CN115671368A - 一种用于生物膜清除的纳米纤维复合贴片及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于生物膜清除的纳米纤维复合贴片及其制备方法，纳米纤维复合贴片包括微针阵列和释氧型纤维膜，微针针体与释氧型纤维膜连接；微针阵列为水溶性的，微针阵列中负载有EPS破坏剂；释氧型纤维膜由纤维膜和粘附在纤维膜上的微藻组成；纳米纤维复合贴片的制备方法为：(1)制备微藻培养液；(2)制备纤维膜；(3)将纤维膜浸泡到微藻培养液中；(4)将EPS破坏剂加入生物相容性高分子水溶液中，混合均匀，再将混合溶液浇筑到微针模板上，使溶液充分填充微针空腔；(5)制备纳米纤维复合贴片。本发明解决了频繁更换敷料的问题，且纳米纤维复合贴片在激光照射后对于伤口处生物膜的清除率为95％以上。
Description
技术领域
本发明属于医用敷料技术领域，涉及一种用于生物膜清除的纳米纤维复合贴片及其制备方法。
背景技术
细菌生物膜是细菌通过自身分泌的胞外聚合物粘附在物体接触面上而形成含有多细胞的三维结构群体，由细菌生物膜引发的感染是医疗卫生领域中的一个十分具有挑战性的问题。定植在伤口处的细菌生物膜通过不断与宿主免疫系统的成分(包括嗜中性粒细胞，巨噬细胞和炎性细胞因子)相互作用来促进长期炎症，导致伤口在炎症阶段停滞不前，进而导致愈合无法在一个月内完成，给患者带来痛苦和经济负担。
生物膜由细菌及其自身分泌的胞外聚合物(extra-cellular polymericsubstances，EPS)组成，EPS包围并保护细胞，其主要成分包含多糖、蛋白质、脂质和细胞外DNA等，是细菌生存的直接环境。EPS为细菌提供了天然的保护屏障，使常规疗法难以有效作用于细菌内部，是生物膜难以清除的重要原因。因此迫切需要开发能破坏生物膜屏障结构的方法，以提高治疗效果，对抗生物膜相关感染。同时细菌生物膜通过不断消耗组织中的氧气形成缺氧的微环境，不仅是细菌产生耐药性的重要原因之一，还会影响伤口处细胞增殖、新生血管生成、胶原合成等修复活动，阻碍伤口愈合进程。
在目前的生物膜治疗方法中，光动力疗法由于不会产生耐药性引发了研究者的关注。光动力疗法通过使用特定波长的光激发光敏剂将能量传递给氧气并产生高活性的单线态氧，对细菌细胞产生超强氧化反应使之失活。目前常用的光敏剂分子具有稳定性差，易发生团聚减弱其光敏活性的缺点，同时光敏剂尽管在黑暗条件下具有良好的生物相容性和安全性，一旦暴露光照下，仍然会给正常细胞和组织带来一定程度的损伤，影响了光动力疗法的治疗效果。微藻是一类单细胞真核或原核生物，由脂质、蛋白质、核酸和碳水化合物组成。微藻中的叶绿素具有二氢卟吩母环结构，可作为天然光敏剂用于光动力消除细菌。同时微藻光合效率高，在光源下可持续释氧，其产氧量是无机催化产氧的三倍。微藻常用作功能性食品或保健品，作为伤口敷料中的释氧以及光敏材料具有良好的体内安全性和生物相容性，具有极大的应用潜力。
目前将微藻用于产氧的研究主要是将微藻包封在水凝胶中来促进微藻的粘附，但CO2在水中溶解度低，且藻细胞密度较大，因此水凝胶中的CO2浓度通常不能满足微藻光合作用的需求，水凝胶中的微藻会随着时间推移而导致生物质损失，最终影响细胞生存能力。因此水凝胶微藻敷料通常1～3天就需要及时更换，以保证治疗效果。但在实际应用过程中，频繁的敷料更换不仅会对患者带来痛苦和麻烦，敷料更换过程中伤口也面临再次感染的风险，因此延长敷料的使用周期、解决治疗过程中需要频繁更换敷料的问题是十分迫切的。同时由于水凝胶敷料中传质阻力大，微藻产生的氧气以及活性氧不能有效地释放到感染部位，也会影响光动力的作用效果。由于光动力疗法释放的ROS作用靶点主要是细菌细胞膜上的脂质、以及细胞内的DNA等成分，EPS的屏障会使ROS无法有效地作用到细菌细胞上，减弱了光动力疗法的治疗效果，因此为了达到更好的生物膜清除效果，需要协同作用破坏EPS屏障，暴露出内部的细菌。
发明内容
