CN115718146A - 牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质及其制备方法。本发明制备方法，包括如下步骤：S1、对奶牛给药阿莫西林，采集含有阿莫西林的牛奶；S2、将空白牛奶和所述含有阿莫西林的牛奶分别进行真空冷冻干燥，得到空白牛奶冻干粉和含有阿莫西林的牛奶冻干粉；S3、将所述空白牛奶冻干粉和所述含有阿莫西林的牛奶冻干粉粉碎后混匀，得到牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质。本发明还原了阿莫西林在奶牛体内完整的代谢过程，由奶牛的喂养开始制备基体标准物质；本发明牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质为阿莫西林的检测提供了实物基体标准物质，满足了阿莫西林残留检测中质量控制和方法学验证的需求，为检测结果的溯源性、可靠性和可比性提供保障。

Description

牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质及其制备方法

技术领域

本发明属于基体标准物质技术领域，尤其涉及牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质及其制备方法。

背景技术

阿莫西林，是一种最常用的半合成青霉素类广谱β-内酰胺类抗生素，为一种白色粉末，在酸性条件下稳定。阿莫西林杀菌作用强，穿透细胞膜的能力也强。是目前应用较为广泛的口服半合成青霉素之一。阿莫西林通过抑制细菌胞壁黏肽合成而发挥杀菌作用。对肺炎链球菌、溶血性链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、巴氏杆菌、沙门氏菌属、流感嗜血杆菌等具有良好的抗菌活性，在家禽家畜养殖过程中应用十分广泛。但过量使用会造成在动物性食品中的残留，会导致敏感人群的过敏反应和细菌耐药性等问题。而且GB-31650-2019中规定阿莫西林在奶中的最大残留限量仅有4μg/kg，故对于检测动物源性食品中的阿莫西林方法的需求十分迫切。

标准物质是一种或多种足够均匀、稳定并有特性量值用于评价方法，校准仪器设备，给材料赋值的物质。“基体标准物质”是具有最高计量学特征、用基准方法确定特性量值的标准物质。标准物质是国家或国际的测量标准和量值传递的载体，是建立测量量值溯源体系最有效的工具。标准物质具有均匀性、稳定性、重复性、不确定度和溯源性等特性，在时间上可以保持特性量值，在空间上可以传递和溯源量值。在兽药残留检测中，样品的基质成分十分复杂。单纯采用纯标准品制备的添加样品进行方法评价存在诸多弊端，例如在检测过程中存在明显的基质效应的干扰，运用基体标准物质对检测过程和结果进行质控和校准是最为有效的手段。因此基体标准物质的研制在兽药残留检测过程中具有十分重要的作用。

目前于国家标准物质资源共享平台上仅可以查询到阿莫西林纯度标准物质，并无涉及到阿莫西林的基体标准品。

阿莫西林的含量检测方法有紫外分光光度法、荧光光度法、酶联免疫吸附试验、高效液相色谱法以及超高效液相色谱-串联质谱法。高效液相色谱法和超高效液相色谱-串联质谱法较为常用，但高效液相色谱法灵敏度较低，若提高灵敏度需要进行衍生化，导致前处理繁琐，样品分析时间长，且流动相需要添加磷酸盐，易造成管路堵塞。因此，需要开发一种用于检测牛奶冻干粉中阿莫西林的分析方法。

发明内容

本发明的目的是提供牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质及其制备方法，牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质可以最大限度克服由于牛奶基质效应所引起的误差，且满足国内外对牛奶中阿莫西林残留实验室的质量控制及方法验证的需求，填补了阿莫西林基体标准物质的空白，为牛奶中阿莫西林残留分析提供了量值溯源的依据。

本发明提供的牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质的制备方法，包括如下步骤：

S1、对奶牛给药阿莫西林，采集含有阿莫西林的牛奶；

S2、将空白牛奶和所述含有阿莫西林的牛奶分别进行真空冷冻干燥，得到空白牛奶冻干粉和含有阿莫西林的牛奶冻干粉；

S3、将所述空白牛奶冻干粉和所述含有阿莫西林的牛奶冻干粉粉碎后混匀，得到牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质。

