点，腺嘌呤脱氨酶即可对靶向链DNA进行编辑，实现靶位点的A到G突变。

其中，nCas9由鸡β肌动蛋白启动子(chickenβ-actin promoter)启动表达并通过表达嘌呤霉素蛋白puro进行阳性筛选，TALE识别蛋白和腺苷脱氨酶组分由SP6启动子启动表达并通过表达绿色荧光蛋白EGFP进行阳性筛选。

1.2sgRNA的设计

根据Cas9的PAM区原则和sgRNA靶序列设计原则，在人类的SMN2基因外显子7上设计sgRNA位点，在spacer 0-12bp范围内并参考TALEN构建原则选取TALE识别序列。

本实施例所参考的人类SMN2位点的核苷酸序列为：5'-ggctaattttttgtactttcagtagaaacggggttttgccatgttggccaggctgttctcgaactcctgagctcaggtgatccaactgtctcggcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagccactgtgcctagcctgagccaccacgccggcctaatttttaaattttttgtagagacagggtctcattatgttgcccagggtggtgtcaagctccaggtctcaagtgatccccctacctccgcctcccaaagttgtgggattgtaggcatgagccactgcaagaaaaccttaactgcagcctaataattgttttctttgggataacttttaaagtacattaaaagactatcaacttaatttctgatcatattttgttgaataaaataagtaaaatgtcttgtgaaacaaaatgctttttaacatccatataaagctatctatatatagctatctatatctatatagctattttttttaacttcctttattttccttacagggttttagacaaaatcaaaaagaaggaaggtgctcacattccttaaattaaggagtaagtctgccagcattatgaaagtgaatcttacttttgtaaaactttatggtttgtggaaaacaaatgtttttgaacatttaaaaagttcagatgttagaaagttgaaaggttaatgtaaaacaatcaatattaaagaattttgatgccaaaactattagataaaaggttaatctacatccctactagaattctcatacttaactggttggttgtgtggaagaaacatactttcacaataaagagctttaggatatgatgccattttatatcactagtaggcagaccagcagacttttttttattgtgatatgggataacctaggcatactgcactgtacactctgacatatgaagtgctctagtcaagtttaactggtgtccacagaggacatggtttaactggaattcgtcaagcctctgg-3'(SEQ ID No.1)。其中，人类SMN2 exon 7序列为：5'-ggttttagacaaaatcaaaaagaaggaaggtgctcacattccttaaattaagga-3'(SEQ ID No.2)。

sgRNA识别序列为5'-attttgtctaaaaccctgtaagg-3'(SEQ ID No.3)。用于识别SMN2基因负链。

1.3 TALE识别蛋白的结合位点与sgRNA位点的距离(spacer)的设计和筛选

1.3.1 spacer的设计和构建

为了测试TALE识别蛋白的结合位点与sgRNA位点的距离(spacer)对人SMN2基因编辑效果的影响，针对pE-ABE8e-TALE-2aGFP设计并构建了TALE识别蛋白的结合位点与sgRNA位点的正向距离分别为0、3、6、7、8、9、10、11、12、13、16bp的11个质粒，分别命名为ABE8e-TALE-T1、ABE8e-TALE-T2、ABE8e-TALE-T3、ABE8e-TALE-T7、ABE8e-TALE-T8、ABE8e-TALE-T4、ABE8e-TALE-T9、ABE8e-TALE-T10、ABE8e-TALE-T5、ABE8e-TALE-T11、ABE8e-TALE-T6；反向距离分别为0、4、7、8、9、10、11、12bp的8个质粒，分别命名为ABE8e-TALE-F1、ABE8e-TALE-F2、ABE8e-TALE-F5、ABE8e-TALE-F3、ABE8e-TALE-F6、ABE8e-TALE-F4、ABE8e-TALE-F7、ABE8e-TALE-F8。如图2所示。

图2中的质粒ABE8e-Cas9(后续简称为ABE)，包括依次连接的CMV启动子、T7启动子、野生型腺嘌呤脱氨酶ecTadA(wt)、突变型腺嘌呤脱氨酶ecTadA*、nCas9、T2A、EGFP。

TALE正向距离分别为0、3、6、7、8、9、10、11、12、13、16bp的TALE正向识别序列的核苷酸序列分别为5'-caaaaagaagga-3'，5'-aaagaaggaagg-3'，5'-gaaggaaggtgc-3'，5'-aaggaaggtgct-3'，5'-aggaaggtgctc-3'，5'-ggaaggtgctca-3'，5'-gaaggtgctcac-3'，5'-aaggtgctcaca-3'，5'-aggtgctcacat-3'，5'-ggtgctcacatt-3'，5'-gctcacattcct-3'，TALE反向距离分别为0、4、7、8、9、10、11、12bp的TALE反向识别序列的核苷酸序列分别为5'-tccttctttttg-3'，5'-accttccttctt-3'，5'-gtgagcaccttcctt-3'，5'-gagcaccttcct-3'，5'-gtgagcaccttcc-3'，5'-gtgagcaccttc-3'，5'-gtgagcacctt-3'，5'-gtgagcacct-3'。