本发明的目的是解决现有技术中存在的上述问题，提供一种用于生物膜清除的纳米纤维复合贴片及其制备方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种释氧型纳米纤维复合贴片，包括微针阵列和释氧型纳米纤维膜，微针的针体与释氧型纳米纤维膜连接；
微针阵列为水溶性的，微针阵列中负载有EPS破坏剂，可以深入破坏EPS，暴露生物膜内部的细菌；
释氧型纳米纤维膜由纳米纤维膜和粘附在纳米纤维膜上的微藻组成，且微藻负载量＞5×106细胞/cm2；
纳米纤维膜的孔隙率为70％～90％，孔道曲折度小于1.5(孔道曲折度主要反应纤维膜内部的孔道弯曲性、连通性以及复杂程度，曲折度越小，说明内部孔道结构越简单，气体、水分等传递的阻力就越小)，孔径为0.8～2μm，有利于气体交换和营养物质运输。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种释氧型纳米纤维复合贴片，微针针体呈圆锥形，高为600～900μm，底部直径为200～400μm。
如上所述的一种释氧型纳米纤维复合贴片，微针阵列为10×10方形阵列，微针阵列中相邻微针针尖间距为500～700μm。
如上所述的一种释氧型纳米纤维复合贴片，微藻为莱茵衣藻、蛋白核小球藻、普通小球藻、椭圆小球藻、雨生红球藻、杜氏盐藻、聚球藻、小球衣藻、裸藻或螺旋藻；
EPS破坏剂为α-淀粉酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、分散素B、抗菌肽Hepcidin-20和柠檬酸两性离子表面活性剂的一种以上。
本发明还提供如上所述的一种释氧型纳米纤维复合贴片的制备方法，包括如下步骤：
(1)将微藻接种到培养基中，在光照培养箱中培养得到处于指数生长期的微藻培养液；
(2)采用静电纺丝方法制备纳米纤维膜；
(3)将纳米纤维膜浸泡到处于指数生长期的微藻培养液中进行处理3～10天，使藻类细胞充分附着在纳米纤维膜上；
(4)将EPS破坏剂加入生物相容性高分子水溶液中，得到均匀的混合溶液，之后将混合溶液浇筑到微针模板上，使微针尖端空腔覆盖完全，在真空环境下保持10～20min使混合溶液充分填充微针空腔；
(5)将步骤(3)浸泡处理后的纳米纤维膜置于步骤(4)的微针模板上并在室温下干燥10～14h，待微针完全干燥后从微针模板中分离得到释氧型纳米纤维复合贴片。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种释氧型纳米纤维复合贴片的制备方法，步骤(1)中培养基为BG11培养基、TAP培养基、SE培养基、F/2培养基、HUT培养基或SP培养基(不同的微藻有相对应的培养基，例如莱茵衣藻使用TAP或SE培养基，蛋白核小球藻使用BG11培养基或SE培养基，普通小球藻使用BG11培养基，椭圆小球藻使用BG11培养基，雨生红球藻使用BG11培养基，杜氏盐藻使用F/2培养基，聚球藻使用BG11培养基，小球衣藻使用SE培养基，裸藻使用HUT培养基，螺旋藻使用SP培养基)，培养温度为20～37℃，光照强度1000～4000Lux(勒克斯)，光照周期为每天12～14h光照处理，10～12h黑暗处理。
如上所述的一种释氧型纳米纤维复合贴片的制备方法，步骤(2)中纳米纤维膜的材质为壳聚糖、聚乳酸、明胶、聚己内酯、丝素蛋白、聚丁二酸丁二醇酯、聚氨酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物或聚β-羟基丁酸酯，静电纺丝的工艺参数为：温度24±2℃，湿度44±2％，纺丝速度0.9～1.5mL/h，电压15～20kV，接收距离15～20cm。
如上所述的一种释氧型纳米纤维复合贴片的制备方法，步骤(4)中微针模板的材质为聚二甲基硅氧烷(PDMS)，生物相容性高分子为聚乙烯醇、透明质酸、甲基丙烯酸酐化明胶、海藻酸钠、聚环氧乙烷、聚乙二醇、聚丙烯酸、羧甲基纤维素钠、硫酸软骨素、羟丙甲纤维素和聚乙烯吡咯烷酮的一种以上，生物相容性高分子水溶液的浓度为10～30wt％，混合溶液中EPS破坏剂的浓度为5～15mg/mL。
本发明还提供如上所述的一种释氧型纳米纤维复合贴片在消除伤口处形成的生物膜中的应用。
作为优选的技术方案：
