CN115666628A

CN115666628A - 用于治疗锯齿状结肠直肠癌的组合物和方法

Info

Publication number: CN115666628A
Application number: CN202180036499.XA
Authority: CN
Inventors: J·马斯喀特; M·T·迪亚斯-梅科; A·杜然; Y·中西
Original assignee: Purebus College Of Medical Exploration Burnham Sanford
Current assignee: Purebus College Of Medical Exploration Burnham Sanford
Priority date: 2020-03-20
Filing date: 2021-03-19
Publication date: 2023-01-31
Also published as: US20230364205A1; WO2021188887A2; AU2021237705A1; MX2022011563A; EP4121098A2; KR20230004497A; IL296622A; EP4121098A4; CA3176067A1; WO2021188887A3; JP2023518544A; BR112022018675A2

Abstract

本文公开了用于鉴定受试者患有锯齿状结肠直肠癌(CRC)的方法，以及人锯齿状CRC的模型。本文还提供了用于治疗所述受试者的锯齿状CRC的方法。

Description

用于治疗锯齿状结肠直肠癌的组合物和方法

相关申请的交叉引用

本申请要求于2020年3月20日提交的美国临时专利申请第62/992,819号的权益。根据35 U.S.C.§119要求优先权。上述专利申请如在本文中完全阐述般通过引用并入。

关于联邦赞助的研究或开发的声明

本发明是根据美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)授予的授权号R01CA207177、R01CA172025、R01CA192642和R01CA218254在政府支持下进行的。政府享有本发明中的某些权利。

背景技术

结肠直肠癌(CRC)的锯齿状腺癌亚型占所有CRC的15％-30％，并且是侵袭性和抗治疗性的。锯齿状CRC通过最常见于近端结肠的前期病变发展。锯齿状CRC通常以内窥镜检查的方式通过检测前期病变来诊断。然而，由于技术或内窥镜医师的限制，很难在患者中鉴定前期病变。在非限制性实例中，右结肠中被粘液帽覆盖的扁平病变特别难以鉴定，并且据报导在超过一半的锯齿状息肉或腺瘤中出现了所述扁平病变。最后，高危锯齿状腺瘤通常被错误分类为低危增生性息肉。因此，需要有更准确的方法来诊断患者的锯齿状CRC，以确保适当的补救和预防治疗方案。

发明内容

关于肿瘤微环境(即基质、炎性和免疫应答)在锯齿状CRC发展中的作用知之甚少。CRC被认为是通过起源于常规或替代性通路的前期病变发展而来。锯齿状CRC在如APC或β-连环蛋白(β-catenin)等常规生物标志物不存在变化的情况下通过替代性CRC通路起源于子宫内膜上皮内癌(EIC)前期病变。替代性通路是由锯齿状腺瘤的形成启动，所述锯齿状腺瘤逐渐进展为恶性EIC。EIC与MAPK级联的激活有关，偶尔作为激活KRAS或BRAF中的突变的结果。然而，这些突变并不存在于所有锯齿状腺瘤中，因此早期检测KRAS或BRAF中的突变在锯齿状CRC的早期检测中用处有限。

锯齿状前期病变与预后非常差的CRC转录亚型相关。尽管两者之间存在明显的机制差异，但对于如何或是否应在临床上以不同于常规CRC的方式治疗起源于锯齿状通路的CRC，尚无明确的治疗共识。对于锯齿状CRC患者，免疫疗法可能是一种可行的选择。在非限制性实例中，程序性细胞死亡1(PD-1)免疫检查点抑制剂是有前途的治疗解决方案，用于治疗锯齿状CRC的某些亚临床表型，但不是所有的亚临床表型。因此，了解锯齿状肿瘤的免疫环境对于确定更有效的治疗方法至关重要。

肠道慢性炎性疾病与CRC风险升高相关。非典型蛋白激酶

由PRKCI基因编码)是肠道炎症的调节因子，特别是在炎性肠病(IBD)如克罗恩氏病(Crohn′s disease，CD)和溃疡性结肠炎(UC)的情况下。

是潘氏细胞(Paneth cell)分化所必需的，并且是肠上皮细胞死亡的负调节因子。CD患者的潘氏细胞中的

水平以与疾病进展相关的方式降低。此外，对CRC患者的卡普兰-迈耶存活率分析(Kaplan-Meiersurvival analysis)证明，低

水平与明显更差的患者存活率相关。不希望受任何特定理论的约束，

缺失的肠上皮的这种促炎环境可能与由潘氏细胞分化受损和肠上皮细胞(IEC)死亡增加导致的屏障缺陷有关。有趣的是，即使在存在慢性炎症的情况下，肠上皮中

的选择性遗传失活也不会导致肿瘤发生，除非与Apc缺陷相组合，在这种情况下，肠腺瘤的数量通过依赖于炎症和微生物组的机制而显著增加；然而，这些腺瘤从未进展到侵袭性和浸润性阶段。据认为，aPKC、PKCζ(由PRKCZ基因编码)可能通过维持能够防止

缺失的肠中癌症发生和发展的通路来补偿

缺失。

本公开提供了两种aPKC的遗传失活导致通过锯齿状通路的自发性肿瘤发生并发展为晚期CRC。上皮

缺陷导致免疫原性细胞死亡，从而抑制肿瘤的发生。而PKCζ缺失会导致干扰素和CD8+T细胞应答受损，并伴有基质活化和免疫抑制。因此，PKCζ和

协同抑制锯齿状肿瘤发生。如此，在从受试者获得的样品中检测到的低水平的PKCζ和

可指示受试者患有或将发展成锯齿状CRC。

本公开进一步提供了来自PKCζ和

缺失的小鼠细胞系的小鼠中的锯齿状肿瘤示出透明质酸(HA)和CD44的表达增加，所述CD44是HA的受体和癌症干细胞标志物。透明质酸的增加伴随着其它干细胞标志物的显著减少。这些发现表明，在从受试者获得的样品中检测到HA或CD44或者HA和CD44的组合可以指示受试者患有或将发展成锯齿状CRC。

本文所公开的方面提供了治疗受试者的疾病或病状的亚型的方法，所述方法通过向受试者施用治疗有效量的程序性死亡配体1(PD-L1)活性或表达的抑制剂，条件是与不患有所述疾病或病状的个体中PKCζ和

的表达水平相比，在从所述受试者获得的生物样品中检测到低PKCζ和

表达水平。在一些实施例中，与不患有所述疾病或病状的所述亚型的个体中透明质酸的表达水平相比，在从所述受试者获得的生物样品中检测到高透明质酸表达水平。在一些实施例中，所述高透明质酸水平是通过包括以下的测定来检测的：聚合酶链反应(PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、脱氧核糖核酸(DNA)测序、核糖核酸(RNA)测序、基因分型阵列、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、单分子阵列(Simoa)或其组合。在一些实施例中，所述高透明质酸表达水平包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或蛋白质。在一些实施例中，与不患有所述疾病或病状的所述亚型的个体相比，在从所述受试者获得的所述生物样品中检测到的PKCζ和

的表达指示所述生物样品中透明质酸的表达增加。在一些实施例中，所述疾病或病状包括结肠直肠癌、胰腺癌、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、纤维化、纤维狭窄或其组合。在一些实施例中，所述疾病或病状的所述亚型包括特征在于与不患有所述疾病或病状的所述亚型的个体相比，从所述受试者获得的所述生物样品中的透明质酸增加的疾病或病状。在一些实施例中，所述疾病或病状的所述亚型包括特征在于所述受试者的肠中的锯齿状息肉的疾病或病状。在一些实施例中，所述锯齿状息肉包括无蒂锯齿状腺瘤(SSA)。在一些实施例中，所述疾病或病状的所述亚型包括特征在于锯齿状腺癌的疾病或病状。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括PD-L1的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-L1抗体。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-1抗体。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的透明质酸活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸-CD44结合或激动作用的抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44的拮抗剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的抗体抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸酶活性或表达的激动剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括培沃透明质酸酶α(PVHA)。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括外源性透明质酸酶。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括重组透明质酸酶。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的转化生长因子β1(TGF-β1)活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括TGF-β1受体的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括加卢尼赛替布(galunisertib)。在一些实施例中，所述生物样品包括血液、血浆、血清或组织活检。在一些实施例中，所述受试者是人。在一些实施例中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施例中，所述低PKCζ和

表达水平是通过包括以下的测定来检测的：聚合酶链反应(PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、脱氧核糖核酸(DNA)测序、核糖核酸(RNA)测序、基因分型阵列、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、单分子阵列(Simoa)或其组合。在一些实施例中，所述PKCζ和

表达水平包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或蛋白质。

本文所公开的方面提供了在患有疾病或病状的受试者中抑制或降低程序性死亡配体1(PD-L1)活性或表达的方法，所述方法包括：a)如与不患有所述疾病或病状的个体中PKCζ和

的表达水平相比，鉴定所述受试者具有低PKCζ和

表达水平；和b)向所述受试者施用治疗有效量的PD-L1活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，所述方法进一步包括：与不患有所述疾病或病状的个体中透明质酸的表达水平相比，鉴定所述受试者具有高透明质酸表达水平。在一些实施例中，所述透明质酸表达水平是通过包括以下的测定来鉴定的：聚合酶链反应(PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、脱氧核糖核酸(DNA)测序、核糖核酸(RNA)测序、基因分型阵列、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、单分子阵列(Simoa)或其组合。在一些实施例中，所述透明质酸表达水平包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或蛋白质。在一些实施例中，与不患有所述疾病或病状的个体相比，所述低PKCζ和

表达水平指示所述受试者中透明质酸的表达增加。在一些实施例中，所述疾病或病状包括结肠直肠癌(CRC)、锯齿状CRC、胰腺癌、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、纤维化、纤维狭窄或其组合。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括PD-L1的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-L1抗体。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-1抗体。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的透明质酸活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸-CD44结合或激动作用的抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44的拮抗剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的抗体抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸酶活性或表达的激动剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括培沃透明质酸酶α(PVHA)。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括外源性透明质酸酶。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括重组透明质酸酶。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的转化生长因子β1(TGF-β1)活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括TGF-β1受体的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括加卢尼赛替布。

在一些实施例中，所述生物样品包括血液、血浆、血清或组织活检。在一些实施例中，所述受试者是人。在一些实施例中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施例中，所述PKCζ和

表达水平是通过包括以下的测定来鉴定的：聚合酶链反应(PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、脱氧核糖核酸(DNA)测序、核糖核酸(RNA)测序、基因分型阵列、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、单分子阵列(Simoa)或其组合。在一些实施例中，所述PKCζ和

表达水平包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或蛋白质。

本文所公开的方面提供了通过向受试者施用治疗有效量的透明质酸活性或表达的抑制剂来治疗所述受试者中的疾病或病状的亚型的方法，条件是与不患有所述疾病或病状的个体中PKCζ和

表达水平。在一些实施例中，与不患有所述疾病或病状的所述亚型的个体中透明质酸的表达水平相比，在从所述受试者获得的生物样品中检测到高透明质酸水平。在一些实施例中，所述高透明质酸水平是通过包括以下的测定来检测的：聚合酶链反应(PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、脱氧核糖核酸(DNA)测序、核糖核酸(RNA)测序、基因分型阵列、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、单分子阵列(Simoa)或其组合。在一些实施例中，检测到所述PKCζ和