1.3.2spacer的筛选

将不含TALE识别蛋白的质粒(ABE8e-Cas9)以及1.3.1中构建的19个质粒分别与PX459-gMSA-nCas9(简称nCas9)，PX459-gMSA-CP1028-nCas9(简称CP1028)进行组合，共40个组合。通过脂质体转染试剂，将上述40个质粒组合分别转染到细胞密度约70％-90％的HEK 293T细胞中，转染12h后换液，加嘌呤霉素(puromycin,puro)筛选4天后进行流式分选，收集表达绿色荧光蛋白EGFP的细胞，并用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒提取细胞的基因组或根据细胞量加适量的裂解液进行裂解，以提取的细胞基因组或细胞裂解产物为模板对靶向位点SMN2进行PCR扩增并测序，计算编辑位点的单碱基编辑效率。

(1)HEK 293T的转染和筛选

①培养HEK 293T细胞至细胞汇合度为70％-90％。

②使用Opti-MEM^TM培养基稀释Lipofectamine^TM 3000试剂，得到Lipofectamine^TM3000稀释液。

Opti-MEM^TM培养基与Lipofectamine^TM 3000试剂的体积比为25:1。

③使用Opti-MEM^TM培养基稀释TALE表达载体和nCas9(质量比为1：1)，或TALE表达载体和CP1028(质量比为1：1)，得到DNA预混液；随后向DNA预混液中添加P3000^TM试剂，得到DNA转染液。以ABE8e-Cas9作为TALE表达载体的对照。

其中，TALE表达载体指1.3.1中构建的19个质粒中的任一种。TALE表达载体或nCas9或CP1028的终浓度为X；DNA预混液与P3000^TM试剂的质量体积比为1μg:2μL。

④将Lipofectamine^TM 3000稀释液与DNA转染液混匀，室温孵育10-15分钟，得到DNA-脂质复合物。

Lipofectamine^TM 3000稀释液与DNA转染液的体积比为26:27。

⑤在每管已稀释的Lipofectamine^TM 3000试剂中加入稀释的DNA。

⑥向HEK 293T细胞中加入53μL DNA-脂质复合物，转染12h后换液，加1μg/mL puro连续筛选4天，然后进行流式分选，收集表达绿色荧光蛋白EGFP的细胞。

(2)细胞基因组提取

本步骤利用血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304-03，天根生化科技有限公司)提取细胞基因组。

①将步骤(1)得到的表达绿色荧光蛋白EGFP的细胞的悬液于10000rpm离心1min，去上清，加200μL缓冲液GA，振荡至细胞彻底悬浮。

②继续加入20μL Proteinase K溶液，混匀。

③继续加入200μL缓冲液GB，充分颠倒混匀，70℃放置10min，溶液应变清亮，简短离心。

④继续加入200μL无水乙醇，充分振荡混匀15s，此时可能会出现絮状沉淀，简短离心。

⑤将步骤④的溶液和絮状沉淀加至套有收集管的吸附柱CB3中，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放回收集管中。

⑥向吸附柱CB3中加入500μL缓冲液GD，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。

⑦向吸附柱CB3中加入600μL漂洗液PW，12000rpm离心30s，倒掉废液，将吸附柱CB3放入收集管中。重复一次。

⑧将吸附柱CB3放回收集管中，12000rpm离心2min，倒掉废液。将吸附柱CB3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液。

⑨将吸附柱CB3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加50-200μL洗脱缓冲液TE，室温放置2min-5min，12000rpm离心2min，离心管中的溶液即为提取得到的DNA溶液。

⑩测定步骤⑨的DNA溶液的基因组浓度。

(3)SMN2靶向位点PCR鉴定

设计针对SMN2基因的外围引物sma-xf1和sma-xr1、内围引物sma-xf2和sma-xr2，用于鉴定靶向位点。

sma-xf1、sma-xr1、sma-xf2和sma-xr2的核苷酸序列具体如下：

sma-xf1：5'-ggctaattttttgtactttcagtagaaac-3'(SEQ ID No.4)；

sma-xr1：5'-gtgaaagtatgtttcttccacac-3'(SEQ ID No.5)；

sma-xf2：5'-gctatctatatatagctatctata-3'(SEQ ID No.6)；

sma-xr2：5'-acattaacctttcaactttc-3'(SEQ ID No.7)。

①利用sma-xf1和sma-xr1对步骤(2)得到的细胞基因组进行扩增，得到PCR原液。

PCR体系和反应程序如表1所示。

表1

②利用sma-xf2和sma-xr2对步骤①得到的PCR原液进行扩增，得到PCR产物。

PCR体系和反应程序如表1所示。

表2

③取2μL步骤②的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，将具有240bp条带的PCR产物送去测序，并通过EDITR网站计算SMN2外显子7位点的单碱基编辑效率。单碱基编辑效率统计结果如图3所示。