上述的制备方法中，所述给药阿莫西林的方式优选为肌肉注射，注射部位具体可为肩胛前部的肌肉和臀部肌肉；

所述给药阿莫西林的剂量可为60～80mg/kg/天，具体可为71mg/kg/天；可连续给药2～4天，具体可连续给药3天；

所述采集含有阿莫西林的牛奶的时间可在给药后的10～30分钟，具体可为15分钟。

所述采集的牛奶在-80℃冷冻保存。

上述的制备方法中，所述真空冷冻干燥是一个稳定化的物质干燥过程，是将含水的物质先冻结成固态，而后使其中的水分从固态直接升华变成气态排除，以除去水分而保存物质的方法；

所述真空冷冻干燥的真空度可为3～50Pa，具体可为10～20Pa；冷肼温度可为-80℃；时间可为60～96h，具体可为72h；

所述真空冻干的预冷温度可为-24～-40℃，具体可为-30℃；

所述真空冻干的样品的厚度为10～20mm，优选15mm。

上述的制备方法中，所述粉碎的转速可为1500～4000r/min，具体可为2000r/min；所述粉碎的时间可为10～30s，具体可为15s；

所述粉碎后过筛，粒径可为0.8～1.0mm，具体可为0.9mm；

所述混匀可为混合机混匀，混匀时间可为1.5～4h，具体可为2h。

上述的制备方法中，所述牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质中阿莫西林的浓度可为4μg/kg。

本发明进一步提供了上述的制备方法制备得到的牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质。

本发明还提供了一种奶粉或牛奶冻干粉中阿莫西林的分析方法，包括如下步骤：

(1)将待检测的奶粉或牛奶冻干粉和水混匀使所述奶粉或牛奶冻干粉还原为牛奶；将所述还原的牛奶脱脂后添加阿莫西林同位素内标，混匀；在所述混匀后的混合液中加入提取试剂进行提取，得到提取液；

(2)将所述提取液通过固相萃取柱进行净化，收集洗脱液；

(3)将所述洗脱液浓缩并定容后进行液相色谱-质谱/质谱分析。

上述的分析方法中，步骤(1)中，所述脱脂的条件具体可为10000rpm离心10min；

步骤(1)中，所述阿莫西林同位素内标的浓度可为10mg/L；

步骤(1)中，所述提取试剂可为无水乙醇；

所述提取可为依次进行涡动、离心，收集上清液；

所述涡动的时间具体可为5min；

所述离心的温度可为4℃，转速具体可为3500rpm，时间具体可为15min；

步骤(2)中，所述固相萃取柱可为HLB固相萃取柱；通过所述HLB固相萃取柱后可用体积分数为90％乙腈的水溶液进行洗脱。

上述的分析方法中，所述阿莫西林以[M+H]+365.90>113.70为定量离子，[M+H]+365.90>207.70为定性离子；

所述阿莫西林同位素内标为阿莫西林-d4；所述阿莫西林-d4以[M+H]+369.90>114.00为定量离子。

上述的分析方法中，所述定容的步骤如下：每0.4mL浓缩液用水定容至1mL；完成定容后每1mL定容液添加3μL甲酸；

所述液相色谱-质谱/质谱分析中的色谱条件可如下：

固定相：十八烷基键合硅胶色谱柱；

流动相：A：0.1％甲酸水溶液，B：0.1％甲酸乙腈溶液；

梯度洗脱程序：0.00～0.50min A的体积分数为99.0％；0.50～1.50min A的体积分数由99.0％降至60.0％；1.50～2.00min A的体积分数为60.0％；2.00～2.01min A的体积分数由60.0％降至2.0％；2.01～2.50min A的体积分数为2.0％；2.50～4.50min A的体积分数由2.0％升至99.0％；

