CN115716877A - 一种表达glp-1和胰岛素缀合物多肽的重组工程菌 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种表达GLP‑1和胰岛素缀合物多肽的重组工程菌。本发明设计包含GLP‑1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽,并将其编码核苷酸片段插入表达载体中,构建重组工程菌,将融合多肽以包涵体形式表达,从而实现GLP‑1和胰岛素缀合物多肽的稳定高表达,具有较高的产业应用价值和前景。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域,特别涉及一种表达GLP-1和胰岛素缀合物多肽的重组工程菌。
背景技术
糖尿病是一种因胰岛素绝对或相对分泌不足和/或胰岛素利用障碍引起的碳水化合物、蛋白质、脂肪等代谢紊乱性疾病,以高血糖为主要标志,可由遗传和环境等多种因素引起。糖尿病是人类三大致死疾病之一,它的死亡率仅次于心脑血管疾病和癌症。
胰岛素是机体内唯一降低血糖的激素,同时促进糖原、脂肪、蛋白质合成,外源性胰岛素及胰岛素衍生物主要用来治疗糖尿病。胰岛素由A、B两个肽链组成,人胰岛素(Insulin Human)A链有11种21个氨基酸,B链有15种30个氨基酸,共51个氨基酸;其中A7(Cys)-B7(Cys)、A20(Cys)-B19(Cys)四个半胱氨酸中的巯基形成两个二硫键,使A、B两链连接起来,此外A链中A6(Cys)与A11(Cys)之间也存在一个二硫键。胰岛素由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌。胰岛素在细胞水平的生物作用是通过与靶细胞膜上的特异受体结合而启动的;胰岛素受体为胰岛素起作用的靶细胞膜上特定部位,仅可与胰岛素或含有胰岛素分子的胰岛素原结合,具有高度的特异性。
胰岛素虽然是治疗糖尿病最有效的手段,但长期使用胰岛素也会存在一些副作用,比如引起肥胖。胰岛素除了能够调节体内糖代谢,还具备调节脂肪代谢的作用:胰岛素能够促进脂肪的合成与贮存,使血液中游离脂肪酸减少,同时抑制脂肪的分解氧化。这也是为什么会引发体重增加,尤其是腹部脂肪增加的原因。此外,胰岛素使用还存在一定的低血糖风险。
胰高血糖素样肽1(GLP-1)是一种由肠道L细胞分泌的促胰素,具有促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素的释放、刺激胰岛β细胞增殖、诱导胰岛β细胞再生、阻止胰岛β细胞凋亡、改善胰岛素敏感性和增加葡萄糖的利用等作用。因此,GLP-1及其类似物和衍生物在治疗I和II型糖尿病的发生、发展中起着重要作用。GLP-1类似物和胰高血糖素的氨基酸序列有近一半相同,同样具有葡萄糖依赖性的促胰岛素分泌和生物合成、抑制胰高血糖素分泌及抑制胃排空等多种功能,同时,GLP-1作为一种肠源性激素,其是在营养物质(特别是碳水化合物)的刺激下才释放入血的,其促胰岛素分泌作用呈葡萄糖浓度依赖性,能够在血糖升高时发挥降糖作用,抑制胰高糖素分泌,增加饱腹感,减少饥饿感,从而达到降低血糖作用。此外,GLP-1还可作用于中枢神经系统(特别是下丘脑)抑制食欲,减少进食量,从而使人体产生饱胀感和食欲下降,减少卡路里的摄入量。因此,GLP-1及其类似物优点在于其不仅能够有效降低血糖,且能够降低体重、调节血压血脂、使心血管获益、无低血糖风险。
胰岛素能够与胰岛素受体结合,GLP-1能够激活GLP-1受体,因此,若将胰岛素和GLP-1进行缀合修饰,则缀合物可以同时对胰岛素受体和GLP-1受体具有激动活性,兼备两者作用,有效调节血糖的情况下,降低低血糖风险,调节体重增加,并对心血管获益有所帮助。并且,GLP-1和胰岛素联用,能够使缀合物靶向至下丘脑,以降低食欲以及减少血液中葡萄糖浓度。另外,GLP-1和胰岛素缀合物可以靶向至β细胞以驱动增加胰岛β细胞生产胰岛素。
目前,对GLP-1和胰岛素缀合物的研究较少,关于其重组表达载体及其重组工程菌的研究则更少。而在确定GLP-1和胰岛素缀合物结构后,制备具有高表达能力的重组工程菌及研发其高表达发酵方法,能够提高单位体积的GLP-1和胰岛素缀合物多肽表达量,显著降低原料生产成本,极大降低药物价格,产品上市后对企业、对患者均有重大意义。本发明目的正是提供一种具有高表达GLP-1和胰岛素缀合物多肽的重组工程菌,并探索其高密度发酵方法。
发明内容
定义
本发明的术语“胰岛素”包括天然存在的胰岛素,例如人胰岛素,以及其胰岛素类似物。人胰岛素由两个多肽链组成,分别被称为人胰岛素A链和人胰岛素B链。
本发明中术语“GLP-1类似物”是指对人天然GLP-1氨基酸进行修饰获得的多肽,所述修饰包括去除和/或取代(置换)和/或添加(延长)一个或多个氨基酸残基,所述氨基酸可以是天然存在的氨基酸,也可以是人工合成的氨基酸。
本发明中,有关肽(例如GLP-1或胰岛素)的术语“衍生物”表示经化学修饰(如共价修饰等)的肽或其类似物。典型的修饰是酰胺、糖类、烷基、酰基、酯等。
本发明中,术语“载体”是指可以将编码蛋白质或多肽的核苷酸片段可操作地插入其中以引起所述蛋白质或多肽表达的媒介物。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞,以使其在宿主细胞内表达携带的遗传元件。载体的实例包括质粒、人工染色体、噬菌体、病毒颗粒等。载体可以含有多种用于控制表达的元件,包含启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件和报告基因。载体还可以包括有助于其进入细胞的材料,包括但不限于病毒颗粒、脂质体或蛋白质包膜。
