CN115710584A

CN115710584A - 超氧化物歧化酶在制备lcda中的应用及过表达其的基因工程菌

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Publication number: CN115710584A
Application number: CN202110948679.7A
Authority: CN
Inventors: 张明明; 刘修才
Original assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Current assignee: Cathay R&D Center Co Ltd; CIBT America Inc
Priority date: 2021-08-18
Filing date: 2021-08-18
Publication date: 2023-02-24
Also published as: WO2023020634A1

Abstract

本发明公开了超氧化物歧化酶在制备LCDA中的应用及过表达其的基因工程菌。所述基因工程菌包括核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的超氧化物歧化酶基因，所述基因工程菌的出发菌为棒状杆菌(Corynebacterium)、白地霉(Geotrichum candidum)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotroula)、酵母属(Saccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)。所述过氧化氢酶在用于制备LCDA中，可提高底物的转化率及产物的产量，并缩短二元酸发酵时间。

Description

超氧化物歧化酶在制备LCDA中的应用及过表达其的基因工程菌

技术领域

本发明属于微生物工程领域，具体涉及超氧化物歧化酶在制备LCDA中的应用及过表达其的基因工程菌。

背景技术

二元酸是α和ω位各有一个羧基的脂肪族二羧酸，分子式为HOOC(CH₂)_nCOOH。根据碳链长度的不同，二元酸可分为长链二元酸、中链二元酸和短链二元酸。一般认为n≥7的二元酸属于长链二元酸(LCDA)。长链二元酸作为一种重要的单体原料，已被广泛用于精细化工和医药等领域，如合成高性能工程塑料、高等香料、航空润滑油、高等油漆和粉末涂料、高温电解质、耐寒性增塑剂和树脂等。以长链二元酸原料合成的材料不仅具有较好的性能、较低的成本及实用价值，并且能够节省能源、降低对环境的污染。

长链二元酸的获取方式主要有植物油裂解法、化学合成法和微生物发酵法三种。植物油裂解生产二元酸容易受到自然因素的影响，而且难以达到较高的纯度水平；化学合成法在合成过程中常常会出现断链的情况，导致无法生产高纯单一产品，且合成流程冗长繁琐，生产成本高，环境污染严重。微生物发酵法主要是利用微生物特有的氧化能力和胞内酶作用的特点，在常温常压下将长链正烷烃两端的两个甲基氧化获得相应碳链长度的二元酸产品，其具有环境友好、操作简便易控以及产品质量高等特点，具有广阔发展前景和工业价值。

维斯假丝酵母是微生物发酵法生产长链二元酸的主要菌株之一。烷烃经过被动扩散或转运蛋白通道进入细胞后，在微粒体内被细胞色素P450与NADPH-细胞色素P450还原酶共同催化发生α-氧化，生成脂肪醇。随后，脂肪醇进入细胞质中，依次在脂肪醇氧化酶和脂肪醛脱氢酶的催化作用下逐步氧化成脂肪醛、脂肪酸。微量的一元脂肪酸被分泌到细胞外，大部分的一元酸会再次进入微粒体，在相同的酶系催化下发生ω-氧化，生成α,ω-二羧酸。烷烃代谢产生的部分二元酸和一元酸会被运送进入过氧化物酶体发生β-氧化反应。在过氧化物酶体内，酰基化的脂肪酸被逐步催化，分解为乙酰-CoA或者丙酰-CoA，最后进入TCA循环。

现阶段主要从发酵工程优化和优良菌种选育角度研究如何提高转化率。如有文献提出在发酵液中加入一定量的H₂O₂可以提高发酵过程中的氧气供应而不产生较大的毒害作用，进而提高十三碳二元酸的生产(中国生物工程学会第三次全国会员代表大会暨学术讨论会论文摘要集，2001:1)；敲除POX4和POX5基因可以有效阻断β-氧化途径，从而显著提高底物的转化率(Mol Cell Biol,1991,11(9),4333-4339)；向二元酸生产菌株中引入一个拷贝的CYP52A14基因有效提高二元酸的转化率(中国发明专利CN103992959B)。

超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，它具有清除氧化胁迫因素(氧自由基)的功能，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用。SOD早在1930年被发现，1969年被正式命名为超氧化物歧化酶。

目前虽然有通过随机诱变或采用基因工程的手段提高二元酸转化率的案例，但是从抗氧化酶-超氧化歧化酶角度入手改良二元酸生产菌株，提高二元酸转化率的研究还未见报道。

发明内容

针对现有技术种缺乏改善氧化胁迫的长链二元酸(LCDA)生产菌株、LCDA的制备效率交底等技术问题，本发明提供了一种超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase，SOD)在制备LCDA中的应用及过表达其的基因工程菌。所述超氧化物歧化酶应用于微生物发酵生产LCDA时，可改善微生物面临的氧化胁迫问题。过表达所述超氧化物歧化酶的基因工程菌可以进一步提高原出发菌的产量二元酸产量及底物的转化率，缩短发酵时间。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之一为：超氧化物歧化酶或超氧化物歧化酶基因在微生物发酵生产长链二元酸中的应用。

较佳地，所述超氧化物歧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，或与SEQ IDNO:9具有至少约95％的同一性的序列，例如至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.1％、至少约99.2％、至少约99.3％、99.4％、至少约99.5％、至少约99.6％、99.7％、至少约99.8％、至少约99.9％、至少约99.91％、至少约99.92％、至少约99.93％、至少约99.94％、至少约99.95％、或至少约99.96％的同一性；

和/或，所述微生物为棒状杆菌(Corynebacterium)、白地霉(Geotrichumcandidum)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotroula)、酵母属(Saccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)，优选为维斯假丝酵母(Candida viswanathii)或热带假丝酵母(Candida tropicalis)，更优选为菌种保藏号CCTCC NO:M 2020048的维斯假丝酵母或菌种保藏号CCTCC NO:M 2021824的维斯假丝酵母。

较佳地，所述长链二元酸选自C₉-C₂₂的长链二元酸，优选自C₉-C₁₈的长链二元酸中的一种或多种，更优选自癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸和十六碳二元酸中的一种或多种；本领域技术人员可以容易地根据目标长链二元酸选用对应的长链烷烃；

和/或，所述长链二元酸为直链长链二元酸。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之二为：一种包含超氧化物歧化酶基因的表达元件，所述表达元件为将超氧化物歧化酶基因构建到质粒上得到的重组表达载体，或为包括超氧化物歧化酶基因的重组表达片段；所述超氧化物歧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，或与SEQ ID NO:9具有至少约95％的同一性的序列，例如至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.1％、至少约99.2％、至少约99.3％、99.4％、至少约99.5％、至少约99.6％、99.7％、至少约99.8％、至少约99.9％、至少约99.91％、至少约99.92％、至少约99.93％、至少约99.94％、至少约99.95％、或至少约99.96％的同一性。

