CN115667925A

CN115667925A - 使用细胞外囊泡来检测补体激活的方法以及其用于评估和/或监测补体介导的疾病的治疗的用途

Info

Publication number: CN115667925A
Application number: CN202180035980.7A
Authority: CN
Inventors: 艾伦·E·米尔曼; 托宾·J·科梅特
Original assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Alexion Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2020-05-15
Filing date: 2021-05-13
Publication date: 2023-01-31
Also published as: JP2023525581A; WO2021231720A1; US20230349887A1; EP4150338A1

Abstract

本文披露了检测生物样品中补体活性的方法。本披露还涉及用于诊断或预后评估受试者中补体介导的疾病的方法和用于监测受试者对用补体调节剂治疗补体介导的疾病的反应的方法。

Description

使用细胞外囊泡来检测补体激活的方法以及其用于评估和/ 或监测补体介导的疾病的治疗的用途

相关申请的交叉引用

本申请要求2020年5月15日提交的美国临时申请号63/025,557的优先权和权益，其全部内容通过引用并入本文。

技术领域

本披露涉及检测生物样品中补体激活的方法。本披露还涉及用于在受试者中诊断或预后评估补体介导的疾病的方法，以及用于在用补体调节剂治疗补体介导的疾病期间和之后监测反应的方法。

背景技术

补体系统是先天免疫系统的一部分，并与身体的其他免疫系统共同作用，以抵御细胞和病毒病原体的入侵。补体途径中至少有25种蛋白质，它们是循环血浆蛋白和细胞膜辅助因子的复杂集合。血浆蛋白占脊椎动物血清中球蛋白的约10％。补体蛋白作为无活性的前体在血液中循环，当受到几种触发因素之一的刺激时，系统中的蛋白酶会切割特定的蛋白以释放细胞因子并引发进一步的切割的放大级联。

补体组分通过激活一系列复杂的细胞表面和液相相互作用来实现其免疫防御功能，这些相互作用涉及精确的酶促切割和质膜结合事件。由此引起的补体级联使得具有调理、免疫调节和溶解功能的产物产生。

补体级联通过经典途径、替代途径或凝集素途径进行。这些途径共享许多组分，虽然它们的初始步骤不同，但它们会聚并共享相同的“末端补体”组分(C5到C9)，这些组分负责激活和破坏靶细胞。

经典途径(CP)通常由抗体识别并结合靶细胞上的抗原位点启动。替代途径(AP)不依赖于抗体，并且能够被病原体表面上的某些分子自动激活。此外，凝集素途径通常以甘露糖结合型凝集素(MBL)与高甘露糖底物的结合启动。这些途径在补体组分C3被活性蛋白酶切割以产生C3a和C3b的点处会聚。激活补体攻击的其他途径可以在导致补体功能各个方面的事件序列中稍后起作用。

补体系统在人体内对抵抗疾病起着至关重要的作用，补体系统中组分的测量可用于疾病的诊断和/或预后，以及监测对补体介导的疾病治疗的反应。

组织活检为大多数疾病诊断提供了明确的临床证据，并且可以是确认补体在疾病发病机制中的作用的直接方法。然而，活检既痛苦又昂贵，并且存在与手术相关的风险。很少进行重复组织活检。因此，不可能通过多个局部组织活检监测对治疗的纵向反应。

细胞外囊泡(EV)是由细胞产生的小的膜结合的包膜颗粒(30-100nm)。它们从亲本细胞的质膜(PM)中释放出来，并含有功能性膜和胞质蛋白、脂质和RNA。EV的其他术语包括：微囊泡、核外颗粒体、脱落的囊泡、微粒和外泌体。EV外膜包含特异于亲本细胞的EV特异性蛋白标志物和PM标志物。EV膜蛋白的取向与亲本PM中的相同。细胞外囊泡携带典型的EV标志物，例如CD9、CD63或CD81，它们是四次穿膜蛋白超家族的成员。四次穿膜蛋白是EV中最丰富的膜蛋白之一。一些EV的表面还带有补体调节剂，例如CD55和CD59。健康的尿液含有约10⁹尿液EV/mL(uEV/mL)，它们主要来自肾脏、泌尿道上皮和(在男性中)生殖道。处于应激下的细胞会增加EV产量。

补体诊断和治疗领域中当前未满足的需求是用于测量末端补体复合物的局部组织沉积的敏感性、特异性和非侵入性临床测试。允许在治疗期间频繁纵向监测细胞表面补体活性的非侵入性测试将提供有关疗法在特定器官局部水平的药效作用的新信息，这代表了对当前仅限于液相补体活性测量的方法的重大进步。

发明内容

本文提供了使用细胞外囊泡作为非侵入性、敏感性和特异性测试来诊断和/或监测患有各种补体介导的疾病的患者中的治疗反应的方法。在一个方面，EV可被视为从包括尿液在内的生物体液分离的液体活检来源。本披露部分地基于EV中补体沉积的发现，该发现可用于许多应用，例如，患者样品的离体分析作为监测体内补体活性的替代；监测调节补体途径的药物功效的方法；随着时间的推移监测患者的方法；以及用于筛选调节全身和/或局部组织表面补体活性的测试化合物的方法。

本测定利用基于珠的免疫捕获方案和免疫荧光检测来在治疗期间在器官特异性组织和调节水平定量补体活性和失调。基于使用尿液样品的示例性概念验证，本发明的方法可广泛应用于使用蛋白和组织特异性检测试剂(包括抗体标记的珠和荧光团)监测任何液体基质中受到补体攻击的任何器官或组织。这种测定的原理和在尿液中进行的概念验证可能会扩展到血液和CSF，用于分析来自其他组织/器官的脱落EV，包括来自末端补体复合物沉积损害的组织的EV。

在一个方面，本披露提供了一种易于使用的方法来分离和富集EV，以及在治疗干预之前、期间和之后对EV表面上的补体进行半定量监测。本方法可以很容易地多路复用和适应多种测定形式和/或与各种分析技术组合，例如纳米颗粒跟踪分析(NTA)、质谱(MS)或超分辨率显微镜。

本披露涉及以下非限制性方面：

本发明提供了一种检测来自受试者的生物样品中的补体活性的方法，该方法包括：

(a)用至少一种第一捕获抗体或其抗原结合片段分离包含细胞外囊泡(EV)或其膜结合部分的该生物样品的一部分以捕获该EV或其膜结合部分上的至少一种第一标志物，其中该第一标志物包含EV特异性标志物或展示在该EV上的组织特异性标志物，

(b)任选地使该样品的一部分与至少一种第二捕获抗体或其抗原结合片段接触以捕获该EV或其膜结合部分上的至少一种第二标志物；并且

(c)用对捕获的EV或其膜结合部分上的补体系统相关组分特异性的至少一种检测抗体或其抗原结合片段定性或定量地检测该补体系统相关组分的存在或水平，从而检测该生物样品中的补体激活。

该第一和/或第二标志物，如果是跨膜的(例如膜攻击复合物或MAC)，则可以独立地位于EV的膜上，或者如果是可溶的(例如C5)则可以位于EV的内部；因此，“在...上”也包括“在...中”或“在...内部”。

在实施例中，第一捕获标志物包含EV特异性标志物并且任选的第二捕获标志物包含展示在EV或其膜结合部分上的组织特异性标志物。在实施例中，检测到第一捕获标志物和第二捕获标志物两者存在，第一捕获标志物包含EV特异性标志物并且第二捕获标志物包含组织特异性标志物。

在实施例中，生物样品中的细胞外囊泡来自液体活检，例如尿液。从液体活检方案获得生物样品。

在实施例中，生物样品来自组织、器官或体液。在实施例中，生物样品包含来自膀胱细胞、肾细胞、全血、红细胞、血小板、血清、血浆、除了血清或血浆之外的血液级分、淋巴、脑脊液(CSF)、唾液、眼泪、阴道排液、精液、腺体分泌物、渗出液、囊肿或粪便内容物、灌洗液或腹水的EV或其膜结合部分。在实施例中，生物样品包含来自以下的EV或其膜结合部分：肾小球足细胞、肾曲小管或膀胱上皮；或红细胞(RBC)。在一个方面，生物样品是尿液样品。在一个方面，生物样品是红细胞(RBC)样品。

在实施例中，第一捕获抗体或其抗原结合片段缀合至第一固体支持物，任选地第二捕获抗体或其抗原结合片段缀合至第二固体支持物，并且检测抗体缀合至可检测标志物。在实施例中，本文所披露的方法包括使生物样品的一部分与第一捕获抗体或其抗原结合片段和第二捕获抗体或其抗原结合片段接触，其中该第一捕获抗体或其抗原结合片段和该第二捕获抗体或其抗原结合片段缀合至相同支持物或不同支持物。

在实施例中，可检测标志物选自由以下组成的组：荧光团、色原和生物素。在实施例中，可检测标志物是具有约500nm至约900nm、约600nm至约1000nm、或约500nm至约1000nm的最大吸收和约550nm至约900nm、约600nm至约1000nm、或约550nm至约1100nm的最大发射的荧光团。在实施例中，可检测标志物是与链霉亲和素缀合或不缀合的藻红蛋白(PE)。在实施例中，可检测标志物是与链霉亲和素-藻红蛋白(SAPE)一起使用的生物素。

在实施例中，第一和第二固体支持物独立地选自由以下组成的组：纳米颗粒、微粒、珠、磁珠、纳米结构、组织培养板、二氧化硅和纳米基质(nanomatrices)。

在实施例中，第一标志物选自由细胞外囊泡相关蛋白组成的组；任选地接触的第二标志物选自由组织特异性细胞外囊泡相关蛋白组成的组；并且补体系统相关组分选自由以下组成的组：(a)替代补体途径(AP)的组分，(b)经典补体途径(CP)的组分，和(c)凝集素补体途径(MBL)的组分。在优选的实施例中，补体系统相关组分选自由以下组成的组：(a)替代途径(AP)的组分，和(b)经典途径(CP)的组分。

在实施例中，补体系统相关组分是选自由以下组成的组的蛋白：C1q、C1r、C1s、C2、C2a、C2b、C3、C3a、C3b、iC3b、C4、C4a、C4b、C5、C5a、C5b、C6、C7、C8、C9、C5b-9(膜攻击复合物，MAC)、TF、CRP、pCRP、CD59、CD55、CR1、CR2、CR3、C5aR1、备解素、因子H、因子H相关蛋白和I因子。参见图11(图片改编自Karasu,E.,等人Frontiers in Immunology[免疫学前沿]9(721),2018)。

在实施例中，第一标志物选自由以下组成的组：ALIX、TSG101、CD9、CD63、CD81、CD40L、CD26、CD31、CD45、CD2、CD11a、CD24、CD55、CD59、CF106、CD56、CD51、CD82、整联蛋白、四次穿膜蛋白、膜联蛋白、HSP90、HSP70、同线蛋白(Syntenin)-1、ADAM10、EHD4、肌动蛋白、Rab5、网格蛋白、筏蛋白-1、MHC I、MHC II、辅肌动蛋白-4、GP96、EHD4、Mitofilin、和LAMP2；第二标志物选自由以下组成的组：足萼糖蛋白(PODXL)、水通道蛋白2(AQP 2)、尿溶蛋白1b(UPK1b)、足蛋白(NPHS2)、血型糖蛋白A(GYPA)、粘蛋白-1、2型Na-K-2Cl共转运蛋白(NKCC2)、水通道蛋白1(AQP 1)、α-谷胱甘肽-S-转移酶(α-GST)、钙结合蛋白-D28K(CalD)、巨蛋白、cubilin、肾病蛋白(Nphs1)、密封蛋白-1、膜联蛋白-V、突触足蛋白抗体(synaptopodin)(Synpo)、维尔姆斯肿瘤蛋白(Wt1)、带3、stomatin(STOM)、BGP1、珠蛋白、血型糖蛋白B、Rh多肽、和Rh糖蛋白；并且补体蛋白选自由以下组成的组：C3、C5b-9、C4、C1q和C9。

在实施例中，生物样品包含来自肾系统的EV，并且第二标志物是选自下组的肾特异性EV标志物，该组由以下组成：足萼糖蛋白(PODXL)、水通道蛋白2(AQP 2)、尿溶蛋白1b(UPK1b)和足蛋白(NPHS2)。

在实施例中，样品包含来自红细胞(RBC)的EV，并且第二标志物是选自血型糖蛋白A(GYPA)的RBC特异性EV标志物。

在实施例中，样品包含对作为第一标志物的CD81呈阴性、对作为第二标志物的尿溶蛋白1B(UPK1B)呈阴性、或对作为第一标志物的CD81和作为第二标志物的UPK1B两者都呈阴性的EV。

在实施例中，捕获和检测标志物存在于相同的EV或其膜结合部分中。

在实施例中，该方法进一步包括确定受试者是否患有补体介导的疾病或有患补体介导的疾病的风险，包括将EV或其膜结合部分上补体途径组分的存在或水平与对照进行比较。在实施例中，对照包括来自健康受试者的相同样品。在实施例中，该方法表明受试者患有补体介导的疾病或有患补体介导的疾病的风险，条件是：与对照相比，从受试者获得的EV或其膜结合部分上的补体途径组分的水平或存在是增强的，即从受试者获得的水平高于来自对照组受试者(未诊断出患有补体介导的疾病)的样品。

本发明进一步提供了用于受试者中补体介导的疾病的诊断或预后评估的方法，该方法包括：

(a)从该受试者获得包含细胞外囊泡(EV)或其膜结合部分的样品，

(b)使该样品的一部分与至少一种第一捕获抗体或其抗原结合片段接触以捕获这些EV或其一个或多个膜结合部分上的至少一种第一标志物；

(c)任选地使该样品的一部分与至少一种第二捕获抗体或其抗原结合片段接触以捕获这些EV或其一个或多个膜结合部分上的至少一种第二标志物；

(d)将包含该至少一种第一标志物和任选地该至少一种第二标志物的捕获的EV或其膜结合部分与对补体系统相关组分特异性的至少一种检测抗体或其抗原结合片段接触；并且

(e)定性或定量地检测该检测抗体或其抗原结合片段，以测量该EV或其膜结合部分上补体途径组分的存在或水平，其中与对照相比，该受试者的样品中补体途径组分的存在或水平的升高表明该受试者患有补体介导的疾病或有患补体介导的疾病的风险。

本发明还提供了一种指示受试者是否患有补体介导的疾病或有患补体介导疾病的风险的方法，该方法包括上述步骤(a)-(e)。

在实施例中，第一标志物包含EV特异性标志物或展示在EV上的组织特异性标志物。在实施例中，第一标志物包含EV特异性标志物并且第二标志物包含展示在EV上的组织特异性标志物。