表达水平包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或蛋白质。在一些实施例中，与不患有所述疾病或病状的所述亚型的个体相比，在从所述受试者获得的所述生物样品中检测到的PKCζ和

的表达指示所述生物样品中透明质酸的表达增加。在一些实施例中，所述疾病或病状包括结肠直肠癌、胰腺癌、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、纤维化、纤维狭窄或其组合。在一些实施例中，所述疾病或病状的所述亚型包括特征在于与不患有所述疾病或病状的所述亚型的个体相比，从所述受试者获得的所述生物样品中的透明质酸增加的疾病或病状。在一些实施例中，所述疾病或病状的所述亚型包括特征在于所述受试者的肠中的锯齿状息肉的疾病或病状。在一些实施例中，所述锯齿状息肉包括无蒂锯齿状腺瘤(SSA)。在一些实施例中，所述疾病或病状的所述亚型包括特征在于锯齿状腺癌的疾病或病状。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸-CD44结合或激动作用的抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44的拮抗剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的抗体抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸酶活性或表达的激动剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括培沃透明质酸酶α(PVHA)。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括外源性透明质酸酶。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括重组透明质酸酶。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的转化生长因子β1(TGF-β1)活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括TGF-β1受体的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括加卢尼赛替布。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的程序性死亡配体1(PD-L1)活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括PD-L1的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-L1抗体。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-1抗体。在一些实施例中，所述生物样品包括血液、血浆、血清或组织活检。在一些实施例中，所述受试者是人。在一些实施例中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施例中，所述PKCζ和

表达水平包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或蛋白质。

本文所公开的方面提供了抑制或降低患有疾病或病状的受试者中透明质酸活性或表达的方法，所述方法包括：a)与不患有所述疾病或病状的个体中PKCζ和

的表达水平相比，鉴定所述受试者具有低PKCζ和

表达水平；和b)向所述受试者施用治疗有效量的透明质酸活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，所述方法进一步包括：与不患有所述疾病或病状的个体中透明质酸的表达水平相比，鉴定所述受试者具有高透明质酸表达水平。在一些实施例中，所述透明质酸表达水平是通过包括以下的测定来鉴定的：聚合酶链反应(PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、脱氧核糖核酸(DNA)测序、核糖核酸(RNA)测序、基因分型阵列、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、单分子阵列(Simoa)或其组合。在一些实施例中，所述高透明质酸表达水平包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或蛋白质。在一些实施例中，与不患有所述疾病或病状的个体相比，所述低PKCζ和

表达水平指示所述受试者中透明质酸的表达增加。在一些实施例中，所述疾病或病状包括结肠直肠癌(CRC)、锯齿状CRC、胰腺癌、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、纤维化、纤维狭窄或其组合。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸-CD44结合或激动作用的抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44的拮抗剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的抗体抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸酶活性或表达的激动剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括培沃透明质酸酶α(PVHA)。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括外源性透明质酸酶。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括重组透明质酸酶。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的转化生长因子β1(TGF-β1)活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括TGF-β1受体的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括加卢尼赛替布。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的程序性死亡配体1(PD-L1)活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括PD-L1的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-L1抗体。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-1抗体。在一些实施例中，所述生物样品包括血液、血浆、血清或组织活检。在一些实施例中，所述受试者是人。在一些实施例中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施例中，所述PKCζ和

表达水平包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或蛋白质。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸-CD44结合或激动作用的抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44的拮抗剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的抗体抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸酶活性或表达的激动剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括培沃透明质酸酶α(PVHA)。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括外源性透明质酸酶。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括重组透明质酸酶。

本文所公开的方面提供了改善或预防患有锯齿状结肠直肠癌(CRC)的受试者中的肿瘤发生的方法，所述方法通过向所述受试者施用治疗有效量的透明质酸活性或表达的抑制剂，条件是与不具有锯齿状CRC的个体中PKCζ和

表达水平。在一些实施例中，与不患有所述CRC的个体中透明质酸的表达水平相比，在从所述受试者获得的生物样品中检测到高透明质酸表达水平。在一些实施例中，所述高透明质酸表达水平是通过包括以下的测定来检测的：聚合酶链反应(PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、脱氧核糖核酸(DNA)测序、核糖核酸(RNA)测序、基因分型阵列、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、单分子阵列(Simoa)或其组合。在一些实施例中，所述高透明质酸表达水平包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或蛋白质。在一些实施例中，与不患有所述锯齿状CRC的个体相比，在从所述受试者获得的所述生物样品中检测到的所述低PKCζ和

表达水平指示所述生物样品中透明质酸的表达增加。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸-CD44结合或激动作用的抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44的拮抗剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的抗体抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸酶活性或表达的激动剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括培沃透明质酸酶α(PVHA)。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括外源性透明质酸酶。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括重组透明质酸酶。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的转化生长因子β1(TGF-β1)活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括TGF-β1受体的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括加卢尼赛替布。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的程序性细胞死亡配体1(PD-L1)活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括PD-L1的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-L1抗体。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-1抗体。在一些实施例中，所述生物样品包括血液、血浆、血清或组织活检。在一些实施例中，所述受试者是人。在一些实施例中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施例中，所述低PKCζ和

表达水平包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或蛋白质。

本文所公开的方面提供了改善或预防患有锯齿状结肠直肠癌(CRC)的受试者中的肿瘤发生的方法，所述方法包括：a)与不患有所述锯齿状CRC的个体中PKCζ和

的表达水平相比，鉴定所述受试者具有低PKCζ和

表达水平；和b)向受试者施用治疗有效量的透明质酸活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，所述方法进一步包括：与不患有所述CRC的个体中透明质酸的表达水平相比，鉴定所述受试者具有高透明质酸表达水平。在一些实施例中，所述高透明质酸表达水平是通过包括以下的测定来鉴定的：聚合酶链反应(PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、脱氧核糖核酸(DNA)测序、核糖核酸(RNA)测序、基因分型阵列、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、单分子阵列(Simoa)或其组合。在一些实施例中，所述透明质酸表达水平包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或蛋白质。在一些实施例中，与不患有所述疾病或病状的个体相比，所述低PKCζ和

表达水平指示所述受试者中透明质酸的表达增加。在一些实施例中，所述生物样品包括血液、血浆、血清或组织活检。在一些实施例中，所述受试者是人。在一些实施例中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施例中，所述PKCζ和

表达水平包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或蛋白质。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸-CD44结合或激动作用的抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44的拮抗剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的抗体抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸酶活性或表达的激动剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括培沃透明质酸酶α(PVHA)。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括外源性透明质酸酶。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括重组透明质酸酶。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的转化生长因子β1(TGF-β1)活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括TGF-β1受体的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括加卢尼赛替布。在一些实施例中，所述方法进一步包括向所述受试者施用治疗有效量的程序性死亡配体1(PD-L1)活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括PD-L1的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-L1抗体。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-1抗体。

本文所公开的方面提供了诊断有需要的受试者的结肠直肠癌(CRC)亚型的方法，所述方法包括：a)从有需要的受试者获得生物样品；b)使所述生物样品经受适合于检测PKCζ和

表达水平的测定；和c)诊断所述受试者患有锯齿状结肠直肠癌(CRC)，条件是与不患有所述CRC的个体中PKCζ和

的表达水平相比，从所述受试者获得的所述生物样品中检测到的PKCζ和

的表达水平更低。在一些实施例中，所述方法进一步包括：a)使所述生物样品经受适合于检测结肠癌亚型(CCS)的测定，所述CCS包括染色体不稳定表型(CCS1)、高度微卫星不稳定性和CpG岛甲基化表型(MSI/CIMP+)或微卫星稳定表型(MSS)；和b)诊断所述受试者患有锯齿状CRC，条件是检测到的CCS包括所述MSS表型。在一些实施例中，与不患有所述疾病或病状的个体相比，所述低PKCζ和

表达水平指示所述受试者中透明质酸的表达增加。在一些实施例中，所述生物样品包括血液、血浆、血清或组织活检。在一些实施例中，所述受试者是人。在一些实施例中，所述受试者是哺乳动物。在一些实施例中，适合于检测PKCζ和

表达水平的所述测定包括聚合酶链反应(PCR)、逆转录PCR(RT-PCR)、脱氧核糖核酸(DNA)测序、核糖核酸(RNA)测序、基因分型阵列、免疫组织化学、酶联免疫吸附测定(ELISA)、单分子阵列(Simoa)或其组合。在一些实施例中，所述PKCζ和

表达水平包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或蛋白质。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过施用治疗有效量的转化生长因子β1(TGF-β1)活性或表达的抑制剂来治疗所述受试者，条件是所述受试者被诊断为患有锯齿状CRC。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括TGF-β1受体的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括加卢尼赛替布。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过施用治疗有效量的透明质酸活性或表达的抑制剂来治疗所述受试者，条件是所述受试者被诊断为患有锯齿状CRC。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸-CD44结合或激动作用的抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44的拮抗剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的抗体抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸酶活性或表达的激动剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括培沃透明质酸酶α(PVHA)。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括外源性透明质酸酶。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括重组透明质酸酶。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过施用治疗有效量的程序性死亡配体1(PD-L1)活性或表达的抑制剂来治疗所述受试者，条件是所述受试者被诊断为患有锯齿状CRC。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括PD-L1的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-L1抗体。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-1抗体。

本文所公开的方面提供了表征受试者的结肠直肠癌(CRC)亚型的方法，所述方法包括：a)从患有结肠直肠癌(CRC)的受试者获得生物样品；b)使所述生物样品经受适合于检测PKCζ和

表达水平的测定；和c)将所述CRC表征为锯齿状CRC，条件是与不患有所述CRC的个体中PKCζ和

的表达水平更低。在一些实施例中，所述方法进一步包括：a)使所述生物样品经受适合于检测结肠癌亚型(CCS)的测定，所述CCS包括染色体不稳定表型(CCS1)、高度微卫星不稳定性和CpG岛甲基化表型(MSI/CIMP+)或微卫星稳定表型(MSS)；和b)将所述CRC亚型表征为锯齿状CRC，条件是检测到的CCS包括所述MSS表型。在一些实施例中，与不患有所述疾病或病状的个体相比，所述低PKCζ和

表达水平包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或蛋白质。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过施用治疗有效量的转化生长因子β1(TGF-β1)活性或表达的抑制剂来治疗所述受试者，条件是所述CRC被表征为锯齿状CRC。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括TGF-β1受体的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括加卢尼赛替布。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过施用治疗有效量的透明质酸活性或表达的抑制剂来治疗所述受试者，条件是所述CRC被表征为锯齿状CRC。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸-CD44结合或激动作用的抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44的拮抗剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的抗体抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸酶活性或表达的激动剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括培沃透明质酸酶α(PVHA)。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括外源性透明质酸酶。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括重组透明质酸酶。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过施用治疗有效量的程序性死亡配体1(PD-L1)活性或表达的抑制剂来治疗所述受试者，条件是所述CRC被表征为锯齿状CRC。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括PD-L1的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-L1抗体。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-1抗体。