如上所述的一种释氧型纳米纤维复合贴片在消除伤口处形成的生物膜中的应用，所述释氧型纳米纤维复合贴片与光动力疗法联合使用，即纳米纤维复合贴片使用后通过波长为650nm激光照射实现清除生物膜的功能；
所述释氧型纳米纤维复合贴片对于伤口处生物膜的清除率为95％以上。
本发明的原理如下：
本发明的一种用于伤口处生物膜清除的释氧型微针纳米纤维复合贴片，由可进行光动力治疗的微藻纳米纤维膜以及负载了EPS破坏剂的微针阵列组成；其中微针阵列为水溶性的，在刺入伤口中后会溶解并释放EPS破坏剂以降解EPS中的多糖、蛋白质等成分并暴露包裹在生物膜内部的细菌；纳米纤维膜上的微藻中的叶绿素在激光照射下会产生活性氧，攻击细菌细胞膜上的脂质、蛋白质以及细菌内部的DNA等使细菌死亡。同时微藻在光照下能持续产生氧气，解决生物膜内部缺氧环境的同时可以促进细胞增殖以及血管再生来促进伤口愈合。微针的机械作用与EPS破坏剂对细菌生物膜的破坏作用使细菌可以暴露出来，解决了活性氧在生物膜内部渗透性差的问题，与光动力疗法发挥了更好的协同作用，同时微针溶解后形成的通道有利于氧气和活性氧的扩散，有效增强了光动力疗法的治疗效果。由于纳米纤维的多孔结构有利于气体交换以及营养物质的运输，粘附在纳米纤维上的微藻可以有效利用空气中的CO2进行光合作用来维持自身的生长繁殖，同时纳米纤维复合贴片使用期间伤口处的渗出物也可以为微藻的生长提供水和营养物质，使微藻保持较长的存活时间。由于微藻可以长期存活，只需激光照射就可以实现光动力活性再生，因此可以通过光动力治疗方案的设计即通过增加激光照射时间或频次可以实现可控的细菌生物膜清除效果，可使纳米纤维复合贴片使用后伤口处生物膜清除率达到95％以上，伤口可在7～14天愈合，而该纳米纤维复合贴片中的微藻能保持其光合作用与治疗效果超过14天，因此可以只通过一次敷料的使用就完成治疗需求，解决了频繁更换敷料的问题。
有益效果：
(1)本发明的释氧型纳米纤维复合贴片，其中释氧型纳米纤维膜上的微藻中的叶绿素在激光照射下会产生活性氧，攻击细菌细胞膜上的脂质、蛋白质以及细菌内部的DNA等使细菌死亡，同时微藻在光照下能持续产生氧气，为光动力疗法提供原料的同时可以改善组织缺氧的问题。
(2)本发明的释氧型纳米纤维复合贴片，其中纳米纤维膜为一种高孔隙率且孔道连通性好的材料，对CO2和氧气具有较好的传质性能，提高了氧气的传质速率和利用率；同时，纳米纤维的高比表面积有利于微藻的粘附和生长，纳米纤维的孔径较小还可以隔绝细菌污染。
(3)附着在纳米纤维上的微藻可以利用空气中的CO2进行光合作用来维持自身的生长繁殖，同时伤口处的渗出物也可以为微藻的生长提供水和营养物质，使微藻保持较长的存活时间，在治疗周期中无需更换敷料，避免了敷料更换带来的麻烦以及二次感染的风险。
(4)与释氧型纳米纤维膜相连的微针溶解后会释放EPS破坏剂，破坏生物膜的EPS屏障，暴露包裹在生物膜内部的细菌。同时微针形成的通道有利于氧气和活性氧的扩散，有效提高了氧气的利用率，提升光动力的治疗效果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
本发明采用的物质来源如下：
(1)莱茵衣藻：来源于中国科学院淡水藻种库，牌号为FACHB-2217；
(2)普通小球藻：来源于中国科学院淡水藻种库，牌号为FACHB-2338；
(3)雨生红球藻：来源于中国科学院淡水藻种库，牌号为FACHB-712；
(4)椭圆小球藻：来源于中国科学院淡水藻种库，牌号为FACHB-40；
(5)螺旋藻：来源于中国科学院淡水藻种库，牌号为FACHB-810；
(6)BG11培养基：来源于中国科学院淡水藻种库，牌号为BG11；
(7)TAP培养基：来源于中国科学院淡水藻种库，牌号为TAP；
(8)SE培养基：来源于中国科学院淡水藻种库，牌号为SE；
(9)SP培养基：来源于中国科学院淡水藻种库，牌号为Spirulina medium；
(10)壳聚糖：重均分子量为30000；
(11)聚乳酸：重均分子量为60000；
(12)聚己内酯：数均分子量为80000；
(13)明胶：胶强度250g Bloom；