本发明还提供了一种用于监测受试者对用补体调节剂治疗补体介导的疾病的反应的方法，该方法包括：

(a)在治疗前后从该受试者获得包含细胞外囊泡(EV)或其膜结合部分的样品，

(e)定性或定量地检测该检测抗体或其抗原结合片段，以测量该EV或其膜结合部分上补体途径组分的存在或水平，其中与用该补体调节剂治疗前相比，用该补体调节剂治疗后该受试者的样品中补体途径组分的存在或水平的减弱表明该受试者对该补体调节剂有反应。

在一些实施例中，补体调节剂是表A中列出的分子。优选地，补体调节剂是调节(例如，增加或降低；优选地降低)补体组分活性的分子，该补体组分选自C1q、C1、C1s、C2、MASP-2、MASP-3、因子D、因子B、备解素(因子P)、因子H、C3/C5转化酶、C5、C5a/C5aR、C3a/C3aR、C6、和/或CD59。特别地，补体调节剂是补体组分的小分子抑制剂或靶向补体组分的siRNA/RNAi或特异性结合补体组分的抗体。

在实施例中，补体介质是补体5(C5)抑制剂、补体5a(C5a)抑制剂、补体5受体(C5R1)抑制剂、补体3(C3)抑制剂、因子D(FD)抑制剂、因子H(FH)抑制剂、因子B(FB)抑制剂、MASP2抑制剂、MASP3抑制剂、备解素抑制剂或其组合。

在实施例中，疾病是炎性疾病或血栓性疾病。在实施例中，疾病是血栓性血液病或血栓性肾病。在实施例中，疾病是选自由以下组成的组的肾病：非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、C3肾小球病(C3G)、致密物沉积病(DDD)、膜增生性肾小球肾炎(MPGN)、狼疮性肾炎(LN)、IgA肾病(IN)、狼疮性肾炎(LN)、膜性肾病(MN)、移植患者血液透析引起的并发症、抗体介导的排斥(AMR)和抗中性粒细胞胞浆抗体(ANCA)相关的血管炎(AAV)。在实施例中，疾病是选自由以下组成的组的血液疾病：阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)、非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)、实体器官移植或造血干细胞移植引起的继发性HUS、血栓性微血管病(TMA)和冷凝集素病(CAD)。在实施例中，疾病是选自视神经脊髓炎谱系障碍(NMOSD)、全身性重症肌无力(gMG)、肌萎缩侧索硬化症(ALS)和原发性进行性多发性硬化症(PPMS)的神经疾病。

在实施例中，检测包括免疫测定法(例如，ELISA或RIA)、电子显微镜(EM)、串联质谱标签(TMT)、发光测定法(例如，LUMINEX)或荧光免疫测定法(FIA)(也称为免疫荧光测定法(IF))。在实施例中，检测步骤以多路复用形式进行，即，其中通过测量一个样品中的几个离散组织中的标志物和/或在单次测定中监测多个潜在补体蛋白和途径来进行检测。

本发明还提供了一种检测受试者的肾组织中的补体激活的方法，该方法包括：

(a)将来自该受试者的尿液样品与第一捕获抗体或其抗原结合片段接触，该尿液样品包含细胞外囊泡(EV)或其膜结合部分，该细胞外囊泡(EV)或其膜结合部分包含第一标志物，该第一标志物是EV特异性标志物或展示在EV或其膜上的组织特异性标志物，该第一捕获抗体或其抗原结合片段对该第一标志物具有特异性，从而捕获含有该第一标志物的EV或膜；

(b)任选地使该尿液样品与第二捕获抗体或其抗原结合片段接触以捕获包含不同于该第一标志物的第二捕获标志物的EV或其一个或多个膜结合部分；并且

(c)用对捕获的EV或其膜结合部分上补体途径的组分特异的抗体或其抗原结合片段，定性或定量地检测该组分的存在或水平，从而检测该尿液样品中的补体激活；

其中EV特异性标志物选自由CD9、CD63和CD81组成的组，

组织特异性标志物选自由以下组成的组：

(1)对肾小球足细胞特异性的足萼糖蛋白(PODXL)；

(2)对曲小管上皮特异性的水通道蛋白2(AQP2)；

(3)对膀胱上皮特异性的尿溶蛋白1b(UPK1b)；以及

(4)对红细胞(RBC)特异性的血型糖蛋白A(GYPA)，以及

补体途径的组分选自由MAC、C3、C5b-9、C4、C1q、和C9组成的组。

在一些实施例中，本披露涉及筛选用于补体调节的测试化合物的方法，该方法包括：

(a)在向患有补体介导的疾病的受试者(例如，动物如小鼠、兔、仓鼠、绵羊、美洲驼、狗、猴、黑猩猩或人)施用该测试化合物之前和之后从该受试者获得含有细胞外囊泡(EV)或其膜结合部分的样品；

(d)将捕获的EV或其膜结合部分与对补体系统相关组分特异性的至少一种检测抗体或其抗原结合片段接触；并且

(e)定性或定量地检测该检测抗体或其抗原结合片段，以测量该EV或其膜结合部分上补体组分的存在或水平，其中与施用测试化合物之前相比，施用测试化合物之后该受试者的样品中补体组分的存在或水平的调节(例如，增加或减少；优选减少)表明该测试化合物能够调节补体。

在一些实施例中，测试化合物特异性地能够调节选自C1q、C1、C1s、C2、MASP-2、MASP-3、因子D、因子B、备解素(因子P)、因子H、C3/C5转化酶、C5、C5a/C5aR、C3a/C3aR、C6、和/或CD59的补体组分。在一些实施例中，测试化合物是单克隆抗体或小分子或siRNA/RNAi。在一些实施例中，将测试化合物的调节活性与具有补体调节活性的分子(例如，阳性对照或标准)的活性进行比较，例如表A中提供的分子。

本发明还提供了以下用途：至少一种第一捕获抗体以捕获至少一种第一靶标；至少一种第二捕获抗体以捕获至少一种第二靶标；和至少一种对补体蛋白特异性的检测抗体以检测捕获的至少一种第一靶标、捕获的至少一种第二靶标或两者的量。

还提供了包含一种或多种与本文所述的生物标志物结合的抗体的试剂盒。在本文所述的试剂盒的一些实施例中，试剂盒是免疫测定，例如，酶联免疫吸附试验。本文所述的任何试剂盒可用于执行本文所述的任何方法。在一些实施例中，试剂盒可以进一步包括用于执行本文所述的任何方法的说明书。作为非限制性实例，此类试剂盒还可包括以下中的一种或多种：用于制备样品的试剂、用于富集细胞外囊泡的试剂、用于检测样品中靶蛋白或组分与固定化抗体结合的试剂、包括纯化的靶蛋白/组分的对照样品和/或使用说明书。

例如，可用于本文所述方法中的试剂盒可包括一种或多种(例如，二、三、四、五、六、七、八、九、十、十一、十二、十三、十四、或十五种)特异性结合如本文所述的生物标志物的抗体或其片段。例如，试剂盒中提供的一种或多种抗体可以固定在表面上(例如，以ELISA测定或基因芯片阵列的形式)。

附图说明

本专利或申请文件包含至少一个彩色附图。本专利或专利申请公开的带有一个或多个彩色附图的副本将根据要求并且并支付必要的费用后由官方提供。

图1，分图(A)和(B)，显示了根据NTA在尿液ExoQuick富集中EV标志物的相对丰度。所有抗体来自博奇公司(Biolegend)：Ms-α-CD9＝PE：克隆HI9a；Ms-α-CD63＝PE：克隆H5C6；Ms-α-CD81＝PE：克隆5A6；通过颗粒Metrix GmbH在ZetaView PMX110上进行的分析。

图2显示了尿液EV(A)和非EV颗粒(B)的EM图像。

图3显示了EM图像对象中Feret直径的分布。

图4显示了根据PSM的前25种蛋白质的相对丰度。

图5显示了根据Luminex的尿液EV亚群的检测。CD9：克隆MM2/57(南方生物技术公司(Southern Biotech))；CD63：克隆H5C6(博奇公司)；CD81：克隆1D6(艾博抗公司(Abcam))；Ms IgG：克隆MG1-45(博奇公司)。

图6显示了仅在CD9+EV上检测到肾PODXL。(1)：Rb-α-PODXL：USB cat#212672-生物素；(2)：Rb-α-PODXL：LSBio cat#LS-C141161。

图7显示了Luminex珠可以鉴定肾小球特异性EV。Rb-α-PODXL(USB 212672)可以在含有CD9或CD40L的EV上检测到，但不能在含有CD63或CD81的EV上检测到。使用2种不同的α-PODXL抗体发现了信号。这只有在两种蛋白都位于同一结构上时才会发生。

图8显示肾单位特异性EV水平随疾病增加。IgAN尿液中的PODXL+EV比对照尿液中更多。在CD9+/PODXL+和CD40+/PODXL+EV群体中均可见增加。CD63+和CD81+EV仍为阴性。

图9，分图(A)和(B)显示了Luminex珠可以测量EV膜上的补体的图。C3c和C5b-9在LN患者尿液中的CD9+和PODXL+珠上均检测到，但在CD63+或CD81+珠上未检测到。这些结果已在10个LN、6个IgAN和7个对照样品中得到证实(数据未显示)。与对照样品相比，LN和IgAN样品都可以在PODXL+和AQP2+EV上具有但不限于C3、C5b-9、C4和C1q沉积。

图10，分图(A)、(B)和(C)显示了显示肾小球C5b-9沉积随着依库珠单抗(Ravulizumab)治疗而减少的图。aHUS患者可能有C3、C5b-9、C1q和C4(未显示)的任意组合沉积在足细胞膜上。在依库珠单抗治疗期间C3没有变化。在依库珠单抗治疗期间，EV上的C5b-9和C1q水平迅速降低。

图11显示了补体途径相关组分。

图12显示了来自使用基于珠荧光的测定方法分析富集EV的尿液样品的数据。

具体实施方式

定义

词语“约”是指该值的正负10％的范围，例如，“约5”是指4.5至5.5，除非本公开的上下文另有说明或与这种解释不一致。例如，在诸如“约49、约50、约55”之类的数值列表中，“约50”是指延伸到前一个和后一个数值之间的一个或多个间隔的一半以下的范围，例如，超过49.5到低于52.5。

在本披露中提供数值范围的情况下，意图是该范围的上限和下限之间的每个中间值以及该范围内的任何其他陈述或中间的值包含在本公开内容中。例如，如果规定了1mM到8mM的范围，则意在明确披露2mM、3mM、4mM、5mM、6mM和7mM。

如本文所用，术语“多个”可以是2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多。

如本文所用，术语“检测”是指通过测量样品中的一个或多个参数来确定与样品相关的一个值或一组值的过程，并且可以进一步包括将测试样品与参考样品进行比较。根据本披露，补体标志物的检测包括鉴定、测定、测量和/或定量一种或多种标志物。

术语“细胞外囊泡”是指存在于从受试者获得的样品(例如，生物流体)中的基于脂质的微粒或纳米颗粒，或富含蛋白的聚集体。细胞外囊泡在本领域和本文中也称为外泌体、微囊泡或纳米囊泡。在本披露中，细胞外囊泡的直径在约30nm至约1000nm之间。细胞外囊泡由多种不同的哺乳动物细胞类型分泌或脱落。本文描述了细胞外囊泡的非限制性实例和用于从哺乳动物受试者获得的样品(例如，生物流体)中富集细胞外囊泡的方法。细胞外囊泡的其他实例和用于从获自哺乳动物受试者的样品中富集细胞外囊泡的方法是本领域已知的。

术语“膜结合”是指包含生物膜的任何结构，即，细胞和细胞器的外部覆盖物，形成半透性屏障。该术语通常是指含有磷脂和蛋白的结构，其衍生自外细胞膜，或细胞器，如高尔基体、ER、细胞核或线粒体。

如本文所用，术语“一种或多种膜蛋白”是指与EV的生物膜相互作用或作为其一部分的蛋白。膜蛋白可以包括但不限于整合膜蛋白和外周膜蛋白。

如本文所用，术语“疾病特异性膜蛋白”是指与特定疾病相关的膜蛋白，例如补体介导的疾病，例如aHUS。疾病特异性膜蛋白可以单独编码疾病，可替代地一组疾病特异性膜蛋白可以编码疾病。

术语“样品”或“生物样品”是指从哺乳动物受试者获得的任何生物流体(例如，含有血液、血浆、血清或其他血液级分、淋巴、尿液、脑脊液、腹水、唾液、母乳、眼泪、阴道排液、羊水、灌洗液、精液、腺体分泌物、渗出液、囊肿和粪便内容物的组合物)。在优选的实施例中，样品包括血液、血清或血浆。

如本文所用，术语“抗体”是指对抗原例如补体蛋白具有高结合亲和力的抗体或其功能部分或片段。该术语以最广泛的意义使用，包括多克隆和单克隆抗体，包括完整抗体和功能性(抗原结合)抗体片段，包括片段抗原结合(Fab)片段、F(ab’)2片段、Fab'片段、Fv片段、重组IgG(rIgG)片段、单链抗体片段，包括单链可变片段(scFv)和单结构域抗体(例如，sdAb、sdFv、纳米抗体)片段。该术语涵盖任何类别或亚类的天然的、基因工程改造的和/或以其他方式修饰的抗体，包括IgG及其亚类、IgM、IgE、IgA和IgD。

术语“抗原”是指可特异性结合抗体或其抗原结合片段的任何分子，例如蛋白或其片段。

术语“抗原片段”是指可以被抗原特异性抗体识别的抗原部分。

“珠”是指已固定所期望捕获抗体的颗粒。在单个过滤基质中，珠的尺寸通常是均匀的，但在不同的过滤基质之间，其尺寸可以在约1nm至约10,000nm的范围内变化。优选的形状是球形；然而，可以使用任何其他形状的颗粒，因为该参数对本发明的性质无关紧要。

“条带”是指已固定所期望捕获珠或所期望捕获抗体的细长扁平元件。条带通常是大小均匀的薄膜，但大小和颜色可能因固定的捕获抗体的数量和类型而异。

术语“多路复用”是指跨单个样品检测多个标志物和/或跨多个样品检测至少一个标志物。

如本文所用，术语“多路复用珠阵列平台”是指利用可区分的颗粒或微粒的任何平台。这种可区分的颗粒可用于例如进行多路复用免疫测定或基于分子探针的测定。有代表性的实例包括