流速：0.3mL/min；

进样体积：10μL；

柱温：35℃；

所述液相色谱-质谱/质谱分析中质谱的条件可如下：

离子源：电喷雾离子源；

扫描方式：正离子扫描；

检测方式：多反应监测；

毛细管电压：3.40KV；

离子源温度：100℃；

去溶剂温度：350℃。

上述的分析方法在对牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质进行均匀性检测、稳定性检测和定值中的应用，也在本发明的保护范围内。

本发明具有如下有益效果：

(1)本发明牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质的浓度远远低于现有标准物质的浓度，表明其具有较高的准确度，且更适用于日常生活中较低浓度的残留监测。本发明还原了阿莫西林在奶牛体内完整的代谢过程，是由奶牛的喂养开始，最后制备基体标准物质。

(2)本发明牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质为阿莫西林的检测提供了实物基体标准物质，满足了阿莫西林残留检测中质量控制和方法学验证的需求，为检测结果的溯源性、可靠性和可比性提供保障。基体标准物质的应用是兽药残留检测技术的发展趋势，目前各类兽药基体标准物质的需求量巨大，本研究在基体标准物质的研制上进行了有益的尝试和探索。本研究成功研制了牛奶冻干粉中阿莫西林的基体标准物质，可以成为牛奶中阿莫西林量值溯源的载体，并能广泛的应用于牛奶中阿莫西林检测的方法学验证和质量控制。

(3)本发明牛奶冻干粉中阿莫西林的检测方法前处理操作简单，快速，灵敏度、准确度等均满足要求，可满足牛奶冻干粉中阿莫西林基体标准物质的定值要求。

附图说明

图1为空白牛奶添加样品的UPLC-MS/MS特征离子质量色谱图(AMO：2μg/kg)。

图2为空白牛奶的UPLC-MS/MS特征离子质量色谱图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实验材料

AMO-d₄标准品购自TRC公司，货号为A634238，纯度为96％。

HLB固相萃取柱购自盛世中方(北京)生物科技有限公司，品牌为DURLab，货号为DL150116001,参数如下：粒径：30μm(球型)，孔径：

比表面积：830m²/g，pH范围：0-14；柱管体积：6cc，吸附剂重量：500mg。

10mol/L NaOH溶液：称取40g NaOH至100mL容量瓶中，加纯水溶解并定容至100mL备用。

0.1mol/L pH8.0磷酸二氢钠缓冲盐：称取3.90g二水磷酸二氢钠至250mL烧杯中，用玻璃棒搅拌溶解。用10mol/L NaOH溶液将pH调至8.0。

给药用阿莫西林是河北远征药业生产的，其商品名称为阿莫西林钠，生产批号为兽药字(2012)030016176，纯度为98％。

后续均匀性、稳定性检测以及定值部分采用的阿莫西林标准物质(二级标物)购买自TMRM坛墨质检-标准物质中心，标准物质编号：GBW(E)061894，研制(生产)单位：中国计量科学研究院，纯度为98.2％，扩展不确定度为0.7％(K＝2)。

阿莫西林的标准工作液的配制过程如下：称取10mg阿莫西林标准品，至10mL棕色容量瓶中，用50％乙腈水溶液溶解并定容至10mL，配制成1000mg/L标准储备液。用Milli-Q水稀释成所需浓度的阿莫西林标准溶液。放置在-20℃冰箱保存，有效期为一个月。

AMO-d₄内标液的配制过程如下：称取1.0mg AMO-d4内标标准品，至10mL棕色容量瓶中，用Milli-Q水溶解并定容至10mL，配制成100mg/L标准储备液。用Milli-Q水稀释成所需浓度的阿莫西林标准溶液。放置在-20℃冰箱保存，有效期为一个月。