载体可以是重组表达载体或克隆载体。本发明提供了载体(例如表达载体),其含有编码所述胰岛素和GLP-1缀合物的本发明提供的核酸序列。载体的实例包括但不限于逆转录病毒(包括慢病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头状瘤病毒、乳多空病毒(例如SV40)、λ噬菌体和M13噬菌体、质粒,如pcDNA3.3、pMD18-T、pOptivec、pCMV、pEGFP、pIRES、pQD-Hyg-GSeu、pALTER、pBAD、pcDNA、pCal、pL、pET、pGEMEX、pGEX、pCI、pEGFT、pSV2、pFUSE、pVITRO、pVIVO、pMAL、pMONO、pSELECT、pUNO、pDUO、Psg5L、pBABE、pWPXL、pBI、p15TV-L、pPro18、pTD、pRS10、pLexA、pACT2.2、pCMV-SCRIPT.RTM.、pCDM8、pCDNA1.1/amp、pcDNA3.1、pRc/RSV、PCR2.1、pEF-1、pFB、pSG5、pXT1、pCDEF3、pSVSPORT、pEF-Bos等。
本发明中术语“重组表达载体”是编码基因的核酸分子,其在宿主细胞中表达且含有控制所述基因的表达的必需元件。通常,表达载体包含转录启动子、目的基因和转录终止子。
本发明中“宿主细胞”是指可将包含编码目的蛋白质或多肽的核苷酸序列片段的载体引入到其中进行克隆或基因表达的细胞。适用于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞是原核生物、酵母或更高级真核生物细胞。
为了解决上述技术问题,本发明提供了一种包含GLP-1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽,编码融合多肽的多核苷酸片段,表达所述融合多肽的重组表达载体及重组基因工程菌。
第一方面,本发明提供一种包含GLP-1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽,所述融合多肽具有促包涵体序列-酶切序列-GLP-1和胰岛素缀合物多肽序列的氨基酸结构,其中促包涵体序列分别为FKFEFKFE(SEQ ID NO:1)、HQHQHQHQHQ(SEQ ID NO:2)或HQHQHQHQHQHQ(SEQ ID NO:3),所述酶切序列为DDDDK(SEQ ID NO:4),所述GLP-1和胰岛素缀合物多肽序列为:HIEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIAWLVKRGGGQAPGQAPGQAPFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTPKVGLSSGQAPGIVEQCCTSICSLEQLENYCN(SEQ ID NO:5)。
作为本发明一种优选技术方案,所述融合多肽的氨基酸结构为:
FKFEFKFEDDDDKHIEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIAWLVKRGGGQAPGQAPGQAPFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTPKVGLSSGQAPGIVEQCCTSICSLEQLENYCN(SEQ ID NO:6);或
HQHQHQHQHQDDDDKHIEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIAWLVKRGGGQAPGQAPGQAPFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTPKVGLSSGQAPGIVEQCCTSICSLEQLENYCN(SEQ ID NO:7);或
HQHQHQHQHQHQDDDDKHIEGTFTSDVSSYLEEQAAREFIAWLVKRGGGQAPGQAPGQAPFVNQHLCGSHLVEALYLVCGERGFHYTPKVGLSSGQAPGIVEQCCTSICSLEQLENYCN(SEQ ID NO:8)。
第二方面,本发明提供了一种编码所述包含GLP-1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽的多核苷酸片段,为了比较不同促包涵体序列对所述包含GLP-1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽的表达影响,申请人首先设计了三组编码所述融合多肽的多核苷酸片段,分别如SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示,并通过化学合成的方式获得。其中,SEQID NO:9为上述SEQ ID NO:6所示融合多肽的编码核苷酸片段,SEQ ID NO:10为上述SEQ IDNO:7所示融合多肽的编码核苷酸片段,SEQ ID NO:11为上述SEQ ID NO:8所示融合多肽的编码核苷酸片段。
本发明进一步提供了一系列优化的编码包含GLP-1和胰岛素缀合物的融合多肽的多核苷酸片段,所述编码融合多肽的多核苷酸片段的序列如SEQ ID NO:12-16所示。