(14)丝素蛋白：重均分子量为26000；
(15)聚β-羟基丁酸酯：数均分子量为500000；
(16)聚乙烯醇：重均分子量为61000；
(17)甲基丙烯酸酐化明胶：来源于Merck公司，胶强度300gBloom；
(18)聚乙烯吡咯烷酮：重均分子量为50000。
本发明中纳米纤维膜的孔道曲折度参照文献“崔红敏.层级复合聚偏氟乙烯/聚氨酯纳米纤维膜的制备及其防水透湿性能研究[D].上海:东华大学,2018.”计算得到。
本发明中生物膜清除率的测试方法如下：
首先进行细菌生物膜培养，具体步骤如下：在无菌12孔板中垂直放置无菌玻璃片(20mm×20mm)，将菌悬液与培养液按1:4体积比混匀后再按5mL/孔加入到12孔板中，细菌初始浓度为107CFU/mL，将孔板置于37℃恒温箱中孵育2d，得到成熟细菌生物膜；
然后采用稀释平板法测试生物膜清除率：将在12孔板中长好的生物膜去除上清液，之后将纳米纤维复合贴片覆盖到细菌生物膜表面，待微针溶解后将纳米纤维复合贴片暴露于650nm激光下照射10～20min，不经纳米纤维复合贴片以及激光照射处理的细菌生物膜作为对照组，将对照组和纳米纤维复合贴片组在37℃下进一步孵育24h后转移至液体培养基中，并进行适当稀释，取稀释后的菌液加入固体培养基上进行涂板定量，计算出菌落数。生物膜清除率＝(对照组菌落数-纳米纤维复合贴片组菌落数)/对照组菌落数×100％。
实施例1
一种释氧型纳米纤维复合贴片的制备方法，包括如下步骤：
(1)将莱茵衣藻接种到TAP培养基中，在光照培养箱中培养得到处于指数生长期的莱茵衣藻培养液；
其中，培养温度为20℃，光照强度2500Lux，光照周期为每天12h光照处理，12h黑暗处理；
(2)采用静电纺丝方法，制备壳聚糖纳米纤维膜；
其中，静电纺丝的工艺参数为：温度22℃，湿度46％，纺丝速度0.9mL/h，电压20kV，接收距离20cm；
得到的壳聚糖纳米纤维膜的孔隙率为87％，孔道曲折度为0.9，孔径为1.6μm；
(3)将壳聚糖纳米纤维膜浸泡到处于指数生长期的莱茵衣藻培养液中进行处理5天，使藻类细胞充分附着在壳聚糖纳米纤维膜上；
(4)将α-淀粉酶加入浓度为20wt％的聚乙烯醇水溶液中，得到均匀的混合溶液，混合溶液中α-淀粉酶的浓度为10mg/mL，之后将混合溶液浇筑到材质为聚二甲基硅氧烷的微针模板上，使微针尖端空腔覆盖完全，在真空环境下保持10min使混合溶液充分填充微针空腔；
(5)将步骤(3)浸泡处理后的壳聚糖纳米纤维膜置于步骤(4)的微针模板上并在室温下干燥14h，待微针完全干燥后从微针模板中分离得到释氧型纳米纤维复合贴片。
制得的释氧型纳米纤维复合贴片包括微针阵列和释氧型纳米纤维膜，微针的针体与释氧型纳米纤维膜连接；微针针体呈圆锥形，高为600μm，底部直径为300μm；微针阵列为10×10方形阵列，微针阵列中相邻微针针尖间距为700μm；微针阵列为水溶性的，微针阵列中负载有α-淀粉酶；释氧型纳米纤维膜由壳聚糖纳米纤维膜和粘附在壳聚糖纳米纤维膜上的莱茵衣藻组成，且莱茵衣藻负载量为5.3×106细胞/cm2。
将释氧型纳米纤维复合贴片应用于消除伤口处形成的生物膜，当纳米纤维复合贴片使用后通过波长为650nm激光照射，释氧型纳米纤维复合贴片对于伤口处生物膜的清除率为98％。
实施例2
一种释氧型纳米纤维复合贴片的制备方法，包括如下步骤：
(1)将普通小球藻接种到BG11培养基中，在光照培养箱中培养得到处于指数生长期的普通小球藻培养液；
其中，培养温度为24℃，光照强度1000Lux，光照周期为每天13h光照处理，11h黑暗处理；
(2)采用静电纺丝方法，制备聚乳酸纳米纤维膜；
其中，静电纺丝的工艺参数为：温度26℃，湿度42％，纺丝速度1.5mL/h，电压15kV，接收距离19cm；
得到的聚乳酸纳米纤维膜的孔隙率为85％，孔道曲折度为0.7，孔径为1.3μm；
(3)将聚乳酸纳米纤维膜浸泡到处于指数生长期的普通小球藻培养液中进行处理10天，使藻类细胞充分附着在聚乳酸纳米纤维膜上；