90％乙腈-水：量取乙腈90mL，用水稀释至100mL，临用现配。

0.1％甲酸乙腈溶液：取甲酸0.1mL，用乙腈稀释至100mL，临用现配。

0.1％甲酸溶液：取甲酸0.1mL，用水稀释至100mL，临用现配。

试验仪器

真空冷冻干燥机(FD-1-50，FD-1-80)，购买自北京博医康实验仪器有限公司。

UPLC-MS/MS为Waters Acquity UPLC-Xevo TQ-s。

高效翻转搅拌混合机购自郑州哲科机械设备有限公司。

实施例1、检测奶粉或牛奶冻干粉中阿莫西林的浓度

一、检测方法

按照如下步骤检测奶粉或牛奶冻干粉中阿莫西林的浓度：

(1)药物提取：称取奶粉或者牛奶冻干粉1g于10 mL离心管中，并加入6.5 mL水将其还原为牛奶，进行10000rpm离心10min脱脂，取2mL上清液加入10mL的EP管中，添加AMO-d₄20μL，内标浓度为10mg/L(AMO-d₄是由Milli-Q水完成配制和稀释步骤)，涡动3min混匀后，静置15min。于样品中加入6mL无水乙醇提取液，涡动5min，4℃3500rpm离心15min，将上清液转移至鸡心瓶中，提取液于37℃下旋转蒸发至1.5mL左右，再加入4mL 0.1M磷酸二氢钠缓冲盐(pH＝8.0)，混匀后，待净化。

(2)净化：依次用3mL甲醇、3mL水、3mL 0.1M磷酸二氢钠缓冲盐(pH＝8.0)活化HLB固相萃取柱(6cc,500mg)，将鸡心瓶中的提取液转移到HLB柱上，再用2mL的磷酸二氢钠缓冲盐洗涤鸡心瓶，将洗液一并转移到萃取柱上。待样品全部通过HLB柱后，用3mL水淋洗并抽干萃取柱，4mL的90％乙腈-水溶液洗脱，收集洗脱液于10mL的EP管中。实验过程中，通过对不同比例的乙腈水溶液进行试验，最终将洗脱液确定为90％乙腈水溶液。

(3)浓缩：氮气吹至0.4mL用水定容至1mL，添加3μL甲酸，14000rpm离心20min，过Pall滤膜供UPLC-MS/MS分析。

(4)UPLC-MS/MS分析的色谱和质谱条件为：

色谱柱：CORTECS^TM

C₁₈Column(2.1mm×50mm，1.6μm)

流动相：A：0.1％甲酸水溶液，B：0.1％甲酸乙腈溶液

梯度洗脱程序见表1。

表1、洗脱程序

时间	A(％)	B(％)
			0.00	99.0	1.0
0.50	99.0	1.0
			1.50	60.0	40.0
2.00	60.0	40.0
			2.01	2.0	98.0
2.50	2.0	98.0
			4.50	99.0	1.0

流速：0.3mL/min

进样体积：10μL

柱温：35℃

离子源：电喷雾离子源(ESI)

扫描方式：正离子扫描

检测方式：多反应监测(MRM)

毛细管电压：3.40KV

离子源温度：100℃

去溶剂温度：350℃

通过对质谱条件的优化，本发明最终选择[M+H]+365.90>113.70作为定量离子，[M+H]+365.90>207.70作为定性离子，AMO-d4的定量离子为[M+H]+369.90>114.00，同时对锥孔电压，碰撞能量，毛细管电压，离子源温度以及去溶剂气温等进行了优化。

二、方法学验证

线性范围：按照上述阿莫西林的前处理方法，得到空白奶样氮吹后样品，加水定容至1mL。吸取不同量的阿莫西林标准工作液(称取10mg阿莫西林标准品，至10mL棕色容量瓶中，用50％乙腈水溶液溶解并定容至10mL，配制成1000mg/L标准储备液。用Milli-Q水稀释成所需浓度的阿莫西林标准溶液。放置在-20℃冰箱保存，有效期为一个月。)加到这些空白样品中，配制成浓度为2、4、8、50、100、250、500μg/L的基质添加标准溶液，进行质谱分析。AMO-d4的添加浓度为100μg/L(称取1.0mg AMO-d4内标标准品，至10mL棕色容量瓶中，用Milli-Q水溶解并定容至10mL，配制成100mg/L标准储备液。用Milli-Q水稀释成所需浓度的阿莫西林标准溶液。放置在-20℃冰箱保存，有效期为一个月)。得到牛奶中阿莫西林在2-500μg/L范围内线性关系良好，线性方程为y＝0.0872x+0.0426(R²＝0.9998)。