技术。

如本文所用，术语“分类染料”是指在多路复用测定中使用的微粒或珠的任何混合物或组合，其具有使仪器能够对颗粒进行分选和分类的分类染料混合物。

术语“报道分子”包括但不限于在测定中与检测分子结合的任何和所有荧光标签。在设计用于测量人抗体的免疫测定的情况下，检测分子可以是例如用藻红蛋白标记的山羊抗人IgG。

例如，在Merck Manual[默克手册]第16版中提供了与补体激活相关的生物活性的简明总结。

如本文所用，“受试者”可以是任何哺乳动物。受试者可以是例如人、非人灵长类动物(例如，猴、狒狒或黑猩猩)、马、牛、猪、绵羊、山羊、狗、猫、兔、豚鼠、沙鼠、仓鼠、大鼠或小鼠。包括例如，转基因动物或基因改变(例如，敲除或敲入)的动物。

如本文所用，“需要预防”、“需要治疗”或“有需要”的受试者是指根据适当的医务工作者(例如，就人而言，是医生、护士或护理工作者；就非人哺乳动物而言，则是兽医)的判断将从给定的治疗(即用于治疗补体介导的疾病或障碍的特定治疗剂)中合理获益的人。

“补体组分”或“补体蛋白”是参与补体系统激活或参与一种或多种补体介导的活性的分子。经典补体途径的组分包括例如，C1q、C1r、C1s、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9和C5b-9复合物(也称为膜攻击复合物(MAC))和上述任何一个(例如，C3a、C3b、C4a、C4b、C5a等)的活性片段或酶切割产物。替代途径的组分包括，例如，因子B、因子D、因子H和因子I，以及备解素，其中因子H和I是该途径的负调节剂。凝集素途径的组分包括，例如，MBL2、MASP-1和MASP-2。补体组分还包括可溶性补体组分的细胞结合受体。这样的受体包括，例如，C5a受体(C5aR1和C5aR2)、C3a受体(C3aR)、补体受体1(CR1)、补体受体2(CR2)、补体受体3(CR3)等。术语“补体组分”并不旨在包括那些充当补体激活“触发器”的分子和分子结构，例如抗原-抗体复合物，或在微生物表面或人造表面上发现的外来结构等。该术语包括但不限于任何补体调节蛋白(例如，因子B、因子D、因子P、因子H、因子I、CD46、CD55和CD59)。

如本文所用，“治疗”是指提供治疗，即，为受试者提供任何类型的内科或外科管理。可以提供治疗以逆转、缓解、抑制障碍或病症的进展、预防或降低障碍或病症的可能性，或逆转、缓解、抑制或预防障碍或病症的一种或多种症状或表现的进展、预防或降低障碍或病症的一种或多种症状或表现的可能性。“预防”是指使得在至少一些个体中至少在一段时间内不发生障碍或病症，或者其症状或表现。治疗可包括在出现指示补体介导的病症的一种或多种症状或表现后，向受试者施用治疗剂/补体调节剂，例如以逆转、缓解、降低病症严重性和/或抑制或预防病症进展和/或逆转、缓解、降低病症的一种或多种症状或表现的严重性和/或抑制病症的一种或多种症状或表现。根据本文所述的方法，可以将组合物/补体调节剂施用于已患补体介导的疾病或病症的受试者或相对于普通人群成员而言患此类病症风险更高的受试者。这种组合物/调节剂可以预防性施用，即在病症的任何症状或表现出现之前施用。通常在这种情况下，受试者将处于患该病症的风险中，例如，当暴露于补体激活组合物(例如颗粒或纳米颗粒封装的治疗剂，例如用于基因疗法的病毒颗粒或通过例如脂质纳米颗粒递送的治疗剂)时。

诸如治疗剂或补体调节剂等活性剂的“有效量”是指足以引发所期望生物反应(或相当于抑制不期望的生物反应)的活性剂的量。有效的特定药剂的绝对量可以根据诸如期望的生物学终点、要递送的药剂、靶组织等因素而变化。“有效量”可以通过单剂量施用，或者可以通过多剂量施用实现。例如，治疗剂的有效量可以是足以缓解障碍的至少一种症状的量。有效量可以是足以减缓慢性和进展性障碍进展的量，例如，增加该障碍的一种或多种症状或体征出现之前的时间，或增加患有该障碍的个体达到一定程度损伤之前的时间。有效量可以是足以允许比不存在药剂时更快或更大程度地从损伤中恢复的量。

如本文所用，术语“诊断”是指可以确定受试者是否可能患有给定疾病或病症(包括但不限于补体介导的疾病)的方法。熟练的技术人员通常根据一个或多个诊断指标进行诊断，例如标志物，其存在、不存在、量或量的变化指示疾病或病症的存在、严重性或不存在。其他诊断指标可以包括患者病史；身体症状，例如生命体征或表型、基因型或环境或遗传因素的无法解释的变化。熟练的技术人员会理解，术语“诊断”是指将发生某些病程或结果的可能性增加；也就是说，与没有表现出给定特征(例如，诊断指标的存在或水平)的个体相比，表现出该特征的患者更可能发生那一病程或结果。本披露的诊断方法可以独立使用，或与其他诊断方法组合使用，以确定病程或结果是否更可能发生在表现出给定特征的患者中。

如本文所用，术语“可能性”通常是指概率、相对概率、存在或不存在或程度。

如本文所用，术语“标志物”是指可以作为正常生物过程、致病过程或对治疗干预(例如，用补体抑制剂治疗)的药理学反应的指标而被客观测量的特征。标志物的代表性类型包括，例如标志物的结构(例如，序列或长度)或数量的分子变化，包含，例如标志物的水平、浓度、活性或特性的变化。

如本文所用，术语“对照”是指测试样品的参考，例如从健康细胞中分离的对照EV等。如本文所用，“参考样品”是指用于比较的可能患有或可能不患有疾病的组织或细胞的样品。因此，“参考”样品因此提供了一个基础，另一个样品，例如含有EV的尿液样品，可以与之进行比较。相反，“测试样品”是指与参考样品相比较的样品。参考样品不必是无病的，例如当参考样品和测试样品取自按时间分开的同一患者时。

术语“水平”可以指二元(例如，不存在/存在)、定性(例如，不存在/低/中/高)或表明特定分子种类的存在的定量信息(例如，与数量、频率或浓度成比例的值)。

术语“基本上”意味着足以达到预期目的。因此，术语“基本上”允许相对于绝对或完全状态、尺寸、测量、结果等诸如此类如本领域普遍技术人员所预料的微小、不明显的变化，但不会明显影响整体性能(例如，+/-10％)。

术语“补体介导的”障碍或疾病是指一种障碍，其中其发病机制涉及超过受试者自我保护机制(例如，自我保护蛋白，包括CD55(衰变加速因子)、CD59(保护素)、因子H等)并对受试者细胞和/或组织造成损害的补体激活。

如本文所用，疾病或障碍的术语“处于风险中”是指倾向于经历特定疾病的受试者(例如，人)。这种倾向可能是遗传的(例如，或由于其他因素(例如，环境条件、高血压、活动水平、代谢综合征等)。因此，不意欲将本披露限于任何特定风险，也不意欲将本发明限于与补体相关的任何特定类型的病症或功能障碍(例如，aHUS)。

本文提供了使用来自非侵入性液体活检方案的细胞外囊泡作为非侵入性、敏感性和特异性测试来诊断和/或监测患有各种补体介导的疾病的患者中的治疗反应的方法。描述了一种半定量方法，用于在治疗干预之前、期间和之后监测EV上表面补体的表达，使用免疫沉淀/免疫分析来分离和分析EV表面标志物。这些方法可以成功地利用EV进行离体监测补体沉积，作为体内活性的替代。因此，通过这些方法，研究人员和医生有工具可以在整个治疗过程中直接监测离散的、可鉴定的组织(例如肾脏区域)的补体攻击。

活检是目前对补体介导的疾病的亚组进行鉴别诊断的标准。然而，严重并发症的风险限制了患者的选择和检测频率。细胞外囊泡提供了易于可及的窗口，可以在治疗前和治疗期间监测特定组织上正在进行的补体沉积。细胞外囊泡还可以提供组织的补体攻击的精确细胞鉴定。任何具有独特PM标志物的目的细胞类型或组织都可用于查询补体沉积。

免疫沉淀/免疫分析

本公开的免疫沉淀/免疫分析使用具有免疫荧光检测的基于珠的免疫捕获方案，其可以允许精确定位受到补体攻击的特定组织并且可以监测治疗反应。该技术可广泛应用于在任何液体基质中监测受到补体攻击的任何器官或组织，只要提供正确的抗体组。本文讨论的方法的一个方面是EV富集和存在于脱落EV表面上的组织特异性生物标志物的免疫捕获的组合。捕获生物标志物可以是典型的EV特异性(如CD9、CD63、CD81)或组织特异性蛋白。检测抗体对补体组分(例如C5b-9、C3、C4、C1q和C9)具有特异性。尿液中组织特异性靶标的实例包括对肾小球中足细胞特异性的足萼糖蛋白(PODXL)、对曲小管上皮特异性的水通道蛋白2(AQP2)或对膀胱上皮特异性的尿溶蛋白1b(UPK1b)。另一个方面是，只有当捕获和检测靶标存在于同一结构上时，才会出现阳性信号。

例如，肾活检是目前慢性肾脏疾病鉴别诊断的标准。然而，这是侵入性手术。但是，尿液细胞外囊泡(uEV)是囊泡和生物标志物的复杂来源，这些囊泡和生物标志物来源于沿肾脏系统中的每种细胞类型，包括肾单位的所有部分。例如，PODXL仅在肾小球的足细胞上产生，AQP2衍生自近端和远端曲小管，而来自RBC的血型糖蛋白A(GYPA)可用于测量从血浆泄漏到滤液中的EV。某些疾病状态，如炎症或恶性肿瘤，会增加细胞脱落的uEV数量。除了典型的EV标志物，uEV还携带来自亲本细胞的质膜结合蛋白，这可能为肾脏系统的“健康”提供新的见解。

在实例部分和其他地方，提供了可用于实施本披露的各种实施例的代表性抗体类型，例如，包含有关特定供应商和/或目录号的信息。应当理解，本披露不限于使用来自特定供应商/制造商的抗体检测试剂的示例性实施例。针对本披露的生物标志物/分析物的抗体可以从任何制造商获得，包括博奇公司(Biolegend)(圣地亚哥，加利福尼亚州)、南方生物技术公司(Southern Biotech)(伯明翰，亚拉巴马州)、美国生物公司(United StatesBiological)(USB；Salem,MA)、生命跨度生物公司(Lifespan Biosciences)(LSBIO；西雅图，华盛顿州)、艾博抗公司(Abcam)(剑桥，英国)，细胞信号传导技术公司(Cell SignalingTechnology)(丹弗斯，马萨诸塞州)，和西格玛奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(圣路易斯，密苏里州)。例如，兔抗PODXL抗体可购自USB(目录号212672)、LSBIO(目录号LS-C141161)、艾博抗公司(目录号ab205350)和西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)(目录号HPA002110)；抗CD9抗体，克隆MM2/57可购自南方技术公司(Southern Biotech)(目录号9310)、EMD密理博公司(EMD Millipore)(目录号CBL162)、VWR公司(目录号89366)和伯乐公司(BIO RAD)(目录号MCA469G)。也可以使用常规技术产生抗体，例如，哺乳动物如小鼠或兔的免疫和/或杂交瘤技术。

EV表征

细胞外囊泡(EV)(如尿细胞外囊泡(uEV))可以通过同时免疫沉淀/免疫分析(即

技术平台)进行表征，并通过查询来确定EV亚群的表面表型和组织来源。

Luminex

制造将免疫沉淀与多路复用免疫测定相结合的设备和xMAP^TM技术。xMAP^TM是一系列专有的、颜色编码的微球，这些微球可以用捕获抗体包被。开放式架构xMAP^TM技术可实现生物测试(测定)的多路复用，与ELISA、蛋白质印迹、PCR和传统阵列等传统方法相比，减少了时间、劳动力和成本。使用xMAP^TM技术的系统在称为微球的颜色编码珠的表面上执行离散测定，然后在紧凑型分析仪中读取这些微球。该分析仪使用多个激光器或LED和高速数字信号处理器，通过报告每个微球上发生的反应来读取多路复用测定结果。

使用Luminex平台允许在免疫测定之前通过免疫沉淀来富集EV。这消除了对初始样品处理/EV富集的需要，从而限制了潜在的错误结果。

使用多路复用形式允许监测一个样品中的多个离散组织。以多孔板形式工作允许在一次测定中监测多个潜在的补体蛋白和途径。

通常，捕获珠与靶标特异性抗体缀合。缀合的珠用于免疫沉淀基质中的靶蛋白(例如，来自液体样品，如尿液)。与标记(例如藻红蛋白(PE)或生物素+链霉亲和素-藻红蛋白(SAPE))缀合的检测抗体用于在分析过程中检测和定量珠捕获的靶标。

包被有针对典型囊泡标志物(如CD9、CD63和CD81)的抗体的xMAP珠的阵列用于富集来自生物样品(如尿液)的离散EV亚群。然后分析每个珠组是否存在其他生物标志物，这些生物标志物定义了亚群表型并将其联系到组织起源，然后进一步分析补体途径蛋白的存在。通过这种方式，建立了非侵入性“液体活检”方法，用于对特定组织(如肾脏)疾病的关键生物标志物进行采样和监测，以进行鉴别诊断、预后评估和/或对治疗反应的纵向监测。

靶蛋白结合

可以使用本领域已知的检测技术检测靶蛋白与溶液中抗体或固定在阵列上的抗体的结合。这种技术的实例包括免疫学技术，例如竞争结合测定和夹心测定；荧光检测，其使用仪器(例如共焦扫描仪、共焦显微镜或基于CCD的系统)以及技术(例如荧光、荧光偏振(FP)、荧光共振能量转移(FRET)、全内反射荧光(TIRF)、荧光相关光谱(FCS))；比色/光谱技术；表面等离子共振，通过它可以测量吸附在表面的材料质量的变化；使用放射性同位素的技术，包括常规的放射性同位素结合和闪烁邻近测定(SPA)；质谱，例如液相色谱-质谱(LC-MS)、HPLC-MS、基质辅助激光解吸/电离质谱(MALDI)和MALDI-飞行时间(TOF)质谱；椭偏仪，其是测量蛋白膜厚度的光学方法；石英晶体微量天平(QCM)，其是非常灵敏的测量吸附到表面的材料质量的方法；扫描探针显微镜，例如原子力显微镜(AFM)和扫描电子显微镜(SEM)；以及电化学、阻抗、声学、微波和红外(IR)/拉曼(Raman)检测等技术。