(4)将蛋白酶K加入浓度为10wt％的透明质酸水溶液中，得到均匀的混合溶液，混合溶液中蛋白酶K的浓度为8mg/mL，之后将混合溶液浇筑到材质为聚二甲基硅氧烷的微针模板上，使微针尖端空腔覆盖完全，在真空环境下保持20min使混合溶液充分填充微针空腔；
(5)将步骤(3)浸泡处理后的聚乳酸纳米纤维膜置于步骤(4)的微针模板上并在室温下干燥10h，待微针完全干燥后从微针模板中分离得到释氧型纳米纤维复合贴片。
制得的释氧型纳米纤维复合贴片包括微针阵列和释氧型纳米纤维膜，微针的针体与释氧型纳米纤维膜连接；微针针体呈圆锥形，高为900μm，底部直径为400μm；微针阵列为10×10方形阵列，微针阵列中相邻微针针尖间距为500μm；微针阵列为水溶性的，微针阵列中负载有蛋白酶K；释氧型纳米纤维膜由聚乳酸纳米纤维膜和粘附在聚乳酸纳米纤维膜上的普通小球藻组成，且普通小球藻负载量为5.9×106细胞/cm2。
将释氧型纳米纤维复合贴片应用于消除伤口处形成的生物膜，当纳米纤维复合贴片使用后通过波长为650nm激光照射，释氧型纳米纤维复合贴片对于伤口处生物膜的清除率为95％。
实施例3
一种释氧型纳米纤维复合贴片的制备方法，包括如下步骤：
(1)将螺旋藻接种到SP培养基中，在光照培养箱中培养得到处于指数生长期的螺旋藻培养液；
其中，培养温度为37℃，光照强度4000Lux，光照周期为每天14h光照处理，10h黑暗处理；
(2)采用静电纺丝方法，制备明胶纳米纤维膜；
其中，静电纺丝的工艺参数为：温度25℃，湿度44％，纺丝速度1.2mL/h，电压18kV，接收距离18cm；
得到的明胶纳米纤维膜的孔隙率为90％，孔道曲折度为1，孔径为1.8μm；
(3)将明胶纳米纤维膜浸泡到处于指数生长期的螺旋藻培养液中进行处理3天，使藻类细胞充分附着在纳米纤维膜上；
(4)将胰蛋白酶加入浓度为30wt％的甲基丙烯酸酐化明胶水溶液中，得到均匀的混合溶液，混合溶液中胰蛋白酶的浓度为15mg/mL，之后将混合溶液浇筑到材质为聚二甲基硅氧烷的微针模板上，使微针尖端空腔覆盖完全，在真空环境下保持15min使混合溶液充分填充微针空腔；
(5)将步骤(3)浸泡处理后的明胶纳米纤维膜置于步骤(4)的微针模板上并在室温下干燥12h，待微针完全干燥后从微针模板中分离得到释氧型纳米纤维复合贴片。
制得的释氧型纳米纤维复合贴片包括微针阵列和释氧型纳米纤维膜，微针的针体与释氧型纳米纤维膜连接；微针针体呈圆锥形，高为750μm，底部直径为200μm；微针阵列为10×10方形阵列，微针阵列中相邻微针针尖间距为600μm；微针阵列为水溶性的，微针阵列中负载有胰蛋白酶；释氧型纳米纤维膜由明胶纳米纤维膜和粘附在明胶纳米纤维膜上的螺旋藻组成，且螺旋藻负载量为5.7×106细胞/cm2。
将释氧型纳米纤维复合贴片应用于消除伤口处形成的生物膜，当纳米纤维复合贴片使用后通过波长为650nm激光照射，释氧型纳米纤维复合贴片对于伤口处生物膜的清除率为96％。
实施例4
一种释氧型纳米纤维复合贴片的制备方法，包括如下步骤：
(1)将莱茵衣藻接种到SE培养基中，在光照培养箱中培养得到处于指数生长期的莱茵衣藻培养液；
其中，培养温度为25℃，光照强度2000Lux，光照周期为每天12h光照处理，12h黑暗处理；
(2)采用静电纺丝方法，制备聚己内酯纳米纤维膜；
其中，静电纺丝的工艺参数为：温度23℃，湿度44％，纺丝速度1mL/h，电压16kV，接收距离17cm；
得到的聚己内酯纳米纤维膜的孔隙率为84％，孔道曲折度为1.2，孔径为1μm；
(3)将聚己内酯纳米纤维膜浸泡到处于指数生长期的莱茵衣藻培养液中进行处理8天，使藻类细胞充分附着在聚己内酯纳米纤维膜上；
(4)将α-胰凝乳蛋白酶加入浓度为15wt％的聚乙烯吡咯烷酮水溶液中，得到均匀的混合溶液，混合溶液中α-胰凝乳蛋白酶的浓度为5mg/mL，之后将混合溶液浇筑到材质为聚二甲基硅氧烷的微针模板上，使微针尖端空腔覆盖完全，在真空环境下保持18min使混合溶液充分填充微针空腔；
(5)将步骤(3)浸泡处理后的聚己内酯纳米纤维膜置于步骤(4)的微针模板上并在室温下干燥13h，待微针完全干燥后从微针模板中分离得到释氧型纳米纤维复合贴片。