根据包含GLP-1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽的氨基酸序列,将氨基酸序列输入到核苷酸转化软件,将其中个别氨基酸的密码子替换为大肠杆菌偏爱的密码子,对密码子进行合理优化,能够增加核苷酸的稳定性,获得相应的经过优化的包含GLP-1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽编码序列,提高包含GLP-1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽在大肠杆菌中的表达水平。
作为本发明一种优选技术方案,根据大肠杆菌偏好密码子对包含GLP-1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽的编码核苷酸片段进行优化,获得经过优化的编码包含GLP-1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽核苷酸片段,所述核苷酸片段优选为SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13、SEQ ID NO:14、SEQ ID NO:15或SEQ ID NO:16所示核苷酸片段。
第三方面,本发明提供了一种重组表达载体,所述重组表达载体包含第二方面所述的多核苷酸片段,通过将核苷酸片段插入表达载体相应酶切位点得到。
优选地,本发明的重组表达载体可以是常规的可用于重组表达构建的载体,如pET-28a(+)、pET-30a(+)或pET-32a(+)。优选地,本申请实施例使用的为pET-30a(+),并通过将所述编码核苷酸片段插入pET-30a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间,构建得到重组表达载体。
第四方面,本发明提供了一种表达包含GLP-1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽的重组工程菌,所述重组工程菌转化有第三方面所述的重组表达载体。
作为本发明一种优选技术方案,所述重组表达载体为重组pET-30a(+)表达载体,所述重组工程菌为重组BL21大肠杆菌工程菌。
作为本发明一种优选技术方案,所述工程菌按照如下方法构建:
(1)合成第二方面所述的多核苷酸片段;
(2)将步骤(1)合成的多核苷酸片段连接至表达载体pET-30a(+)中,构建得到重组表达载体;
(3)将步骤(2)构建的重组表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,得到所述重组工程菌。
作为本发明一种优选技术方案,所述工程菌构建方法的步骤(2)为:将步骤(1)中多核苷酸片段插入表达载体pET-30a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间,构建得到重组表达载体。
作为本发明一种优选技术方案,所述工程菌构建方法的步骤(3)为:将步骤(2)得到的重组表达载体通过热击法转化导入到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中,筛选得到重组工程菌。
其中:
以FKFEFKFE作为促包涵体序列的融合多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:6,编码融合多肽的多核苷酸片段为SEQ ID NO:9,得到的重组工程菌简称为HS-1。
以HQHQHQHQHQ作为促包涵体序列的融合多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:7,编码融合多肽的多核苷酸片段为SEQ ID NO:10,得到的重组工程菌简称为HS-2。
以HQHQHQHQHQHQ作为促包涵体序列的融合多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO:8,编码融合多肽的多核苷酸片段为SEQ ID NO:11,得到的重组工程菌简称为HS-3。
由密码子优化后的核苷酸片段SEQ ID NO:12构建得到的重组工程菌命名为HS-4,SEQ ID NO:13构建得到的重组工程菌命名为HS-5,SEQ ID NO:14构建得到的重组工程菌命名为HS-6,SEQ ID NO:15构建得到的重组工程菌命名为HS-7,SEQ ID NO:16构建得到的重组工程菌命名为HS-8。
第五方面,本发明提供一种第四方面所述重组工程菌的构建方法,所述构建方法包括如下步骤:
(1)合成第二方面所述的多核苷酸片段;
(2)将步骤(1)合成的多核苷酸片段连接至表达载体pET-30a(+)中,构建得到重组表达载体;
(3)将步骤(2)构建的重组表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,得到所述重组工程菌。
作为本发明一种优选技术方案,所述工程菌构建方法的步骤(2)为:将步骤(1)中多核苷酸片段插入表达载体pET-30a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间,构建得到重组表达载体。
