CN115678956A - 筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于微生物技术领域中的细菌筛选分离，公开了一种筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的海洋细菌的方法包括：通过比较确定产琼胶酶菌株的高效富集培养基H，构建产芳基硫酸酯酶菌株鉴定方法，筛选得到同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的海洋细菌。本发明提供了一种筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，可用于筛选催化效率高、稳定性强的琼胶降解酶，进而以绿色、高效和经济的方式提高琼胶寡糖的产量和质量。本发明能为琼胶寡糖的工业化生产提供条件，可有效地推动海洋多糖活性物质的绿色开发和高效利用，加快发展海洋经济。

Description

筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法及应用

技术领域

本发明属于细菌筛选分离技术领域，尤其涉及一种筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法及应用。

背景技术

琼胶是目前使用最为广泛的三大海藻糖之一，是龙须菜、麒麟菜等红藻中细胞壁外层的主要成分，在食品和医药等方面应用广泛。但由于琼胶黏度高/水溶性低，不易被吸收，在应用上受到较大的限制。为了解决这个问题，可利用酸法/酶法进行降解获得琼胶寡糖。琼胶寡糖水溶性好，易吸收，极大的提高了琼胶的应用价值，是一种新型的海洋功能性低聚糖。

目前，国内外主要采用酸降解法和酶法制备琼胶寡糖。酸降解法应用最广泛，降解得到的寡糖得率高，但存在产物不均一、需要高温酸解、污染环境、寡糖活性丧失、产物分析和回收难等问题，故而难以工业化生产功能性寡糖，以满足社会需求。酶法能够克服酸降解法存在的不足，具有分解条件温和、易控制，产物专一性好、易于分离纯化和分析且活性高，工艺绿色环保等优点。

琼胶主要由琼脂糖和硫琼胶两部分组成。其中，琼脂糖是琼胶的主要组成部分，为形成凝胶的一种中性链状多糖；而硫琼胶的结构较为复杂，主要碳链结构与琼脂糖的相同，但含更多的硫酸基。硫酸基需通过碱或芳基硫酸酯酶处理才能脱除，转化为低硫酸基的琼脂糖，从而充分利用硫琼胶这一长期以来被看做提取琼脂糖的废弃物。此外，芳基硫酸酯酶具有断裂硫酸酯键的功能，并可应用于酶法脱除琼胶上的硫酸基，提高凝胶强度，改善琼胶性能，用于制备高品质的琼脂糖。

硫琼胶经芳基硫酸酯酶脱硫变为琼脂糖，在琼胶酶的作用下生成琼胶寡糖。琼胶寡糖具有多种生物活性，能抵抗病毒、抗肿瘤/抗氧化和抗炎症，能够增强免疫力，具有保湿和美白等作用，可以作为天然的防腐剂、抗氧化剂和功能性食品基料等，在医药、食品、生物技术和化妆品等多个领域具有广泛的应用前景，开发潜力极大。

琼胶降解酶来源少、活性低，目前仅有Pseudomonas atlantica菌株的β-琼胶酶和Flammeovirgapacifica菌株的芳基硫酸酯酶应用于生产，但产量少且价格昂贵。报道的产琼胶酶的琼胶降解菌主要分布在假交替单胞菌属(Pseudoalteromonas)、噬琼胶菌属(Agarivorans)、交替单胞菌属(Alteromonas)等类群中。除了Flammeovirga属于拟杆菌门(Bacteroidetes)外，其余菌株均属于变形菌门(Proteobacteria)γ-变形菌纲(Gamma-proteobacteria)。应用于琼胶脱硫的产芳基硫酸酯酶菌株仅有数株，同时含有琼胶酶和芳基硫酸酯酶的菌株尚未有报道。因此，建立分离同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，将为提高琼胶利用率和增加琼胶寡糖产量提供丰富的菌种资源和酶资源，与国家着力促进海洋经济“绿色发展”的理念相呼应，实现经济效益和环境保护的双重目标。

通过上述分析，现有技术存在的问题及缺陷为：现有技术没有能够筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法；现有的琼胶寡糖制备方法产物不均一、需要高温酸解、污染环境、寡糖活性丧失、产物分析和回收难，难以进行工业化生产功能性寡糖。

发明内容

针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法及应用。

本发明是这样实现的，一种筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法包括：

通过比较确定产琼胶酶菌株的高效富集培养基H，构建产芳基硫酸酯酶菌株鉴定方法，筛选得到同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的海洋细菌。