在本发明一优选实施例中，所述质粒为pCIB2；和/或，所述重组表达片段通过如SEQ ID NO:3与SEQ ID NO:4所示的引物序列扩增所述超氧化物歧化酶基因获得。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之三为：一种基因工程菌，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的超氧化物歧化酶基因，所述基因工程菌的出发菌为棒状杆菌(Corynebacterium)、白地霉(Geotrichum candidum)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotroula)、酵母属(Saccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)，优选为维斯假丝酵母(Candida viswanathii)或热带假丝酵母(Candida tropicalis)，更优选为菌种保藏号CCTCC NO:M 2020048的维斯假丝酵母或菌种保藏号CCTCC NO:M2021824的维斯假丝酵母。

较佳地，所述基因工程菌包括如本发明技术方案之二所述的表达元件中的重组表达片段。优选地，所述重组表达片段导入所述出发菌后，通过同源重组方式整合在所述出发菌的基因组上。在本发明一具体实施例中，所述整合的位点为int1基因或其同源基因。除了int1外，也可选择其他整合位点，本领域技术人员可以在不影响微生物生理的情况下容易地选择所述整合位点。

较佳地，所述过氧化物酶基因利用非整合方式导入所述基因工程菌；

优选地，所述非整合方式为：将包含超氧化物歧化酶基因的重组表达载体转化所述出发菌；更优选地，所述重组表达载体的出发质粒为pCIB2。

本发明技术方案之三提供的基因工程菌，可以比未重组超氧化物歧化酶基因的微生物提高长链二元酸的产量和底物转化率。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之四为：一种制备如本发明技术方案之三所述的基因工程菌的方法，所述方法包括以下步骤：将核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的超氧化物歧化酶基因导入棒状杆菌(Corynebacterium)、白地霉(Geotrichumcandidum)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotroula)、酵母属(Saccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)，优选为维斯假丝酵母(Candida viswanathii)或热带假丝酵母(Candida tropicalis)，更优选为菌种保藏号CCTCC NO:M2020048的维斯假丝酵母或菌种保藏号CCTCC NO:M 2021824的维斯假丝酵母。本发明方提供的制备基因工程菌的方法可以解决微生物中氧化胁迫引起的脂质、蛋白质及DNA等生物的大分子损伤，进而导致细胞正常生理代谢功能受损的问题。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之五为：一种长链二元酸的制备方法，所述制备方法为在培养基中发酵如本发明技术方案之三所述的基因工程菌，得到所述长链二元酸。

发酵生产过程中，所述发酵培养基包括：碳源、氮源、无机盐和营养盐。

在一些实施方案中，所述碳源包括选自葡萄糖、蔗糖和麦芽糖中的一种或多种；和/或所述碳源的添加量为1％-10％(w/v)，例如1.5％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％、5.0％、6.0％、7.0％、8.0％、9.0％。

在一些实施方案中，所述氮源包括选自蛋白胨、酵母膏、玉米浆、硫酸铵、尿素和硝酸钾中的一种或多种；和/或所述氮源的总添加量为0.1％-3％(w/v)，例如0.2％、0.4％、0.5％、0.6％、0.8％、1.0％、1.2％、1.5％、1.8％、2.0％、2.5％。

在一些实施方案中，所述无机盐包括选自磷酸二氢钾、氯化钾、硫酸镁、氯化钙、氯化铁、硫酸铜中的一种或多种；和/或所述无机盐的总添加量为0.1％-1.5％(w/v)，例如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.1％、1.2％、1.3％、1.4％。

在一些实施方案中，所述营养因子包括选自维生素B1、维生素B2，维生素C、生物素中的一种或多种；和/或所述营养因子的总添加量为0-1％(w/v)，例如0.2％、0.3％、0.4％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％。

和/或，所述长链二元酸为直链长链二元酸。

较佳地，所述培养基包括：蔗糖7-40g/L、总氮含量1-3wt％的玉米浆0.5-5g/L、酵母膏2-12g/L、NaCl 0-3g/L、KNO₃ 2-12g/L、KH₂PO₄ 2-12g/L、尿素0.1-3g/L、发酵底物180-400mL/L和丙烯酸4-10g/L，所述发酵底物包括C₉-C₂₂的长链烷烃中的一种或多种，所述培养基的pH为7-8；所述培养基优选包括：蔗糖10g/L、总氮含量2.5wt％的玉米浆1g/L、酵母膏4g/L、KNO₃ 4g/L、KH₂PO₄ 4g/L、尿素0.5g/L、发酵底物180mL/L和丙烯酸4g/L，所述发酵底物包括正十二烷、正十烷和正十六烷中的一种或多种，所述培养基的pH为7.5-7.6；

和/或，所述发酵的条件为：所述基因工程菌的接种量为10-30％，例如11％、12％、13％、14％、15％、16％、17％、18％、19％、20％、22％、24％、25％、27％或29％，温度为20-40℃，时间为60-180h，所述发酵中还进行搅拌，所述搅拌的转速为200-300rpm；所述发酵的条件优选为：所述基因工程菌的接种量为20％，温度为30℃，时间为90-144h，所述发酵中还进行搅拌，所述搅拌的转速为250rpm。

本发明中所述百分比为质量体积比，即：w/v；％表示g/100mL

任选地，所述发酵前还包括对所述基因工程菌进行种子液培养，所述种子液培养为本领域常规，优选为将所述基因工程菌培养至菌体密光密度稀释30倍后，OD₆₂₀≥0.5，更优选为OD₆₂₀≥0.8。

在一些实施方案中，所述的方法还包括从培养产物中分离长链二元酸的步骤，所述分离长链二元酸的步骤为本领域常规。

本发明技术方案制备的长链二元酸可用于生产尼龙长丝、工程塑料、合成香料、耐寒增塑剂、高级润滑油和聚酰胺热熔胶等产品。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案之六为：一种重组DNA，其特征在于，所述重组DNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的超氧化物歧化酶基因。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

本发明涉及超氧化物歧化酶在制备长链二元酸中的应用及过表达其的基因工程菌。所述的超氧化物歧化酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。本发明通过多种方式，将所述过氧化氢酶序列导入长链二元酸发酵菌株，使其过表达所述过氧化氢酶，并提高了底物的转化率和长链二元酸的产量，能有效缩短二元酸发酵时间，大大提高了长链二元酸的生物发酵水平。