本文所公开的方面提供了确定患有炎性肠病(IBD)的受试者是否患有或将发展成锯齿状结肠直肠癌(CRC)的方法，所述方法包括：a)从所述受试者获得生物样品；b)使所述生物样品经受适合于检测PKCζ和

表达水平的测定；和c)确定所述受试者患有或将发展成锯齿状CRC，条件是与不患有CRC的个体中PKCζ和

的表达水平更低。在一些实施例中，所述IBD包括克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、医学上难治的溃疡性结肠炎、医学上难治的或复杂形式的克罗恩氏病、结肠炎、纤维化、纤维狭窄或其组合。在一些实施例中，与不患有所述疾病或病状的个体相比，所述低PKCζ和

表达水平包括核糖核酸(RNA)、脱氧核糖核酸(DNA)或蛋白质。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过施用治疗有效量的转化生长因子β1(TGF-β1)活性或表达的抑制剂来治疗所述受试者，条件是所述受试者被确定患有或将发展为锯齿状CRC。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括TGF-β1受体的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括加卢尼赛替布。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过施用治疗有效量的透明质酸活性或表达的抑制剂来治疗所述受试者，条件是所述受试者被确定患有或将发展为锯齿状CRC。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸-CD44结合或激动作用的抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44的拮抗剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的抗体抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸酶活性或表达的激动剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括培沃透明质酸酶α(PVHA)。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括外源性透明质酸酶。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括重组透明质酸酶。在一些实施例中，所述方法进一步包括通过施用治疗有效量的程序性死亡配体1(PD-L1)活性或表达的抑制剂来治疗所述受试者，条件是所述受试者被确定患有或将发展为锯齿状CRC。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括PD-L1的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-L1抗体。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-1抗体。

本文所公开的方面提供了锯齿状结肠直肠癌的模型，所述模型包括：a)一定量的不表达或低表达PKCζ和

的细胞；b)已经注射了所述量的不表达或低表达PKCζ和

的所述细胞的动物；或c)具有包括Prkci和Prkcz敲除或敲低的转基因的转基因动物。在一些实施例中，所述量的细胞和所述转基因动物进一步被表征为微卫星稳定表型。在一些实施例中，所述量的细胞和所述转基因动物富集了细胞外信号调节激酶(ERK)通路和/或Yes相关蛋白(YAP)通路中的一个或多个基因的表达。在一些实施例中，与一定量的不表达或低表达PKCζ或

的细胞相比，所述量的细胞表现出更低的细胞死亡。在一些实施例中，与具有包括Prkci或Prkcz敲除或敲低的转基因的转基因动物相比，所述转基因动物表现出更低的细胞死亡。在一些实施例中，所述量的细胞过度表达透明质酸。在一些实施例中，所述转基因动物在所述转基因动物的锯齿状肿瘤的基质中过度表达透明质酸。在一些实施例中，所述量的细胞过度表达CD44。在一些实施例中，所述转基因动物过度表达CD44。在一些实施例中，所述量的细胞低表达包括Olfm4、Ascl2或Lgr5的干细胞生物标志物。在一些实施例中，所述转基因动物低表达包括Olfm4、Ascl2或Lgr5的干细胞生物标志物。在一些实施例中，所述转基因动物低表达包括Irf7、Oas1a、Isg15或Cxcl10的干扰素应答基因。在一些实施例中，所述量的细胞低表达包括Irf7、Oas1a、Isg15或Cxcl10的干扰素应答基因。在一些实施例中，所述转基因动物包括哺乳动物。在一些实施例中，所述转基因动物包括小鼠。在一些实施例中，所述转基因动物包括大鼠。在一些实施例中，所述转基因动物包括猴。在一些实施例中，所述量的细胞包括类器官。在一些实施例中，所述量的细胞包括3D培养物。在一些实施例中，通过繁殖具有编码重组酶的转基因的第一动物和具有loxP侧接基因的第二动物来产生所述转基因动物，所述转基因与小肠和大肠的绒毛和隐窝上皮细胞中普遍存在的启动子可操作地连接，所述loxP侧接基因包括Prkci和Prkcz，以产生分别具有Prkci和Prkcz敲除或敲低的转基因动物、小肠和大肠的绒毛和隐窝上皮细胞。在一些实施例中，所述普遍存在的启动子包括vasa启动子、c-kit启动子、Dnd1启动子、Dppa3启动子、Fkbp6启动子、Fragilis启动子、Fragilis-2启动子、GDF-3启动子、Mov10l1启动子、Nanog启动子、Nanos2启动子、Nanos3启动子、oct3/4启动子、Prdm1启动子、Prdm14启动子、Tex13启动子、Tiar启动子或TNAP启动子。

本文所公开的方面提供了筛选锯齿状肿瘤发生的调节剂的方法，所述方法包括：a)提供本文所公开的锯齿状结肠直肠癌的模型；b)将所述模型与肿瘤发生的推定调节剂接触；和c)检测所述模型中一个或多个肿瘤相关参数的一个或多个变化。在一些实施例中，所述肿瘤相关参数包括CD8+T细胞向锯齿状肿瘤的募集、无蒂锯齿状腺瘤(SSA)向腺癌的进展、锯齿状肿瘤的数量、锯齿状肿瘤的大小、锯齿状肿瘤的总负荷、α平滑肌肌动蛋白(αSMA)表达的增加或胶原沉积或其组合。在一些实施例中，所述推定调节剂负调节肿瘤发生，条件是观察到向锯齿状肿瘤的CD8+T细胞的增加。在一些实施例中，所述推定调节剂负调节肿瘤发生，条件是未观察到所述SSA向腺癌的进展。在一些实施例中，所述推定调节剂负调节肿瘤发生，条件是与在所述模型与所述推定调节剂接触之前所述模型中的锯齿状肿瘤的数目相比，观察到锯齿状肿瘤的数目减少。在一些实施例中，所述推定调节剂负调节肿瘤发生，条件是与在所述模型与所述推定调节剂接触之前所述模型中锯齿状肿瘤的大小相比，观察到锯齿状肿瘤的大小减小。在一些实施例中，所述推定调节剂负调节肿瘤发生，条件是与在所述模型与所述推定调节剂接触之前所述模型中锯齿状肿瘤的总负荷相比，观察到锯齿状肿瘤的总负荷减少。在一些实施例中，所述推定调节剂负调节肿瘤发生，条件是与在所述模型与所述推定调节剂接触之前所述模型中的αSMA表达相比，未观察到αSMA表达增加。在一些实施例中，所述推定调节剂负调节肿瘤发生，条件是与在所述模型与所述推定调节剂接触之前所述模型中的胶原沉积相比，未观察到所述模型中胶原沉积的增加。在一些实施例中，所述推定调节剂选自由以下组成的组：程序性死亡配体1(PD-L1)活性或表达的抑制剂、转化生长因子β1(TGF-β1)活性或表达的抑制剂和透明质酸活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括PD-L1的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)的拮抗剂。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-L1抗体。在一些实施例中，所述PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗PD-1抗体。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸-CD44结合或激动作用的抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44的拮抗剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的抗体抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸酶活性或表达的激动剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括培沃透明质酸酶α(PVHA)。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括外源性透明质酸酶。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括重组透明质酸酶。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗原结合片段。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括TGF-β1受体的小分子抑制剂。在一些实施例中，所述TGF-β1活性或表达的抑制剂包括加卢尼赛替布。

本文所公开的方面提供了产生锯齿状结肠直肠癌的动物模型的方法，所述方法包括：a)提供Prkci fl/fl和Prkcz fl/fl的动物，其中所述动物具有侧接于包括Prkci和Prkcz的基因的loxP位点；和b)将所述作为Prkci fl/fl和Prkcz fl/fl的动物与表达Cre重组酶的动物杂交，所述重组酶与小肠和大肠的绒毛和隐窝上皮细胞中普遍存在的启动子可操作地连接，从而产生在所述小肠和大肠的绒毛和隐窝上皮细胞中Pkcζ和

缺失的转基因动物。在一些实施例中，所述动物模型包括哺乳动物。在一些实施例中，所述动物模型包括小鼠。在一些实施例中，所述动物模型包括大鼠。在一些实施例中，所述动物模型包括猴。在一些实施例中，所述动物模型的特征在于微卫星稳定表型。在一些实施例中，所述动物模型富集了细胞外信号调节激酶(ERK)通路和/或Yes相关蛋白(YAP)通路中的一种或多种基因的表达。在一些实施例中，与不表达或低表达PKCζ或

的动物相比，所述动物模型表现出更低的细胞死亡。在一些实施例中，与具有包括Prkci或Prkcz敲除或敲低的转基因的动物相比，所述动物模型表现出更低的细胞死亡。在一些实施例中，所述动物模型在所述动物的锯齿状肿瘤的基质中过度表达透明质酸。在一些实施例中，与正常动物相比，所述动物模型过度表达CD44。在一些实施例中，与正常动物相比，所述动物模型低表达包括Olfm4、Ascl2或Lgr5的干细胞生物标志物。在一些实施例中，与正常动物相比，所述动物模型低表达包括Irf7、Oas1a、Isg15或Cxcl10的干扰素应答基因。

本文所公开的方面还提供了治疗受试者的锯齿状肿瘤的方法。所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的透明质酸活性或表达的抑制剂的步骤，其中与不患有锯齿状肿瘤的个体中PKCζ和

的表达水平相比，来自所述受试者的生物样品具有低PKCζ和

表达水平。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括小分子。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸-CD44结合或激动作用的抑制剂。可替代地和/或另外，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44的拮抗剂。在一些情况下，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的抗体抑制剂。在一些情况下，透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的小分子抑制剂。

在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸酶活性或表达的激动剂。在此类实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括外源性透明质酸酶，或者所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括重组透明质酸酶，或者所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括培沃透明质酸酶α(PVHA)。

在一些实施例中，所述PVHA的治疗有效量介于0.01mg/kg至0.5mg/kg之间，或者所述PVHA的治疗有效量介于0.02mg/kg至0.4mg/kg之间。在一些实施例中，所述培沃透明质酸酶α(PVHA)作为单一疗法施用于所述受试者。在一些实施例中，与未经治疗的个体相比，所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以将所述受试者中的肿瘤发生减少至少30％。在此类实施例中，优选的是，所述肿瘤发生通过对锯齿状息肉和癌进行计数来量化。在一些实施例中，与未经治疗的个体相比，所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以将所述受试者中的肿瘤负担减少至少20％。在此类实施例中，优选的是，所述肿瘤负担使用肿瘤总数、肿瘤平均大小或肿瘤负荷中的至少一个来量化。在一些实施例中，所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以减少所述肿瘤中的透明质酸沉积。在一些实施例中，所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以减少所述肿瘤中的胶原沉积。