在HEK 293T细胞中，nCas9组合单碱基编辑效率高于CP1028组合；TALE正向距离为8-10bp或12bp最好；TALE反向距离为9-11bp最好；对T6C的有效基因编辑效率为70％以上，远高于常规ABE(ABE8e-Cas9)编辑效果(低于20％)。在nCas9组合中，当TALE反向识别序列与sgRNA序列相隔10bp时，对T6C的有效基因编辑效率最高，即最优组合是ABE8e-TALE-F4与PX459-gMSA-nCas9。虽然对T3、T4和T5也产生了一定的低效率编辑，但是这种突变不会影响SMN的剪接，也不会影响SMN蛋白的功能。

ABE8e-TALE-F4质粒的TALE识别蛋白的编码核苷酸序列为：5'-CTCACACCGGATCAAGTTGTCGCTATTGCTTCTAACAATGGTGGGAAGCAGGCATTGGAAACCGTCCAGAGACTCCTTCCCGTGCTTTGCCAAGCTCATGGACTGACTCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACGGTGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTCACCCCCGATCAGGTCGTTGCAATCGCATCCAACAATGGCGGAAAACAAGCCCTGGAGACAGTGCAACGATTGCTGCCGGTCCTGTGTCAAGCACACGGCCTTACACCGGATCAAGTTGTCGCTATTGCTTCTAACATTGGTGGGAAGCAGGCATTGGAAACCGTCCAGAGACTCCTTCCCGTGCTTTGCCAAGCTCATGGACTGACTCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACAATGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTCACCCCCGATCAGGTCGTTGCAATCGCATCCCACGATGGCGGAAAACAAGCCCTGGAGACAGTGCAACGATTGCTGCCGGTCCTGTGTCAAGCACATGGACTCACACCGGATCAAGTTGTCGCTATTGCTTCTAACATTGGTGGGAAGCAGGCATTGGAAACCGTCCAGAGACTCCTTCCCGTGCTTTGCCAAGCTCATGGACTGACTCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCCACGATGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTCACCCCCGATCAGGTCGTTGCAATCGCATCCCACGATGGCGGAAAACAAGCCCTGGAGACAGTGCAACGATTGCTGCCGGTCCTGTGTCAAGCACACGGCTTGACACCGGATCAAGTTGTCGCTATTGCTTCTAACGGTGGTGGGAAGCAGGCATTGGAAACCGTCCAGAGACTCCTTCCCGTGCTTTGCCAAGCTCATGGACTGACTCCGGACCAAGTGGTGGCTATCGCCAGCAACGGTGGCGGCAAGCAAGCGCTCGAAACGGTGCAGCGGCTGTTGCCGGTGCTGTGCCAGGACCATGGCCTCACCCCCGATCAGGTCGTTGCAATCGCATCCCACGATGGCGGAAGACCAGCCCTGGAGA-3'(SEQ ID No.8)。