测量补体抑制/调节

可以使用任何合适的方法来评估药剂或含有该药剂的组合物抑制补体激活的能力(或任何其他相关特性)。可以使用多种体外测定。例如，药剂抑制经典或替代补体途径的能力可以由人血清或一组补体组分在有或没有该药剂的情况下通过测量补体介导的红细胞溶血(例如，抗体致敏或未致敏的兔或绵羊红细胞)来评估。药剂与一种或多种补体组分如C3、C5、C6、C7、C8、C9、因子B或因子D结合的能力可以使用例如等温滴定量热法或其他适于在液相中进行的方法来评估。例如，可以使用ELISA测定来测量药剂与补体组分结合的能力。其他使用方法包括表面等离子共振、平衡透析等。

用于测量发生在体外或在体内的全身或局部补体激活以及用于确定补体抑制剂抑制这种激活的能力的方法是本领域已知的。例如，对补体激活产物如C3a、C5a、C3bBb、C5b-9等的测量提供了补体激活程度的指示。此类产物的量减少表明补体激活受到抑制。在一些实施例中，测量活性切割产物与其无活性去精氨酸(desArg)形式之间的比率(例如，C3a/C3adesArg)。本领域技术人员可以通过适当选择测量的一种或多种补体激活产物和/或适当的补体激活剂，如酵母聚糖、脂多糖、免疫复合物等来区分经典、替代和凝集素途径激活。其他方法涉及测量补体介导的作为末端复合物形成的结果的红细胞溶血。

体内补体激活和/或补体抑制剂对其的抑制可以在适当的生物样品中进行测量。例如，可以在血液样品中测量全身补体激活和/或补体抑制剂对其的抑制。在补体抑制剂施用之前开始的系列测量提供了补体抑制剂抑制补体激活的程度以及抑制的时间过程和持续时间的指示。应当理解，只有在施用补体抑制剂之前存在的激活产物已经被降解或清除时，激活产物的减少才会变得明显。

在一些实施例中，本文所述的补体调节剂可以与用于治疗或预防受试者的补体相关障碍的另外的活性剂一起配制。用于治疗受试者补体相关障碍的其他药剂包括但不限于抗高血压药(例如，血管紧张素转换酶抑制剂)、抗凝剂、皮质类固醇(例如，强的松)或免疫抑制剂(例如，长春新碱或环孢素A)；抗凝剂(例如，华法林(香豆素)、肝素、苯茚二酮、磺达肝素、艾卓肝素)；凝血酶抑制剂(例如，阿加曲班、来匹卢定、比伐卢定或达比加群)；纤维蛋白溶解剂(例如，安克洛酶、ε-氨基己酸、抗纤维蛋白溶酶-a₁、前列环素和去纤维素)；降脂剂；或抗CD20剂，如利妥昔单抗。

比较方法

在本文所述方法的一些实施例中，这些方法包括将检测到的补体生物标志物水平与参考水平进行比较。在一些实施例中，参考代表健康对照，即，未被诊断患有补体介导的疾病的受试者中的生物标志物水平。在一些实施例中，参考水平是参考队列中的中位值或截断水平，例如，定义统计学显著不同组的截断，例如参考队列的顶部或底部三分位数、四分位数、五分位数或其他百分位数。

根据检测到的蛋白生物标志物的身份，高于或低于参考水平的水平可能表明存在疾病或风险升高，即水平升高(即水平高于参考水平)或水平降低(即水平低于参考水平)表明疾病的存在或降低。

在一些实施例中，高于参考水平的升高水平具有统计学意义，或升高至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％、200％、300％、400％、500％或1000％。如本文所述，升高可通过与阈值或基线值(例如，用于确定蛋白存在或不存在的测定的阈值检测水平)，或参考受试者(例如，健康参考)中蛋白的参考水平相比较来确定。在一些实施例中，低于参考水平的降低水平具有统计学意义，或降低至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％或95％。如本文所述，降低可通过与阈值或基线值(例如，用于确定蛋白存在或不存在的测定的阈值检测水平)，或参考受试者(例如，健康参考受试者或没有补体介导疾病的受试者)中蛋白的水平相比较来确定。

在一些实施例中，该方法包括计算受试者样品中蛋白生物标志物的水平与参考水平的比率，并且如果该比率大于阈值比率，则确定该受试者患有本文所述的补体介导疾病或正处于患如本文所述的补体介导疾病的风险中。在一些实施例中，确定该比率是阳性还是阴性，阳性或阴性比率的存在表明受试者患有如本文所述的补体介导疾病或正处于患如本文所述的补体介导疾病的风险中。同样，根据本文的披露内容，可以容易地确定阳性或阴性比率是否指示疾病的存在，或者风险增加或减少。

补体系统由几种小蛋白构成，这些小蛋白组织成生化级联反应，用于帮助免疫系统清除病原体。补体蛋白作为无活性前体在血液中循环。当受到几种触发因素之一的刺激时，系统中的蛋白酶会切割特定的蛋白以释放细胞因子并引发进一步的切割的放大级联。

测量补体激活

用于测量在体外或在体内发生的全身或局部补体激活的方法是本领域已知的。例如，对补体激活产物如C3a、C5a、C3bBb、C5b-9等的测量提供了补体激活程度的指示。此类产物的量减少表明补体激活受到抑制。在一些实施例中，测量活性切割产物与其无活性desArg形式之间的比率(例如，C3a/C3a desArg)。本领域技术人员可以通过适当选择测量的一种或多种补体激活产物和/或适当的补体激活剂，如酵母聚糖、脂多糖、免疫复合物等来区分经典、替代和凝集素途径激活。其他方法涉及测量补体介导的作为末端复合物(MAC)形成的结果的红细胞溶血。

具有类似于补体介导的反应的一种或多种特征的病理特征的许多不同动物模型是本领域已知的。用于补体介导疾病治疗的补体调节剂的应用可以是以多种剂量施用于小鼠、大鼠、犬、灵长类动物等，其自发地表现出障碍或通过对动物进行适当的方案而实验性地诱导出障碍。使用标准方法和准则评估调节剂预防或治疗疾病的一种或多种体征或症状的能力。

在动物研究中显示有希望的结果的化合物或补体调节剂(如在人受试者的相关血管外位置施用预期有效治疗补体介导的疾病的剂量的可接受的安全性和可行性)可以在人中进行测试，例如，使用所研究的特定障碍的治疗方法的临床试验的标准方案和终点。

上述组合物可用于尤其是治疗或预防受试者的多种补体相关障碍的方法。使用部分地取决于施用途径的多种方法，组合物可以施用于受试者，例如人受试者。途径可以是例如，静脉内注射或输注(IV)、皮下注射(SC)、腹膜内(IP)注射或肌肉内注射(IM)。

施用可以通过例如，局部输注、注射或借助于植入物。植入物可以是多孔材料、无孔材料或凝胶状材料，包括膜，例如硅胶(sialastic)膜，或纤维。植入物可以被配置为向受试者持续或定期释放组合物(美国专利申请公开号20080241223；美国专利号5,501,856；4,863,457；和3,710,795；EP 488401；和EP 430539，其中每一个的披露内容通过引用以其整体并入本文)。组合物可以通过基于例如扩散、可腐蚀或对流系统的可植入装置递送至受试者，例如渗透泵、可生物降解的植入物、电扩散系统、电渗系统、蒸汽压力泵、电解泵、泡腾泵、压电泵、基于腐蚀的系统、或机电系统。

在一些实施例中，治疗剂通过局部施用被递送至受试者。如本文所用，“局部施用”或“局部递送”是指不依赖于将组合物或药剂通过血管系统运输至其预期靶组织或部位的递送。例如，可以通过组合物或药剂的注射或植入，或者通过包含组合物或药剂的装置的注射或植入来递送组合物。在靶组织或部位附近局部施用后，组合物或药剂或其一种或多种组分可以扩散到预期的靶组织或部位。

如实例部分中详细概述的，本披露的测定方法包括测量EV中补体组分的表达或水平的变化。EV可以来自任何生物样品，例如尿液、血液、淋巴、CSF、腹水、脓液、胸水、血红蛋白、奶、羊水、滑液、粘液、唾液、痰、房水、玻璃体等等。

在一些实施例中，诸如差速超速离心、密度梯度超速离心、尺寸排阻色谱、超滤和亲和/免疫亲和捕获方法等方法可用于从生物样品中富集EV，尽管该步骤是任选的。优选地，EV富集步骤在第一标志物和任选的第二标志物与相应的抗体或抗原结合片段接触之前进行。

接下来，在群体水平或单颗粒水平上表征EV。在这里，分析了EV中分子的组成和水平，例如蛋白质、脂质或核酸。技术范围从光散射显微镜或光谱到使用蛋白质组学的分子指纹识别。也可以测量群体中独特分子的总体水平。对于单颗粒分析，可以使用专门的方法，例如光学显微镜和流式细胞术(用于EV>200nm)、单颗粒干涉反射成像(>40nm)、纳米流式细胞术(约40nm)和电子显微镜。特别是，电子显微镜和流式细胞术允许研究单个EV，而无需事先与生物基质进行大量分离。

在一些实施例中，可以使用裂解缓冲液(例如RIPA缓冲液(20mM Tris-HCl[pH7.5]、150mM NaCl、1mM Na₂EDTA 1mM EGTA、1％ NP-40、1％脱氧胆酸钠、2.5mM焦磷酸钠、1mM b-甘油磷酸盐、1mM Na₃VO₄、1μg/ml亮抑酶肽)裂解EV。

EV的表征可能包括使用与EV上的标志物(例如，通常是蛋白质或肽，但可能包括其他抗原)特异性结合的捕获抗体。在一些实施例中，使用对EV标志物具有特异性的单一捕获抗体。在一些实施例中，使用至少两种捕获抗体，其中第一捕获抗体对EV特异性标志物具有特异性，并且第二捕获抗体对EV上展示的组织特异性标志物具有特异性。

EV特异性标志物包括但不限于ALIX(UNIPROT：Q8WUM4)、TSG101(UNIPROT：Q99816)、CD9(UNIPROT：P21926)、CD63(UNIPROT：P08962)、CD81(UNIPROT：P60033)、CD40L(UNIPROT：P29965)、CD26(UNIPROT：P27487)、CD31(UNIPROT：P16284)、CD45(UNIPROT：P08575)、CD2(UNIPROT：P06729；Q53F96)、CD11a(UNIPROT：P20701)、CD24(UNIPROT：P25063)、CD55(UNIPROT：P08174)、CD59(UNIPROT：P13987；Q6FHM9)、CF106(UNIPROT：Q9H6K1)、CD56(UNIPROT：P13591)、CD51(UNIPROT：P06756)、CD82(UNIPROT：P27701)、整联蛋白、四次穿膜蛋白、膜联蛋白、HSP90(UNIPROT：P07900(α1)；Q14568(α2)；P14625(β))、HSP70(例如，UNIPROT：P11021)、同线蛋白-1(UNIPROT：O00560)、ADAM10(UNIPROT：O14672)、EHD4(UNIPROT：Q9H223)、肌动蛋白、Rab5(UNIPROT：P20339(α)；P61020(β)；P51148(γ)；)、网格蛋白(UNIPROT：P09496(α)；P09497(β)；Q00610(H))、筏蛋白-1(UNIPROT：O75955)、MHC I、MHCII、辅肌动蛋白-4(UNIPROT：O43707)、GP96(UNIPROT：P14625)、EHD4(UNIPROT：Q9H223)、Mitofilin(UNIPROT：Q16891)、和LAMP2(UNIPROT：P13473)、或其片段。

关于组织特异性，对肾小球足细胞、肾曲小管或膀胱上皮细胞具有特异性的EV可用于研究肾脏疾病，并且来自红细胞(RBC)的EV可用于研究血液疾病。在一些实施例中，组织特异性EV包括但不限于以下：

PODXL(UNIPROT：O00592)，在肾小球足细胞，内皮细胞，输卵管、子宫和精囊腺细胞中高表达；

AQP 2(UNIPROT：P41181)，存在于肾脏集尿管主细胞的顶端细胞膜和细胞内囊泡中；

UPK1b(UNIPROT：O75841)，存在于膀胱的不对称单位膜中；

NPHS2(UNIPROT：Q9NP85)，在胎儿和成熟肾小球的足细胞中表达；

GYPA(UNIPROT：P02724)，红细胞的主要内在膜蛋白，被Mab TER119特异性识别；

粘蛋白-1(UNIPROT：P15941；Q7Z551)，在上皮细胞(尤其是气道、乳房和子宫的上皮细胞)的顶端表面表达；在T细胞中表达并在上皮肿瘤(例如乳腺癌或卵巢癌)以及在非上皮肿瘤细胞中过度表达；

NKCC2(UNIPROT：Q13621)，肾特异性肾Na、K和Cl协同转运蛋白；

AQP1(UNIPROT：P29972)，在红细胞和肾近端小管的质膜中表达；

GST-α，例如GSTα1(UNIPROT：P08263)，主要在小肠和大肠和结肠中表达，在淋巴细胞中弱表达；GSTα2(UNIPROT：P09210)；GSTα3(UNIPROT：Q16772)；GSTα4(UNIPROT：O15217)，在脑、胎盘和骨骼肌中高水平表达；和GSTα5(UNIPROT：Q7RTV2)；

THP(UNIPROT：P07911)，在肾小管细胞中表达，特别是由亨利袢粗升支和远曲小管腔的上皮细胞表达；

钙结合蛋白-D28K(CalB1；UNIPROT：P05937)，存在于哺乳动物肾脏中；也在许多神经元和内分泌细胞中表达，特别是在小脑中。

巨蛋白(Megalin)(UNIPROT：P98164)，在许多吸收性上皮细胞的质膜中发现的多配体结合受体；

Cubilin(CUBN；UNIPROT：O60494)，在肾脏和小肠中表达；

肾病蛋白(Nephrin)(Nphs1；UNIPROT：O60500)，在肾小球足细胞中表达；

密封蛋白-1(CLDN1；UNIPROT：O95832)，在肝脏和肾脏中强烈表达；在心、脑、脾、肺和睾丸中表达；

膜联蛋白-V(ANXA5；UNIPROT：P08758)，在许多组织和血细胞中表达；

突触足蛋白抗体(Synpo；Q8N3V7)，在神经元和大脑皮层中表达；

维尔姆斯肿瘤(Wilm’s tumor)蛋白(Wt1；P19544)，在肾脏和造血细胞亚群中表达；

带3(Band 3)，阴离子转运蛋白(SLC4A1；P02730)，在红细胞中表达(PMID：7506871，PMID：26542571)；同工型2在肾脏中表达(PMID：7506871)；