在一些实施例中，所述生物样品包括血液、血浆、血清或组织活检。在一些实施例中，所述PKCζ和

的低表达水平包括PKCζ和

的低转录水平、低翻译水平或低活性水平。

本文所公开的方面提供了治疗受试者的锯齿状肿瘤的方法，所述方法通过向受试者施用治疗有效量的透明质酸活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括培沃透明质酸酶α(PVHA)。在一些实施例中，所述培沃透明质酸酶α(PVHA)作为单一疗法施用于所述受试者。在一些实施例中，所述PVHA的治疗有效量介于0.01mg/kg至0.5mg/kg之间。在一些实施例中，所述PVHA的治疗有效量介于0.02mg/kg至0.4mg/kg之间。在一些实施例中，与未经治疗的个体相比，所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以将所述受试者中的肿瘤发生减少至少30％。在一些实施例中，与不患有锯齿状肿瘤的个体中PKCζ和

的表达水平相比，来自所述受试者的生物样品具有更低的PKCζ和

表达水平。

在一些实施例中，与未经治疗的个体相比，所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以将所述受试者中的肿瘤发生减少至少30％。在一些情况下，所述肿瘤发生是通过对锯齿状息肉和癌进行计数来量化的。在一些实施例中，与未经治疗的个体相比，所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以将所述受试者中的肿瘤负担减少至少20％，所述肿瘤负担任选地是使用肿瘤总数、肿瘤平均大小或肿瘤负荷中的至少一个来量化的。在一些实施例中，所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以减少所述肿瘤中的透明质酸沉积。在一些实施例中，所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以减少所述肿瘤中的胶原沉积。在一些实施例中，所述生物样品包括血液、血浆、血清或组织活检。

附图说明

本专利申请含有至少一张彩色附图。根据请求并支付必要的费用后，专利局将提供带有彩图的本专利或专利申请的副本。

在所附权利要求中具体阐述了本公开的各个方面。通过参考阐述了说明性实施例的以下详细说明，将获得对本公开的特征和优点的更好理解，在所述实施例中利用了本公开的原理，并且在附图中：

图1，小图A-L例示了

和PKCζ的同时失活驱动小肠和结肠中的锯齿状肿瘤发生。小图A例示了野生型(WT)和Pkci和Pkcz敲除(DKO^IEC)的交叉图像。箭头表示经扩张的肠。小图B例示了WT小鼠(n＝15)和DKO^IEC小鼠(n-23)的体重。小图C例示了WT小鼠(n＝20)和DKO^IEC小鼠(n＝22)的卡普兰-迈耶存活率曲线(Kaplan-Meier survival curve)。小图D例示了来自WT小鼠和DKO^IEC小鼠(n＝20)的小肠和结肠切片的苏木精和曙红(H&E)染色。比例尺，100μm。小图E例示了来自WT小鼠和DKO^IEC小鼠的小肠的宏观图像。箭头表示肿瘤。比例尺，2mm。小图F例示了不同年龄的DKO^IEC小鼠的小肠和结肠中宏观肿瘤的数量。小图G例示了DKO^IEC小鼠的小肠和结肠中具有不同肿瘤大小分布的宏观肿瘤的数量。每个圆圈表示一只小鼠(n-39)。小图H例示了来自DKO^IEC小鼠的结肠的总体图像。箭头表示升结肠中的肿瘤。虚线圆圈表示肿瘤中的粘蛋白。比例尺，2mm。小图I例示了在DKO^IEC小鼠中观察到的管状腺癌的图像。小图J例示了在DKO^IEC小鼠中观察到的低分化腺癌。小图K例示了在DKO^IEC小鼠中观察到的印戒细胞癌。小图L例示了在DKO^IEC小鼠中观察到的促结缔织增生变化。箭头表示浸润性肿瘤前缘。比例尺，100μm。结果示出为平均值+/-平均值的标准误差(SEM)。

图2，小图A-G例示了DKO^IEC小鼠肿瘤携带类似于人锯齿状肿瘤的独特分子特征。小图A和小图B例示了在来自DKO^IEC或Apc^fl/+、LKO^IEC小鼠(n＝3)的指示类型的肠肿瘤中的连环蛋白染色和量化。比例尺，50μm。小图C例示了在DKO^IEC肿瘤与野生型(WT)肠中指示基因特征的富集的基因集富集分析(GSEA)图。术语“NES”是指归一化富集评分。术语“FDR”是指错误发现率。小图D例示了来自指示基因型的小鼠(n＝3)的小肠中的磷酸-ERK、磷酸-EGFR和YAP染色。比例尺，25μm。小图E例示了DKO^IEC肿瘤与WT肠的GSEA图。小图F例示了来自关于DKO^IEC肿瘤与WT肠的RNA-seq的转录组数据的GSEA。小图G例示了在人锯齿状数据集中DKO^IEC小鼠基因集(DKO_SIGNATURE)的富集的GSEA。结果示出为平均值+/-SEM。

图3，小图A-M例示了DKO^IEC肿瘤中的肠免疫抑制。小图A-C例示了在来自指示基因型和病变的小鼠的小肠中针对CD45、CD8以及CD45和PD-L1的染色和量化(n＝3)。线条标记肿瘤(T)边界。小图D-J例示了来自指示基因型的小鼠的免疫细胞群的流式细胞术分析。CD45+细胞中CD8+T细胞(图3D)、PD-L1+(小图E)、Treg细胞的百分比(Foxp3+CD4+TCR-β+；小图F)；Treg细胞与CD8+T细胞的比率(小图G)；CD4+T细胞中产生IL-17A的细胞的百分比(小图H)；CD45+细胞中CD11b+(小图I)和CD11b+Ly6ChighLy6G–和CD11b+Ly6C+Ly6G+(J)细胞的百分比。(n：WT＝7，LKO^IEC＝8，并且DKO^IEC肿瘤＝4)。(小图K–M)来自指示基因型和病变的小鼠(n＝3)的小肠中的αSMA(小图K)和马森氏三色(Masson′s trichrome)(小图L)染色，以及Ereg原位杂交(小图M)。结果示出为平均值+/-SEM。比例尺，25μm。

图4，小图A-M例示了CD8+T细胞在DKO^IEC小鼠的锯齿状肿瘤发生中的作用。小图A和小图B例示了来自用或不用抗生素(Abx)治疗的WT和DKO^IEC小鼠(n＝3)的小肠中的CD45+染色(图4A)和量化(小图B)。小图C例示了Abx实验中来自WT和DKO^IEC小鼠的CD45+细胞群的流式细胞术分析(n：WT对照＝8，WT Abx治疗＝5，DKO^IEC对照＝4并且DKO^IEC Abx治疗＝3)。小图D例示了小肠和结肠中肿瘤总数的量化，以及在Abx实验中根据DKO^IEC小鼠的大小对小肠肿瘤数量进行的分层。(n：对照＝6和Abx治疗＝7)。小图E-G例示了Abx实验中来自DKO^IEC小鼠的小肠肿瘤的苏木精和曙红(H&E)染色(小图E)和Ki67、磷酸-ERK和YAP染色(小图F)，以及Ki67染色的量化(小图G)。比例尺，100μm。小图H例示了来自用或未用αCD8抗体治疗的WT和LKO^IEC小鼠的CD8+T细胞的流式细胞术分析(n：WT＝3，LKO^IEC＝6，并且LKO^IECαCD8抗体治疗＝7)。小图I例示了在CD8耗竭实验中治疗的LKO^IEC小肠的宏观图像。箭头表示肿瘤。比例尺，2mm。小图J和小图K例示了在CD8耗竭实验中小肠肿瘤的发病率(小图J)和总数(小图K)的量化(n＝7)。小图L和小图M例示了来自指示基因型和处理的小鼠的小肠样品的H&E、Ki67、切割的胱天蛋白酶3(C-胱天蛋白酶3)、TUNEL和马森氏三色染色(小图L)以及量化(小图M)(n＝3-5)。比例尺，100μm。结果示出为平均值+/-SEM。

图5，小图A-N例示了PKCζ损失对干扰素应答的抑制会损害CD8+依赖性免疫监测。小图A例示了来自RNA-seq数据的LKO^IEC与WT IEC中指示基因的mRNA表达。小图B例示了用奥沙利铂(Oxaliplatin)处理24小时(20μM)的sgC和

MODE-K细胞中的细胞外ATP水平(n＝3)。小图C例示了用奥沙利铂(20μM)、硼替佐米(Bortezomib)(0.1μM)或TNFα(10ng/ml)加环己酰亚胺(2.5μg/ml)处理24小时的sgC和

MODE-K细胞中指示蛋白质的蛋白质印迹。小图D例示了用0.5μg/ml poly(I:C)转染或模拟物转染6小时的指示基因型的MODE-K中Cxcl10、Oas1a、Ifnb和Nlrc5 mRNA水平的qRT-PCR分析(n＝3)。小图E例示了在指示基因型的MODE-K细胞中H-2Kb和H-2Dk的表面表达(平均荧光强度，MFI)，所述细胞为HBSS饥饿型或用奥沙利铂(20μM)处理24小时(n＝3)。小图F例示了在指示T:E比率下OT-I细胞-MC38OVA杀伤测定(24小时)(左)。在与OT-I细胞共培养24小时后，shNT和

MC38^OVA细胞中的PI染色(右)(n＝3)。小图G例示了来自关于ZKO^IEC与WT IEC的RNA-seq的转录组数据的GSEA。将指示的基因特征应用于分析。FDR，错误发现率。小图H例示了表示与基因型间差异表达的干扰素应答相关基因的WT和ZKO^IEC IEC的RNA-seq数据的热图。小图I例示了用或未用5AZA-CdR处理的指示基因型的类器官中Irf7、Oas1a、Isg15和Cxcl10mRNA水平的qRT-PCR分析。小图J例示了用0.5μg/ml poly(I:C)转染或模拟物转染6小时的指示基因型的293T细胞中CXCL10和IFNB mRNA水平的qRT-PCR分析(n＝3)。小图K例示了用0.5μg/ml poly(I:C)转染或模拟物转染6小时的指示基因型的293T细胞中的指示蛋白质的蛋白质印迹(n＝3)。小图L例示了在ZKO^IEC与WT IEC中差异表达的基因的NextBio分析。维恩图(Venndiagram)示出两个集合中共有和独特基因的数量。与GO术语“通过MHC l类进行的肽抗原的抗原加工和呈递”相对应的基因特征。小图M例示了对用或未用5-AZA-CdR处理的指示基因型的类器官中H-2Kb阳性细胞群的流式细胞术分析(n＝3)。小图N例示了来自指示基因型小鼠(n＝3)的小肠中的MHC I(H-2)染色。比例尺，50μm。结果示出为平均值+/-SEM。