制得的释氧型纳米纤维复合贴片包括微针阵列和释氧型纳米纤维膜，微针的针体与释氧型纳米纤维膜连接；微针针体呈圆锥形，高为700μm，底部直径为250μm；微针阵列为10×10方形阵列，微针阵列中相邻微针针尖间距为550μm；微针阵列为水溶性的，微针阵列中负载有α-胰凝乳蛋白酶；释氧型纳米纤维膜由聚己内酯纳米纤维膜和粘附在聚己内酯纳米纤维膜上的莱茵衣藻组成，且普莱茵衣藻负载量为5.5×106细胞/cm2。
将释氧型纳米纤维复合贴片应用于消除伤口处形成的生物膜，当纳米纤维复合贴片使用后通过波长为650nm激光照射，释氧型纳米纤维复合贴片对于伤口处生物膜的清除率为95％。
实施例5
一种释氧型纳米纤维复合贴片的制备方法，包括如下步骤：
(1)将雨生红球藻接种到BG11培养基中，在光照培养箱中培养得到处于指数生长期的小球藻培养液；
其中，培养温度为25℃，光照强度3000Lux，光照周期为每天13h光照处理，11h黑暗处理；
(2)采用静电纺丝方法，制备丝素蛋白纳米纤维膜；
其中，静电纺丝的工艺参数为：温度24℃，湿度46％，纺丝速度1.1mL/h，电压17kV，接收距离16cm；
得到的丝素蛋白纳米纤维膜的孔隙率为88％，孔道曲折度为0.8，孔径为1.2μm；
(3)将丝素蛋白纳米纤维膜浸泡到处于指数生长期的雨生红球藻培养液中进行处理4天，使藻类细胞充分附着在丝素蛋白纳米纤维膜上；
(4)将质量比为1:1的蛋白酶K和胰蛋白酶混合物加入浓度为25wt％的质量比为1:1的聚乙烯醇和透明质酸的混合物水溶液中，得到均匀的混合溶液，混合溶液中质量比为1:1的蛋白酶K和胰蛋白酶混合物的浓度为12mg/mL，之后将混合溶液浇筑到材质为聚二甲基硅氧烷的微针模板上，使微针尖端空腔覆盖完全，在真空环境下保持12min使混合溶液充分填充微针空腔；
(5)将步骤(3)浸泡处理后的丝素蛋白纳米纤维膜置于步骤(4)的微针模板上并在室温下干燥11h，待微针完全干燥后从微针模板中分离得到释氧型纳米纤维复合贴片。
制得的释氧型纳米纤维复合贴片包括微针阵列和释氧型纳米纤维膜，微针的针体与释氧型纳米纤维膜连接；微针针体呈圆锥形，高为750μm，底部直径为350μm；微针阵列为10×10方形阵列，微针阵列中相邻微针针尖间距为650μm；微针阵列为水溶性的，微针阵列中负载有质量比为1:1的蛋白酶K和胰蛋白酶混合物；释氧型纳米纤维膜由丝素蛋白纳米纤维膜和粘附在丝素蛋白纳米纤维膜上的雨生红球藻组成，且雨生红球藻负载量为6×106细胞/cm2。
将释氧型纳米纤维复合贴片应用于消除伤口处形成的生物膜，当纳米纤维复合贴片使用后通过波长为650nm激光照射，释氧型纳米纤维复合贴片对于伤口处生物膜的清除率为97％。
实施例6
一种释氧型纳米纤维复合贴片的制备方法，包括如下步骤：
(1)将螺旋藻接种到SP培养基中，在光照培养箱中培养得到处于指数生长期的螺旋藻培养液；
其中，培养温度为35℃，光照强度3500Lux，光照周期为每天14h光照处理，10h黑暗处理；
(2)采用静电纺丝方法，制备聚β-羟基丁酸酯纳米纤维膜；
其中，静电纺丝的工艺参数为：温度24℃，湿度42％，纺丝速度1.5mL/h，电压19kV，接收距离15cm；
得到的β-羟基丁酸酯纳米纤维膜的孔隙率为86％，孔道曲折度为0.9，孔径为1.5μm；
(3)将纳米纤维膜浸泡到处于指数生长期的螺旋藻培养液中进行处理7天，使藻类细胞充分附着在纳米纤维膜上；
(4)将α-淀粉酶加入浓度为28wt％的聚乙烯醇水溶液中，得到均匀的混合溶液，混合溶液中α-淀粉酶的浓度为10mg/mL，之后将混合溶液浇筑到材质为聚二甲基硅氧烷的微针模板上，使微针尖端空腔覆盖完全，在真空环境下保持20min使混合溶液充分填充微针空腔；
(5)将步骤(3)浸泡处理后的β-羟基丁酸酯纳米纤维膜置于步骤(4)的微针模板上并在室温下干燥12h，待微针完全干燥后从微针模板中分离得到释氧型纳米纤维复合贴片。
制得的释氧型纳米纤维复合贴片包括微针阵列和释氧型纳米纤维膜，微针的针体与释氧型纳米纤维膜连接；微针针体呈圆锥形，高为800μm，底部直径为380μm；微针阵列为10×10方形阵列，微针阵列中相邻微针针尖间距为680μm；微针阵列为水溶性的，微针阵列中负载有α-淀粉酶；释氧型纳米纤维膜由β-羟基丁酸酯纳米纤维膜和粘附在β-羟基丁酸酯纳米纤维膜上的螺旋藻组成，且螺旋藻负载量为5.8×106细胞/cm2。