ABE8e-TALE-F4质粒中N端腺嘌呤脱氨酶ABE8e至C端腺嘌呤脱氨酶ABE8e段对应的核苷酸序列为：5'-tctgaggtggagttttcccacgagtactggatgagacatgccctgaccctggccaagagggcacgcgatgagagggaggtgcctgtgggagccgtgctggtgctgaacaatagagtgatcggcgagggctggaacagagccatcggcctgcacgacccaacagcccatgccgaaattatggccctgagacagggcggcctggtcatgcagaactacagactgattgacgccaccctgtacgtgacattcgagccttgcgtgatgtgcgccggcgccatgatccactctaggatcggccgcgtggtgtttggctggaggaactcaaaaagaggcgccgcaggctccctgatgaacgtgctgaactaccccggcatgaatcaccgcgtcgaaattaccgagggaatcctggcagatgaatgtgccgccctgctgtgcgatttctatcggatgcctagacaggtgttcaatgctcagaagaaggcccagagctccatcaacagcggaggtgggggttctggtacaggtaccgtggatctacgcacgctcggctacagccagcagcaacaggagaagatcaaaccgaaggttcgttcgacagtggcgcagcaccacgaggcactggtcggccatgggtttacacacgcgcacatcgttgcgctcagccaacacccggcagcgttagggaccgtcgctgtcaagtatcaggacatgatcgcagcgttgccagaggcgacacacgaagcgatcgttggcgtcggcaaacagtggtccggcgcacgcgctctggaggccttgctcacggtggcgggagagttgagaggtccaccgttacagttggacacaggccaacttctcaagattgcaaaacgtggcggcgtgaccgcagtggaggcagtgcatgcatggcgcaatgcactgacgggtgcccccctgaacctcacaccggatcaagttgtcgctattgcttctaacaatggtgggaagcaggcattggaaaccgtccagagactccttcccgtgctttgccaagctcatggactgactccggaccaagtggtggctatcgccagcaacggtggcggcaagcaagcgctcgaaacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggaccatggcctcacccccgatcaggtcgttgcaatcgcatccaacaatggcggaaaacaagccctggagacagtgcaacgattgctgccggtcctgtgtcaagcacacggccttacaccggatcaagttgtcgctattgcttctaacattggtgggaagcaggcattggaaaccgtccagagactccttcccgtgctttgccaagctcatggactgactccggaccaagtggtggctatcgccagcaacaatggcggcaagcaagcgctcgaaacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggaccatggcctcacccccgatcaggtcgttgcaatcgcatcccacgatggcggaaaacaagccctggagacagtgcaacgattgctgccggtcctgtgtcaagcacatggactcacaccggatcaagttgtcgctattgcttctaacattggtgggaagcaggcattggaaaccgtccagagactccttcccgtgctttgccaagctcatggactgactccggaccaagtggtggctatcgccagccacgatggcggcaagcaagcgctcgaaacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggaccatggcctcacccccgatcaggtcgttgcaatcgcatcccacgatggcggaaaacaagccctggagacagtgcaacgattgctgccggtcctgtgtcaagcacacggcttgacaccggatcaagttgtcgctattgcttctaacggtggtgggaagcaggcattggaaaccgtccagagactccttcccgtgctttgccaagctcatggactgactccggaccaagtggtggctatcgccagcaacggtggcggcaagcaagcgctcgaaacggtgcagcggctgttgccggtgctgtgccaggaccatggcctcacccccgatcaggtcgttgcaatcgcatcccacgatggcggaagaccagccctggagagcattgttgcccagttatctcgccctgatccggcgttggccgcgttgaccaacgaccacctcgtcgccttggcctgcctcggcggacgtcctgcgctggatgcagtgaaaaagggattgccgcacgcgccggccttgatcaaaagaaccaatcgccgtattcccgaacgcacatcccatcgcgttgccgatggcggaggtagcccaaagaagaagcggaaagtctctgaggtggagttttcccacgagtactggatgagacatgccctgaccctggccaagagggcacgcgatgagagggaggtgcctgtgggagccgtgctggtgctgaacaatagagtgatcggcgagggctggaacagagccatcggcctgcacgacccaacagcccatgccgaaattatggccctgagacagggcggcctggtcatgcagaactacagactgattgacgccaccctgtacgtgacattcgagccttgcgtgatgtgcgccggcgccatgatccactctaggatcggccgcgtggtgtttggctggaggaactcaaaaagaggcgccgcaggctccctgatgaacgtgctgaactaccccggcatgaatcaccgcgtcgaaattaccgagggaatcctggcagatgaatgtgccgccctgctgtgcgatttctatcggatgcctagacaggtgttcaatgctcagaagaaggcccagagctccatcaac-3'(SEQ ID No.9)。对应的氨基酸序列为：SEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGWRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSINSGGGGSGTGTVDLRTLGYSQQQQEKIKPKVRSTVAQHHEALVGHGFTHAHIVALSQHPAALGTVAVKYQDMIAALPEATHEAIVGVGKQWSGARALEALLTVAGELRGPPLQLDTGQLLKIAKRGGVTAVEAVHAWRNALTGAPLNLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNNGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNIGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQAHGLTPDQVVAIASNGGGKQALETVQRLLPVLCQDHGLTPDQVVAIASHDGGRPALESIVAQLSRPDPALAALTNDHLVALACLGGRPALDAVKKGLPHAPALIKRTNRRIPERTSHRVADGGGSPKKKRKVSEVEFSHEYWMRHALTLAKRARDEREVPVGAVLVLNNRVIGEGWNRAIGLHDPTAHAEIMALRQGGLVMQNYRLIDATLYVTFEPCVMCAGAMIHSRIGRVVFGWRNSKRGAAGSLMNVLNYPGMNHRVEITEGILADECAALLCDFYRMPRQVFNAQKKAQSSIN(SEQ ID No.10)。

实施例2

本实施例提供ABE8e-TALE-T8、ABE8e-TALE-T4、ABE8e-TALE-T9、ABE8e-TALE-T10、ABE8e-TALE-T5、ABE8e-TALE-T11(分别对应T8、T9、T10、T11、T12、T13)，ABE8e-TALE-F5、ABE8e-TALE-F3、ABE8e-TALE-F6、ABE8e-TALE-F4、ABE8e-TALE-F7、ABE8e-TALE-F8(分别对应F7、F8、F9、F10、F11、F12)中的任一种与PX459-gMSA-nCas9(简称nCas9)的质粒组合在HeLa细胞中的编辑效率。操作步骤具体参见实施例1的1.3.2 spacer的筛选，区别仅在于将HEK 293T细胞替换为HeLa细胞。

单碱基编辑效率统计结果如图4所示。

在HeLa细胞中，TALE正向距离8-10bp或12bp最好；TALE反向距离9-11bp最好，碱基编辑效率与HEK 293T细胞中的碱基编辑效率相近。

实施例3

本实施例提供ABE8e-TALE-T8、ABE8e-TALE-T4、ABE8e-TALE-T9、ABE8e-TALE-T10、ABE8e-TALE-T5、ABE8e-TALE-T11(分别对应T8、T9、T10、T11、T12、T13)，ABE8e-TALE-F5、ABE8e-TALE-F3、ABE8e-TALE-F6、ABE8e-TALE-F4、ABE8e-TALE-F7、ABE8e-TALE-F8(分别对应F7、F8、F9、F10、F11、F12)中的任一种与PX459-gMSA-nCas9(简称nCas9)的质粒组合在HeLa细胞中的编辑效率。操作步骤具体参见实施例1的1.3.2 spacer的筛选，区别仅在于将HEK 293T细胞替换为U2OS细胞。