进一步，所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法包括以下步骤：

步骤一，将沉积物或海水样品加入富集培养基H中颠倒混匀，并进行培养，得到培养液；

步骤二，将得到培养液与9倍量的富集培养基H混合后进行稀释，并将稀释液涂布于2216E固体培养基，进行培养，分离纯化获得单菌落；

步骤三，挑取单菌落于2216E液体培养基中进行过夜培养，将卢戈氏碘液覆盖于2216E培养基平板上菌落的周边区域，产生透明圈的即为产琼胶酶细菌；

步骤四，将单菌落的过夜培养液进行划线培养，平板分为两等份，一份涂对硝基苯酚硫酸酯盐pNPS，另一份涂等量的PBS缓冲液，仅涂pNPS的平板变为淡黄色的菌株，即为同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的细菌。

进一步，所述沉积物或海水样品与所述富集培养基H的体积比为1:9。

进一步，所述富集培养基H由0.05％的MgSO₄·7H₂O、0.1％的琼胶、0.002％的FeSO₄·7H₂O、0.02％的CaCl₂、2.5％的NaCl、0.2％的NaNO₃以及0.1％的K₂HPO₄组成；所述富集培养基pH为7.5。

进一步，所述步骤一中进行培养包括：于28℃下培养48小时；所述步骤二中进行培养包括：于28℃下培养48小时。

进一步，所述步骤二中，进行单菌落的挑选包括：确定固体培养基上菌株的生长情况，挑选不同菌落形态特别是形成平板凹陷乃至产生孔洞的细菌进行纯化，经多次划线培养后得到单菌落。

进一步，所述步骤三中，培养包括：取10μL单菌落过夜培养液，滴在2216E固体培养基上，于28℃、150rpm下培养24小时；所述步骤四中进行培养包括：挑取单菌落进行平板划线培养，将2216E固体培养基分为两等份，分别涂抹50μLPBS缓冲液与终浓度为5mM的pNPS，28℃培养48小时。

进一步，所述步骤三中，将卢戈氏碘液覆盖菌落的周边区域，呈现透明圈的菌落为产琼胶酶海洋细菌；

进一步，所述步骤四中，涂pNPS的平板变为淡黄色，而涂PBS缓冲液的不变色，得到产芳基硫酸酯酶的海洋细菌。

本发明的另一目的在于提供一种基于所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌方法进行高效琼胶菌筛选的方式。

结合上述的技术方案和解决的技术问题，本发明所要保护的技术方案所具备的优点及积极效果为：

本发明提供了一种筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，可用于筛选催化效率高、稳定性强的琼胶降解酶，进而以绿色、高效和经济的方式制备高品质的琼脂糖以提高琼胶寡糖的产量和质量。

本发明绿色环保，不会污染环境，且筛选效率高。

本发明将为提升琼胶利用率、提高琼胶寡糖产量和质量提供丰富的菌种资源和酶资源，能为琼胶寡糖的工业化生产提供条件，可有效地推动海洋多糖活性物质的绿色开发和高效利用，加快发展海洋经济。

本发明的技术方案转化后的预期收益和商业价值为：本发明能提升琼胶的利用率，提高琼胶寡糖的产量和质量。

本发明的技术方案填补了国内外业内技术空白：本发明填补了目前没有研究同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌方法的技术空白。

本发明的技术方案克服了技术偏见：本发明克服了大规模的商业应用是酶法和物理法结合的技术偏见。

附图说明

图1是本发明实施例提供的筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法原理图。

图2是本发明实施例提供的筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法流程图。

图3是本发明实施例提供的卢戈氏碘液染色分离产琼胶酶的菌株图。

图4是本发明实施例提供的pNPS筛选产芳基硫酸酯酶的菌株图。

图5是本发明实施例提供的海洋细菌DA14降解琼脂产生的凹陷示意图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

为了使本领域技术人员充分了解本发明如何具体实现，该部分是对权利要求技术方案进行展开说明的解释说明实施例。

如图1-图2所示，本发明实施例提供的筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法包括以下步骤：

S101，富集培养：将沉积物或海水样品加入富集培养基H中颠倒混匀，并于28℃下培养48小时，得到培养液；

S102，分离鉴定：将得到的培养液与9倍量的富集培养基H混合后进行稀释，然后涂布于2216E固体培养基，于28℃下培养48小时，经多次分离纯化获得单菌落，然后进行16SrRNA分子鉴定，确定菌株的种属；

S103，产琼胶酶细菌的筛选：将挑取的单菌落在2216E液体培养基中进行过夜培养，取10μL培养液滴于2216E固体培养基上，28℃培养24小时，然后进行卢戈氏染色，出现透明圈的即为产琼胶酶细菌；