图6，小图A-S例示了DKO^IEC小鼠肿瘤中的治疗干预。小图A例示了加卢尼赛替布(Gal)处理的实验设计。小图B和小图C例示了Gal实验中DKO^IEC小鼠中小肠肿瘤的总数、平均大小和负荷(小图B)以及癌症和浸润性癌症的发生率(小图C)的量化。(n：对照＝8和Gal处理＝6)。小图D例示了在Gal实验中来自DKO^IEC小鼠的小肠肿瘤中的H&E、马森氏三色、磷酸-Smad2以及CD45和PD-L1双染色。比例尺＝100μm。小图E例示了Gal实验中Angptl2、Cdkn2b、Il11和Ereg mRNA水平的qRT-PCR分析(n：WT＝3，DKO^IEC对照＝4，DKO^IEC Gal处理＝5)。小图F–J例示了Gal实验中DKO^IEC肿瘤中免疫细胞群的流式细胞术分析。CD4+T细胞中产生IL-17A的细胞的百分比(小图F)；CD45+细胞中CD8+T细胞(小图G)和Foxp3+CD4+Treg细胞的百分比(小图H)；Treg与CD8+T细胞的比率(小图I)；以及CD45+细胞中CD11b+、CD11b+Ly6ChighLy6G–和CD11b+Ly6C+Ly6G+细胞的百分比(小图J)。(n：对照＝4并且Gal处理＝3只DKO^IEC小鼠)。小图K和小图L例示了Gal实验中DKO^IEC肿瘤中CD45/PD-L1染色的量化(小图K)和图像(小图L)。比例尺，100μm。箭头：CD45+/PD-L1+。小图M例示了利用αPD-L1抗体和Gal的组合疗法的实验设计。小图N和小图O例示了在组合疗法实验(小图M)中在DKO^IEC小鼠中小肠肿瘤的总数、平均大小和负荷(小图N)以及癌症和浸润性癌症的发生率(小图O)的量化。(n：对照＝6并且αPD-L1+Gal处理＝7只DKO^IEC小鼠)。小图P例示了在组合疗法实验(小图M)中来自DKO^IEC小鼠的小肠肿瘤中的H&E和CD8染色。虚线勾勒出肿瘤的轮廓(图6T)。比例尺，100μm。图6Q-图6S例示了组合疗法实验中DKO^IEC肿瘤中免疫细胞群的流式细胞术分析。CD45+细胞中CD8+T(小图Q)；Foxp3+CD4+Treg的百分比(小图R)；以及CD45+细胞中的CD11b+、CD11b+Ly6ChighLy6G–和CD11b+Ly6C+Ly6G+细胞的百分比(小图S)。(n：对照＝5并且αPD-L1+Gal处理＝4只DKO^IEC小鼠)。结果示出为平均值+/-SEM。

图7，小图A-J例示了人锯齿状肿瘤的两种非典型PKC的表达降低。小图A和小图B例示了人正常结肠(n＝20)、无蒂锯齿状腺瘤/息肉(SSA/P；n＝30)以及管状腺瘤(TA；n＝30)的aPKC免疫组织化学(小图A)和量化(小图B)。比例尺，50μm。小图C例示了基于PRKCI和PRKCZ表达水平分层的来自TCGA的CRC患者样品中的GSEA图。小图D例示了通过CCS分类分层的AMC-AJCCII-90组(GSE33113)中的PRKCI和PRKCZ mRNA水平。小图E例示了根据aPKC mRNA表达(GSE33113)的具有CCS1、CCS2或CCS3 CRC亚型的CRC患者的比例。小图F例示了基于aPKC表达水平分层的CRC患者(TCGA)的卡普兰-迈耶总体存活率曲线。小图G例示了基于aPKC表达水平分层的CRC样品(TCGA)的转录组数据的GSEA。小图H例示了来自IBD患者的指示数据集的转录组数据的GSEA。示出了归一化富集评分(NES)。比较克罗恩氏病(CD)与健康结肠(对照)或溃疡性结肠炎(UC)与对照时PRKCI和PRKCZ表达的变化倍数(FC)。FDR<0.1被认为是显著的。NS，不显著。小图I和小图J例示了在人近端CRC中的aPKC和CD8染色(小图I)和量化(小图J)(n：高aPKC＝12，低aPKC＝13)。比例尺，50μm。结果示出为平均值+/-SEM。

图8，小图A-J例示了DKO^IEC小鼠发展成肠锯齿状肿瘤。小图A例示了来自DKO^IEC小鼠(n＝3)的小肠的切片的阿尔新蓝和溶菌酶染色。比例尺，50.tm。小图B例示了DKO^IEC小鼠(n＝6)的小肠和结肠中的微囊泡性增生性息肉和杯状细胞增生性息肉。比例尺，100.tm。小图C例示了不同年龄时(左)以及按大小分级(右)的LKO^IEC和DKO^IEC小肠中的总宏观肿瘤。每个圆圈表示一只小鼠。小图D例示了小肠(n＝39)和结肠(n＝27)中肿瘤分布的饼图。小图E例示了来自WT的正常组织和来自DKO^IEC小鼠的SSA/P和癌的五个微卫星标志物(Bat24、Bat26、Bat30、Bat37和Bat64)的电泳图图像。小图F例示了WT和DKO^IEC小鼠组织的微卫星不稳定性状态(n＝3–4)。每个柱表示一个样品。比较了等位基因模式。(小图G和小图H)来自RNA-seq数据的WT和DKO^IEC肿瘤组织中与DNA错配修复(DNA-MMR，小图G)和CpG岛甲基化表型(CIMP，小图H)相关的基因的mRNA表达。小图I例示了DKO^IEC非肿瘤和肿瘤组织中的β-半乳糖苷酶染色(n＝3)。小图J例示了来自WT和DKO^IEC肿瘤的小肠组织中的p53、p21和p16染色和量化(n＝3)。比例尺，50.tm。结果示出为平均值±SEM。

图9，小图A-C例示了DKO^IEC肿瘤中增加的细胞增殖和抑制的细胞死亡。小图A-C例示了来自指示基因型的小鼠的小肠中的Ki67(小图A)、切割的胱天蛋白酶3(C-胱天蛋白酶3)(小图B)和TUNEL(小图C)染色和量化(n＝3)。比例尺，50μm。结果示出为平均值±SEM。

图10，小图A-F例示了DKO^IEC肿瘤中的免疫抑制和基质活化。小图A例示了来自DKOIEC肠的SSA/P和癌中的CD8染色(n＝6)。比例尺，50μm。红线标记肿瘤(T)与外周(P)之间的边界。小图B例示了来自指示基因型的小鼠的免疫细胞群的流式细胞术分析。CD45+细胞中CD4+T、B220+B和NK1.1+NK细胞的百分比。(n：WT＝7，LKO^IEC＝8，并且DKO^IEC肿瘤＝4)。结果示出为平均值±SEM。小图C例示了表示与胶原相关的差异表达基因的WT肠和DKO^IEC肿瘤的RNA-seq数据的热图。小图D例示了TGF-β靶向DKO^IEC肿瘤与WT肠的富集的GSEA图。小图E例示了表示与基质活化和基质源性因子相关的差异表达基因的WT肠和DKO^IEC肿瘤的RNA-seq数据的热图。小图F例示了DKO^IEC肿瘤与WT肠中的富集的GSEA图。

图11，小图A-C例示了LKO^IEC小鼠中隐窝细胞增殖和YAP/ERK信号传导通路的激活依赖于炎症。小图A和小图B例示了来自用或未用抗生素(Abx)治疗的WT和LKO^IEC小鼠的小肠中的H&E、Ki67、磷酸-ERK和YAP染色(小图A)，以及Ki67染色的量化(小图B)(n＝3)。(小图C)来自用或未用Abx治疗的WT和LKO^IEC小鼠的CD45+细胞群的流式细胞术分析(n＝3)。比例尺＝50μm。结果示出为平均值±SEM。

图12，小图A-D例示了DKO^IEC肿瘤和IEC中干扰素应答受损。小图A例示了在HBSS饥饿缓冲液或用奥沙利铂(20μM)处理24小时后，sgC和

MODE-K细胞中的细胞活力(7-AAD+细胞)(n＝3)。小图B例示了DKO^IEC肿瘤与WT肠中来自MSigDB的指示基因特征的富集的GSEA图。小图C例示了来自关于DKO^IEC与LKO^IEC IEC的RNA-seq分析的转录组数据的GSEA。将来自MSigDB的标志集合的指示基因特征应用于分析。FDR，错误发现率。小图D例示了表示与干扰素应答相关的差异表达基因的DKO^IEC和LKO^IEC IEC的转录组分析的热图。

图13，小图A-I例示了抗PD-L1疗法对DKO^IEC小鼠肿瘤的影响。小图A例示了αPD-L1处理的实验设计。小图B例示了来自用或未用αPD-L1处理的DKO^IEC小鼠的小肠肿瘤中的H&E和CD8染色。比例尺＝100μm。小图C和小图D例示了在用或未用αPD-L1处理的DKO^IEC小鼠中小肠肿瘤的总数、平均大小和负荷(小图C)以及癌症和浸润性癌症的发生率(小图D)的量化(n：对照＝7并且αPD-L1处理＝4)。小图E例示了αPD-L1处理的实验设计(n：对照＝7，αPD-L1处理＝4)。小图F例示了来自用或未用αPD-L1处理的DKO^IEC小鼠的小肠肿瘤中的H&E和CD8染色。小图G和小图H例示了在用或未用αPD-L1处理的DKO^IEC小鼠中小肠肿瘤的总数、平均大小和负荷(小图G)以及癌症和浸润性癌症的发生率(小图H)的量化(n：对照＝7并且αPD-L1处理＝4)。小图I例示了来自DKO^IEC小鼠的小肠肿瘤中的αSMA和马森氏三色染色(n＝每个年龄3只)。比例尺，100μm。结果示出为平均值±SEM。**p<0.01，***p<0.005。

图14，小图A-L例示了两种aPKC表达均较低的CRC患者表现出具有免疫抑制的CCS3表型和间充质表型。小图A例示了使用识别PKCζ和

的抗体对来自指示基因型的分离IEC样品中的aPKC进行的免疫印迹分析。小图B和小图C例示了TCGA中的PRKCI和PRKCZ mRNA水平(小图B)和Khambata-Ford数据集(小图C，GSE5851)。图4D和图4E例示了根据TCGA(小图D)和GSE5851(小图E)中aPKC mRNA表达的具有CCS1、CCS2或CCS3 CRC亚型的CRC患者的比例。小图F例示了基于aPKC表达水平分层的CRC患者(GSE5851)的卡普兰-迈耶无进展存活期(PFS)曲线。小图G例示了来自TCGA数据的BRAF和KRAS的突变状态以及aPKC基因表达谱。绿色和橙色矩形分别表示在BRAF和KRAS中存在突变。FDR，错误发现率。(小图H-J)基于aPKC表达水平和以下BRAF和KRAS的突变状态分层的CRC患者(来自TCGA)的转录组数据的GSEA：BRAF/KRAS WT(小图H)、BRAF突变(小图I)或KRAS突变(小图)。小图K例示了使用指示基因的平均表达值的GSE33113和TCGA中CCS分类的患者样品的转录组数据(每行中归一化的中值)的热图。小图L例示了比较CCS2与CCS3亚组之间GSE33113和TCGA中指示基因的转录组数据的小提琴状图。结果示出为平均值±SEM。