单碱基编辑效率统计结果如图5所示。

在U2OS细胞中，TALE正向距离8-10bp或12bp最好；TALE反向距离9-11bp最好，碱基编辑效率与HEK 293T细胞中的碱基编辑效率相近。

实施例4

本实施例提供SMN1基因缺失的人类诱导多能干细胞系(hiPSCs)，命名为SMA-hiPSCs。

4.1 sgRNA靶序列的设计

根据Cas9的PAM区和sgRNA靶序列设计原则，在人类的SMN1基因外显子7附近设计2条sgRNA，分别为sgRNA1和sgRNA2，由金斯瑞生物科技公司合成。sgRNA1和sgRNA2的设计示意图如图6所示。sgRNA1和sgRNA2的核苷酸序列如下：

sgRNA1：5'-attttgtctgaaaccctgta-3'(SEQ ID No.11)；

sgRNA2：5'-tcagatgttaaaaagttgaa-3'(SEQ ID No.12)。

本实施例中使用的人类SMN1位点的核苷酸序列为：5'-ctaattttttgtactttcagtagaaatggggttttgccatgttggccaggctgttctcgaactcctgagctcaggtgatccaactgtctcggcctcccaaagtgctgggattacaggcgtgagccactgtgcctagcctgagccaccacgccggcctaatttttaaattttttgtagagacagggtctcattatgttgcccagggtggtgtcaagctccaggtctcaagtgatccccctacctccgcctcccaaagttgtgggattgtaggcatgagccactgcaagaaaaccttaactgcagcctaataattgttttctttgggataacttttaaagtacattaaaagactatcaacttaatttctgatcatattttgttgaataaaataagtaaaatgtcttgtgaaacaaaatgctttttaacatccatataaagctatctatatatagctatctatgtctatatagctattttttttaacttcctttattttccttacagggtttcagacaaaatcaaaaagaaggaaggtgctcacattccttaaattaaggagtaagtctgccagcattatgaaagtgaatcttacttttgtaaaactttatggtttgtggaaaacaaatgtttttgaacatttaaaaagttcagatgttaaaaagttgaaaggttaatgtaaaacaatcaatattaaagaattttgatgccaaaactattagataaaaggttaatctacatccctactagaattctcatacttaactggttggttatgtggaagaaacatactttcac-3'(SEQ ID No.13)。其中，人类SMN1位点exon7的核苷酸序列为：5'-ggtttcagacaaaatcaaaaagaaggaaggtgctcacattccttaaattaagga-3'(SEQ ID No.14)。

4.2 SMA-hiPSCs细胞系的建立

本实施例在实验室之前保存的抵抗凋亡和可定向诱导的干细胞系NILB-iPSCs细胞系上进行SMN1基因修饰。NILB-iPSCs细胞系可以在体外经强力霉素(Doxycycline,Dox)诱导后，高效、定向分化为运动神经元，还具有以下特点：①在人类诱导多能干细胞系(hiPSCs)中转入了Tet-on系统，实现运动神经元转录因子Ngn2、Isl1、Lhx3条件性表达，既保留hiPSCs本身增殖快的特点，又可以利用药物定向诱导运动神经元分化；②在hiPSCs中过表达抗凋亡因子Bcl-xL，保证移植细胞的长期存活。

(1)电转

采用Neon^TM试剂盒(由赛默飞世尔科技(中国)有限公司提供)进行电转。Cas9蛋白为GenCrispr NLS-Cas9-NLS Nuclease，购自GenScript公司。

①复苏和培养NILB-iPSCs细胞，并收集NILB-iPSCs细胞到离心管中。

当细胞融合率达到70％-90％后，吸掉培养基，杜氏磷酸缓冲液(DPBS)洗涤细胞2次，弃去上清液，加入Accutase(细胞消化液)，37℃孵育3min；加入DPBS，吹打混匀后转移至1.5mL离心管，1000rpm离心5分钟，弃上清。

②向11μL bufferR中依次加入15pmol sgRNA1，15pmol sgRNA2和2.8μg Cas9蛋白，室温孵育10分钟，组装得到RNP复合物。

③用步骤②RNP复合物重悬步骤①的细胞，至终细胞密度为1.0×10⁵cells/mL，得到细胞-RNP复合物。

④用2.5mL缓冲液E填充Neon^TM管，将Neon^TM管插入Neon^TM移液器站，直到听到咔哒声；将Neon^TM移液器上的按钮按到第二个位置以打开夹子，插入Neon^TM吸头，直到夹子完全抓住活塞的安装杆；将Neon^TM吸头浸入细胞-RNP复合物中，缓慢按钮，将细胞-RNP复合物吸入Neon^TM吸头，在移液过程中避免气泡；将装有细胞-RNP复合物的Neon^TM移液器垂直插入放置在Neon^TM移液器站中的Neon^TM管中，直到听到咔嗒声。

⑤设置电转参数，进行电转。电转参数为：脉冲电压(Pulse Voltage)为1200V；脉冲宽度(Pulse width)为20ms；脉动数(Pulse number)为2；Tip type为10μL。