生物材料保藏信息

本发明的维斯假丝酵母CAes2121，已于2021年7月7日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，邮编：430072，保藏编号为：CCTCC No:M 2021824，培养物名称是Candida viswanathii CAes2121，分类命名是维斯假丝酵母(Candida viswanathii)。

本发明的维斯假丝酵母CAES2113，已于2020年2月24日保藏在中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学，邮编：430072，保藏编号为：CCTCC No:M 2020048，培养物名称是Candida viswanathii CAES2113，分类命名是维斯假丝酵母(Candida viswanathii)。

具体实施方式

定义：

长链烷烃：本发明的发酵底物包括长链烷烃，长链烷烃属于饱和链烃，是碳氢化合物下的一种饱和烃，其整体构造大多仅由碳、氢、碳碳单键与碳氢单键所构成，其包括化学式CH₃(CH₂)_nCH3的烷烃，其中n≥7。

长链二元酸(LCDA；也称为长链二羧酸或长链二酸、以下或简称为二元酸)包括化学式HOOC(CH₂)_nCOOH的二元酸，其中n≥7。

产长链二元酸的微生物：已报道的可产生和积累二元酸的菌株包括细菌、酵母以及霉菌等，如：棒状杆菌(Corynebacterium)、白地霉(Geotrichum candidum)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotroula)、酵母属(Saccharomyces)、耶氏酵母属(Yarrowia)等。其中假丝酵母属的许多种类是发酵生产二元酸的优良菌种。

基因sod可编码超氧化物歧化酶，是生物体内存在的一种抗氧化金属酶，能够催化超氧阴离子自由基歧化，在机体氧化与抗氧化平衡中起到至关重要的作用。

同源基因是指序列相似性达80％的两条或多条基因序列，其包括直向同源基因(又称为垂直同源基因、正同源基因或定向进化同源基因)、横向同源基因(又称为旁系同源基因、并系同源基因或平行进化同源基因)和/或异源同源基因。本发明中所指的超氧化物歧化酶编码基因的同源基因既可以是超氧化物歧化酶编码基因的直向同源基因，也可以是其横向同源基因或异源同源基因。

序列同一性是指在序列比对和引入缺口后，多核苷酸序列变体的残基与非变体序列的相同的百分比。在具体实施方式中，多核苷酸变体与本文所述的多核苷酸具有至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％、至少约99.1％、至少约99.2％、至少约99.3％、99.4％、至少约99.5％、至少约99.6％、99.7％、至少约99.8％、至少约99.9％、至少约99.91％、至少约99.92％、至少约99.93％、至少约99.94％、至少约99.95％、或至少约99.96％的多核苷酸或多肽同源性。

抗性标记是指选择性标记的一种，可赋予转化子在抗生素存在条件下生存的能力。所述抗性标记基因包括SAT、HYG及CAT等，分别可以抗诺尔丝菌素、潮霉素以及氯霉素等。

同源重组是指依赖于序列相似性的DNA分子之间的重组，最常见于细胞内用于修复有丝分裂期间产生的突变。同源重组技术已广泛应用于基因组编辑，包括基因敲除、基因修复以及向特定位点引入新的基因等。以酿酒酵母为代表的一类微生物，其细胞内发生同源重组的几率非常高，不依赖于序列特异性，在基因组编辑方面具有明显的优势。

游离载体是指能够在细胞内独立于宿主细胞本身的复制周期而实现扩增的载体。游离载体在蛋白表达、基因调控与编辑等方面存在广泛应用。

实施例

下面将通过下述非限制性实施例进一步说明本发明，本领域技术人员公知，在不背离本发明精神的情况下，可以对本发明做出许多修改，这样的修改也落入本发明的范围。

下述实验方法如无特别说明，均为常规方法，所使用的实验材料如无特别说明，均可容易地从商业公司获取。

实施例1培养基、培养发酵方法及二元酸检测方法

1、LB培养基(w/v)：1％氯化钠，1％胰蛋白胨和0.5％酵母提取物(OXOID,LP0021)。固体培养基中还需加入1.5％琼脂粉。

2、YPD培养基(w/v)：2％蛋白胨，2％葡萄糖和1％酵母提取物(OXOID,LP0021)。固体培养基中还需加入2％琼脂粉。

培养时，挑取单菌落于含有1mL YPD液体培养基的2mL离心管中，30℃下，250rpm摇床培养1天。

3、种子培养基(w/v)：1％蔗糖，0.3％酵母膏，0.2％工业发酵用玉米浆(总氮含量2.5wt％)，0.4％KH₂PO₄，0.05％尿素，发酵底物为正癸烷20mL/L。

培养时，将步骤1培养后的菌液接入含有30mL种子培养基的500mL摇瓶，接种量为3％，在250rpm、30℃摇床培养至OD₆₂₀达到0.8时(稀释30倍后)。

4、发酵培养基(w/v)：蔗糖10g/L，玉米浆(总氮含量2.5wt％)1g/L，酵母膏4g/L，KNO₃ 4g/L，KH₂PO₄ 4g/L，尿素0.5g/L，丙烯酸4g/L，发酵底物正癸烷180mL/L，调节pH值至7.5-7.6。

发酵时，将步骤2培养的种子液接种到装有15mL发酵培养基的500mL摇瓶中，接种量为20％，在30℃、250rpm摇床培养90-144h。培养过程中通过隔段时间补加酸/碱的方式调节pH值至7.5-7.6范围。

5、检测方法：

(1)发酵液产物及杂质含量检测：气相色谱法。

(2)固体产品纯度及杂质含量检测：气相色谱检测。

实施例2超氧化物歧化酶基因重组片段制备

本实施例中所有DNA片段均使用Takara公司

HS高保真DNA聚合酶(Takara,R040A)扩增得到。1％琼脂糖凝胶电泳后用Axygen凝胶回收试剂盒(Axygen,AP-GX-250G)回收纯化DNA片段。本研究参考文献(Fungal Genet Biol 2005,42(9):737-748)通过Cre-loxp方式进行重组片段构建。

维斯假丝酵母CAES2113(菌种保藏号：CCTCC NO:M 2020048)基因组DNA提取采用Ezup酵母基因组DNA快速提取试剂盒(生工，货号518257)，并辅以液氮研磨的方法提高破壁效率。每50μL反应体系加入1μg基因组作为模板进行PCR扩增。所用的引物及PCR反应条件如下：

1、同源重组过表达片段的扩增，引物序列如下(下划线部分为同源臂)：

Pro-F：5’-CGGTTCACTTCTCTCTCACAACCCCCTCTCTTTATATTTATTTATAGTTTACGGCATAAGGATCCAAGAAGAGGAG-3’(SEQ ID NO.1)