Stomatin(STOM；P27105)，在红细胞中检测到并广泛表达；

癌胚抗原相关细胞粘附分子1(BGP1；P13688)，在结肠柱状上皮细胞(PMID：10436421)、T细胞(PMID：18424730)中表达，并在粒细胞和淋巴细胞中表达；

珠蛋白(例如细胞珠蛋白(CYGB)；Q8WWM9)，在心脏、胃、膀胱和小肠中表达；

血型糖蛋白B(GYPB；P06028)，在肾内皮和上皮中表达；

Rh多肽，Rh糖蛋白(RHAG；Q02094)，在红细胞中表达。

接下来，检测捕获的EV上补体系统相关组分的存在或水平。任何方法都可以用于检测补体组分，例如，具有对该组分具有特异性的检测抗体或其抗原结合片段；也可以使用适体。用于检测的说明性方法包括，例如，免疫组织化学染色、蛋白质印迹、细胞免疫印迹、免疫荧光染色、ELISA、RIA和荧光激活细胞分选(FACS)，或本领域已知的任何方法。

通常有两种用于检测抗原表位的策略，直接方法和间接方法。直接方法包括一步染色，并且可能涉及与EV上/内的抗原直接反应的经标记的抗体(例如，FITC缀合的抗体)。间接方法包括与体液或组织抗原反应的未标记的一抗，以及与一抗反应的经标记的二抗。标记可包括放射性标记、荧光标记、半抗原标记例如生物素、或酶例如辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶。进行这些测定的方法是本领域众所周知的。参见，例如，Harlow等人(Antibodies[抗体],冷泉港实验室,纽约州,1988)，Harlow等人(Using Antibodies,A LaboratoryManual[抗体使用-实验手册],冷泉港实验室,纽约州,1999),Virella(MedicalImmunology[医学免疫学],第6版,医疗保健信息(Informa HealthCare),纽约,2007)，和Diamandis等人(Immunoassays[免疫测定法],学术出版社(Academic Press,Inc.),纽约,1996)。用于进行这些测定的试剂盒可从例如克罗泰克公司(Clontech)商购获得。

可以使用本方法检测多种补体蛋白，包括，例如(a)替代途径(AP)的组分，(b)与经典途径(CP)相关的组分，和(c)与凝集素途径(MBL)相关的组分。在一些实施例中，可检测到来自不同途径的多个组分，例如来自AP和CP的组分。

在优选的实施例中，补体系统相关组分是AP或CP的组分，选自，例如C3、C5b-9、C4、C1q、C9、C3b、iC3b、TF、CRP、pCRP、MAC、CD59、CF55、CR1、C5aR1、和C5；优选MAC、C3、C5b-9、C4、C1q、和C9。可以检测各种成分的组合，例如C3和C5的组合。其中组分是膜攻击复合物(MAC)，该方法可以包括检测MAC的任何亚基或所有亚基，例如，C5b、C6、C7、C8和C9分子。

在一些实施例中，本披露的方法包括用缺乏某些标志物的EV进行测量，例如外泌体特异性标志物，例如CD81(UNIPROT：P60033)，其是B细胞(PMID：20237408)、单核细胞/巨噬细胞(PMID：12796480)、肝细胞(PMID：12483205)以及CD4阳性T细胞(PMID：22307619)上表达的蛋白。

在一些实施例中，本披露的方法包括用对非目的组织特异的EV进行测量，例如泌尿系统背景下的膀胱。实例包括例如，在膀胱上皮细胞中表达的UPK1B(UNIPROT：O75841)。

常规方法可用于分选出对非理想标志物呈阳性的EV，例如FACS。

测定方法的下游应用

本发明用于检测生物样品中补体激活的方法可用于许多下游应用。例如，这些方法可用于确定受试者(从其获得生物样品)是否患有补体介导的疾病或处于发展补体介导的疾病的风险中。补体介导的障碍的发生率或风险的测量是通过将EV或其膜结合部分上补体途径组分的存在或水平与对照(或参考标准)进行比较来进行的。通常，对照或参考标准包含处来自健康受试者的相同生物样品中分离的EV。可以执行常规方法来处理和标准化从不同受试者获得的样品。

同样，本发明的方法也可用于确定补体介导的疾病随时间的进展或消退。这是通过比较受试者样品中EV或其膜结合部分上的补体途径的组分在两个不同的时间点(例如，t1和t2，其中t2>t1)的存在或水平。与t1相比，在t2时补体的存在/水平降低表明补体状态改善和补体疾病消退；如果与t1相比，在t2时补体的存在/水平增加，则相反。测量之间的间隔(例如，t2-t1)可以取决于疾病的性质，范围从几天到几年，例如几周、1个月、3个月、6个月、1年、2年、3年、5年、10年或更长时间，例如，20年。

测量药物的功效

本披露的方法和测定可用于监测对用补体调节剂治疗补体介导的疾病的反应。补体调节剂是可以直接或间接调节例如，激活或抑制补体组分(例如组分蛋白)的分子。不受任何方式的限制，表A中提供了可以根据本发明描述的方法测试其功效的代表性补体调节剂。

表A.调节补体系统的治疗方法：下面包括对患有补体介导的疾病的患者进行检查的示例性方法。

例如，本披露涉及以下用于监测各种补体介导的疾病的疗法的功效的方法：

(A)监测对用抗C1q单克隆抗体治疗受试者的自身免疫性疾病(例如，GBS、wAIHA、自身抗体疾病)或神经退行性疾病(例如，ALS、HD、青光眼/地图样萎缩(GA))的反应的方法。

(B)监测对用C1-INH(例如，BERINERT、RUCONEST、CYNRIZE)治疗受试者的遗传性血管性水肿(HAE)的反应的方法。

(C)(1)监测对用抗C1s单克隆抗体(例如，BIVV020或激活的抗C1s抗体)治疗受试者的冷凝集素病(CAD)溶血事件的反应的方法。

(C)(2)监测对用C1s肽治疗受试者的补体介导的疾病治疗的反应的方法，该疾病选自冷凝集素病(CAD)、温抗体自身免疫性溶血性贫血(wAIHA)、神经退行性疾病(例如HD、AD、ALS、GBS)。

(D)监测用抗C2单克隆抗体(例如，PRO-02)治疗受试者的抗体介导的炎症或缺血再灌注损伤的反应的方法。

(E)监测用α-MASP-2单克隆抗体(例如，纳索利单抗(Narsoplimab))治疗受试者的造血干细胞移植相关血栓性微血管病(HSCT-TMA)；非典型溶血性尿毒症综合征(aHUS)；或IgA肾病(IgAN)的反应的方法。

(F)监测用α-MASP-3单克隆抗体(例如，OMS906)治疗受试者的补体介导的疾病如阵发性夜间血红蛋白尿(PNH)的反应的方法。

(G)监测用α-因子D(FD)单克隆抗体(例如，兰帕利珠单抗(lampalizumab))治疗受试者的地图样萎缩(GA)/年龄相关性黄斑变性(AMD)的反应的方法。

(H)监测用小分子D因子(FD)抑制剂(例如，danicopan(ACH-4471)或ACH-5228)治疗受试者的输血依赖性贫血；PNH伴溶血(EVH)的反应的方法。

(I)监测用小分子因子D(FD)抑制剂(例如美国专利号9388199(将其通过引用并入本文)中的BCX9930或FD抑制剂)治疗受试者的补体介导的障碍的反应的方法。

(J)监测用因子B(FB)抑制剂(例如，因子B siRNA IONIS-FB-L_RX或α-FB单克隆抗体)治疗受试者的补体介导的障碍如IgA肾病(IgAN)的反应的方法。

(K)监测用B因子(FB)抑制剂(LNP023)治疗受试者的PNH；C3-肾小球病(C3G)；膜性肾小球肾炎和其他肾脏疾病的反应的方法。

(L)监测用α-备解素(P因子)单克隆抗体(例如，CLG561)治疗受试者的肾病或退行性疾病(例如AMD或GA)的反应的方法。

(M)监测用因子H(FH)调节剂(例如，微型因子H；AMY-201或CR2因子H/TT30)治疗受试者的牙周病或PNH的反应的方法。

(N)监测用坎普他汀(compstatin)或其衍生物(例如，APL2、APL9；AMY-101)或sCR1/TP10或米罗考普(Mirococept)治疗受试者的补体介导的障碍(选自GA、PNH、冷凝集素病(CAD)、wAIHA、补体依赖性肾病(CDN)和C3G)；或减轻牙周炎、移植排斥、同种异体移植物中的缺血再灌注损伤或基因疗法中腺相关病毒载体(AAV)的排斥的反应的方法。

(O)监测用抗C5单克隆抗体(例如，依库丽单抗或生物仿制药，例如，ABP 959、Elizaria或SB12)治疗受试者的PNH、aHUS、重症肌无力(gMG)、视神经脊髓炎谱系障碍(NMOSD)的反应的方法。

(P)(1)监测用诺玛库安(nomacopan)(覆盖素(Coversin)；rVA576)治疗受试者的PNH；aHUS；大疱性类天疱疮(BP)；葡萄膜炎；血栓性微血管病(TMA)；角膜结膜炎；或类风湿关节炎(RA)的反应的方法。

(P)(2)监测用Zilucoplan(RA101495)治疗受试者的gMG；ALS；免疫介导的坏死性肌病(IMNM)；或肾脏疾病的反应的方法。

(P)(3)监测用抗C5 siRNA塞迪司兰(cemdisiran)(ALN-CC5)治疗受试者的aHUS的反应的方法。

(P)(4)监测用Zimura(ARC1905)治疗受试者的GA/AMD；新生血管性AMD；或Stargardt病的反应的方法。

(Q)监测用改进的抗C5单克隆抗体(例如，依库珠单抗)治疗受试者的PNH；aHUS；gMG；NMOSD；造血干细胞移植(HSCT)-TMA；ALS；补体介导的TMA；或重症COVID-19的反应的方法。

(R)(1)监测用抗C5亲和体(例如，SOBI005)治疗受试者的补体介导的障碍的反应的方法。

(R)(2)监测用抗C5抗体特度鲁单抗(LFG316)治疗受试者的移植相关微血管病(TAM)；全葡萄膜炎；AMD；GA；PNH；或肾移植排斥的反应的方法。

(R)(3)监测用抗C5抗体帕泽利单抗(pozelimab)或可伐利单抗(crovalimab)(SKY059)治疗受试者的PNH的反应的方法。

(S)(1)监测用阿伐可泮(Avacopan)(CCX-168)治疗受试者的抗中性粒细胞胞浆自身抗体(ANCA)血管炎的反应的方法。

(S)(2)监测用抗C5单克隆抗体(例如奥伦达珠单抗(olendalizumab)(ALXN1007)或BDB-001或IFX2)治疗受试者的GVHD或COVID-19的反应的方法。

(T)(1)监测用选自抗C6单克隆抗体和C6反义RNA的补体C6抑制剂治疗受试者的自身免疫性疾病或重症肌无力(MG)的反应的方法。

(T)(2)监测用补体C6抑制剂CP010治疗受试者的神经退行性障碍的反应的方法。

(U)监测用编码可溶性CD59(HMR59)的腺相关载体(AAV)治疗受试者的干性和湿性AMD的反应的方法。

上述用于测量对治疗的反应的代表性方法通常与上述用于检测EV中补体蛋白的方法一致地实践，例如，通过(a)在治疗前后从该受试者获得包含细胞外囊泡(EV)或其膜结合部分的样品，(b)使该样品的一部分与至少一种第一捕获抗体或其抗原结合片段接触以捕获这些EV或其一个或多个膜结合部分上的至少一种第一标志物；(c)任选地使该样品的一部分与至少一种第二捕获抗体或其抗原结合片段接触以捕获这些EV或其一个或多个膜结合部分上的至少一种第二标志物；(d)将捕获的EV或其膜结合部分与对补体系统相关组分特异性的至少一种检测抗体或其抗原结合片段接触；和(e)定性或定量地检测该检测抗体或其抗原结合片段，以测量该EV或其膜结合部分上补体途径组分的存在或水平，其中与用该补体调节剂治疗前相比，用该补体调节剂治疗后该受试者的样品中补体途径组分的存在或水平的调节(例如，增加或减少；优选减少)表明该受试者对该补体调节剂有反应。

在一些实施例中，补体调节剂是C1q、C1、C1s、C2、MASP-2、MASP-3、因子D、因子B、备解素(因子P)、因子H、C3/C5转化酶、C5、C5a/C5aR、C3a/C3aR、C6、或CD59的调节剂；优选补体抑制剂，例如单克隆抗体或小分子抑制剂或siRNA/RNAi，如表A所示。

上述方法对于测试抑制末端补体激活或活性(例如在C5轴或C3轴)的分子的功效特别有用。特别是，上述方法特别适用于测试C5抑制剂(例如依库丽单抗或后续分子，如依库珠单抗)的功效。

补体调节测试化合物的筛选方法

在一些实施例中，本披露涉及筛选用于补体调节的测试化合物的方法，该方法包括(a)从患有补体介导的疾病的受试者(例如，动物如小鼠、兔、仓鼠、绵羊、美洲驼、狗、猴、黑猩猩或人)获得含有细胞外囊泡(EV)或其膜结合部分的样品，其中该样品在施用该测试化合物之前和之后获得；(b)使该样品的一部分与至少一种第一捕获抗体或其抗原结合片段接触以捕获这些EV或其一个或多个膜结合部分上的至少一种第一标志物；(c)任选地使该样品的一部分与至少一种第二捕获抗体或其抗原结合片段接触以捕获这些EV或其一个或多个膜结合部分上的至少一种第二标志物；(d)将捕获的EV或其膜结合部分与对补体系统相关组分特异性的至少一种检测抗体或其抗原结合片段接触；和(e)定性或定量地检测该检测抗体或其抗原结合片段，以测量该EV或其膜结合部分上补体组分的存在或水平，其中与施用测试化合物之前相比，施用测试化合物之后该受试者的样品中补体组分的存在或水平的调节(例如，增加或减少；优选减少)表明该测试化合物能够调节补体。优选地，测试化合物能够调节补体，该补体是C1q、C1、C1s、C2、MASP-2、MASP-3、因子D、因子B、备解素(因子P)、因子H、C3/C5转化酶、C5、C5a/C5aR、C3a/C3aR、C6、或CD59、或其组合。