⑥从Neon^TM移液器站中取出Neon^TM移液器，按移液器上的按钮到第一个停止位置，立即将样品从Neon^TM吸头转移到预先铺上基质胶(Matrigel matrix)的6孔板中，每孔添加1.5mL含Y-27632的mTeSR^TM培养基。

⑦将6孔培养板置于37℃和5％CO₂的恒温培养箱中培养，直到单克隆细胞形成。

(2)单克隆挑选

细胞培养一周左右在显微镜下看到细胞克隆生成，挑选外缘光滑平整，细胞形态正常且生长良好的细胞克隆。

①用基底膜基质(Matrigel)包被48孔板，每孔添加含Y-27632和双抗的mTeSR^TM培养基。

②在显微镜下，使用10μL移液枪进行克隆刮取，转移到步骤①的48孔板中。

③将48孔板置于37℃和5％CO₂的恒温培养箱中培养。

(3)单克隆基因型鉴定

①步骤(2)挑取的单克隆细胞培养3天后，每个单克隆细胞收取一半用于基因型鉴定，另外一半于37℃和5％CO₂的恒温培养箱中继续培养。

②向步骤①收取的单克隆细胞中添加适量的细胞裂解液，按裂解程序进行裂解，得到细胞裂解产物。裂解程序为：56℃，1h；95℃，10min；16℃，∞。

③以细胞裂解产物为模板，进行PCR鉴定。

针对SMN1基因设计外围引物smn-f1和smn-r1，内围引物smn-f2和smn-r2。smn-f1、smn-r1、smn-f2和smn-r2的核苷酸序列如下：

smn-f1：5'-ctaattttttgtactttcagtagaaat-3'(SEQ ID No.15)；

smn-r1：5'-gtgaaagtatgtttcttccacat-3'(SEQ ID No.16)；

smn-f2：5'-gctatctatatatagctatctatg-3'(SEQ ID No.17)；

smn-r2：5'-ttgttttacattaacctttcaactttt-3'(SEQ ID No.18)。

首先用外围引物smn-f1和smn-r1分别对53个单克隆细胞的细胞裂解产物进行PCR扩增，得到PCR原液，PCR体系和反应程序如表1所示；再用smn-f2和smn-r2或smn-r1对PCR原液进行扩增，得到PCR产物PCR体系和反应程序如表2所示。

各取2μLPCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图7所示。

④将PCR产物送测序，测序结果与野生型(NILB-hiPSCs SMN1)序列比对，发现其中有两株细胞克隆(6#-SMA-iPSCs和28#-SMA-iPSCs)为纯合SMN1突变株。

比对结果如图8所示。6#-SMA-iPSCs的突变方式为在SMN1的7号外显子前的剪接受体区插入一个碱基A，破坏剪接受体，使SMN1的RNA成熟过程无法剪接获得7号外显子。28#-SMA-iPSCs突变方式为删除了SMN1的7号外显子，从而导致SMN1蛋白表达不全，功能丧失。

⑤将筛选出的2株SMA-iPSCs细胞系(6#-SMA-iPSCs和28#-SMA-iPSCs)扩大培养，并冻存。

4.3SMA-iPSCs细胞系SMN2基因的精确修复

(1)细胞转染

①将6#-SMA-iPSCs和28#-SMA-iPSCs分别传代至24孔培养板于37℃和5％CO₂的恒温培养箱中培养。

②将Opti-MEM^TM培养基、FUGENE HD试剂、ABE8e-TALE-F4和px459-gMSA-nCas9混匀，室温孵育15-30分钟，得到DNA复合物。

ABE8e-TALE-F4和px459-gMSA-nCas9的质量比为1:1，ABE8e-TALE-F4和px459-gMSA-nCas9的总量为300ng；Opti-MEM^TM培养基、FUGENE HD试剂的体积比为25:0.9。

③当细胞汇合度为70％-90％时进行转染，将DNA复合物分别加至6#-SMA-iPSCs和28#-SMA-iPSCs中，将细胞于37℃和5％CO₂的恒温培养箱中培养。

(2)筛选和鉴定

①步骤(1)的细胞转染24h后换液，加0.5μg/mL puro连续筛选69h，收取一半细胞进行PCR鉴定。PCR鉴定的方法同实施例1第1.3.2节的步骤(3)。剩余一半细胞传代到6孔培养板中，放入37℃和5％CO₂培养箱中进行培养，每天观察细胞形态，1周左右进行单克隆挑选。

测序结果和T6C编辑效率的结果如图9所示。在SMA-iPSCs中，整体修复最高可实现SMN2外显子7上21％的T6C转换。由于转染试剂对干细胞的转染效率较低，且未对转染后的干细胞进行流式分选，使得干细胞T6C编辑效率低于HEK 293T细胞、HeLa细胞和U2OS细胞。