将释氧型纳米纤维复合贴片应用于消除伤口处形成的生物膜，当纳米纤维复合贴片使用后通过波长为650nm激光照射，释氧型纳米纤维复合贴片对于伤口处生物膜的清除率为95％。
实施例7
一种释氧型纳米纤维复合贴片的制备方法，包括如下步骤：
(1)将莱茵衣藻接种到TAP培养基中，在光照培养箱中培养得到处于指数生长期的莱茵衣藻培养液；
其中，培养温度为23℃，光照强度2500Lux，光照周期为每天14h光照处理，10h黑暗处理；
(2)采用静电纺丝方法，制备明胶纳米纤维膜；
其中，静电纺丝的工艺参数为：温度24℃，湿度42％，纺丝速度1.4mL/h，电压16kV，接收距离18cm；
得到的明胶纳米纤维膜的孔隙率为85％，孔道曲折度为0.6，孔径为1.4μm；
(3)将纳米纤维膜浸泡到处于指数生长期的莱茵衣藻培养液中进行处理6天，使藻类细胞充分附着在纳米纤维膜上；
(4)将蛋白酶K加入浓度为22wt％的透明质酸水溶液中，得到均匀的混合溶液，混合溶液中蛋白酶K的浓度为6mg/mL，之后将混合溶液浇筑到材质为聚二甲基硅氧烷的微针模板上，使微针尖端空腔覆盖完全，在真空环境下保持15min使混合溶液充分填充微针空腔；
(5)将步骤(3)浸泡处理后的明胶纳米纤维膜置于步骤(4)的微针模板上并在室温下干燥13h，待微针完全干燥后从微针模板中分离得到释氧型纳米纤维复合贴片。
制得的释氧型纳米纤维复合贴片包括微针阵列和释氧型纳米纤维膜，微针的针体与释氧型纳米纤维膜连接；微针针体呈圆锥形，高为850μm，底部直径为220μm；微针阵列为10×10方形阵列，微针阵列中相邻微针针尖间距为600μm；微针阵列为水溶性的，微针阵列中负载有蛋白酶K；释氧型纳米纤维膜由明胶纳米纤维膜和粘附在明胶纳米纤维膜上的莱茵衣藻组成，且莱茵衣藻负载量为5.4×106细胞/cm2。
将释氧型纳米纤维复合贴片应用于消除伤口处形成的生物膜，当纳米纤维复合贴片使用后通过波长为650nm激光照射，释氧型纳米纤维复合贴片对于伤口处生物膜的清除率为95％。
实施例8
一种释氧型纳米纤维复合贴片的制备方法，包括如下步骤：
(1)将椭圆小球藻接种到BG11培养基中，在光照培养箱中培养得到处于指数生长期的椭圆小球藻培养液；
其中，培养温度为23℃，光照强度1500Lux，光照周期为每天12h光照处理，12h黑暗处理；
(2)采用静电纺丝方法，制备聚己内酯纳米纤维膜；
其中，静电纺丝的工艺参数为：温度24℃，湿度46％，纺丝速度1.3mL/h，电压18kV，接收距离16cm；
得到的聚己内酯纳米纤维膜的孔隙率为89％，孔道曲折度为0.8，孔径为1.7μm；
(3)将聚己内酯纳米纤维膜浸泡到处于指数生长期的椭圆小球藻培养液中进行处理9天，使藻类细胞充分附着在纳米纤维膜上；
(4)将胰蛋白酶加入浓度为18wt％的甲基丙烯酸酐化明胶水溶液中，得到均匀的混合溶液，混合溶液中胰蛋白酶的浓度为13mg/mL，之后将混合溶液浇筑到材质为聚二甲基硅氧烷的微针模板上，使微针尖端空腔覆盖完全，在真空环境下保持18min使混合溶液充分填充微针空腔；
(5)将步骤(3)浸泡处理后的聚己内酯纳米纤维膜置于步骤(4)的微针模板上并在室温下干燥14h，待微针完全干燥后从微针模板中分离得到释氧型纳米纤维复合贴片。
制得的释氧型纳米纤维复合贴片包括微针阵列和释氧型纳米纤维膜，微针的针体与释氧型纳米纤维膜连接；微针针体呈圆锥形，高为650μm，底部直径为280μm；微针阵列为10×10方形阵列，微针阵列中相邻微针针尖间距为700μm；微针阵列为水溶性的，微针阵列中负载有胰蛋白酶；释氧型纳米纤维膜由聚己内酯纳米纤维膜和粘附在聚己内酯纳米纤维膜上的椭圆小球藻组成，且椭圆小球藻负载量为5.9×106细胞/cm2。
将释氧型纳米纤维复合贴片应用于消除伤口处形成的生物膜，当纳米纤维复合贴片使用后通过波长为650nm激光照射，释氧型纳米纤维复合贴片对于伤口处生物膜的清除率为96％。