作为本发明一种优选技术方案,所述工程菌构建方法的步骤(3)为:将步骤(2)得到的重组表达载体通过热击法转化导入到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中,筛选得到重组工程菌。
本发明实施例提供的技术方案与现有技术相比具有如下优点:
本发明利用大肠杆菌原核表达系统,设计包含GLP-1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽,并将其编码核苷酸片段插入表达载体中,将融合多肽以包涵体形式表达,并对编码包含GLP-1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽的核苷酸片段进行密码子优化,从而实现GLP-1和胰岛素缀合物多肽的稳定高表达,具有较高的产业应用价值和前景。
附图说明
此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分,示出了符合本发明的实施例,并与说明书一起用于解释本发明的原理。
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,对于本领域普通技术人员而言,在不付出创造性劳动性的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例2所述重组工程菌菌株诱导电泳图:
其中,泳道从左到右依次为:HS-3重组工程菌未诱导对照、HS-3重组工程菌诱导电泳图、HS-2重组工程菌未诱导对照、HS-2重组工程菌诱导电泳图、HS-1重组工程菌未诱导对照、HS-1重组工程菌诱导电泳图;
图2为本发明实施例3所述密码子优化后重组工程菌菌株诱导电泳图:
泳道1为HS-2重组工程菌未诱导对照;泳道2为HS-2重组工程菌诱导电泳图,泳道3-7分别对应密码子优化的工程菌菌株HS-4至HS-8重组工程菌诱导电泳图。
具体实施方式
为了能够更清楚地理解本发明的上述目的、特征和优点,下面将对本发明的方案进行进一步描述。需要说明的是,在不冲突的情况下,本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。
在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明,但本发明还可以采用其他不同于在此描述的方式来实施;显然,说明书中的实施例只是本发明的一部分实施例,而不是全部的实施例。
实施例1:表达GLP-1和胰岛素缀合物的重组大肠杆菌工程菌的构建
本实施例构建了一种能高效表达包含本发明缀合物多肽的融合多肽的重组工程菌,制备方法如下(以SEQ ID NO:11所示编码核苷酸片段为例):
(1)构建编码包含GLP-1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽的表达质粒
HQHQHQHQHQHQ作为促包涵体序列,DDDDK作为酶切序列,并将促包涵体序列、酶切序列以及GLP-1和胰岛素缀合物多肽的编码核苷酸序列依次串联融合,得到如SEQ ID NO:11所示编码核苷酸片段;通过NdeI和XhoI位点,将上述片段插入原核表达质粒pET-30a(+)中并测序验证,得到表达质粒。
(2)构建表达包含GLP-1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽的重组工程菌
将50μL的BL21感受态细胞(TransGenBiotech)置于冰浴上融化,加入5μL步骤(1)构建的表达质粒并轻轻摇匀,冰浴中放置30min,42℃水浴热激30-90s,然后快速将离心管转移到冰浴中放置2min,该过程不要摇动离心管。
向离心管中加入500μL不含抗生素的无菌LB培养基,混匀后置于37℃,150-80rpm培养1h,以使细菌复苏;然后吸取200μL已转化的感受态细胞加到含有卡那霉素抗性的LB琼脂培养基平板上,将细胞均匀涂开,将平板置于37℃至液体被吸收,倒置平板,37℃培养过夜,使用接种环挑取转化平板上的较为饱满的单克隆菌落,并接种于10-15mL的含卡那霉素抗生素的无菌LB培养基,150-80rpm,37℃过夜培养。将500μL过夜培养菌液加入到1.5mL无菌离心管中,再加入500μL的50%无菌甘油混匀,得到甘油冻存菌,-80℃保存。
以SEQ ID NO:9-10所示编码核苷酸片段构建的重组工程菌均按照本实施例1相同的方法构建得到。
实施例2:重组工程菌的诱导表达
取10μL的重组大肠杆菌甘油冻存菌接入无菌的5mL添加了卡纳霉素(50μg/mL)的LB培养基中,装在50mL离心管中于37℃,200rpm摇床培养至OD600为0.6~0.8,加入IPTG至终浓度为0.5mM,30℃条件下200rpm过夜振摇,诱导蛋白表达。次日取培养好的菌液离心沉淀,去掉上清液,加入SDS page buffer,终OD为1,100℃加热15-20min,空白control为未诱导全菌液,吸取10μL处理过的蛋白样品200V,25分钟跑胶,洗脱后,蛋白表达结果在电泳胶上呈现结果见图1。
由图1可知,HS-3重组工程菌的表达量最高,即本发明以促包涵体氨基酸序列为HQHQHQHQHQHQ的SEQ ID NO:11核苷酸片段构建得到的重组工程菌能够高表达包含GLP-1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽。但结果也表明,使用SEQ ID NO:9和SEQ ID NO:10所述编码核苷酸片段构建的重组工程菌HS-1和HS-2,虽然其最终表达量低于HS-3,但同样能够有效表达目的融合多肽。