Pro-R：5’-ATTGAATAATTAGTATGGGGGTGTGGTGTG-3’(SEQ ID NO.2)

sod-F：5’-CACACCCCCATACTAATTATTCAATATGGTCAAAGCTGGTATGTATCCCAG-3’(SEQID NO.3)

sod-R：5’-CTCCAATATCAAATCAGAATATTCTCTAGTTACTCAAACCAATGACACCACAG-3’(SEQID NO.4)

Ter-F：5’-AGAATATTCTGATTTGATATTGGAGTGC-3’(SEQ ID NO.5)

Ter-R：5’-CTTCGTATAGCATACATTATACGAAGTTATCTGTGTGTGCGTGTGTTATGTTATAG-3’(SEQ ID NO.6)

PCR反应条件为：

步骤1:98℃2min，

步骤2:98℃10s,58℃10s,72℃2min,30个循环，

步骤3:72℃5min。

Pro-F/R，Ter-F/R和sod-F/R分别扩增出大小约为1.0Kb，0.5Kb和0.7Kb的片段，凝胶电泳后进行回收纯化片段，经测序证实无误，分别命名为Pro，Ter和sod，其序列如SEQ IDNO.7，SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示。

2、参考抗性筛选标记(HYG，即潮霉素抗性基因)以质粒PCIB2(专利号EP3550014B1)为模板扩增，，引物序列如下(下划线部分为同源臂)：

lox-F：5’-ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAG-3’(SEQ ID NO.10)

lox-R：5’-GCGTACATTAACAATTAACATCGAAAACAGAGAAGTAACTACACACTGATAACTTCGTATAGCATACATTATACGAAG-3’(SEQ ID NO.11)

PCR反应条件为：

步骤1:98℃2min，

步骤2:98℃10s,55℃10s,72℃2min 30s,30个循环，

步骤4:72℃5min。

lox-F/R扩增出片段大小均约为1.8kb，凝胶电泳后进行回收纯化片段，经测序证实无误，命名为lox-hyg，序列如SEQ ID NO.12所示。

3、PCR重叠延伸得到完整的重组模板

将回收后的Pro，Ter，sod和lox-hyg片段等摩尔混合作为模板，用Pro-F/lox-R进行PCR扩增，反应条件为：

步骤1:98℃2min，

步骤2:98℃10s,55℃10s,72℃2min 30s,5个循环，

步骤3:98℃10s,72℃3min,30个循环，

步骤4:72℃5min。

凝胶电泳回收大小约为3.0Kb的重组片段。

SEQ ID NOs:7-9和12序列如下：

SEQ ID NO.7(启动子Ppxp9)

CGGTTCACTTCTCTCTCACAACCCCCTCTCTTTATATTTATTTATAGTTTACGGCATAAGGATCCAAGAAGAGGAGAAGCTAGAGTGGGAGAGATGAGTATTAGGGTGTGTAGTGTGTGTGTGTCATGTCTAAAGATAGCACAGTGCCACGATTATTAAGATTGCTGTATTGTTGTTGGGTGGGTGGGTTGGTTGGTTGGTTGGTTGATTAAGGTTGTAGAGCGGAGTAGCTGAGAGGATGTGTAATTGTAAGCAATAGTACAAATTTCAGTCTGGGCCATTAAAGGCAAAAAAAAAAAAAAGAAAAATGGGGTGATCTCCTATTTGGTTGATTATTAAGATGTAGATGAAGGGTGTTGGTTGATCTGTGAGTAGATCCTCTGTCCACGGGATTTGGGGGCCGATGGACCAACTGGTGGTGGTGAGTTTTGTGTGTGTATGTGTGTGTGTGCACGTGAGGGAGTGGGAAGATTCAACCGAGGAACAAAACAACCAGCAGGGCGTTTCCCCAGAATTTTGTGTGGGCAGTGGGGAGCAATTAGCCAATGGATGGCAAGTAAAAAGTAATCCCACCAGAGAGAGGAGAAGATTAACAATGGATGTTGATTAAACTTTGTCTGTTTCCCTCCTGGAGTGTAAAACACGCGGGTCTAGTATTAGAGTAGCCAGCCAGTCCAACCCATTATTAATCAAGAGTAGAAGAGTGGGTGGTTCAATGGTTGATGGTTATTAGTTGGTGGTTAAGTTGTGCGCACCCACAGGTCTGGAACACTGCCAGTGATTGATAATACCACATGAAAAATTATGTGTGCGCAACTCTCAACTCTCAACTCTTACTGCTTAACTTATCATGGAAAAAAAAACCTGTTAGCCCCCCGCTTATTTCTCCCCCAAGTCCTGTGCACTATAAATACCCCCGTGCTTTTCCCTCTGGCTGGAATTTCCCACTTTCCACCAAATAATATCCAATTGATTACTAAAACAATCAACATCACACCACACCCCCATACTAATTATTCAAT

SEQ ID NO.8(终止子Tpxp9)

AGAATATTCTGATTTGATATTGGAGTGCTAAAGGTGTTAGCTAGGTTCTTTTCTTTTTTTTCCCCTCTATTAATATTTATAGTTGTTGTAATGTTTTTTTACAGTAAATTGAATGCGGTTTTATTTGATAATTGACAATGGAAGTGTAGAAGCAATGGTGGAGGTTGTGGTTGTGGTTGTGGTGGTGGTTATTAAACGCTACCCGTTGTTCGGGATGAAATTCTCATCCATTGGCGCGCAAAGCAAAAATAACAGAAGATGGCCCAGAACTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTTAGCTCAAAAAAAAATAAAAAAAAAAAAATTTTTCTCACTTACTCACATTACTGAAAATATTGAAAACCATCATCATCACCAACCACAACAACTACAACAACTACAGCCATCATAACACCACCTTATCTATAACATAACACACGCACACACAG

SEQ ID NO.9(sod)