(3)基因型鉴定

①随机选取10株单克隆细胞，收取一半用于基因型鉴定，另一半继续置于37℃和5％CO2的恒温培养箱中培养。

②向步骤①收取的单克隆细胞中添加适量细胞裂解液，按裂解程序进行裂解，得到细胞裂解产物。裂解程序为：56℃，1h；95℃，10min；16℃，∞。

③首先用外围引物sma-xf1和sma-xr1分别对单克隆细胞的细胞裂解产物进行PCR扩增，得到PCR原液，PCR体系和反应程序如表1所示；再用内围引物sma-xf2和sma-xr2对PCR原液进行扩增，得到PCR产物，PCR体系和反应程序如表2所示。

④各取2μL PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。电泳结果如图10所示。10个单克隆细胞对应的PCR产物均电泳得到247bp预期大小的条带。

⑤将10管PCR产物送测序。部分单克隆细胞的测序序列比对结果如图11所示。

其中9#(即9#-SC-SMA^T6C-iPSCs)是一株纯合SMN2突变株，在6#-SMA-iPS细胞系中实现了SMN2外显子7上T6C 100％剪接校正。10#克隆细胞系T6C编辑效率为50％，可能是杂合子。

测试例1

本测试例对NILB-iPSCs，6#-SMA-iPSCs，28#-SMA-iPSCs，#9SC-SMA^T6C-iPSCs分别进行细胞免疫荧光实验测试。具体实验步骤如下：

(1)将NILB-iPSCs，6#-SMA-iPSCs，28#-SMA-iPSCs，#9SC-SMA^T6C-iPSCs分别传代到四孔板中，待细胞克隆形成后，将培养基吸出，用PBS浸洗3次，每次5min。

(2)用4％的多聚甲醛固定细胞30min，PBS浸洗3次，每次7min。

(3)加入0.5％Trition X-100(PBS配制)室温通透20min，PBS浸洗3次，每次7min。

(4)吸干PBS，滴加正常山羊血清，室温封闭40min。

(5)吸干正常山羊血清，每个孔直接加入300μL稀释好的Oct4、Sox2或Nanog抗体(一抗)，4℃孵育过夜。

(6)将一抗吸出，用PBS浸洗3次，每次7min。

(7)吸干PBS，加入对应的稀释好的荧光二抗，用锡箔纸室温孵育40min。

(8)将二抗吸出，用PBS避光浸洗3次，每次7min。

(9)吸干PBS，加入稀释后的DAPI，避光孵育5min，复染细胞核，随后用PBS浸洗3次，每次7min。

(10)吸干PBS，每孔加入300μL PBS，于倒置荧光显微镜下观察并拍照。

细胞免疫荧光实验结果如图12-15所示。

与NILB-iPSCs相比，6#-SMA-iPSCs，28#-SMA-iPSCs，#9SC-SMA^T6C-iPSCs中均表达多能性标记物(包括OCT4、SOX2和NANOG)。这说明6#-SMA-iPSCs，28#-SMA-iPSCs，#9SC-SMA^T6C-iPSCs具有多能性。

测试例2

本测试例通过碱性磷酸酶检测试剂盒(MP7503，懋康生物科技有限公司)对NILB-iPSCs，6#-SMA-iPSCs，28#-SMA-iPSCs，#9SC-SMA^T6C-iPSCs分别进行碱性磷酸酶检测。具体实验步骤如下：

(1)对24孔板单孔，先取0.2mL溶液A和0.2mL溶液B于离心管中混匀。室温孵育2min，然后加入溶液C混匀。

(2)将NILB-iPSCs，6#-SMA-iPSCs，28#-SMA-iPSCs，#9SC-SMA^T6C-iPSCs分别传代到24孔板中，待细胞克隆形成后，吸出细胞培养液，PBST洗2次，用0.5mL固定液室温固定3min。

(3)吸出固定液，PBST洗2次，吸出PBST。

(4)按0.6mL/孔加入染色工作液，使之覆盖细胞，室温避光放置10min。

(5)将染色工作液去除，用PBS洗2次后，加入PBS在显微镜下观察。

碱性磷酸酶检测结果如图16所示。

NILB-iPSCs、6#-SMA-iPSCs、28#-SMA-iPSCs、9#-SC-SMA^T6C-iPSCs呈紫色。这表明6#-SMA-iPSCs，28#-SMA-iPSCs，9#-SC-SMA^T6C-iPSCs并没有分化。

测试例3

本测试例提供对SMA-iPSCs和SC-SMA^T6C-iPSCs的体外定向分化及鉴定。

(1)体外定向分化

①用灭菌的眼科镊将无菌的细胞爬片放入24孔板中，每孔加入300μL Matrigel包被过夜。

②使用DPBS洗涤细胞两次，将1×10⁵个SMA-iPSCs和SC-SMA^T6C-iPSCs分别接种于24孔板中，用mTeSR培养基培养。

③将mTeSR培养基替换为添加有强力霉素(Dox，1μg/mL)的运动神经元诱导培养基，以诱导定向分化。

(2)细胞爬片的免疫荧光染色

免疫荧光染色所用的一抗为TUJ1(18207，Abcam)，GFP(ab290，Abcam)，HB9(81.5C10，DSHB)，SMN1(bs-4628R，Bioss)，二抗为Anti-mouse 488/555(Abcam)，Anti-rabbit 488/555(Abcam)。具体实验步骤如下：