检出限和定量限：取20份空白牛奶样品，按照上述方法进行样品的前处理和测定，测得基线噪音值。以S/N(信噪比)≥3时的浓度为方法的检测限(LOD)，以S/N(信噪比)≥10时的浓度为方法的定量限(LOQ)。牛奶中阿莫西林的检测限为0.5μg/L，定量限为2μg/L。

准确度和精密度：准确度用空白样品添加药物的回收率表示，精密度用同一批次的回收率的变异系数表示。具体步骤如下：取空白牛奶2mL，基质添加标准品配制成低、中、高4个浓度(2、4、8、50μg/L)的质量控制样品，内标添加浓度为100μg/L。按照上述阿莫西林的前处理方法和测定方法，每天进行6个水平样品测定获得批内精密度，连续测定3天，获得批间精密度。实验结果见表2。

表2、牛奶中添加阿莫西林的回收率和精密度：

称取空白牛奶样品2mL，加入100μg/L的阿莫西林标准溶液40μL加于空白牛奶样本中，取5μg/mL的阿莫西林-d4内标40μL加于空白牛奶样本中。随后按照上述前处理方法提取、净化、浓缩并进行液相色谱串联质谱分析，得到图1所示特征离子质量色谱图。图1中三个特征离子质量色谱图分别为阿莫西林定性离子，定量离子和阿莫西林-d4定量离子所对应的色谱图，阿莫西林的添加浓度为2μg/L，阿莫西林-d4的添加浓度为100μg/L。

称取空白牛奶样品2mL，随后按照上述前处理方法提取、净化、浓缩并进行液相色谱串联质谱分析可得到图2所示特征离子质量色谱图(理论上不含有阿莫西林以及阿莫西林-d4)。图2中三个特征离子质量色谱图分别为阿莫西林定性离子，定量离子和阿莫西林-d4定量离子所对应的色谱图。

实施例2、牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质的制备及检测

一、制备

按照如下步骤制备牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质：

选择健康中产奶牛2头(体重700kg，日产奶量40kg)，对其进行肌肉注射给药，注射剂量为71mg/kg/天，药物具有水溶性，溶剂选择生理盐水。给药前将实验奶牛单独饲养，给药前三天每天按正常时间，上、中、下午各采一次牛奶，前四把牛奶弃掉，前三天的牛奶混装。空白牛奶需要进行阿莫西林含量检测和奶牛乳房炎检测，确定无阿莫西林残留和奶牛乳房炎症状后，第四天开始给药，连续给药三天，注射部位为肩胛前部的肌肉和臀部肌肉。由于阿莫西林在奶牛体内代谢极快，所以必须在给药后较短的时间就开始采集牛奶，第三天给药后15分钟就立刻采集牛奶，上午和下午采集的牛奶均需分装，采集好的牛奶在-80℃冷冻保存。

阿莫西林治疗奶牛乳房炎时，给药方式为乳房灌注，药物主要是在乳区中进行分布代谢，仅有少量一部分透过血乳屏障进入血液，而且代谢速度也较快。致使最终在牛奶中检测到的药物含量并未通过全身代谢，因此为了更合理获得含有阿莫西林的牛奶，本研究采用肌肉注射给药，且给药前对牛奶进行药物含量检测和乳房炎检测，确认合格后再给药。

采用真空冷冻干燥技术对已预冻的空白牛奶和含高浓度阿莫西林的牛奶进行真空冷冻干燥。采用真空冷冻干燥机，真空度为10-20Pa；冷肼温度为-80℃；真空冷冻干燥所需时长约72h；在真空冷冻干燥期间需要1-2天进行一次除冰，10天换一次真空泵的泵油。采用锡箔纸盒盛放样品，因为其热传导性最佳。牛奶冷冻干燥过程中，牛奶的预冷温度和厚度均会影响其冻干效率。预冷温度由牛奶的共晶点温度决定，预冷温度必须超过共晶点温度5-10℃。若不预冻直接抽真空，当压力降到一定程度时液体就会被抽走，若样品未冻实而抽真空，液体中的气体迅速逸出而引起“沸腾”现象，引起药物损失或者制品表面凹凸不平。实验中测得牛奶共晶点为-19℃，故预冷温度设定为-30℃。样品厚度的优化是在相同条件下，选取10、15、20mm三个水平的厚度，对其进行冷冻干燥，结果表明厚度为15mm时冻干效果最佳。