图15例示了aPKC-DKO^IEC锯齿状肿瘤的基质在疾病进展时表现出透明质酸的增加产生。

图16，小图A-C例示了aPKC-DKO^IEC小鼠中的上皮肿瘤细胞具有CD44的上调表达，所述CD44是透明质酸的受体。

图17，小图A-B示出了表明PVHA治疗减少了aPKC-DKO^IEC小鼠的锯齿状肿瘤的数据。

图18，小图A-C示出了表明PVHA治疗减少了aPKC-DKO^IEC肿瘤的数据。

图19示出了表明PVHA治疗后锯齿状aPKC-DKO^IEC肿瘤中透明质酸减少的数据。

图20示出了表明PVHA治疗后锯齿状aPKC-DKO^IEC肿瘤中胶原沉积减少的数据。

图21示出了表明PVHA治疗增加aPKC-DKO^IEC肿瘤中CD8 T细胞浸润的数据。

具体实施方式

特定术语的定义

除非另外定义，否则本文所使用的所有技术术语和科学术语均具有与所要求保护的主题所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。应当理解，前述一般性描述和以下详细描述仅为示例性和解释性的，并且不限制所要求保护的任何主题。在本申请中，除非另外特别说明，否则单数的使用包括复数。必须注意，如在说明书和所附权利要求中所使用，单数形式“一个(a)”、“一种(an)”和“所述(the)”包括复数指示物，除非上下文另外清楚地指示。在本申请中，除非另外说明，否则“或者”的使用意指“和/或”。此外，术语“包括(including)”以及如“包括(include)”、“包括(includes)”和“包括(included)”等其它形式的使用不是限制性的。

术语“约(about)”或“大约(approximately)”意指在如由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分地取决于所述值是如何测量或确定的，例如，测量系统的局限性。例如，根据给定值的实践，“约”可以意指在1个或大于1个标准偏差内。术语“约”包括确切量。例如，“约5μL”意指“约5μL”，并且还意指“5μL”。在本申请和权利要求中描述特定值的情况下，除非另外说明，否则术语“约”应被假定为意指所述特定值的可接受的误差范围。

术语“任选的”或“任选地”表示随后描述的事件或情况可能但不必发生，并且那个描述包括事件或情况发生的实例和事件或情况不发生的实例。

如本文所使用的，术语“核酸”通常是指一个或多个核碱基、核苷或核苷酸。例如，核酸可以包括一个或多个选自以下的核苷酸：腺苷(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)、胸腺嘧啶(T)和尿嘧啶(U)或其变体。核苷酸通常包括核苷和至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个或更多个磷酸(PO3)基团。核苷酸可以包括核碱基、五碳糖(核糖或脱氧核糖)和一个或多个磷酸基团。核糖核苷酸包括其中糖为核糖的核苷酸。脱氧核糖核苷酸包括其中糖为脱氧核糖的核苷酸。核苷酸可以是核苷单磷酸、核苷二磷酸、核苷三磷酸或核苷多磷酸。

如本文所使用的，术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”可互换使用，并且是指通过肽键连接并且可以由两条或更多条多肽链构成的氨基酸残基的聚合物。术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是指通过酰胺键连接在一起的至少两个氨基酸单体的聚合物。氨基酸可以是L-光学异构体或D-光学异构体。更具体地，术语“多肽”、“蛋白质”和“肽”是指由两个或更多个氨基酸以特定顺序构成的分子；例如，由编码蛋白质的基因或RNA中核苷酸的碱基序列决定的顺序。在一些情况下，蛋白质可以是蛋白质的一部分，例如蛋白质的结构域、亚结构域或基序。在一些情况下，蛋白质可以是所述蛋白质的变体(或突变)，其中一个或多个氨基酸残基被插入、缺失和/或取代到所述蛋白质的天然存在的(或至少已知的)氨基酸序列中。蛋白质或其变体可以是天然存在的或重组的。

如本文所使用的，术语“生物样品”是指可从中制备和检查多核苷酸、多肽、生物标志物和/或代谢物的任何生物材料。非限制性实例涵盖组织活检、全血、血浆、唾液、血清、脸颊拭子、粪便样本、尿液样本、细胞团或任何其它体液或组织。

如本文所使用的，术语“施用(administer/administering/administration)”等是指可以用于使化合物或组合物能够递送到期望的生物作用位点的方法。这些方法包括但不限于口服途径(p.o.)、十二指肠内途径(i.d.)、肠胃外注射(包括静脉内(i.v.)、皮下(s.c.)、腹膜内(i.p.)、肌肉内(i.m.)、血管内或输注(inf.)、局部(top.)和直肠(p.r.)施用。在一些实施例中，本文所描述的化合物和组合物口服施用。

如本文所使用的，术语“共同施用”等意在涵盖将所选择的治疗剂施用于单个患者，并且旨在包括通过相同或不同时间；或通过相同或不同的途径时施用药剂的治疗方案。在一些实施例中，所选治疗剂构成单一组合物。在一些实施例中，所选治疗剂为单独组合物。

如本文所使用的，术语“有效量”或“治疗有效量”是指所施用的药剂或化合物的足够量，其将在某种程度上减轻所治疗的疾病或病状的症状中的一种或多种症状；例如减少和/或缓解疾病的体征、症状或病因，或任何其它期望的生物系统改变。例如，用于治疗用途的“有效量”可以是提供一种或多种疾病症状的临床显著减少的药剂的量。在个体病例中，可以使用如剂量递增研究等技术来确定在任何合适的“有效”量。在一些实施例中，用于治疗用途的“有效量”是提供肿瘤大小、肿瘤负荷和肿瘤数量的临床显著减少或预防肿瘤发生的药剂的量。

术语“受试者”或“患者”涵盖哺乳动物。哺乳动物的实例包括但不限于哺乳动物类别的任何成员：人、非人灵长类动物如黑猩猩以及其它猿类和猴类；农场动物如牛、马、绵羊、山羊、猪等；家养动物如兔子、狗和猫等；实验动物，包括如大鼠、小鼠和豚鼠等啮齿动物。在一方面，哺乳动物是人。如本文中所使用的，术语“动物”包括人类和非人动物。在一个实施例中，“非人类动物”是哺乳动物，例如啮齿动物，如大鼠或小鼠。

如本文所使用的，术语“治疗(treat/treating/treatment)”包括缓解、减弱或改善疾病或病状的至少一种症状、预防另外的症状、抑制疾病或病状，例如阻止疾病或病状的发展、减轻疾病或病状、引起疾病或病状的消退、减轻由疾病或病状引起的病状或预防上和/或治疗上停止疾病或病状的症状。

术语“预防(preventing/prevention)”疾病状态表示使所述疾病状态的临床症状不在可以暴露于或易患所述疾病状态但尚未经历或显示所述疾病状态的症状的受试者中发展。

如本文所使用的，术语“包括(comprise)”或其变体，如“包括(comprises)”或“包括(comprising)”意在表明包括任何所列举的特征，但是不排除任何它特征。因此，如本文所使用的，术语“包括(comprising)”是包含性的并且不排除另外的、未列举的特征。在本文提供的任何组合物和方法的一些实施例中，“包括(comprising)”可以用“基本上由……组成”或“由……组成”代替。短语“基本上由……组成”在本文中用于要求指定的特征以及那些不会实质上影响所要求保护的公开内容的特征或功能的特征。如本文所使用的，术语“组成”用于指示单独存在的所列举特征。本文所使用的小节标题仅是为了组织目的并且不应该被解释为对所描述的主题进行限制。

本文提供了用于基于对从受试者获得的生物样品中本文公开的生物标志物的检测来鉴定所述受试者患有锯齿状结肠直肠癌(CRC)或易发展成锯齿状结肠直肠癌(CRC)的方法。还提供了用于利用靶向锯齿状CRC微环境中的基质活化和免疫抑制的疗程治疗受试者的锯齿状CRC的方法。进一步提供了人锯齿状CRC的模型，所述模型包括但不限于动物模型和组织模型，以及产生本文所公开的模型的方法。还提供了使用本文所公开的模型来鉴定可用作锯齿状CRC的治疗方案的肿瘤发生调节剂的方法。

受试者的锯齿状结肠直肠癌的诊断和预后方法

本文所公开的方面提供了诊断、表征和/或预测受试者的锯齿状结肠直肠癌(CRC)的方法，条件是在从受试者获得的生物样品中检测到某些生物标志物。生物样品可以直接或间接获自受试者。在一些实施例中，生物样品包括来自肠、肿瘤或两者的组织活检。在一些情况下，组织活检是穿刺活检、手术活检或抽吸活检。在一些情况下，细针活检包括细针抽吸(FNA)。在一些实施例中，生物样品包括全血、血清或血浆。在一些情况下，受试者是哺乳动物。在一些情况下，受试者是小鼠、大鼠、猴或兔。在一些情况下，受试者是人。在一些情况下，受试者患有疾病或病状或具有与疾病或病状相关的症状。在一些情况下，疾病或病状包括炎性疾病。炎性疾病的非限制性实例包括炎性肠病、克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、结肠炎、哮喘、肠纤维化、肠纤维狭窄性疾病、关节炎疾病、自身免疫性疾病和肝炎。在一些情况下，疾病或病状包括肠癌。肠癌的非限制性实例包括腺癌、肉瘤、平滑肌肉瘤、类癌瘤、胃肠道间质瘤和淋巴瘤。

用于锯齿状结肠直肠癌的诊断和预后的生物标志物

非典型蛋白激酶C(aPKC)ζ和

属于PKC的亚家族。

由PRKCI基因(Entrez基因ID号5584)编码。PKCζ由PRKCZ基因(Entrez基因ID号5590)编码。本文的公开内容提供了肠上皮细胞中PKCζ和

的同时缺失导致无蒂锯齿状腺瘤/息肉(SSA/P)的发展，所述无蒂锯齿状腺瘤/息肉进展为具有强烈反应性和免疫抑制性基质的晚期锯齿状结肠直肠癌(CRC)。本文的公开内容进一步提供了在MSS/锯齿状CRC肿瘤的肠上皮细胞(IEC)中透明质酸(HA)及其受体CD44–一种与CRC肿瘤发生有关的生长因子的表达增加。本公开提供PKCζ、

HA和/或CD44可以是用于鉴定患有或将发展为MSS/锯齿状CRC的受试者的有用生物标志物。患有锯齿状CRC的缺乏PKCζ和

并且具有HA和/或CD44表达增加的受试者对许多基于免疫疗法的策略具有抗性。因此，本文公开的生物标志物可用于鉴定患有或易于发展成锯齿状CRC的受试者，并能够发现和改进替代性治疗方案。

诊断患有锯齿状CRC的受试者的方法

的表达水平更低。PKCζ和

的表达水平可以通过测量基因PKCZ和PKCI的表达或从基因PKCZ和PKCI表达的基因产物来检测。在一些实施例中，PKCζ和

表达包括核糖核酸(RNA)表达。在一些实施例中，PKCζ和

表达包括蛋白质表达。在一些实施例中，PKCζ和

表达包括脱氧核糖核酸(DNA)表达。PKCζ和

的“低”表达水平是指低于正常或非患病个体中的表达水平的统计学上显著的表达量。在一些实施例中，向根据本发明方法诊断患有锯齿状CRC的受试者施用TGF-β1、PD-L1、透明质酸或CD44的抑制剂或其抑制剂的组合。在一些实施例中，所述PKCζ和