在一些实施例中，将测试化合物的调节活性与具有补体调节活性的分子(例如，阳性对照或标准)的调节活性进行比较，例如表A中提供的分子。

抑制C5激活或活性的化合物

在代表性实施例中，根据上述方法测试或筛选其活性的补体调节剂是抑制C5激活从而降低、抑制和/或消除补体介导的作用的分子(例如，CSR或CARPA)。C5的切割释放C5a(一种有效的过敏毒素和趋化因子)并导致裂解的末端补体复合物C5b-9的形成。C5a和C5b-9还具有多效性细胞激活特性，这是通过放大下游炎症因子(例如水解酶、活性氧、花生四烯酸代谢物和各种细胞因子)的释放。

适用于降低、抑制和/或消除在某些治疗剂(例如，颗粒或纳米颗粒包封的治疗剂)的治疗性施用期间发生的补体介导的作用的补体抑制剂可以与C5结合。示例性药剂包括抗体、抗体片段、多肽、小分子和适体。示例性抗体描述于美国专利号6,534,058和Wang,等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊],92:8955-8959,1995。与C5结合并抑制C5的示例性化合物描述于美国专利号7,348,401和7,999,081中。在某些实施例中，补体抑制剂是抗体、小分子、适体或多肽，其与美国专利号6,534,058中描述的抗体或美国专利号7,348,401中描述的肽结合C5上基本相同的结合位点。美国专利号7,538,211披露了与C5结合并抑制C5的适体。抑制C5或CSR局部表达的RNAi剂也可用于本文所述的方法中。

在其他实施例中，药剂是C5a受体(C5aR)的拮抗剂。

C5a被替代或经典C5转化酶从C5的α链上切割下来。转化酶作用的切割位点位于或紧邻C5aα链的氨基酸残基733。在该切割位点处或附近结合的化合物将具有阻断C5转化酶接近该切割位点的潜力，从而起到补体抑制剂的作用。在切割位点远端与C5结合的化合物也可能具有阻断C5切割的潜力，例如，通过空间位阻介导的C5和C5转化酶之间相互作用的抑制。示例性的C5a受体拮抗剂包括各种小环肽，例如以下中描述的那些：美国专利号6,821,950；美国公开号2009/0117171；和/或WO 2006/099330，或单克隆抗体BB5.1(Frei Y.等人,Mol.Cell.Probes[分子与细胞探测],1:141-9,1987)、BB5.1的单链可变片段(scFV)或抗BB5.1 Fab(Peng等人,J Clin Invest.[临床研究杂志],115(6):1590-1600,2005)，其阻止C5a和C5b的形成。

在某些实施例中，补体抑制剂包含抗C5抗体。适用于本文的抗C5抗体(或衍生自其的VH/VL结构域)可以使用本领域已知的方法来鉴定。可替代地，可以使用本领域公认的抗C5抗体。也可以使用与这些本领域公认的抗体竞争结合C5的抗体。

CDR的确切边界已根据不同的方法进行了不同的定义。在一些实施例中，轻链或重链可变结构域内的CDR或框架区的位置可以如以下所定义：Kabat等人[(1991)“Sequencesof Proteins of Immunological Interest[具有免疫学意义的蛋白质序列].”NIH出版号91-3242,美国卫生与公众服务部(U.S.Department of Health and Human Services),贝塞斯达,马里兰州]。在这种情况下，CDR可以称为“Kabat CDR”(例如，“Kabat LCDR2”或“Kabat HCDR1”)。在一些实施例中，轻链或重链可变区的CDR的位置可以如Chothia,C.等人(Nature[自然],342:877 83,1989)所定义。因此，这些区域可以称为“Chothia CDR”(例如“Chothia LCDR2”或“Chothia HCDR3”)。在一些实施例中，轻链和重链可变区的CDR的位置可以如Kabat Chothia组合定义所定义。在此类实施例中，这些区域可称为“组合的KabatChothia CDR”(Thomas,T.等人,Mol.Immunol.[分子免疫学],33:1389 401,1996)举例说明根据Kabat和Chothia定义鉴定CDR边界。

另一种示例性抗C5抗体是抗体BNJ421，如WO 2015/134894和美国专利号9,079,949(其教导通过引用并入本文)中所述。

抗C5抗体可以包含例如与人新生儿Fc受体(FcRn)结合的变体人Fc恒定区，其中变体人Fc CH3恒定区在对应于天然人IgG Fc恒定区的甲硫氨酸428和天冬酰胺434的残基处(各自以EU编号)包含Met-429-Leu和Asn-435-Ser取代。

另一种示例性抗C5抗体是美国专利号8,241,628和8,883,158(其中的披露内容通过引用并入本文)中描述的7086抗体。

另一种示例性抗C5抗体是也在美国专利号8,241,628和8,883,158(其中的披露内容通过引用并入本文)中描述的8110抗体。

另一种示例性的抗C5抗体是美国专利号9,765,135(其中的披露内容通过引用并入本文)中描述的305LO5抗体。

另一个示例性抗C5抗体是SKY59抗体(Fukuzawa,T.等人,Sci.Rep.[科学报道],7:1080,2017，其中的披露内容通过引用并入本文)。

另一种示例性抗C5抗体是描述于美国公开号2017/0355757或WO 2017218515(其中的披露内容通过引用并入本文)中的REGN3918抗体(也称为H4H12166PP)。

在另一个实施例中，抗体与上述抗体(例如，7086抗体、8110抗体、305LO5抗体、SKY59抗体或REGN3918抗体)竞争与C5上的相同表位结合和/或竞争结合至C5上的相同表位。抗C5抗体可以与上述抗体具有例如至少约90％的可变区氨基酸序列同一性(例如，至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％可变区同一性)。

在一些实施例中，本文所述的抗C5抗体可以包含与人新生儿Fc受体(FcRn)结合的变体人Fc恒定区，其结合人新生儿Fc受体的亲和力大于与从其衍生出变体人Fc恒定区的天然人Fc恒定区的亲和力。Fc恒定区可以包含一个或多个(例如，两个、三个、四个、五个、六个、七个或八个或更多个)相对于从其衍生出变体人Fc恒定区的天然人Fc恒定区的氨基酸取代。例如，取代可以增加含有变体Fc恒定区的IgG抗体在pH 6.0下对FcRn的结合亲和力，同时保持相互作用的pH依赖性。用于测试抗体的Fc恒定区中的一个或多个取代是否增加Fc恒定区在pH 6.0对FcRn的亲和力(同时保持相互作用的pH依赖性)的方法是本领域已知的并且在工作实例中举例说明(WO 2015134894和美国专利号9,079,949，其每个的披露内容通过引用以其整体并入本文)。

增强抗体Fc恒定区对FcRn的结合亲和力的取代是本领域已知的，包括，例如，(1)M252Y/S254T/T256E三重取代(Dall’Acqua,W.等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],281:23514 24,2006)；(2)M428L或T250Q/M428L取代(Hinton,P.等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],279:6213 6,2004；Hinton,P.等人,J.Immunol.[免疫学杂志],176:346 56,2006)；和(3)N434A或T307/E380A/N434A取代(Petkova,S.等人,Int.Immunol.[国际免疫学],18:1759 69,2006)。另外的取代配对，例如，P257I/Q311I、P257I/N434H和D376V/N434H，也已被描述(Datta-Mannan,A.等人,J.Biol.Chem.[生物化学杂志],282:1709 17,2007)。每个引用的参考文献的全部教导通过引用并入本文。

在一些实施例中，变体恒定区在EU氨基酸残基255处具有对缬氨酸的取代。在一些实施例中，变体恒定区在EU氨基酸残基309处具有对天冬酰胺的取代。在一些实施例中，变体恒定区在EU氨基酸残基312处具有对异亮氨酸的取代。在一些实施例中，变体恒定区在EU氨基酸残基386处具有取代。

在一些实施例中，变体Fc恒定区包含不超过30个(例如，不超过29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3或2)相对于衍生其的天然恒定区的氨基酸取代、插入或缺失。在一些实施例中，变体Fc恒定区包含一个或多个选自由以下组成的组的氨基酸取代：M252Y、S254T、T256E、N434S、M428L、V259I、T250I和V308F。在一些实施例中，变体人Fc恒定区在位置428包含甲硫氨酸并且在位置434包含天冬酰胺，其各自以EU编号。在一些实施例中，变体Fc恒定区包含428L/434S双取代，如例如美国专利号8,088,376(其披露内容通过引用以其整体并入本文)中所描述。

在一些实施例中，这些突变的精确位置可能由于抗体工程而从天然人Fc恒定区位置偏移。例如，当在IgG2/4嵌合Fc中使用时，428L/434S双取代可对应于描述于美国专利号9,079,949(其披露内容通过引用以其整体并入本文)中的M429L和N435S变体中的429L和435S。

在一些实施例中，变体恒定区相对于天然人Fc恒定区包含在氨基酸位置237、238、239、248、250、252、254、255、256、257、258、265、270、286、289、297、298、303、305、307、308、309、311、312、314、315、317、325、332、334、360、376、380、382、384、385、386、387、389、424、428、433、434或436(EU编号)处的取代。在一些实施例中，取代选自由以下组成的组：位置237处甲硫氨酸取代甘氨酸；位置238处丙氨酸取代脯氨酸；位置239处赖氨酸取代丝氨酸；位置248处异亮氨酸取代赖氨酸；位置250处丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、甲硫氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸取代苏氨酸；位置252处苯丙氨酸、色氨酸或酪氨酸取代甲硫氨酸；位置254处苏氨酸取代丝氨酸；位置255处谷氨酸取代精氨酸；位置256处天冬氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺取代苏氨酸；位置257处丙氨酸、甘氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、丝氨酸、苏氨酸或缬氨酸取代脯氨酸；位置258处组氨酸取代谷氨酸；位置265处丙氨酸取代天冬氨酸；位置270处苯丙氨酸取代天冬氨酸；位置286处丙氨酸或谷氨酸取代天冬酰胺；位置289处组氨酸取代苏氨酸；位置297处丙氨酸取代天冬酰胺；位置298处甘氨酸取代丝氨酸；位置303处丙氨酸取代缬氨酸；位置305处丙氨酸取代缬氨酸；位置307处丙氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、精氨酸、丝氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸取代苏氨酸；位置308处丙氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、谷氨酰胺或苏氨酸取代缬氨酸；位置309处丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、脯氨酸或精氨酸取代亮氨酸或缬氨酸；位置311处丙氨酸、组氨酸或异亮氨酸取代谷氨酰胺；位置312处丙氨酸或组氨酸取代天冬氨酸；位置314处赖氨酸或精氨酸取代亮氨酸；位置315处丙氨酸或组氨酸取代天冬酰胺；位置317处丙氨酸取代赖氨酸；位置325处甘氨酸取代天冬酰胺；位置332处缬氨酸取代异亮氨酸；位置334处亮氨酸取代赖氨酸；位置360处组氨酸取代赖氨酸；位置376处丙氨酸取代天冬氨酸；位置380处丙氨酸取代谷氨酸；位置382处丙氨酸取代谷氨酸；位置384处丙氨酸取代天冬酰胺或丝氨酸；位置385处天冬氨酸或组氨酸取代甘氨酸；位置386处脯氨酸取代谷氨酰胺；位置387处谷氨酸取代脯氨酸；位置389处丙氨酸或丝氨酸取代天冬酰胺；位置424处丙氨酸取代丝氨酸；位置428处丙氨酸、天冬氨酸、苯丙氨酸、甘氨酸、组氨酸、异亮氨酸、赖氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、脯氨酸、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、缬氨酸、色氨酸或酪氨酸取代甲硫氨酸；位置433处赖氨酸取代组氨酸；位置434处丙氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、丝氨酸、色氨酸或酪氨酸取代天冬酰胺；以及位置436处组氨酸取代酪氨酸或苯丙氨酸，均采用EU编号。

在一个实施例中，抗体在pH 7.4和25℃(以及，否则，在生理条件下)以至少0.1(例如至少0.15、0.175、0.2、0.25、0.275、0.3、0.325、0.35、0.375、0.4、0.425、0.45、0.475、0.5、0.525、0.55、0.575、0.6、0.625、0.65、0.675、0.7、0.725、0.75、0.775、0.8、0.825、0.85、0.875、0.9、0.925、0.95或0.975)nM的亲和解离常数(K_D)与C5结合。在一些实施例中，抗C5抗体或其抗原结合片段的K_D不大于1(例如，不大于0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3或0.2)nM。

在其他实施例中，[(抗体针对C5在pH 6.0和25℃时的K_D)/(抗体针对C5在pH 7.4和25℃时的K_D)]大于21(例如，大于22、23、24、25、26、27、28、29、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500或8000)。

抑制因子B激活或活性的化合物

在某些实施例中，补体抑制剂抑制因子B的激活。补体抑制剂可以结合因子B，例如从而抑制激活。示例性药剂包括抗体、抗体片段、肽、小分子和适体。抑制因子B的示例性抗体描述于美国专利号20050260198。在某些实施例中，分离的抗体或抗原结合片段选择性地结合第三短共有重复(SCR)结构域内的因子B。在某些实施例中，抗体防止形成C3bBb复合物。在某些实施例中，抗体或抗原结合片段防止或抑制因子D对因子B的切割。在某些实施例中，补体抑制剂是抗体、小分子、适体或多肽(其与因子B上与美国专利公开号20050260198中描述的抗体基本相同的结合位点结合)，或者是抑制因子B局部表达的RNAi剂。结合并抑制因子B的肽可使用本领域已知的方法鉴定。

抑制因子D活性的化合物

在某些实施例中，补体抑制剂抑制因子D。补体抑制剂可以结合因子D，例如从而抑制因子D。示例性药剂包括抗体、抗体片段、肽、小分子和适体。虽然由于其相对低的血清浓度和抑制替代途径激活的能力，已提出因子D作为全身补体抑制的理想靶标，但本披露涉及用以抑制因子D的局部施用的药剂的治疗性潜力。抑制因子D的抗体描述于美国专利号7,112,327中。在某些实施例中，补体抑制剂是抗体、小分子、适体或多肽，其与因子D上与美国专利号7,112,327中描述的抗体基本相同的结合位点结合。抑制替代途径激活并被认为抑制因子D的示例性多肽披露于美国公开号20040038869。可以使用本领域已知的方法鉴定结合并抑制因子D的肽。

多模式补体抑制剂/调节剂

可用于本文所述方法的补体抑制剂可以结合多于一种补体蛋白和/或抑制补体激活途径中的多于一个步骤。此类补体抑制剂在本文中称为“多模式的”。

补体抑制剂可以是例如病毒补体控制蛋白(VCCP)(美国专利号7,947,267和WO2006042252)。在某些实施例中，VCCP是痘病毒补体控制蛋白(PVCCP)或疱疹病毒补体控制蛋白(HVCCP)。