ATGGTCAAAGCTGGTATGTATCCCAGATCCCAATGGCTGCAAAAGAAAAGCCTATATTACAATTGGCGAGAGGATCTCTGGTTGAGTAAATTTTCCAGTTCCCATTGAAGTAACTTCAAATTTGCTCAACGTGGATTTTTTCAACCAACACCGTAGGTTTCTTTTTTTTTGCAAGTTGCATCCACTATAGGCCCTACCAATTGGTTCTGTTACTAACAATTGAGTCTAGTCGCTGTCGTTAGAGGTGATTCTAAAGTCTCCGGTGTCGTTTACTTCGAACAAGCCTCCCCATCAGAGCCAACCACTGTCTCCTGGGAAATTTCTGGAAATGACCCAAATGCCTTGAGAGGTTTCCACATCCACGAATTCGGTGACAACACCAACGGTTGTACCTCTGCTGGTCCACACTTCAACCCACAAGGTAAGGAGCACGGTGGCCCAACTGATGAAGTCCGCCACGTTGGTGATTTGGGCAACATTGCCACTGACGCCAATGGTCTCGCCAAGGGTCAACTCAAAGACTCTTGGGTCAAGGTCAACGACATCCTTGGTAGAACCATTGTTGTCCATGCTGGTCAAGACGATTTGGGTAAGGGTGGTTTCGACGACTCCAAGACCACCGGCCACGCTGGTGGCAGAAACGCCTGTGGTGTCATTGGTTTGAGTAACTAG

SEQ ID NO.12(lox-hyg)

ATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTATTCCCCGGGGCCTCCAAATACCAACTCACCCGAGAGAGATAAAGAGACACCACCCACCACGAGACGGAGTATATCCACCAAGGTAAGTAACTCAGAGTTAATGATACAGGTGTACACAGCTCCTTCCCTAGCCATTGAGTGGGTATCACATGACACTGGTAGGTTACAACCACGTTTAGTAGTTATTTTGTGCAATTCCATGGGGATCAGGAAGTTTGGTTTGGTGGGTGCGTCTACTGATTCCCCTTTGTCTCTGAAAATCTTTTCCCTAGTGGAACACTTTGGCTGAATGATATAAATTCACCTTGATTCCCACCCTCCCTTCTTTCTCTCTCTCTCTGTTACACCCAATTGAATTTTCTTTTTTTTTTTACTTTCCCTCCTTCTTTATCATCAAAGATAAGTAAGTTTATCAATTGCCTATTCAGAATGAAAAAGCCTGAACTCACCGCGACGTCTGTCGAGAAGTTTCTCATCGAAAAGTTCGACAGCGTCTCCGACCTCATGCAGCTCTCGGAGGGCGAAGAATCTCGTGCTTTCAGCTTCGATGTAGGAGGGCGTGGATATGTCCTCCGGGTAAATAGCTGCGCCGATGGTTTCTACAAAGATCGTTATGTTTATCGGCACTTTGCATCGGCCGCGCTCCCGATTCCGGAAGTGCTTGACATTGGGGAATTCAGCGAGAGCCTCACCTATTGCATCTCCCGCCGTGCACAGGGTGTCACGTTGCAAGACCTCCCTGAAACCGAACTCCCCGCTGTTCTCCAGCCGGTCGCGGAGGCCATGGATGCGATCGCTGCGGCCGATCTTAGCCAGACGAGCGGGTTCGGCCCATTCGGACCGCAAGGAATCGGTCAATACACTACATGGCGTGATTTCATATGCGCGATTGCTGATCCCCATGTGTATCACTGGCAAACTGTGATGGACGACACCGTCAGTGCGTCCGTCGCGCAGGCTCTCGATGAGCTCATGCTTTGGGCCGAGGACTGCCCCGAAGTCCGGCACCTCGTGCACGCGGATTTCGGCTCCAACAATGTCCTCACGGACAATGGCCGCATAACAGCGGTCATTGACTGGAGCGAGGCGATGTTCGGGGATTCCCAATACGAGGTCGCCAACATCTTCTTCTGGAGGCCGTGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGACGCGCTACTTCGAGCGGAGGCATCCGGAGCTTGCAGGATCGCCGCGGCTCCGGGCGTATATGCTCCGCATTGGTCTTGACCAACTCTATCAGAGCTTGGTTGACGGCAATTTCGATGATGCAGCTTGGGCGCAGGGTCGATGCGACGCAATCGTCCGATCCGGAGCCGGGACTGTCGGGCGTACACAAATCGCCCGCAGAAGCGCGGCCGTCTGGACCGATGGCTGTGTAGAAGTACTCGCCGATAGTGGAAACCGACGCCCCAGCACTCGTCCGAGGGCAAAGGAATAGTGTGCTACCCACGCTTACTCCACCAGAGCTATTAACATCAGAAATATTTATTCTAATAAATAGGATGCAAAAAAAACCCCCCTTAATAAAAAAAAAAGAAACGATTTTCTATCTAATGAAGTCTATGTATCTAACAAATGTATGTATCAATGTTTATTCCGTTAAACAAAAATCAGTCTGTAAAAAAGGTTCTAAATAAATATTCTGTCTAGTGTACACATTATAACTTCGTATAATGTATGCTATACGAAGTTAT

实施例3重组菌株的转化

1、酵母电转化感受态细胞的制备

将30℃，250rpm摇床过夜培养的酵母细胞CAES2113接种到实施例1的100mL YPD培养基中，至OD₆₂₀为0.1。相同条件下培养至OD₆₂₀至1.3时，3000g、4℃离心收集细胞。用冰冷的无菌水洗涤细胞两次并收集后将细胞重悬于10mL冰上预冷的1M的山梨醇溶液，4℃、1500g离心收集细胞后重悬于1mL上述山梨醇溶液，分装100μL细胞悬液用于遗传转化。

2、酵母感受态电击转化

上述感受态细胞中分别加入1μg回收纯化的重组片段，冰上放置5min后迅速转移至0.2cm电击杯，电击转化(BioRad，MicropulserTM Electroporator，转化程序SC2，1.5kV，25uFD，200ohms)。迅速加入1mL YPD和1M山梨醇(1:1，v/v)的混合液，30℃，200rpm培养2小时后，收集菌液后涂布含有100mg/L潮霉素B的YPD培养基平板，30℃静置培养2至3天，至长出单菌落。

实施例4重组菌株的筛选

挑取实施例4中获取的单菌落接种于含有1mL 1YPD培养基(含100mg/L潮霉素B)的2mL离心管中，250rpm、30℃培养过夜。次日进行菌落PCR鉴定，所用引物序列和PCR反应条件如下：

sod-cF:5’-GCTGGTCAAGACGATTTGGGTAAG-3’(SEQ ID NO.13)

intD-R:5’-TATTCCCCCGTTACAGCTCCTTG-3’(SEQ ID NO.14)