S104，产芳基硫酸酯酶细菌的筛选：挑取产琼胶酶的单菌落进行平板划线培养，将2216E固体培养基分为两等份，分别涂抹50μL PBS缓冲液与终浓度为5mM的pNPS。28℃培养48小时，涂pNPS的平板变为淡黄色，而涂PBS缓冲液的不变色，即为同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的海洋细菌。

本发明实施例提供的沉积物或海水样品与所述富集培养基H的体积比为1：9。

本发明实施例提供的富集培养基H由0.05％的MgSO₄·7H₂O、0.1％的琼胶、0.002％的FeSO₄·7H₂O、0.02％的CaCl₂、2.5％的NaCl、0.2％的NaNO₃以及0.1％的K₂HPO₄组成；所述富集培养基pH为7.5。

本发明实施例提供的进行单菌落的挑选包括：确定固体培养基上菌株的生长情况，挑选不同菌落形态特别是形成平板凹陷乃至产生孔洞的细菌进行纯化，经多次划线培养后得到单菌落。

步骤S103中，本发明实施例提供的培养包括：于28℃、150rpm下培养24小时；再取10μL菌液滴在2216E固体培养基上，28℃培养24小时；步骤S104中，本发明实施例提供的培养包括：取单菌落菌液进行平板划线，平板等分为涂pNPS和PBS缓冲液的两部分，28℃培养48小时。

步骤S103中，将卢戈氏碘液覆盖菌落的周边区域，呈现透明圈的菌落为产琼胶酶海洋细菌；步骤S104中，涂pNPS的平板变为淡黄色，而涂PBS缓冲液的不变色，得到产芳基硫酸酯酶的海洋细菌。

下面结合具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

实施例1：

琼胶主要由琼脂糖和硫琼胶两部分组成。芳基硫酸酯酶具有断裂硫酸酯键的功能，并可应用于酶法脱除硫琼胶的硫酸基，提高凝胶强度，改善琼胶性能，提高琼胶利用率，制备高品质琼脂糖。芳基硫酸酯酶对人工合成的底物对硝基苯酚硫酸酯盐(pNPS)降解效果良好，其产物对硝基苯酚(pNP)在中碱性环境下会发生黄色显色反应。因此，目前常用pNPS作为底物筛选产芳基硫酸酯酶的微生物。琼胶酶降解琼脂形成降解圈或明显孔洞，用卢戈氏碘液覆盖菌落周边区域，被降解的琼胶不能与碘着色而呈明显的透明区，通常采用该法筛选产琼胶酶的细菌。

通过比较确定产琼胶酶菌株的高效富集培养基H

取1g沉积物或1mL海水样品，加入9mL以琼脂粉为唯一碳源的富集培养基H或其它培养基，颠倒混匀，28℃培养约48小时；取100mL培养液涂布于相应的固体培养基平板，28℃培养24小时，挑选不同菌落形态的细菌进一步纯化，以卢戈氏碘液进行验证，分离得到能够降解琼脂的细菌。

建立产芳基硫酸酯酶菌株快速简便的鉴定方法

平板等分为2份，一份涂50μL无菌的1×PBS缓冲液，另一份涂等量的5mM pNPS。将纯化好的细菌进行划线培养，28℃培养48小时，仅pNPS平板出现黄色显色反应的为能产芳基硫酸酯酶的细菌。

筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的海洋细菌

结合以上实验结果确定同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的海洋细菌。目前采用本发明的方法已经分离到24株能同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的海洋细菌。

为了证明本发明的技术方案的创造性和技术价值，该部分是对权利要求技术方案进行具体产品上或相关技术上的应用实施例。

本发明的应用实施例提供了一种基于筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的海洋细菌方法的琼胶降解酶筛选方法。

本发明的应用实施例将所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法应用于筛选催化效率高、稳定性强的琼胶降解酶中，并利用筛选的琼胶降解酶以绿色、高效和经济的方式提高琼胶寡糖的产量和质量。

本发明实施例在研发或者使用过程中取得了一些积极效果，和现有技术相比的确具备很大的优势，下面内容结合试验过程的数据和图表等进行描述。

1.确定筛选产琼胶酶的高效培养基，提高产琼胶酶菌株的分离率

步骤1：样品采集于广西壮族自治区北海市竹林红树林和海草床区域，以样品勺采集0-20cm处沉积物样品，以无菌水样采集袋收集海水，每组设三个重复。样品放置于低温保温箱中，带回实验室立即处理。