针对空白牛奶冻干粉和含有高浓度阿莫西林的牛奶冻干粉的粉碎，采用刀式混合研磨仪以2000r/min的转速粉碎15s，粉碎后的样品过0.9mm孔径的筛。采用实施例1中的方法检测上述牛奶冻干粉中阿莫西林的含量，用空白牛奶冻干粉将上述牛奶冻干粉稀释至阿莫西林的浓度为4μg/kg，收集两种牛奶冻干粉至干净的不锈钢容器中进行混匀(高效翻转搅拌混合机郑州哲科机械设备有限公司)，时间约2h，得到牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质候选物。将牛奶冻干粉分装于5mL棕色螺口瓶中，每瓶装填的量为1g，共500瓶，置于-20℃冰箱中避光冷冻保存。

二、检测

(1)均匀性检测

按照JJG 1006-1994《一级标准物质技术规范》对均匀性检验的要求，总体样本数500份情况下，查阅随机数表随机抽取15瓶，对所取每个样品重复测定3次。按照单因素方差分析法对牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质进行均匀性评价，单因素方差分析方法是用来统计检验均匀性的最常用方法，是通过组间方差和组内方差的比较来判断各组测量值之间有无系统性差异，若两者的比值小于统计检验的临界值，则认为样品是均匀的。

实验结果见表3。

表3、牛奶中阿莫西林基体标准物质的均匀性检验结果

(2)稳定性检测

长期稳定性：长期稳定性的检验考察了样品在20℃、4℃、-20℃三个贮存温度条件下样品在四个月内牛奶冻干粉中阿莫西林的稳定性情况，三个贮存温度下各取5个样品进行长期稳定性评估。

实验结果见表4。

表4、牛奶冻干粉中阿莫西林标准物质长期稳定性检测结果

考察各个温度下监测的牛奶冻干粉中阿莫西林标准物质的稳定性，一般选用线性模型对其进行评价。在此模型中的特性量值而言，期望直线的截距(在不确定度范围内)等于该标准物质的定值结果，同时直线的斜率接近为零。实验结果见表5。

表5、牛奶冻干粉中阿莫西林标准物质在各贮存温度下的稳定性评价结果

	4℃	-20℃	20℃
				斜率b<sub>1</sub>	-0.004683	0.00042	0.006177
截距b<sub>0</sub>	4.0902	4.1092	3.9970
				S(b<sub>1</sub>)	0.01822	0.013709	0.02102
t<sub>0.95,3</sub>*S(b<sub>1</sub>)	0.05794	0.04359	0.06684
				结论	稳定	稳定	稳定

短期稳定性：本研究短期稳定性是结合运输环境和极端贮存条件对其进行评价，综合了运输环境和短期贮存温度两个因素。将样品通过快递邮寄的方式寄到广州、上海、乌鲁木齐、哈尔滨等四个城市，并按指定温度储存。广州邮寄时间共5天，室温(18℃)放置3天，37℃环境放置3天。上海邮寄时间共4天，室温(9℃)放置3天，4℃放置3天。乌鲁木齐邮寄时间共6天，室温(5℃)放置3天，-20℃放置3天。哈尔滨邮寄时间共8天，室温(10℃)放置3天，-80℃放置3天。

实验结果如下见表6和表7。

表6、牛奶冻干粉中阿莫西林标准物质短期稳定性检测结果(监测前)：

表7、牛奶冻干粉中阿莫西林标准物质短期稳定性检测结果(监测后)：

四种环境下监测后的值与总平均值的极差小于t_(α,n-1)与测量方法的标准偏差的乘积，则认为在监测时间范围内没有发生显著变化。t_(α,n-1)是显著水平α，自由度n-1时的t检验临界值。根据检测结果可知，在95％置信水平，短期稳定性结果良好，与监测前的实验结果之间无明显差异，表明在四种极端的运输和贮存条件下冻干粉中的阿莫西林还是能保持稳定。