步骤1:95℃5min，

步骤2:95℃30s,55℃30s,72℃1min,35个循环，

步骤3:72℃5min。

PCR产物进行测序分析后，正确的菌株命名为lox2113sod。

实施例5重组菌株lox2113sod发酵生产十碳长链二元酸

分别接种菌株CAES2113和lox2113sod至含有3mL实施例1所述YPD培养基的15mL离心管中，30℃下，250rpm摇床培养1天。取上述菌液接入含有30mL实施例1种子培养基的500mL摇瓶中，接种量为3％，摇床250rpm，30℃条件下培养至OD₆₂₀达到0.8(所述OD值为菌体光密度，且为稀释30倍时测定的值)。将种子液接种到装有15mL实施例1发酵培养基的摇瓶中，接种量为20％，发酵培养基中底物为十碳烷烃。继续摇床培养250rpm、30℃培养至发酵结束。并以菌株CAES2113作为对照组，培养和发酵方法与上述相同。

分别取0.5g上述发酵液样品，采用实施例1中所述的方法进行GC检测，计算十碳二元酸含量。结果显示菌株lox2113sod于119h结束发酵，比对照菌株CAES2113的发酵时间提前了18h。另外两株菌二元酸的产量也有明显区别，其中菌株lox2113sod的二元酸产量为115.85g/L，而对照菌株的二元酸产量仅为102.35。由此表明过表达超氧化物歧化酶有助于长链二元酸生产。

实施例6以CAes2121为宿主评价超氧化物歧化酶过表达后对发酵的影响

本专利还选择另外一株宿主评价超氧化物歧化酶过表达对发酵的影响。该宿主是以维斯假丝酵母CAES2113为出发菌株，通过5-氟尿嘧啶和ARTP复合诱变、筛选培育获得。参考实施例3重组菌株的转化和实施例4重组菌株的筛选步骤构建超氧化物歧化酶过表达菌株，验证正确的菌株命名为CAes2121sod。参考实施例5重组菌株发酵生产十碳长链二元酸步骤评价重组菌株发酵性能。结果如表1所示：

表1

菌株	CAes2121	CAes2121sod
			发酵时间(h)	137	118
二元酸产量(g/L)	104.54	116.87

由表1可知以CAes2121为宿主时，超氧化物歧化酶过表达也有助于长链二元酸生产。

实施例7评价通过游离载体过表达超氧化物歧化酶对发酵的影响

1、过表达元件扩增

参考实施例2中第3部分重叠延伸扩增方法，以等摩尔混合后的Pro，Ter和sod为模板，用引物Kpn-pro-F/BamHI-ter-R扩增制备sod过表达DNA片段。引物序列如下(下划线为酶切位点)：

Kpn-pro-F：5’-GCTCGGTACCGGCATAAGGATCCAAGAAGAGGAG-3’(SEQ ID NO.15)

BamHI-ter-R：5’-TATAGGATCCCTGTGTGTGCGTGTGTTATGTTATAG-3’(SEQ ID NO.16)

2、游离载体过表达元件制备

选用内切酶KpnI和BamHI(Thermo，USA)双酶切本公司所有的载体pCIB2(专利号：EP3550014B1)和过表达DNA片段，然后通过T4酶连接方法将过表达元件整合在载体中，最后转入大肠杆菌中制备过表达超氧化物歧化酶的载体psod。

酶切体系为：

KpnI和BamHI：各1.0μl

10*buffer：5.0μl

载体或DNA片段：1μg

ddH2O：补足至50μl

37℃条件下酶切1h后，凝胶电泳回收片段，以备后续连接反应。

采用T4连接酶(Thermo，USA)进行连接反应，反应体系和条件为：

T4连接酶：0.5μl

10*T4 buffer：1.0μl

DNA片段：50ng

载体：50ng

ddH₂O：补足至10μl

步骤1：22℃ 30m

步骤2：65℃ 10m,

3、大肠杆菌感受态制备及转化

挑取平板中大肠杆菌单菌落接种于含有100mL LB培养基的250mL摇瓶中，200rpm，37℃条件下培养3-4h，至菌液OD600达0.2～0.4；于冰上放置30min，使细胞停止生长，然后4000rpm，4℃条件下离心10min，收集菌体；用10mL预冷的0.1M CaCl₂溶液重悬细胞，冰浴10min后，于4000rpm，4℃条件下离心10min，除净上清液；添加8mL预冷的0.1MCaCl₂和30％甘油的混合液重悬细胞，分装至1.5mL离心管中，-80℃保存。

4、载体转化及验证

取100μl制备好的感受态细胞，冰上融化；加入10μl的连接产物，轻轻混匀后，冰浴30min；然后与42℃水浴锅中水浴90s，迅速置于冰浴中2min；添加500μl的LB培养基，200rpm，37℃条件下培养40-45min；6000rpm离心1min，去除300μl的上清液后，混匀细胞；取100μl涂布于含有相应抗生素的LB固体平板，37℃条件下培养12-16h。随后提取载体并进行PCR验证和测序验证，最终验证正确的载体命名为psod。

5、评价载体过表达突变体对发酵的影响

分别参考实施例3重组菌株的转化，实施例4重组菌株的筛选步骤以菌CAES2113为宿主构建超氧化物歧化酶载体过表达菌株，验证正确的菌株命名为2113psod。参考实施例5重组菌株发酵生产十碳长链二元酸步骤评价重组菌株发酵性能。结果如表2所示：

表2

菌株	CAES2113	2113p sod
			发酵时间(h)	137	121
二元酸产量(g/L)	102.35	116.43

由表2可知通过游离载体过表达超氧化物歧化酶也也有助于长链二元酸生产。

对比例1评价POX4敲除对CAES2113菌发酵的影响

参考文献Mol Cell Biol,1991,11(9),4333-9中方法与材料部分描述，本研究在维斯假丝酵母CAES2113分别构建了POX4敲除菌株2113pox4。同时以2113pox4菌株为宿主将实施例2中制备的超氧化物歧化酶基因重组片段，参考实施例3重组菌株的转化和实施例4重组菌株的筛选步骤进行了过表达构建，正确的菌株命名为2113pox4-sod。然后参考实施例5评价了其发酵性能，发酵时间为137h，具体结果见表3。

表3

菌株	CAES2113	2113pox4	2113pox4-sod
				二元酸产量(g/L)	102.35	89.01	99.45

由表2可知通过游离载体过表达超氧化物歧化酶也有助于长链二元酸生产。

本专利发现，POX4敲除后导致二元酸产量降低，推测是由于POX4敲除导致细胞能量供应不足，进而影响了二元酸合成。在POX4敲除菌株基础上过表达超氧化物歧化酶后二元酸产量虽然没能恢复到对照菌株的水平，但是其比2113pox4菌株的产量高，再次表明过表达超氧化物歧化酶也也有助于长链二元酸生产。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海凯赛生物技术股份有限公司