步骤2：将采集的1g海洋沉积物或1mL海水样品加入9mL富集培养基H(MgSO₄·7H₂O0.05％、琼胶0.1％、FeSO₄·7H₂O 0.002％、CaCl₂0.02％、NaCl 2.5％、NaNO₃0.2％、K₂HPO₄0.1％、pH 7.5)、分离培养基S(蛋白胨0.5％、酵母粉0.1％、KCl 0.1％、MgSO₄·7H₂O0.05％、CaCl₂0.02％、NaCl 2.5％、K₂HPO₄0.1％、pH 7.5)、R2A培养基(青岛海博公司)和2216E(Difco公司)培养基中颠倒混匀，28℃培养48小时，获得培养液。

步骤3：取1mL培养液加至含9mL富集培养基H的15mL离心管中，进行梯度稀释，稀释梯度分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5。

步骤4：分别取100μL稀释度为10^-3、10^-4、10^-5的稀释液涂布于2216E固体培养基，每组3个平行，28℃培养48小时左右。

步骤5：观察固体培养基上菌株的生长情况，挑选不同菌落形态特别是形成平板凹陷乃至产生孔洞的细菌进行纯化，经多次划线培养后获得单菌落，并进行16S rRNA分子鉴定，确定菌株的种属。

步骤6：挑取单菌落在2216E液体培养基中进行培养，28℃，150rpm，过夜培养，取10μL菌液滴在2216E固体培养基上，28℃培养24小时后，将卢戈氏碘液覆盖菌落的周边区域，出现透明圈的即为产琼胶酶海洋细菌。透明圈和菌株的直径之比越大，酶活力可能越强。

步骤7：比较不同培养基对分离产琼胶酶细菌数量和种类的影响，确定最合适的培养基。

表一不同培养基中分离出产琼胶酶细菌的数量和种类

2.改进产芳基硫酸酯酶菌株的分离方式

方法1：

挑取产琼胶酶的单菌落进行平板划线培养，将2216E固体培养基分为两等份，分别涂抹50μL PBS缓冲液与终浓度为5mM的pNPS。28℃培养2-3天，涂pNPS的平板变为淡黄色，而涂PBS缓冲液的不变色，即为产芳基硫酸酯酶的细菌。

方法2：

取分离产琼胶酶方法步骤2中梯度稀释液涂布于2216E固体培养基上，该培养基表面事先涂布100μL 5mM的pNPS溶液，28℃培养2天左右，观察菌落周围是否变黄，以涂布等量的PBS缓冲液的平板为对照，仅pNPS平板变黄的为产芳基硫酸酯酶菌。

方法3：

取10μL单菌落的过夜培养液滴在2216E固体培养基上，一半培养基上涂布50μLPBS缓冲液，另一半涂布50μL pNPS溶液，28℃培养24小时，观察比较菌落周围平板是否变黄，仅pNPS平板变黄的为产芳基硫酸酯酶菌。

三种方法的分离结果：

方法1：大量菌落分散分布，培养产芳基硫酸酯酶菌的培养基变黄明显；方法2：菌落多但杂，难以观察到菌落周围培养基变黄的变化；方法3：菌落集中但分布范围小，部分菌落周围培养基变黄的变化难以发现。由此可见，方法1的效果较好。

3.应用

步骤1：样品采集于广西壮族自治区北海市的红树林和海草床区域，以样品勺采集0-20cm处沉积物样品，以无菌水样采集袋收集海水，每组设三个重复。样品放置于低温保温箱中，带回实验室立即处理。

步骤2：将采集的1g海洋沉积物或1mL海水样品加入9mL富集培养基H(MgSO₄·7H₂O0.05％、琼胶0.1％、FeSO₄·7H₂O 0.002％、CaCl₂0.02％、NaCl 2.5％、NaNO₃0.2％、K₂HPO₄0.1％、pH 7.5)培养基中颠倒混匀，28℃培养48小时，获得培养液。

步骤3：取1mL培养液加至含9mL富集培养基H的15mL离心管中，进行梯度稀释，稀释梯度分别为10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5。

步骤4：分别取100μL稀释度为10^-3、10^-4、10^-5的稀释液涂布于2216E固体培养基，每组3个平行，28℃培养48小时左右。

步骤5：观察固体培养基上菌株的生长情况，挑选不同菌落形态特别是形成平板凹陷乃至产生孔洞的细菌进行纯化，经多次划线培养后获得单菌落。

步骤6：挑取单菌落在2216E液体培养基中进行培养，28℃，150rpm，过夜培养，取10μL菌液滴在2216E固体培养基上，28℃培养24小时后，将卢戈氏碘液覆盖菌落的周边区域，出现透明圈的即为产琼胶酶海洋细菌。透明圈和菌株的直径之比越大，酶活力可能越强。