实施例3:密码子优化
为进一步构建具备更高、更稳定表达量的重组工程菌,申请人针对构建的重组工程菌宿主的密码子偏好,对编码包含GLP-1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽的核苷酸片段进行密码子优化,最终筛选得到5条优化编码核苷酸片段,分别如SEQ ID NO:12-16所示。按照实施例1的方法,使用所述编码核苷酸片段构建重组工程菌,并进行摇瓶表达,蛋白表达结果通过SDS-PAGE检测,电泳结果见图2。
由图2可知,HS-5重组工程菌表达最优,即SEQ ID NO:13核苷酸片段构建得到的重组工程菌对包含GLP-1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽具有更高的表达量。但同时也可以看到,其他经优化的编码核苷酸片段构建的重组工程菌,同样具备良好的目的融合多肽的表达。
需要说明的是,在本文中,诸如“第一”和“第二”等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来,而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且,术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含,从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素,而且还包括没有明确列出的其他要素,或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。在没有更多限制的情况下,由语句“包括一个……”限定的要素,并不排除在包括所述要素的过程、方法、物品或者设备中还存在另外的相同要素。
以上所述仅是本发明的具体实施方式,使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的,本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下,在其它实施例中实现。因此,本发明将不会被限制于本文所述的这些实施例,而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种包含GLP-1和胰岛素缀合物多肽的融合多肽,其特征在于,所述融合多肽由促包涵体序列、酶切序列和GLP-1和胰岛素缀合物多肽序列依次串联组成,其序列如SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7或SEQ ID NO:8所示。
2.一种编码权利要求1所述融合多肽的多核苷酸片段。
3.根据权利要求2所述的多核苷酸片段,其特征在于,所述多核苷酸片段的序列选自SEQ ID NO:9-16中的任意一项。
4.一种重组表达载体,其特征在于,所述重组表达载体包含权利要求2或3所述的多核苷酸片段。
5.一种表达GLP-1和胰岛素缀合物多肽的重组工程菌,其特征在于,所述重组工程菌包含权利要求4所述的重组表达载体。
6.根据权利要求5所述的重组工程菌,其特征在于,所述重组表达载体为重组pET-30a(+)表达载体,所述重组工程菌为重组BL21大肠杆菌工程菌。
7.根据权利要求6所述的重组工程菌,其特征在于,所述重组工程菌按照如下方法构建:
(1)合成权利要求2或3所述的多核苷酸片段;
(2)将步骤(1)合成的多核苷酸片段连接至表达载体pET-30a(+)中,构建得到重组表达载体;
(3)将步骤(2)构建的重组表达载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)中,得到所述重组工程菌。
8.根据权利要求7所述的重组工程菌,其特征在于,所述方法的步骤(2)为:将步骤(1)中所述多核苷酸片段插入表达载体pET-30a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间,构建得到所述重组表达载体;
和/或,所述方法的步骤(3)为:将所述重组表达载体通过热击法转化导入到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中,筛选得到所述重组工程菌。
9.一种权利要求5-8中的任一项所述重组工程菌的构建方法,其特征在于,所述构建方法包括如下步骤:
(1)合成权利要求2或3所述的多核苷酸片段;
(2)将步骤(1)合成的所述多核苷酸片段连接至表达载体pET-30a(+)中,构建得到重组表达载体;
(3)将步骤(2)构建的重组表达载体转入大肠杆菌BL21(DE3)中,得到所述重组工程菌。
10.根据权利要求9所述的构建方法,其特征在于,所述方法的步骤(2)为:将步骤(1)中所述多核苷酸片段插入表达载体pET-30a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间,构建得到所述重组表达载体;
和/或,所述方法的步骤(3)为:将所述重组表达载体通过热击法转化导入到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中,筛选得到所述重组工程菌。
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