三、定值

JJF 1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》规定，标准物质特性量的标准值一般代表当前对其“真值”的最佳估计。样品通过均匀性检验后，进行准确测量并对数据进行系统分析处理即为标准物质的定值。本发明采用同位素稀释质谱法和多家实验室联合定值，采用实施例1中的分析方法对样品进行定值，5家实验室分别是：1.国家兽药残留基准实验室(中国农业大学)(仪器型号：Quattro Micro API)；2.北京市兽药监督所(仪器型号：TQ-S)；3.中国农业科学院饲料研究所(仪器型号：TQ-S)；4.北京市疾病预防控制中心(仪器型号：TQ-S)；5.农业部农产品加工质量安全风险评估实验室(北京)(仪器型号：安捷伦1290UHPLC-6495QQQ)。5家实验室所用的色谱柱均为CORTECS^TM

C₁₈Column(2.1mm×50mm，1.6μm)。每个实验室检测结果如下：

表8、牛奶冻干粉中阿莫西林标准物质的定值数据

对上述所有数据采用如下程序处理：

(1)利用科克伦准则判断这5组数据中哪一组为可疑数据。

判定准则见表9。

表9、判定准则

C与临界值C<sub>0</sub>的关系	C≤C<sub>0(95％)</sub>	C<sub>0(95％)</sub>≤C≤C<sub>0(90％)</sub>	C&gt;C<sub>0(90％)</sub>
				判定结果	正确值	可疑值	离群值

给定显著水平α＝0.05，测定组数m＝5，每组测定次数n＝8，自由度f＝4，查表得科克伦最大方差检验临界值C(α,m,f)＝0.5441。C_计算＝0.3225，小于临界值C₀。故5家实验室的测定等精度，应予以保留，克服了各实验室之间的系统误差。

(2)利用狄克逊法对每组数据进行检验是否存在离群值，若存在，可进行剔除。

狄克逊法判定准则如下：定值样品数n＝8，显著水平α＝0.05，查表的临界值D(0.05,8)＝0.608。由于属于n＝8-10的情况，所以统计量计算如下：

若r₁>r_n，r₁>D(0.05,8)，则r₁为异常值

狄克逊法剔除异常数据后的结果见表10。

表10、狄克逊法剔除异常数据后的结果

(3)数据经处理后余下的正常数据求其平均值，得到牛奶冻干粉中阿莫西林标准物质总的定值结果为4.06μg/kg。

四、不确定度的评估

JJF 1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》规定，对于标准物质定值结果，其不确定度由三部分组成，包括标准物质不均匀性引起的不确定度、标准物质的有效期内的变动引起的不确定度、定制过程引起的不确定度。将三者的不确定度按照平方和开方的方法叠加得出总不确定度，记为U_CRM。总不确定度乘以因子(包含因子，记为k)得出扩展不确定度，记为U。(k的数值与要求的置信概率与自由度有关。)

(1)标准物质不均匀性引起的不确定度

(2)标准物质在有效期内的变动性引起的不确定度

在时长4个月的长期稳定性引起的不确定度：

u_s＝s(b₁)·X＝0.013709×4＝0.054836

s(b₁)为长期稳定性部分与斜率相关的不确定度。

(3)标准物质在定值过程中引起的不确定度

标准物质定值过程带来的不确定度包括按统计方法计算出的不确定度和以非统计分析的方法评定的不确定度。

①按照统计方法计算出的不确定度(u_char,1)

牛奶冻干粉中阿莫西林标准物质按照统计方法计算出的不确定度即是由5家实验室测量数据统计引入的不确定度。

②按照非统计分析方法评定得到的不确定度(u_char,2)