步骤7：挑取产琼胶酶的单菌落进行平板划线培养，将2216E固体培养基分为两等份，分别涂抹50μL PBS缓冲液与终浓度为5mM的pNPS。

步骤8：28℃培养2-3天，涂pNPS的平板变为淡黄色，而涂PBS缓冲液的不变色，即为产芳基硫酸酯酶的细菌。

步骤9：统计数据，分析结果。采用该技术成功分离出137株3门28个不同种属产琼胶酶的细菌，24株Proteobacteria门Gilvimarinus、Marinobacter、Pseudoalteromonas、Shewanella、Vibrio 5属11种同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的细菌，其中DA14为潜在新菌。

DA14与标准菌株Gilvimarinus chinensis DSM 19667的16S rDNA相似性为98.65％，同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶。基因组在NCBI数据库的登录号为CP100350，基因组分析显示DA14含有8个琼胶酶基因和2个芳基硫酸酯酶基因。

本发明实施例提供的菌种属于现有技术，基因也属于现有技术，NCBI中16SrDNA收录号为OM510271；菌株保藏在中国海洋微生物菌种保藏管理中心，收藏号为MCCC 1K07516。

以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，其特征在于，所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法通过比较确定产琼胶酶菌株的高效富集培养基H，构建产芳基硫酸酯酶菌株鉴定方法，筛选得到同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的海洋细菌。

2.如权利要求1所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，其特征在于，所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法包括以下步骤：

步骤一，将沉积物或海水样品加入富集培养基H中颠倒混匀，并进行培养，得到培养液；

步骤二，将得到培养液与9倍量的富集培养基H混合后进行稀释，然后涂布于2216E固体培养基，进行培养，分离纯化获得单菌落；

步骤三，挑取单菌落于2216E液体培养基中进行过夜培养，将卢戈氏碘液覆盖2216E培养基平板上的菌落的周边区域，产生透明圈的即为产琼胶酶细菌；

步骤四，将单菌落的过夜培养液进行划线，平板分为两等份，一份涂pNPS，另一份涂等量的PBS缓冲液，进行培养，涂pNPS的平板变为淡黄色即为产芳基硫酸酯酶的细菌。以此筛选得到同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的海洋细菌。

3.如权利要求2所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，其特征在于，所述沉积物或海水样品与所述富集培养基H的体积比为1：9。

4.如权利要求2所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，其特征在于，所述富集培养基H由0.05％的MgSO₄·7H₂O、0.1％的琼胶、0.002％的FeSO₄·7H₂O、0.02％的CaCl₂、2.5％的NaCl、0.2％的NaNO₃以及0.1％的K₂HPO₄组成；所述富集培养基pH为7.5。

5.如权利要求2所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，其特征在于，所述步骤一中进行培养包括：于28℃下培养48小时；所述步骤二中进行培养包括：于28℃下培养48小时。

6.如权利要求2所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，其特征在于，所述步骤三中，进行单菌落的挑选包括：确定固体培养基上菌株的生长情况，挑选不同菌落形态特别是形成平板凹陷乃至产生孔洞的细菌进行纯化，经多次划线培养后得到单菌落。

7.如权利要求2所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，其特征在于，所述步骤三中，培养包括：取10μL单菌落过夜培养液，滴在2216E固体培养基上，于28℃、150rpm下培养24小时；所述步骤四中进行培养包括：挑取产琼胶酶的单菌落进行平板划线培养，将2216E固体培养基分为两等份，分别涂抹50μL PBS缓冲液与终浓度为5mM的pNPS并进行培养，28℃培养48小时。

8.如权利要求2所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，其特征在于，所述步骤三中，将卢戈氏碘液覆盖菌落的周边区域，呈现透明圈的菌落为产琼胶酶海洋细菌。

9.如权利要求2所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌的方法，其特征在于，所述步骤四中，涂pNPS的平板变为淡黄色，而涂PBS缓冲液的不变色，得到产芳基硫酸酯酶的细菌，筛选得到同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶的海洋细菌。

10.一种基于如权利要求1-9任意一项所述筛选同时产琼胶酶和芳基硫酸酯酶海洋细菌方法进行高效琼胶降解菌筛选的方式。

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