的表达水平是使用本文公开的检测方法进行的。在一些情况下，在从受试者获得的生物样品中检测到低PKCζ和

水平表达表明受试者在肠上皮细胞(IEC)中透明质酸和/或CD44的表达增加。

本文所公开的方面提供了诊断有需要的受试者的结肠直肠癌(CRC)亚型的方法，所述方法包括：a)从有需要的受试者获得生物样品；b)使所述生物样品经受适合于检测透明质酸和/或CD44表达水平的测定；和c)诊断所述受试者患有锯齿状结肠直肠癌(CRC)，条件是与不患有所述CRC的个体中透明质酸和/或CD44的表达水平相比，从所述受试者获得的所述生物样品中检测到的透明质酸和/或CD44的表达水平更高。透明质酸和/或CD44的表达水平可以通过测量基因透明质酸合成酶2(HAS2)和/或CD44的表达或从基因HAS2和CD44表达的基因产物来检测。在一些实施例中，透明质酸和CD44表达包括RNA表达。在一些实施例中，透明质酸和CD44表达包括蛋白质表达。在一些实施例中，透明质酸和CD44表达包括DNA表达。透明质酸和/或CD44的“高”表达水平是指高于正常或非患病个体中的表达水平的统计学上显著的表达量。在一些实施例中，向根据本发明方法诊断患有锯齿状CRC的受试者施用TGF-β1、PD-L1、透明质酸或CD44的抑制剂或其抑制剂的组合。在一些实施例中，透明质酸和/或CD44的表达水平是使用本文公开的检测方法进行的。

表达水平的分析；c)使所述生物样品经受适合于检测透明质酸和/或CD44表达水平的测定；和d)诊断所述受试者患有锯齿状结肠直肠癌(CRC)，条件是与不患有所述CRC的个体中PKCζ和

的表达水平更低，并且条件是与不患有所述CRC的个体中透明质酸和/或CD44的表达水平相比，从所述受试者获得的所述生物样品中检测到的透明质酸和/或CD44的表达水平更高。PKCζ和

表达包括RNA表达。在一些实施例中，PKCζ和

表达包括蛋白质表达。在一些实施例中，PKCζ和

表达包括DNA表达。PKCζ和

的“低”表达水平是指低于正常或非患病个体中的表达水平的统计学上显著的表达量。透明质酸和/或CD44的表达水平可以通过测量基因HAS2和/或CD44的表达或从基因HAS2和CD44表达的基因产物来检测。在一些实施例中，透明质酸和CD44表达包括RNA表达。在一些实施例中，透明质酸和CD44表达包括蛋白质表达。在一些实施例中，透明质酸和CD44表达包括DNA表达。透明质酸和/或CD44的“高”表达水平是指高于正常或非患病个体中的表达水平的统计学上显著的表达量。在一些实施例中，向根据本发明方法诊断患有锯齿状CRC的受试者施用TGF-β1、PD-L1、透明质酸或CD44的抑制剂或其抑制剂的组合。在一些实施例中，PKCζ、

透明质酸和CD44的表达水平是使用本文公开的检测方法进行的。

表征结肠直肠癌亚型

本文所公开的方面提供了表征受试者的结肠直肠癌(CRC)亚型的方法，所述方法包括：a)从受试者获得生物样品；b)使所述生物样品经受适合于检测PKCζ和

表达水平的测定；和c)将所述受试者的所述CRC表征为锯齿状CRC，条件是与不患有所述CRC的个体中PKCζ和

的表达水平更低。PKCζ和

表达包括RNA表达。在一些实施例中，PKCζ和

表达包括蛋白质表达。在一些实施例中，PKCζ和

表达包括DNA表达。PKCζ和

的“低”表达水平是指低于正常或非患病个体中的表达水平的统计学上显著的表达量。在一些实施例中，向患有CRC的受试者施用TGF-β1、PD-L1、透明质酸或CD44的抑制剂或其抑制剂的组合，所述受试者患有的CRC根据本发明方法被表征为锯齿状CRC。在一些实施例中，所述PKCζ和

本文所公开的方面提供了表征有需要的受试者的结肠直肠癌(CRC)亚型的方法，所述方法包括：a)从有需要的受试者获得生物样品；b)使所述生物样品经受适合于检测透明质酸和/或CD44表达水平的测定；和c)将所述CRC表征为锯齿状结肠直肠癌(CRC)，条件是与不患有所述CRC的个体中透明质酸和/或CD44的表达水平相比，从所述受试者获得的所述生物样品中检测到的透明质酸和/或CD44的表达水平更高。透明质酸和/或CD44的表达水平可以通过测量基因HAS2和/或CD44的表达或从基因HAS2和CD44表达的基因产物来检测。在一些实施例中，透明质酸和CD44表达包括RNA表达。在一些实施例中，透明质酸和CD44表达包括蛋白质表达。在一些实施例中，透明质酸和CD44表达包括DNA表达。透明质酸和/或CD44的“高”表达水平是指高于正常或非患病个体中的表达水平的统计学上显著的表达量。在一些实施例中，向患有CRC的受试者施用TGF-β1、PD-L1、透明质酸或CD44的抑制剂或其抑制剂的组合，所述受试者患有的CRC根据本发明方法被表征为锯齿状CRC。在一些实施例中，透明质酸和/或CD44的表达水平是使用本文公开的检测方法进行的。

本文所公开的方面提供了表征受试者的结肠直肠癌(CRC)亚型的方法，所述方法包括：a)从有需要的受试者获得生物样品；b)使所述生物样品经受适合于检测PKCζ和

表达水平的分析；c)使生物样品经受适合于检测透明质酸和/或CD44表达水平的测定；和d)将CRC的亚型表征为锯齿状CRC，条件是与不患有所述CRC的个体中PKCζ和

表达包括RNA表达。在一些实施例中，PKCζ和

表达包括蛋白质表达。在一些实施例中，PKCζ和

表达包括DNA表达。PKCζ和

的“低”表达水平是指低于正常或非患病个体中的表达水平的统计学上显著的表达量。透明质酸和/或CD44的表达水平可以通过测量基因HAS2和/或CD44的表达或从基因HAS2和CD44表达的基因产物来检测。在一些实施例中，透明质酸和CD44表达包括RNA表达。在一些实施例中，透明质酸和CD44表达包括蛋白质表达。在一些实施例中，透明质酸和CD44表达包括DNA表达。透明质酸和/或CD44的“高”表达水平是指高于正常或非患病个体中的表达水平的统计学上显著的表达量。在一些实施例中，向患有CRC的受试者施用TGF-β1、PD-L1、透明质酸或CD44的抑制剂或其抑制剂的组合，所述受试者患有的CRC根据本发明方法被表征为锯齿状CRC。在一些实施例中，PKCζ、

确定受试者是否患有或将会发展成锯齿状结肠直肠癌

本文所公开的方面提供了确定受试者是否患有或将发展成锯齿状结肠直肠癌(CRC)的方法，所述方法包括：a)从有需要的受试者获得生物样品；b)使所述生物样品经受适合于检测PKCζ和

表达水平的测定；和c)确定受试者患有或将罹患锯齿状CRC，条件是与不患有所述CRC的个体中PKCζ和

的表达水平更低。PKCζ和

表达包括核糖核酸(RNA)表达。在一些实施例中，PKCζ和

表达包括蛋白质表达。在一些实施例中，PKCζ和

表达包括脱氧核糖核酸(DNA)表达。PKCζ和

的“低”表达水平是指低于正常或非患病个体中的表达水平的统计学上显著的表达量。在一些实施例中，向根据本发明方法确定患有或预测将发展成锯齿状CRC的受试者施用TGF-β1、PD-L1、透明质酸或CD44的抑制剂或其抑制剂的组合。在一些实施例中，PKCζ和

本文所公开的方面提供了确定受试者是否患有或将发展成锯齿状结肠直肠癌(CRC)的方法，所述方法包括：a)从有需要的受试者获得生物样品；b)使所述生物样品经受适合于检测透明质酸和/或CD44表达水平的测定；和c)确定所述受试者患有或将罹患锯齿状CRC，条件是与不患有所述CRC的个体中透明质酸和/或CD44的表达水平相比，从所述受试者获得的所述生物样品中检测到的透明质酸和/或CD44的表达水平更高。透明质酸和/或CD44的表达水平可以通过测量基因透明质酸合成酶2(HAS2)和/或CD44的表达或从基因HAS2和CD44表达的基因产物来检测。在一些实施例中，透明质酸和CD44表达包括RNA表达。在一些实施例中，透明质酸和CD44表达包括蛋白质表达。在一些实施例中，透明质酸和CD44表达包括DNA表达。透明质酸和/或CD44的“高”表达水平是指高于正常或非患病个体中的表达水平的统计学上显著的表达量。在一些实施例中，向根据本发明方法确定患有或预测将发展成锯齿状CRC的受试者施用TGF-β1、PD-L1、透明质酸或CD44的抑制剂或其抑制剂的组合。在一些实施例中，透明质酸和/或CD44的表达水平是使用本文公开的检测方法进行的。

本文所公开的方面提供了确定受试者是否患有或将发展成锯齿状CRC的方法，所述方法包括：a)从有需要的受试者获得生物样品；b)使所述生物样品经受适合于检测PKCζ和

表达水平的分析；c)使所述生物样品经受适合于检测透明质酸和/或CD44表达水平的测定；和d)确定所述受试者患有或将罹患锯齿状CRC，条件是与未患有所述CRC的个体中PKCζ和

的表达水平更低，并且条件是与未患有所述CRC的个体中透明质酸和/或CD44的表达水平相比，从所述受试者获得的所述生物样品中检测到的透明质酸和/或CD44的表达水平更高。PKCζ和

表达包括RNA表达。在一些实施例中，PKCζ和

表达包括蛋白质表达。在一些实施例中，PKCζ和

表达包括DNA表达。PKCζ和

的“低”表达水平是指低于正常或非患病个体中的表达水平的统计学上显著的表达量。透明质酸和/或CD44的表达水平可以通过测量基因HAS2和/或CD44的表达或从基因HAS2和CD44表达的基因产物来检测。在一些实施例中，透明质酸和CD44表达包括RNA表达。在一些实施例中，透明质酸和CD44表达包括蛋白质表达。在一些实施例中，透明质酸和CD44表达包括DNA表达。透明质酸和/或CD44的“高”表达水平是指高于正常或非患病个体中的表达水平的统计学上显著的表达量。在一些实施例中，向根据本发明方法确定患有或预测将发展成锯齿状CRC的受试者施用TGF-β1、PD-L1、透明质酸或CD44的抑制剂或其抑制剂的组合。在一些实施例中，PKCζ、