牛奶冻干粉中阿莫西林标准物质以非统计分析方法评定的不确定度即为测量过程引入的不确定度。

牛奶冻干粉中阿莫西林标准物质定值过程中引入的不确定度为：

(4)牛奶冻干粉中阿莫西林标准物质的总不确定度

扩展不确定度：U＝0.187×2＝0.374μg/kg(K＝2)

结论：通过对本发明牛奶冻干粉中基体标准物质进行均匀性检验、稳定性检验、定值和不确定度的评估，结果表明其可广泛应用于牛奶中阿莫西林残留检测的方法学验证与质量控制。

Claims (10)

1.牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质的制备方法，包括如下步骤：

S1、对奶牛给药阿莫西林，采集含有阿莫西林的牛奶；

S2、将空白牛奶和所述含有阿莫西林的牛奶分别进行真空冷冻干燥，得到空白牛奶冻干粉和含有阿莫西林的牛奶冻干粉；

S3、将所述空白牛奶冻干粉和所述含有阿莫西林的牛奶冻干粉粉碎后混匀，得到牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：

所述给药阿莫西林的方式为肌肉注射；

所述给药阿莫西林的剂量为60～80mg/kg/天，连续给药2～4天；

所述采集含有阿莫西林的牛奶的时间在给药后的10～30分钟。

3.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：

所述真空冷冻干燥的真空度为3～50Pa，时间为60～96h；

所述真空冷冻干燥的预冷温度为-24～-40℃；

所述真空冷冻干燥的样品的厚度为10～20mm。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的制备方法，其特征在于：

所述粉碎的转速为1500～4000r/min，时间为10～30s；

所述粉碎后过筛，粒径为0.8～1.0mm；

所述混匀为仪器混匀，混匀时间为1.5～4h。

5.根据权利要求1-4中任一项所述的制备方法，其特征在于：

所述牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质中阿莫西林的浓度为4μg/kg。

6.权利要求1-5中任一项所述的制备方法制备得到的牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质。

7.一种奶粉或牛奶冻干粉中阿莫西林的分析方法，包括如下步骤：

(1)将待检测的奶粉或牛奶冻干粉和水混匀使所述奶粉或牛奶冻干粉还原为牛奶；将所述还原的牛奶脱脂后添加阿莫西林内标，混匀；在所述混匀后的混合液中加入提取试剂进行提取，得到提取液；

(2)将所述提取液通过固相萃取柱进行净化，收集洗脱液；

(3)将所述洗脱液浓缩并定容后进行液相色谱-质谱/质谱分析。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

步骤(1)中，所述提取试剂为无水乙醇；

步骤(2)中，所述固相萃取柱为HLB固相萃取柱；通过所述HLB固相萃取柱后用90％乙腈的水溶液进行洗脱。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：

所述阿莫西林以[M+H]+365.90>113.70为定量离子，[M+H]+365.90>207.70为定性离子；

所述阿莫西林内标为阿莫西林-d4；所述阿莫西林-d4以[M+H]+369.90>114.00为定量离子；

所述液相色谱-质谱/质谱分析中的色谱条件如下：

固定相：十八烷基键合硅胶色谱柱；

流动相：A：0.1％甲酸水溶液，B：0.1％甲酸乙腈溶液；

梯度洗脱程序：0.00～0.50min A的体积分数为99.0％；0.50～1.50min A的体积分数由99.0％降至60.0％；1.5～2.00min A的体积分数为60.0％；2.00～2.01min A的体积分数由60.0％降至2.0％；2.01～2.50min A的体积分数为2.0％；2.50～4.50min A的体积分数由2.0％升至99.0％；

流速：0.3mL/min；

进样体积：10μL；

柱温：35℃；

所述液相色谱-质谱/质谱分析中质谱的条件如下：

离子源：电喷雾离子源；

扫描方式：正离子扫描；

检测方式：多反应监测；

毛细管电压：3.40KV；

离子源温度：100℃；

去溶剂温度：350℃。

10.权利要求7-9中任一项所述的方法在对牛奶冻干粉阿莫西林基体标准物质进行均匀性检测、稳定性检测和定值中的应用。

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