CIBT美国公司

<120> 超氧化物歧化酶在制备LCDA中的应用及过表达其的基因工程菌

<130> P21015582C

<160> 16

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 76

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物Pro-F

<400> 1

cggttcactt ctctctcaca accccctctc tttatattta tttatagttt acggcataag 60

gatccaagaa gaggag 76

<210> 2

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物Pro-R

<400> 2

attgaataat tagtatgggg gtgtggtgtg 30

<210> 3

<211> 51

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物sod-F

<400> 3

cacaccccca tactaattat tcaatatggt caaagctggt atgtatccca g 51

<210> 4

<211> 53

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物sod-R

<400> 4

ctccaatatc aaatcagaat attctctagt tactcaaacc aatgacacca cag 53

<210> 5

<211> 28

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物Ter-F

<400> 5

agaatattct gatttgatat tggagtgc 28

<210> 6

<211> 56

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物Ter-R

<400> 6

cttcgtatag catacattat acgaagttat ctgtgtgtgc gtgtgttatg ttatag 56

<210> 7

<211> 1022

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 启动子Ppxp9

<400> 7

cggttcactt ctctctcaca accccctctc tttatattta tttatagttt acggcataag 60

gatccaagaa gaggagaagc tagagtggga gagatgagta ttagggtgtg tagtgtgtgt 120

gtgtcatgtc taaagatagc acagtgccac gattattaag attgctgtat tgttgttggg 180

tgggtgggtt ggttggttgg ttggttgatt aaggttgtag agcggagtag ctgagaggat 240

gtgtaattgt aagcaatagt acaaatttca gtctgggcca ttaaaggcaa aaaaaaaaaa 300

aagaaaaatg gggtgatctc ctatttggtt gattattaag atgtagatga agggtgttgg 360

ttgatctgtg agtagatcct ctgtccacgg gatttggggg ccgatggacc aactggtggt 420

ggtgagtttt gtgtgtgtat gtgtgtgtgt gcacgtgagg gagtgggaag attcaaccga 480

ggaacaaaac aaccagcagg gcgtttcccc agaattttgt gtgggcagtg gggagcaatt 540

agccaatgga tggcaagtaa aaagtaatcc caccagagag aggagaagat taacaatgga 600

tgttgattaa actttgtctg tttccctcct ggagtgtaaa acacgcgggt ctagtattag 660

agtagccagc cagtccaacc cattattaat caagagtaga agagtgggtg gttcaatggt 720

tgatggttat tagttggtgg ttaagttgtg cgcacccaca ggtctggaac actgccagtg 780

attgataata ccacatgaaa aattatgtgt gcgcaactct caactctcaa ctcttactgc 840

ttaacttatc atggaaaaaa aaacctgtta gccccccgct tatttctccc ccaagtcctg 900

tgcactataa atacccccgt gcttttccct ctggctggaa tttcccactt tccaccaaat 960

aatatccaat tgattactaa aacaatcaac atcacaccac acccccatac taattattca 1020

at 1022

<210> 8

<211> 450

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 终止子Tpxp9

<400> 8

agaatattct gatttgatat tggagtgcta aaggtgttag ctaggttctt ttcttttttt 60

tcccctctat taatatttat agttgttgta atgttttttt acagtaaatt gaatgcggtt 120

ttatttgata attgacaatg gaagtgtaga agcaatggtg gaggttgtgg ttgtggttgt 180

ggtggtggtt attaaacgct acccgttgtt cgggatgaaa ttctcatcca ttggcgcgca 240

aagcaaaaat aacagaagat ggcccagaac taaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaatttag 300

ctcaaaaaaa aataaaaaaa aaaaaatttt tctcacttac tcacattact gaaaatattg 360

aaaaccatca tcatcaccaa ccacaacaac tacaacaact acagccatca taacaccacc 420

ttatctataa cataacacac gcacacacag 450

<210> 9

<211> 672

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> sod片段

<400> 9

atggtcaaag ctggtatgta tcccagatcc caatggctgc aaaagaaaag cctatattac 60

aattggcgag aggatctctg gttgagtaaa ttttccagtt cccattgaag taacttcaaa 120

tttgctcaac gtggattttt tcaaccaaca ccgtaggttt cttttttttt gcaagttgca 180

tccactatag gccctaccaa ttggttctgt tactaacaat tgagtctagt cgctgtcgtt 240

agaggtgatt ctaaagtctc cggtgtcgtt tacttcgaac aagcctcccc atcagagcca 300

accactgtct cctgggaaat ttctggaaat gacccaaatg ccttgagagg tttccacatc 360

cacgaattcg gtgacaacac caacggttgt acctctgctg gtccacactt caacccacaa 420

ggtaaggagc acggtggccc aactgatgaa gtccgccacg ttggtgattt gggcaacatt 480

gccactgacg ccaatggtct cgccaagggt caactcaaag actcttgggt caaggtcaac 540

gacatccttg gtagaaccat tgttgtccat gctggtcaag acgatttggg taagggtggt 600

ttcgacgact ccaagaccac cggccacgct ggtggcagaa acgcctgtgg tgtcattggt 660

ttgagtaact ag 672

<210> 10

<211> 30

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗性筛选标记HYG引物lox-F

<400> 10

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag 30

<210> 11

<211> 78

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 抗性筛选标记HYG引物lox-R

<400> 11

gcgtacatta acaattaaca tcgaaaacag agaagtaact acacactgat aacttcgtat 60

agcatacatt atacgaag 78

<210> 12

<211> 1744

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> lox-hyg片段

<400> 12

ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag ttattccccg gggcctccaa ataccaactc 60