①经诱导分化6天后，在含有细胞爬片的24孔板中，每个孔先用300μL DPBS清洗细胞3次，每次3min；随后每孔加300μL多聚甲醛溶液(4％PFA)，室温固定30min。

②弃掉4％PFA，每孔用300μL DPBS洗3次，每次7min。

③封闭通透：每孔加入300μL组织封闭液，室温封闭2h。

④一抗孵育：弃去封闭液，直接滴加300μL封闭液稀释好的一抗，4℃孵育过夜。

⑤弃一抗，用DPBS清洗3次，每次7min。

⑥二抗孵育：洗涤完毕后，根据一抗的属性选择相应的荧光二抗(5％BSA稀释荧光二抗)，每孔加入300μL二抗工作液，室温避光孵育2h。

⑦弃二抗，DPBS清洗3遍，每次7min。

⑧滴加DAPI工作液，每孔300μL，室温避光孵育5min，然后用DPBS清洗细胞3次，每次3min。

⑨取出细胞爬片，细胞面向上置于封口膜上，每片滴加20μL的50％甘油，将载玻片倒扣于细胞爬片上，防止气泡产生，挤掉多于甘油，并擦干玻片。

⑩封片完毕后，避光保存，并置于Leica TCS SP8 STED超高分辨共聚焦显微镜下进行拍照。

免疫荧光表征结果如图17所示。6#-SMA-iPSCs，28#-SMA-iPSCs，9#-SC-SMA^T6C-iPSCs在Dox诱导下定向分化为运动神经元，分别表达神经元通用marker TUJ1和运动神经元marker HB9。这表明，6#-SMA-iPSCs，28#-SMA-iPSCs，9#-SC-SMA^T6C-iPSCs可在体外有效地定向分化为运动神经元。

9#-SC-SMA^T6C-iPSCs比SMA疾病细胞模型6#-SMA-iPSCs、28#-SMA-iPSCs诱导出来的运动神经元含有更多的SMN蛋白双胞体(白色箭头指向SMN1和HB9共定位)。这说明碱基校正后，SMN蛋白表达水平增加。

上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。

Claims (10)

1.一种单碱基编辑系统，其特征在于，包括：

第一质粒，包括第一插入序列，所述第一插入序列包括基因编辑蛋白的编码基因，和sgRNA；

第二质粒，包括第二插入序列，所述第二插入序列包括脱氨酶的编码基因，和TALE识别蛋白的编码基因；

所述TALE识别蛋白的结合位点与所述sgRNA的结合位点的正向距离为8bp-12bp，或所述TALE识别蛋白的结合位点与所述sgRNA的结合位点的反向距离为9bp-11bp。

2.根据权利要求1所述的单碱基编辑系统，其特征在于，所述第一插入序列还包括第一筛选标记基因；

优选地，所述第二插入序列还包括第二筛选标记基因；

优选地，所述第一筛选标记基因包括抗性标记基因和荧光标记基因中的至少一种；

优选地，所述第二筛选标记基因包括抗性标记基因和荧光标记基因中的至少一种。

3.根据权利要求1所述的单碱基编辑系统，其特征在于，所述第一插入序列依次包括第一启动子、所述sgRNA、第二启动子、所述基因编辑蛋白的编码基因；

优选地，所述第二插入序列依次包括第三启动子、第一脱氨酶的编码基因、所述TALE识别蛋白的编码基因、第二脱氨酶的编码基因；

优选地，第一脱氨酶编码基因和第二脱氨酶编码基因选自胞嘧啶核苷脱氨酶编码基因或腺嘌呤脱氨酶编码基因；

优选地，所述基因编辑蛋白包括Cas9、nCas9、Cas10、Cas9a、Cas12、Cas12a、Cas12b、Cas13、Cas14中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的单碱基编辑系统，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列如SEQID No.3所示；

优选地，所述TALE识别蛋白的编码核苷酸序列如SEQ ID No.8所示。

5.一种生物材料，其特征在于，生物材料包括含有所述权利要求1至4任一项的所述第一质粒、所述第二质粒中的至少一种的重组细胞。

6.权利要求1至4任一项所述的单碱基编辑系统或权利要求5所述的生物材料在制备治疗基因突变相关疾病的药物中的应用；

优选地，所述基因突变相关疾病包括脊髓性肌萎缩疾病。

7.权利要求1至4任一项所述的单碱基编辑系统或权利要求5所述的生物材料在制备单碱基编辑试剂盒中的应用。

8.一种治疗基因突变相关疾病的药物，其特征在于，药物包括权利要求1至4任一项所述的单碱基编辑系统或权利要求5所述的生物材料。

9.一种单碱基编辑试剂盒，其特征在于，包括权利要求1至4任一项所述的单碱基编辑系统或权利要求5所述的生物材料。

10.一种基于权利要求1至4任一项所述的单碱基编辑系统修饰细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将权利要求1至4任一项所述的单碱基编辑系统导入目标细胞中；所述目标细胞中含所述sgRNA针对的基因。

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