Claims (10)
1.一种释氧型纳米纤维复合贴片，其特征在于：包括微针阵列和释氧型纳米纤维膜，微针的针体与释氧型纳米纤维膜连接；
微针阵列为水溶性的，微针阵列中负载有EPS破坏剂；
释氧型纳米纤维膜由纳米纤维膜和粘附在纳米纤维膜上的微藻组成，且微藻负载量＞5×106细胞/cm2；
纳米纤维膜的孔隙率为70％～90％，孔道曲折度小于1.5，孔径为0.8～2μm。
2.根据权利要求1所述的一种释氧型纳米纤维复合贴片，其特征在于，微针针体呈圆锥形，高为600～900μm，底部直径为200～400μm。
3.根据权利要求2所述的一种释氧型纳米纤维复合贴片，其特征在于，微针阵列为10×10方形阵列，微针阵列中相邻微针针尖间距为500～700μm。
4.根据权利要求1所述的一种释氧型纳米纤维复合贴片，其特征在于，微藻为莱茵衣藻、蛋白核小球藻、普通小球藻、椭圆小球藻、雨生红球藻、杜氏盐藻、聚球藻、小球衣藻、裸藻或螺旋藻；
EPS破坏剂为α-淀粉酶、蛋白酶K、胰蛋白酶、α-胰凝乳蛋白酶、脱氧核糖核酸酶、分散素B、抗菌肽Hepcidin-20和柠檬酸两性离子表面活性剂的一种以上。
5.如权利要求1～4任一项所述的一种释氧型纳米纤维复合贴片的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
(1)将微藻接种到培养基中，在光照培养箱中培养得到处于指数生长期的微藻培养液；
(2)采用静电纺丝方法制备纳米纤维膜；
(3)将纳米纤维膜浸泡到处于指数生长期的微藻培养液中进行处理3～10天；
(4)将EPS破坏剂加入生物相容性高分子水溶液中，得到均匀的混合溶液，之后将混合溶液浇筑到微针模板上，使微针尖端空腔覆盖完全，在真空环境下保持10～20min使混合溶液充分填充微针空腔；
(5)将步骤(3)浸泡处理后的纳米纤维膜置于步骤(4)的微针模板上并在室温下干燥10～14h，待微针完全干燥后从微针模板中分离得到释氧型纳米纤维复合贴片。
6.根据权利要求5所述的一种释氧型纳米纤维复合贴片的制备方法，其特征在于，步骤(1)中培养基为BG11培养基、TAP培养基、SE培养基、F/2培养基、HUT培养基或SP培养基，培养温度为20～37℃，光照强度1000～4000Lux，光照周期为每天12～14h光照处理，10～12h黑暗处理。
7.根据权利要求5所述的一种释氧型纳米纤维复合贴片的制备方法，其特征在于，步骤(2)中纳米纤维膜的材质为壳聚糖、聚乳酸、明胶、聚己内酯、丝素蛋白、聚丁二酸丁二醇酯、聚氨酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物或聚β-羟基丁酸酯，静电纺丝的工艺参数为：温度24±2℃，湿度44±2％，纺丝速度0.9～1.5mL/h，电压15～20kV，接收距离15～20cm。
8.根据权利要求5所述的一种释氧型纳米纤维复合贴片的制备方法，其特征在于，步骤(4)中微针模板的材质为聚二甲基硅氧烷，生物相容性高分子为聚乙烯醇、透明质酸、甲基丙烯酸酐化明胶、海藻酸钠、聚环氧乙烷、聚乙二醇、聚丙烯酸、羧甲基纤维素钠、硫酸软骨素、羟丙甲纤维素和聚乙烯吡咯烷酮的一种以上，生物相容性高分子水溶液的浓度为10～30wt％，混合溶液中EPS破坏剂的浓度为5～15mg/mL。
9.如权利要求1～4任一项所述的一种释氧型纳米纤维复合贴片在消除伤口处形成的生物膜中的应用。
10.根据权利要求9所述的一种释氧型纳米纤维复合贴片在消除伤口处形成的生物膜中的应用，其特征在于，所述释氧型纳米纤维复合贴片与光动力疗法联合使用；
所述释氧型纳米纤维复合贴片对于伤口处生物膜的清除率为95％以上。
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| CN116459385A (zh) * | 2023-03-27 | 2023-07-21 | 天津大学 | 一种基于微藻的活体水凝胶及其制备方法和应用 |
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