acccgagaga gataaagaga caccacccac cacgagacgg agtatatcca ccaaggtaag 120

taactcagag ttaatgatac aggtgtacac agctccttcc ctagccattg agtgggtatc 180

acatgacact ggtaggttac aaccacgttt agtagttatt ttgtgcaatt ccatggggat 240

caggaagttt ggtttggtgg gtgcgtctac tgattcccct ttgtctctga aaatcttttc 300

cctagtggaa cactttggct gaatgatata aattcacctt gattcccacc ctcccttctt 360

tctctctctc tctgttacac ccaattgaat tttctttttt tttttacttt ccctccttct 420

ttatcatcaa agataagtaa gtttatcaat tgcctattca gaatgaaaaa gcctgaactc 480

accgcgacgt ctgtcgagaa gtttctcatc gaaaagttcg acagcgtctc cgacctcatg 540

cagctctcgg agggcgaaga atctcgtgct ttcagcttcg atgtaggagg gcgtggatat 600

gtcctccggg taaatagctg cgccgatggt ttctacaaag atcgttatgt ttatcggcac 660

tttgcatcgg ccgcgctccc gattccggaa gtgcttgaca ttggggaatt cagcgagagc 720

ctcacctatt gcatctcccg ccgtgcacag ggtgtcacgt tgcaagacct ccctgaaacc 780

gaactccccg ctgttctcca gccggtcgcg gaggccatgg atgcgatcgc tgcggccgat 840

cttagccaga cgagcgggtt cggcccattc ggaccgcaag gaatcggtca atacactaca 900

tggcgtgatt tcatatgcgc gattgctgat ccccatgtgt atcactggca aactgtgatg 960

gacgacaccg tcagtgcgtc cgtcgcgcag gctctcgatg agctcatgct ttgggccgag 1020

gactgccccg aagtccggca cctcgtgcac gcggatttcg gctccaacaa tgtcctcacg 1080

gacaatggcc gcataacagc ggtcattgac tggagcgagg cgatgttcgg ggattcccaa 1140

tacgaggtcg ccaacatctt cttctggagg ccgtggttgg cttgtatgga gcagcagacg 1200

cgctacttcg agcggaggca tccggagctt gcaggatcgc cgcggctccg ggcgtatatg 1260

ctccgcattg gtcttgacca actctatcag agcttggttg acggcaattt cgatgatgca 1320

gcttgggcgc agggtcgatg cgacgcaatc gtccgatccg gagccgggac tgtcgggcgt 1380

acacaaatcg cccgcagaag cgcggccgtc tggaccgatg gctgtgtaga agtactcgcc 1440

gatagtggaa accgacgccc cagcactcgt ccgagggcaa aggaatagtg tgctacccac 1500

gcttactcca ccagagctat taacatcaga aatatttatt ctaataaata ggatgcaaaa 1560

aaaacccccc ttaataaaaa aaaaagaaac gattttctat ctaatgaagt ctatgtatct 1620

aacaaatgta tgtatcaatg tttattccgt taaacaaaaa tcagtctgta aaaaaggttc 1680

taaataaata ttctgtctag tgtacacatt ataacttcgt ataatgtatg ctatacgaag 1740

ttat 1744

<210> 13

<211> 24

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物sod-cF

<400> 13

gctggtcaag acgatttggg taag 24

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物intD-R

<400> 14

tattcccccg ttacagctcc ttg 23

<210> 15

<211> 34

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物Kpn-pro-F

<400> 15

gctcggtacc ggcataagga tccaagaaga ggag 34

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 引物BamHI-ter-R

<400> 16

tataggatcc ctgtgtgtgc gtgtgttatg ttatag 36

Claims

1.超氧化物歧化酶或超氧化物歧化酶基因在微生物发酵生产长链二元酸中的应用。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述超氧化物歧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，或与SEQ ID NO:9具有至少约95％的同一性的序列；

和/或，所述微生物为棒状杆菌(Corynebacterium)、白地霉(Geotrichum candidum)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotroula)、酵母属(Saccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)，优选为维斯假丝酵母(Candida viswanathii)或热带假丝酵母(Candida tropicalis)，更优选为菌种保藏号CCTCC NO:M 2020048的维斯假丝酵母或菌种保藏号CCTCC NO:M 2021824的维斯假丝酵母。

3.一种包含超氧化物歧化酶基因的表达元件，其特征在于，所述表达元件为将超氧化物歧化酶基因构建到质粒上得到的重组表达载体，或为包括超氧化物歧化酶基因的重组表达片段；所述超氧化物歧化酶基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，或与SEQ ID NO:9具有至少约95％的同一性的序列；

优选地，所述质粒为pCIB2；和/或，所述重组表达片段通过如SEQ ID NO:3与SEQ IDNO:4所示的引物序列扩增所述超氧化物歧化酶基因获得。

4.一种基因工程菌，其特征在于，其包括核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的超氧化物歧化酶基因，所述基因工程菌的出发菌为棒状杆菌(Corynebacterium)、白地霉(Geotrichumcandidum)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotroula)、酵母属(Saccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)，优选为维斯假丝酵母(Candida viswanathii)或热带假丝酵母(Candida tropicalis)，更优选为菌种保藏号CCTCC NO:M2020048的维斯假丝酵母或菌种保藏号CCTCC NO:M 2021824的维斯假丝酵母。

5.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌包括如权利要求3所述的表达元件中的重组表达片段；优选地，所述重组表达片段导入所述出发菌后，通过同源重组方式整合在所述出发菌的基因组上；更优选地，所述整合的位点为int1基因或其同源基因。

6.如权利要求4所述的基因工程菌，其特征在于，所述过氧化物酶基因利用非整合方式导入所述基因工程菌；

7.一种制备如权利要求4-6任一项所述的基因工程菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的超氧化物歧化酶基因导入棒状杆菌(Corynebacterium)、白地霉(Geotrichum candidum)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotroula)、酵母属(Saccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)，优选为维斯假丝酵母(Candida viswanathii)或热带假丝酵母(Candida tropicalis)，更优选为菌种保藏号CCTCC NO:M 2020048的维斯假丝酵母或菌种保藏号CCTCC NO:M 2021824的维斯假丝酵母。

8.一种长链二元酸的制备方法，其特征在于，所述制备方法为在培养基中发酵如权利要求4-6任一项所述的基因工程菌，或在培养基中发酵棒状杆菌(Corynebacterium)、白地霉(Geotrichum candidum)、假丝酵母属(Candida)、毕赤酵母属(Pichia)、红酵母属(Rhodotroula)、酵母属(Saccharomyces)或耶氏酵母属(Yarrowia)，优选为维斯假丝酵母(Candida viswanathii)或热带假丝酵母(Candida tropicalis)，更优选为菌种保藏号CCTCC NO:M2020048的维斯假丝酵母或菌种保藏号CCTCC NO:M 2021824的维斯假丝酵母的同时添加超氧化物歧化酶，得到所述长链二元酸；优选地，所述超氧化物歧化酶由SEQ IDNO:9所示的核苷酸序列或与SEQ ID NO:9具有至少约95％的核苷酸序列编码。

9.如权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述长链二元酸选自C₉-C₂₂的长链二元酸中的一种或多种，优选自C₉-C₁₈的长链二元酸中的一种或多种，更优选自癸二酸、十一碳二元酸、十二碳二元酸、十三碳二元酸、十四碳二元酸、十五碳二元酸和十六碳二元酸中的一种或多种；

和/或，所述长链二元酸为直链长链二元酸。

10.一种重组DNA，其特征在于，所述重组DNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示的超氧化物歧化酶基因。