VCCP可抑制经典补体途径、替代补体途径、凝集素途径或其中任何两种或更多种。VCCP，例如，PVCCP，可以与C3b、C4b或两者结合。PVCCP可以包含一个或多个推定的肝素结合位点(K/R--X--K/R)和/或具有整体正电荷。在一些实施例中，PVCCP包含至少3个SCR模块(例如，模块1-3)，例如4个SCR模块。PVCCP蛋白可以是成熟PVCCP的前体(即，可以包括在病毒感染的细胞中表达该蛋白时通常被切割掉的信号序列)或可以是成熟形式(即，缺少信号序列)。

牛痘补体控制蛋白(VCP)已被证明通过其以下能力抑制补体激活的经典途径：与C3和C4结合并作为这些组分的经因子I介导的裂解的辅助因子以及促进已有转化酶的衰变(Kotwal,G.等人,Science[科学],250:827-30,1990；McKenzie,R.等人,J.Infect.Dis.[感染性疾病杂志],166:1245-50,1992)。它还被证明通过导致C3b裂解为iC3b来抑制替代途径，从而阻止替代途径C3转化酶的形成(Sahu,A.等人,J.Immunol.[免疫学杂志],160,5596-604,1998)。因此，VCP在多个步骤阻断补体激活并降低促炎趋化因子C3a、C4a和C5a的水平。VCP的同源物(例如天花补体酶抑制剂(SPICE)或其抑制补体激活的任何部分，例如，含有四个SCR的SPICE相关多肽)可用于本文所述的方法中。此外，来自牛痘病毒(IMP)或猴痘病毒(MCP)的补体控制蛋白也可用于本文所述的方法中。

除了VCCP，还存在许多其他病毒蛋白，它们干扰补体途径中的一个或多个步骤，并且可以用于本文所述的方法中，例如，来自HSV-1、HSV-2、VZV、PRV、BHV-1、EHV-1和EHV-4的糖蛋白gC(Schreurs,C.等人,J.Virol.[病毒学杂志],62:2251-7,1988)。除了VZV，这些病毒编码的gC蛋白与C3b结合(Friedman,H.等人,Nature[自然],309:633-5,1984)并且gC1(来自HSV-1)加速经典途径C3转化酶的衰变并抑制备解素和C5与C3的结合。上述蛋白统称为病毒补体干扰蛋白(VCIP)。通过多种方式中的任一种，例如干扰补体激活的一个或多个步骤、加速补体组分的衰变和/或增强补体调节蛋白的活性，这些VCIP被称为抑制补体。任何这些蛋白或其衍生物，例如，其片段或变体可用作本文所述方法中的治疗剂。

另外的补体抑制剂、调节剂、混合物和修饰

多种其他补体抑制剂可用于本文所述方法的各种实施例中。在一些实施例中，补体抑制剂是天然存在的哺乳动物补体调节蛋白或其片段或衍生物。补体调节蛋白可以是例如CR1、DAF、MCP、CFH或CFI。在一些实施例中，补体调节多肽是在其天然存在状态下通常与膜结合的多肽。在一些实施例中，使用此类多肽的缺少跨膜和/或细胞内结构域中的一些或全部的片段。例如，可以使用可溶形式的补体受体1(sCR1)。例如，可以使用称为TP10或TP20(艾万特疗法公司(Avant Therapeutics))的化合物。C1抑制剂(C1-INH)也是有用的。在一些实施例中，使用可溶性补体控制蛋白，例如CFH。在一些实施例中，多肽被修饰以增加其溶解度。

C1s抑制剂是有用的(例如，美国专利号6,515,002描述了抑制C1s的化合物(呋喃基和噻吩基脒、杂环脒和胍)；美国专利号6,515,002和7,138,530描述了抑制C1s的杂环脒；美国专利号7,049,282描述了抑制经典途径激活的肽；美国专利号7,041,796披露了C3b/C4b补体受体样分子及其抑制补体激活的用途；美国专利号6,998,468披露了补体激活的抗C2/C2a抑制剂；美国专利号6,676,943披露了来自肺炎链球菌的人补体C3降解蛋白)。

在本文所述的方法中涵盖使用两种或更多种补体抑制剂的组合疗法。两种或更多种补体抑制剂可以在相同的组合物中提供。在某些实施例中，补体抑制剂结合两种或更多种不同的补体组分。在某些实施例中，补体抑制剂结合两种或更多种不同的可溶性补体蛋白。在某些实施例中，补体抑制剂抑制选自C3、C5、C6、C7、C8、C9、因子B和因子D中的至少两种补体蛋白的激活或活性。

实例

实例1

使用

技术平台通过同时免疫沉淀/免疫分析来表征尿细胞外囊泡(uEV)。

使用包被有抗体的xMAP珠的阵列，针对经典囊泡标志物CD9、CD63和CD81，以富集尿液中的离散EV亚群。然后分析每个珠组是否存在其他生物标志物，这些生物标志物定义了亚群表型并将其联系到组织起源。通过这种方式，建立了非侵入性“液体活检”方法，用于对特定肾病的关键生物标志物进行采样和监测，以进行鉴别诊断、预后评估和/或对治疗反应的纵向监测。

电子显微镜：

电子显微镜样品制备：

1)从新鲜尿液+蛋白酶抑制剂开始。离心机2.5K x g；收集上清液；

2)使用ExoQuick Ultra TC试剂盒富集至300uL；

3)产物的NTA±EV的ExoGlow和总颗粒密度；

4)在Microcon 10K mwco中浓缩制剂至30uL；

5)添加等体积的Karnovsky固定液；

6)仅对总颗粒密度重复NTA；

7)成像过程。

根据NTA在尿液ExoQuick富集中的EV标志物的相对丰度显示在图1中。尿液EV和非EV颗粒的EM成像显示在图2中。EM图像对象中Feret直径的分布显示在图3中。

质谱：

串联质谱标签(TMT)标记：

1)从新鲜尿液+蛋白酶抑制剂开始。离心机300x g；收集上清液；

2)使用ExoQuick-Ultra TC试剂盒进行富集；

3)还原和酰胺化巯基键；

4)在80％丙酮中沉淀总蛋白，过夜，-20℃；

5)在缓冲液中复溶并用胰蛋白酶消化；

6)用TMT^TM等压标签标记片段；

7)合并样品并干燥；

8)通过Ultimate3000分离片段；

9)通过OrbiTrap Lumos分析LC级分。

根据PSM的前25种蛋白的相对丰度显示在图4中。

表1：根据TMT的关键生物标志物的平均丰度

Luminex测定开发：

dUC样品制备：

2)将S300转移到Ultra-Clear^TM管中并在4℃以200K x g离心过夜；

3)在冷PBS+蛋白酶抑制剂+200mg/mL DTT中重悬浮和合并沉淀；

4)4℃200K x g离心6小时；

5)将沉淀重悬浮于PBS+蛋白酶抑制剂中；

6)等分分装并储存≤-70℃。

EV的FSL-生物素标记：

FSL-生物素是Kode^TM技术构建体，旨在用生物素标记疏水表面。FSL-生物素由以下构成：生物素(维生素B7)单体缀合至带有马来酰亚胺的羧甲基甘氨酸基接头缀合至二油酰磷脂酰乙醇胺的激活型己二酸酯衍生物(KODE Biotech网站：kodebiotech.com/sales/products/product_info.php？id＝129&cat＝rdt(2018年9月27日访问)。

Luminex测定设计：

1)使用1E6 EV/孔的dUC富集型uEV；

2)添加等体积的经标记的MagPlex^TM珠；

3)孵育过夜，4℃，轻轻振荡；

4)用PBS洗涤2X；

5)添加以下中任一

a.PBS/BSA中的生物素化多克隆抗体+SAPE

b.PBS中的FSLB+SAPE；

6)孵育1小时，RT，轻轻振荡；

7)用PBS洗涤2X；

8)用鞘液清洗2X；

9).在Luminex机器上读取，高PMT。

图5显示了根据Luminex的尿液EV亚群的检测。如图6显示仅在CD9⁺EV上检测到的肾PODXL。

这些结果表明该方案富集了uEV并且CD9+亚群包含PODXL，这是肾组织起源的标志物。通过提高灵敏度和特异性来优化该方案应该改善uEV富集并鉴定更多的肾脏生物标志物。一旦优化，这种方法可以应用于各种疾病人群，以与健康供体相比进行差异分析。

实例2

使用

技术平台通过同时免疫沉淀/免疫分析尿液细胞外囊泡(uEV)来评估器官和组织中的补体沉积。

使用包被有抗体的xMAP珠的阵列，针对肾单位的限定区域：肾小球足细胞的足萼糖蛋白(PODXL)或曲小管的水通道蛋白2(AQP2)。然后分析每个珠组是否存在已沉积在来源细胞的质膜(PM)上的补体标志物。通过这种方式，尿液EV可用于监测肾单位中的补体沉积，以进行鉴别诊断、预后评估和/或纵向监测对治疗的反应。

EV携带来自其亲本细胞的表面标志物。这些标志物可用于根据细胞来源对EV进行免疫分离。PODXL仅在肾小球的足细胞上产生。AQP2衍生自近曲小管和远曲小管。来自RBC的血型糖蛋白A(GYPA)可用于测量从血浆泄漏到滤液中的EV。循环EV浓度在炎症和血栓形成条件下升高。一些EV在其表面带有补体调节剂，例如CD55和CD59。细胞可以使用EV从其表面脱落低浓度的MAC复合物。EV可作为凝血酶产生的场所。

Luminex测定开发：

测定设计目标：

为了成为肾脏活检的有用且实用的替代，本测定通常包括以下特征：例如(a)从冷冻样品开始的能力；(b)需要最少的处理来实现目标；(c)简单性和同时且一致地分析多个样品的能力；以及(e)保持膜完整性。这意味着在luminex珠IP之前对囊泡群体的预富集选择通常被最小化。

Luminex测定设计：

1)使用50uL/孔的在PBS/BSA中1:2稀释的尿液；

2)添加1000个/孔的经标记的xMAPTM珠；

3)孵育过夜，4℃，轻轻振荡；

4)用PBS洗涤2X；

5)添加在PBS/BSA中的生物素化多克隆抗体+SAPE；

6)孵育1小时，RT，轻轻振荡；

7)用PBS洗涤2X；

8)用鞘液清洗2X；

9)在Luminex机器上读取，高PMT。

表2：

Luminex珠可以鉴定肾小球特异性EV。如图7所示：Rb-α-PODXL可以在含有CD9或CD40L的EV上检测到，但不能在含有CD63或CD81的EV上检测到；使用2种不同的α-PODXL抗体发现了信号；只有在两种蛋白都位于同一结构上时才会发生。

结果表明，肾单位特异性EV水平随疾病增加。如图8所示：IgAN尿液中的PODXL+EV比对照尿液中更多；在CD9+/PODXL+和CD40+/PODXL+EV群体中均可见增加；并且CD63+和CD81+EV仍为阴性。

Luminex珠可以测量EV膜上的补体。如图9所示：C3c和C5b-9在LN患者尿液中的CD9+和PODXL+珠上均检测到，但在CD63+或CD81+珠上未检测到；这些结果已在10个LN、6个IgAN和7个对照样品中得到证实(数据未显示)；与对照样品相比，LN和IgAN样品都可以在PODXL+和AQP2+EV上具有C3、C5b-9、C4和C1q沉积。

结果还表明，肾小球C5b-9沉积随着依库珠单抗治疗而减少。如图10所示：aHUS患者可能有C3、C5b-9、C1q和C4的任意组合沉积在足细胞膜上；在依库珠单抗治疗期间C3没有变化；以及在依库珠单抗治疗期间，EV上的C5b-9和C1q水平迅速降低。

肾活检是目前慢性肾脏疾病鉴别诊断的标准。然而，严重并发症的风险限制了患者的选择和检测频率。EV提供了易于可及的窗口，可以在治疗前和治疗期间监测肾膜上正在进行的补体沉积。它还允许精确的细胞鉴定沿肾单位的补体攻击。

这种技术可以扩展到肾脏和尿液以外的任何生物样品。任何具有独特PM标志物的目的细胞类型或组织都可用于查询补体沉积。图11提供了可以根据本披露进行分析的标志物的示意图。

实例3：使用经修饰的膜结合荧光团进行生物测定使EV数据归一化

为了改善测定的稳健性，重要的是测量每个捕获抗体包被的LUMINEX珠上分离的膜囊泡的数量。在一些方面，实施“归一化”步骤是由于个体供体之内和之间的囊泡/珠的和囊泡/mL样品基质的可变性。因此，预期经修饰的膜结合荧光团-半胱氨酸-赖氨酸-棕榈酰基团(mCLING；塞纳提克系统公司(Synaptic Systems)，目录号710-MCK)可以改进测定。一方面，通过生物素化修饰mCLING，并将经修饰的mCLING添加到免疫珠捕获的EV的重复孔中的每个测试样品中。洗涤每组珠后，添加链霉亲和素藻红蛋白(SA-PE)，并测量mCLING样品和匹配的分析物样品的荧光强度。

在一项研究中，尿液EV获得来自健康志愿者(对照)和狼疮肾炎(LN)和IgA肾病(IgAN)患者，被一组抗体捕获珠富集，然后在复制孔中针对以下进行表面表型分析：(a)总EV，使用生物素化的mCLING或(b)补体iC3b，使用Quidel抗体A710(单克隆，新抗原特异性)。分析物(iC3b)的归一化信号是通过取iC3b信号与生物素化-mCLING信号的比率(信号＝(b)/(a))而生成的。结果示于图12中，其是iC3b的代表性归一化EV数据。归一化反应(显示在y轴上)表示每个标志物报告的平均荧光强度值(如x轴所示)除以它们相应的mCLING平均荧光强度值。

对照代表来自健康供体的相同样品。针对每个标志物一起表示患者(LN或IgAN)。

数据显示，某些EV(例如那些对CD9和PODXL呈阳性的EV)选择性地含有高于背景水平的补体(例如，iC3b)沉积(如图12中的水平虚线所示)。数据显示，激活的补体途径蛋白(如iC3b)与补体介导的疾病病理生理学相关，如分别从两种疾病亚群LN和IgAN获得的EV所提示。

应当理解，贯穿本说明书给出的每个最大数值限制都包括每个较低数值限制，就好像这种较低数值限制在本文中被明确地写出一样。贯穿本说明书给出的每个最小数值限制都将包括每个较高数值限制，就好像这些较高数值限制在本文中被明确写出一样。贯穿本说明书给出的每个数值范围都将包括落入这种更宽的数值范围内的每个较窄数值范围，就好像这些较窄数值范围在本文中被明确写出一样。

除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。本文描述了用于本发明的方法和材料；也可以使用本领域已知的其他合适的方法和材料。材料、方法和实例仅是说明性的并不旨在是限制性的。本文提及的所有出版物、专利申请、专利、序列、数据库条目(例如，PUBMED、NCBI或UNIPROT登录号)和其他参考文献通过引用以其整体并入。在有矛盾的情况下，将以本说明书(包括定义)为准。

尽管已经说明和描述了本发明的特定实施例，但是对于本领域技术人员来说显而易见的是，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以进行各种其他变化和修改。因此，旨在在所附权利要求中涵盖在本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims

1.一种检测来自受试者的生物样品中的补体活性的方法，该方法包括：

(a) 用至少一种第一捕获抗体或其抗原结合片段分离包含细胞外囊泡（EV）或其膜结合部分的该生物样品的一部分以捕获该EV或其膜结合部分上的至少一种第一标志物，其中该第一标志物包含EV特异性标志物或展示在该EV上的组织特异性标志物，

(b) 任选地使该样品的一部分与至少一种第二捕获抗体或其抗原结合片段接触以捕获该EV或其膜结合部分上的至少一种第二标志物；并且

(c) 用对捕获的EV或其膜结合部分上的补体系统相关组分特异性的至少一种检测抗体或其抗原结合片段定性或定量地检测该补体系统相关组分的存在或水平，从而检测该生物样品中的补体激活。

2.如权利要求1所述的方法，其中该第一捕获标志物包含EV特异性标志物并且该任选的第二捕获标志物包含展示在该EV或其膜结合部分上的组织特异性标志物。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中检测到该第一捕获标志物和该第二捕获标志物两者存在，该第一捕获标志物包含EV特异性标志物并且该第二捕获标志物包含组织特异性标志物。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该生物样品来自组织、器官或体液。

5.如权利要求1-4中任一项所述的方法，其中该生物样品包含来自膀胱细胞、肾细胞、全血、红细胞、血小板、血清、血浆、除了血清或血浆之外的血液级分、淋巴、脑脊液（CSF）、唾液、眼泪、阴道排液、精液、腺体分泌物、渗出液、囊肿或粪便内容物、灌洗液或腹水的EV或其膜结合部分。

6.如权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该生物样品包含来自以下的EV或其膜结合部分：肾小球足细胞、肾曲小管或膀胱上皮；或红细胞（RBC）。

7.如权利要求1-6中任一项所述的方法，其中该第一捕获抗体或其抗原结合片段缀合至第一固体支持物，任选地该第二捕获抗体或其抗原结合片段缀合至第二固体支持物，并且该检测抗体缀合至可检测标志物。

8.如权利要求7所述的方法，其包括使该生物样品的一部分与该第一捕获抗体或其抗原结合片段和该第二捕获抗体或其抗原结合片段接触，其中该第一捕获抗体或其抗原结合片段和该第二捕获抗体或其抗原结合片段缀合至相同支持物或不同支持物。

9.如权利要求7所述的方法，其中该可检测标志物选自由以下组成的组：荧光团、色原和生物素。

10.如权利要求7-9中任一项所述的方法，其中该可检测标志物是最大吸收在500-1000nm之间、最大发射在550-1100 nm之间的荧光团。

11.如权利要求7-10中任一项所述的方法，其中该可检测标志物是藻红蛋白（PE）。

12.如权利要求7-10中任一项所述的方法，其中该可检测标志物是生物素。

13.如权利要求7-12中任一项所述的方法，其中该第一和第二固体支持物独立地选自由以下组成的组：纳米颗粒、微粒、珠、磁珠、纳米结构、组织培养板、二氧化硅和纳米基质。

14.如权利要求1-13中任一项所述的方法，其中：

该第一标志物选自由细胞外囊泡相关蛋白组成的组；

任选地，该第二标志物选自由组织特异性细胞外囊泡相关蛋白组成的组；并且

该补体系统相关组分选自由以下组成的组：(a) 替代途径（AP）的组分，(b) 与经典途径（CP）相关的组分，和 (c) 与凝集素途径（MBL）相关的组分。

15.如权利要求1-14中任一项所述的方法，其中该补体系统相关组分选自由以下组成的组：(a) 替代途径（AP）的组分和 (b) 与经典途径（CP）相关的组分。

16.如权利要求14所述的方法，其中该补体系统相关组分是选自由以下组成的组的蛋白：C3、C5b-9、C4、C1q、C9、C3b、iC3b、TF、CRP、pCRP、MAC、CD59、CD55、CR1、C5aR1、和C5a。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中：

该第一标志物选自由以下组成的组：ALIX、TSG101、CD9、CD63、CD81、CD40L、CD26、CD31、CD45、CD2、CD11a、CD24、CD55、CD59、CF106、CD56、CD51、CD82、整联蛋白、四次穿膜蛋白、膜联蛋白、HSP90、HSP70、同线蛋白-1、ADAM10、EHD4、肌动蛋白、Rab5、网格蛋白、筏蛋白-1、MHCI、MHC II、辅肌动蛋白-4、GP96、EHD4、Mitofilin、和LAMP2；

该第二标志物选自由以下组成的组：足萼糖蛋白（PODXL）、水通道蛋白2（AQP 2）、尿溶蛋白1b（UPK1b）、足蛋白（NPHS2）、血型糖蛋白A（GYPA）、粘蛋白-1、2型Na-K-2Cl共转运蛋白（NKCC2）、水通道蛋白1（AQP 1）、α-谷胱甘肽-S-转移酶（α-GST）、尿调节素（TH）、钙结合蛋白-D28K（CalD）、巨蛋白、cubilin、肾病蛋白（Nphs1）、密封蛋白-1、膜联蛋白-V、突触足蛋白抗体（Synpo）、维尔姆斯肿瘤蛋白（Wt1）、带3、stomatin（STOM）、BGP1、珠蛋白、血型糖蛋白B、Rh多肽、和Rh糖蛋白；并且

该补体蛋白选自由以下组成的组：MAC、C3、C5b-9、C4、C1q和C9。

18.如权利要求17所述的方法，其中该生物样品包含来自肾细胞的EV，并且该第二标志物是选自下组的肾特异性EV标志物，该组由以下组成：足萼糖蛋白（PODXL）、水通道蛋白2（AQP 2）、尿溶蛋白1b（UPK1b）和足蛋白（NPHS2）。

19.如权利要求17所述的方法，其中该样品包含来自红细胞（RBC）的EV，并且该第二标志物是选自血型糖蛋白A（GYPA）的RBC特异性EV标志物。

20.如权利要求17所述的方法，其中该样品包含对作为第一标志物的CD81和/或作为第二标志物的尿溶蛋白1B（UPK1B）呈阴性的EV。

21.如权利要求1所述的方法，其中该捕获标志物和该检测标志物存在于相同的EV或其膜结合部分中。

22.如权利要求1-21中任一项所述的方法，其进一步包括确定该受试者是否患有补体介导的疾病或有患补体介导的疾病的风险，包括将该EV或其膜结合部分上该补体途径的组分的存在或水平与对照进行比较。

23.如权利要求22所述的方法，其中该对照包含来自健康受试者的相同样品。

24.如权利要求22或23所述的方法，其包括表明该受试者患有补体介导的疾病或有患补体介导的疾病的风险，条件是：与对照相比，从该受试者获得的EV或其膜结合部分上该补体途径的组分的水平或存在增强。

25.一种用于受试者中补体介导的疾病的诊断或预后评估的方法，该方法包括：

(a) 从该受试者获得包含细胞外囊泡（EV）或其膜结合部分的样品，

(b) 使该样品的一部分与至少一种第一捕获抗体或其抗原结合片段接触以捕获这些EV或其一个或多个膜结合部分上的至少一种第一标志物；

(c) 任选地使该样品的一部分与至少一种第二捕获抗体或其抗原结合片段接触以捕获这些EV或其一个或多个膜结合部分上的至少一种第二标志物；

(d) 将包含该至少一种第一标志物和任选地该至少一种第二标志物的捕获的EV或其膜结合部分与对补体系统相关组分特异性的至少一种检测抗体或其抗原结合片段接触；并且

(e) 定性或定量地检测该检测抗体或其抗原结合片段，以测量该EV或其膜结合部分上该补体途径的组分的存在或水平，其中与对照相比，该受试者的样品中该补体途径的组分的存在或水平的升高表明该受试者患有该补体介导的疾病或有患该补体介导的疾病的风险。

26.如权利要求25所述的方法，其中该第一标志物包含EV特异性标志物或展示在EV上的组织特异性标志物。

27.如权利要求25所述的方法，其中该第一标志物包含EV特异性标志物并且该第二标志物包含展示在EV上的组织特异性标志物。

28.一种用于监测受试者对用补体调节剂治疗补体介导的疾病的反应的方法，该方法包括：

(a) 在该治疗前后从该受试者获得包含细胞外囊泡（EV）或其膜结合部分的样品，

(e) 定性或定量地检测该检测抗体或其抗原结合片段，以测量该EV或其膜结合部分上该补体途径的组分的存在或水平，其中与用该补体调节剂治疗前相比，用该补体调节剂治疗后该受试者的样品中该补体途径的组分的存在或水平的减弱表明该受试者对该补体调节剂有反应。

29.如权利要求28所述的方法，其中补体介质是补体5（C5）抑制剂、补体5a（C5a）抑制剂、补体5受体（C5R1）抑制剂、补体3（C3）抑制剂、因子D（FD）抑制剂、因子H（FH）抑制剂、因子B（FB）抑制剂、MASP2抑制剂、MASP3抑制剂、备解素抑制剂或其组合。

30.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其中该疾病是炎性疾病或血栓性疾病。

31.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其中该疾病是血栓性血液病或血栓性肾病。

32.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其中该疾病是选自由以下组成的组的肾病：非典型溶血性尿毒症综合征（aHUS）、C3肾小球病（C3G）、致密物沉积病（DDD）、膜增生性肾小球肾炎（MPGN）、狼疮性肾炎（LN）、IgA肾病（IN）、狼疮性肾炎（LN）、膜性肾病（MN）、移植患者血液透析引起的并发症、抗体介导的排斥（AMR）和抗中性粒细胞胞浆抗体（ANCA）相关的血管炎（AAV）。

33.如权利要求25-29中任一项所述的方法，其中该疾病是选自由以下组成的组的血液疾病：阵发性睡眠性血红蛋白尿症（PNH）、非典型溶血性尿毒症综合征（aHUS）、实体器官移植或造血干细胞移植引起的继发性HUS、血栓性微血管病（TMA）和冷凝集素病（CAD）。

34.如权利要求1-33中任一项所述的方法，其中该检测包括免疫测定法（例如，ELISA或RIA）、电子显微镜（EM）、串联质谱标签（TMT）、发光测定法（例如，LUMINEX）或荧光免疫测定法（FIA）。

35.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中检测步骤以多路复用形式进行。

36.如权利要求1-34中任一项所述的方法，其中通过测量一个样品中的几个离散组织中的标志物和/或在单次测定中监测多个潜在补体蛋白和途径来进行检测步骤。

37.如权利要求1-36中任一项所述的方法，其中EV富集步骤在该第一标志物和任选的该第二标志物与相应的抗体或其抗原结合片段接触之前进行。

38.如权利要求1-37中任一项所述的方法，其中从非侵入性液体活检方案获得该生物样品。

39.一种检测受试者的肾组织中的补体激活的方法，该方法包括：

(a) 将该受试者的尿液样品与第一捕获抗体或其抗原结合片段接触，该尿液样品包含细胞外囊泡（EV）或其膜结合部分，该细胞外囊泡（EV）或其膜结合部分包含第一标志物，该第一标志物是EV特异性标志物或展示在EV或其膜上的组织特异性标志物，该第一捕获抗体或其抗原结合片段对该第一标志物具有特异性，从而捕获含有该第一标志物的EV或膜；

(b) 任选地使该样品与第二捕获抗体或其抗原结合片段接触以捕获包含不同于该第一标志物的第二捕获标志物的EV或其一个或多个膜结合部分；并且

(c) 用对捕获的EV或其膜结合部分上补体途径的组分特异的抗体或其抗原结合片段，定性或定量地检测该组分的存在或水平，从而检测该生物样品中的补体激活；

其中该EV特异性标志物选自由CD9、CD63和CD81组成的组，

该组织特异性标志物选自由以下组成的组：

(1) 对肾小球足细胞特异性的足萼糖蛋白（PODXL）；

(2) 对曲小管上皮特异性的水通道蛋白2（AQP2）；

(3) 对膀胱上皮特异性的尿溶蛋白1b（UPK1b）；以及

(4) 对红细胞（RBC）特异性的血型糖蛋白A（GYPA），并且

该补体途径的组分选自由MAC、C3、C5b-9、C4、C1q、和C9组成的组。

40.以下的用途：至少一种第一捕获抗体以捕获至少一种第一靶标；至少一种第二捕获抗体以捕获至少一种第二靶标；和至少一种对补体蛋白特异性的检测抗体以检测捕获的至少一种第一靶标、捕获的至少一种第二靶标或两者的量。

41.一种筛选用于补体调节的测试化合物的方法，该方法包括

(a) 在向患有补体介导的疾病的受试者（例如，动物如小鼠、兔、仓鼠、绵羊、美洲驼、狗、猴、黑猩猩或人）施用该测试化合物之前和之后从该受试者获得含有细胞外囊泡（EV）或其膜结合部分的样品；

(d) 将捕获的EV或其膜结合部分与对补体系统相关组分特异性的至少一种检测抗体或其抗原结合片段接触；并且

(e) 定性或定量地检测该检测抗体或其抗原结合片段，以测量该EV或其膜结合部分上补体组分的存在或水平，其中与施用该测试化合物之前相比，施用该测试化合物之后该受试者的样品中补体组分的存在或水平的调节（例如，增加或减少；优选减少）表明该测试化合物能够调节补体。

42.如权利要求41所述的方法，其中该测试化合物特异性地能够调节C1q、C1、C1s、C2、MASP-2、MASP-3、因子D、因子B、备解素（因子P）、因子H、C3/C5转化酶、C5、C5a/C5aR、C3a/C3aR、C6、或CD59。

43.如权利要求41所述的方法，其中该测试化合物是单克隆抗体或小分子或siRNA/RNAi。

44.如权利要求41所述的方法，其中将该测试化合物的调节活性与具有补体调节活性的分子的调节活性进行比较。

45.如权利要求44所述的方法，其中该分子在表A中提供。