本文所公开的方面提供了评估从受试者获得的生物样品中核酸序列的存在、不存在和/或数量的方法，所述核酸序列来自包括HAS2、CD44、PKCZ和/或PKCI的基因，或者从包括HAS2、CD44、PKCZ和/或PKCI的基因表达的基因产物。在一些情况下，所述核酸序列包括脱氧核糖核酸(DNA)。在一些情况下，所述核酸序列包括变性的DNA分子或其片段。在一些情况下，所述核酸序列包括选自以下的DNA：基因组DNA、病毒DNA、线粒体DNA、质粒DNA、扩增DNA、环状DNA、循环DNA、无细胞DNA或外泌体DNA。在一些情况下，所述DNA是单链DNA(ssDNA)、双链DNA、变性双链DNA、合成DNA及其组合。环状DNA可以被切割或片段化。在一些情况下，所述核酸序列包括核糖核酸(RNA)。在一些情况下，所述核酸序列包括片段化RNA。在一些情况下，所述核酸序列包括部分降解RNA。在一些情况下，所述核酸序列包括微小RNA或其部分。在一些情况下，所述核酸序列包括选自以下的RNA分子或片段化RNA分子(RNA片段)：微小RNA(miRNA)、前miRNA、前miRNA、mRNA、前mRNA、病毒RNA、类病毒RNA、拟病毒RNA、环状RNA(circRNA)、核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、前tRNA、长链非编码RNA(lncRNA)、小核RNA(snRNA)、循环RNA、无细胞RNA、外泌体RNA、载体表达RNA、RNA转录物、合成RNA或其组合。

在一些实施例中，本文公开了基于核酸的检测测定，其可用于检测来自包括HAS2、CD44、PKCZ和/或PKCI的基因或从来自包括HAS2、CD44、PKCZ和/或PKCI的基因表达的基因产物的核酸序列的存在、不存在和/或数量。在一些情况下，基于核酸的检测测定包括定量聚合酶链反应(qPCR)、凝胶电泳(包括例如Northern或Southern印迹)、免疫化学、原位杂交如荧光原位杂交(FISH)、细胞化学或测序。在一些实施例中，测序技术包括下一代测序。在一些实施例中，所述方法涉及杂交测定，如荧光qPCR(例如，TaqMan^TM或SYBR绿色)，其涉及用特异性引物对进行的核酸扩增反应，以及包括对靶核酸序列具有特异性的可检测部分或分子的扩增核酸探针的杂交。另外的示例性基于核酸的检测测定包括使用缀合或以其它方式固定在珠、多孔板或其它底物上的核酸探针，其中所述核酸探针被配置成与靶核酸序列杂交。在一些情况下，使用对本文公开的一个或多个基因具有特异性的核酸探针。在一些情况下，核酸探针对HAS2、CD44、PKCZ和/或PKCI或从包括HAS2、CD44、PKCZ和/或PKCI的基因表达的基因产物具有特异性。

在一些实施例中，本文公开了通过使从个体获得的样品经受核酸扩增测定来检测个体的基因的方法。在一些情况下，扩增测定包括聚合酶链反应(PCR)、qPCR、自我维持序列复制、转录扩增系统、Q-β复制酶、滚环复制或任何合适的其它核酸扩增技术。合适的核酸扩增技术被配置成扩增包括本文公开的一个或多个基因或其基因表达产物的核酸序列的区。在一些情况下，扩增测定需要引物。本文已知或提供的基因或其基因表达产物的核酸序列足以使本领域技术人员能够选择引物来扩增基因或遗传变体的任何部分。适合作为引物的DNA样品可以例如通过基因组DNA、基因组DNA的片段、连接到衔接子序列或克隆序列的基因组DNA的片段的聚合酶链反应(PCR)扩增获得。本领域技术人员将利用计算机程序来设计具有期望特异性和最佳扩增特性的引物，如Oligo 7.0版(国家生物科学(NationalBiosciences))。对本领域技术人员显而易见的是，受控的机器人系统可用于分离和扩增核酸，并且可被使用。

在一些实施例中，检测包括HAS2、CD44、PKCZ和/或PKCI的基因的存在或不存在和/或数量或从基因HAS2、CD44、PKCZ和/或PKCI产生和表达的基因表达包括对从来自受试者的生物样品获得的遗传材料进行测序。可用任何合适的测序技术进行测序，包括但不限于单分子实时(SMRT)测序、Polony测序、连接测序、可逆终止子测序、质子检测测序、离子半导体测序、纳米孔测序、电子测序、焦磷酸测序、Maxam-Gilbert测序、链终止(例如Sanger)测序、+S测序或边合成边测序。测序方法还包括下一代测序，例如现代测序技术，如Illumina测序(例如Solexa)、Roche 454测序、Ion torrent测序和SOLiD测序。在一些情况下，下一代测序涉及高通量测序方法。还可以采用本领域技术人员可获得的其它测序方法。

在一些情况下，测序的核苷酸的数量是至少5个核苷酸、10个核苷酸、15个核苷酸、20个核苷酸、25个核苷酸、30个核苷酸、35个核苷酸、40个核苷酸、45个核苷酸、50个核苷酸、100个核苷酸、150个核苷酸、200个核苷酸、300个核苷酸、400个核苷酸、500个核苷酸、2000个核苷酸、4000个核苷酸、6000个核苷酸、8000个核苷酸、10000个核苷酸、20000个核苷酸、50000个核苷酸、100000个核苷酸或超过100000个核苷酸。在一些情况下，测序的核苷酸的数量在约1个核苷酸至约100000个核苷酸、约1个核苷酸至约10000个核苷酸、约1个核苷酸至约1000个核苷酸、约1个核苷酸至约500个核苷酸、约1个核苷酸至约300个核苷酸、约1个核苷酸至约200个核苷酸、约1个核苷酸至约100个核苷酸、约5个核苷酸至约100000个核苷酸、约5个核苷酸至约10000个核苷酸、约5个核苷酸至约1000个核苷酸、约5个核苷酸至约500个核苷酸、约5个核苷酸至约300个核苷酸、约5个核苷酸至约200个核苷酸、约5个核苷酸至约100个核苷酸、约10个核苷酸至约100000个核苷酸、约10个核苷酸至约10000个核苷酸、约10个核苷酸至约1000个核苷酸、约10个核苷酸至约500个核苷酸、约10个核苷酸至约300个核苷酸、约10个核苷酸至约200个核苷酸、约10个核苷酸至约100个核苷酸、约20个核苷酸至约100000个核苷酸、约20个核苷酸至约10000个核苷酸、约20个核苷酸至约1000个核苷酸、约20个核苷酸至约500个核苷酸、约20个核苷酸至约300个核苷酸、约20个核苷酸至约200个核苷酸、约20个核苷酸至约100个核苷酸、约30个核苷酸至约100000个核苷酸、约30个核苷酸至约10000个核苷酸、约30个核苷酸至约1000个核苷酸、约30个核苷酸至约500个核苷酸、约30个核苷酸至约300个核苷酸、约30个核苷酸至约200个核苷酸、约30个核苷酸至约100个核苷酸、约50个核苷酸至约100000个核苷酸、约50个核苷酸至约10000个核苷酸、约50个核苷酸至约1000个核苷酸、约50个核苷酸至约500个核苷酸、约50个核苷酸至约300个核苷酸、约50个核苷酸至约200个核苷酸、或约50个核苷酸至约100个核苷酸的范围内。

在一些实施例中，检测包括HAS2、CD44、PKCZ和/或PKCI的基因的存在或不存在和/或数量或由包括HAS2、CD44、PKCZ和/或PKCI的基因产生和表达的基因表达包括将探针或报告序列与本文所描述的靶核酸杂交。可以用作探针的分子的实例包括但不限于RNA和DNA。在一些实施例中，关于核酸的术语“探针”是指能够与特定靶核酸序列选择性结合的任何分子。在一些情况下，探针被特别设计成例如用放射性标记、荧光标记、酶、化学发光标签、比色标签或本领域已知的其它标记或标签进行标记。在一些情况下，荧光标记包括荧光团。在一些情况下，荧光团是芳香族或杂芳香族化合物。在一些情况下，荧光团是芘、蒽、萘、吖啶、芪、苯并噁唑、吲哚、苯并吲哚、噁唑、噻唑、苯并噻唑、花菁(canine)、羰花菁、水杨酸盐、邻氨基苯甲酸盐、呫吨染料、香豆素。示例性呫吨染料包括例如荧光素和罗丹明染料。荧光素和罗丹明染料包括但不限于6-羧基荧光素(FAM)、2′7′-二甲氧基-4′5′-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、四氯荧光素(TET)、6-羧基罗丹明(R6G)、N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)。合适的荧光探针还包括在α或β位置具有氨基的萘胺染料。例如，萘胺基化合物包括1-二甲基氨基萘基-5-磺酸酯、1-苯胺基-8-萘磺酸酯和2-对甲苯胺基-6-萘磺酸酯、5-(2′-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。示例性香豆素包括例如3-苯基-7-异氰酸香豆素；吖啶，如9-异硫氰酸酯吖啶和吖啶橙；N-(对(2-苯并噁唑基)苯基)马来酰亚胺；花菁，例如吲哚二碳菁3(Cy3)、吲哚二碳菁5(Cy5)、吲哚二碳菁5.5(Cy5.5)、3-(-羧基-戊基)-3′-乙基-5,5′-二甲基氧杂碳菁(CyA)；1H,5H,11H,15H-呫吨并[2,3,4-ij:5,6,7-i′j′]二喹啉嗪-18-正离子、9-[2(或4)-[[[6-[2,5-二氧代-1-吡咯烷基)氧基]-6-氧己基]氨基]磺酰基]-4(或2)-磺苯基]-2,3,6,7,12,13,16,17-八氢-内盐(TR或德克萨斯红)；或BODIPYTM染料。在一些情况下，探针包括FAM作为染料标记。

在一些情况下，本文描述的用于检测靶核酸的引物和/或探针用于扩增反应。在一些情况下，扩增反应是qPCR。示例性qPCR是采用TaqMan^TM测定的方法。

在一些情况下，qPCR包括使用嵌入染料。嵌入染料的实例包括SYBR绿I、SYBR绿II、SYBR金、溴化乙锭、亚甲蓝、派洛宁Y、DAPI、吖啶橙、Blue View或藻红蛋白。在一些情况下，嵌入染料是SYBR。

在一些情况下，用于在扩增测定中检测靶核酸的扩增循环数为约5个循环至约30个循环。在一些情况下，用于检测靶核酸的扩增循环数为至少约5个循环。在一些情况下，用于检测靶核酸的扩增循环数为至多约30个循环。在一些情况下，用于检测靶核酸的扩增循环数为约5个循环至约10个循环、约5个循环至约15个循环、约5个循环至约20个循环、约5个循环至约25个循环、约5个循环至约30个循环、约10个循环至约15个循环、约10个循环至约20个循环、约10个循环至约25个循环、约10个循环至约30个循环、约15个循环至约20个循环、约15个循环至约25个循环、约15个循环至约30个循环、约20个循环至约25个循环、约20个循环至约30个循环或约25个循环至约30个循环。

一方面，本文提供的用于确定来自特定基因型的核酸序列的存在、不存在和/或数量的方法包括扩增反应，如qPCR。在示例性方法中，从受试者的样品，例如血液或血清样品中获得遗传物质。在提取核酸的某些实施例中，使用不干扰后续分析的任何技术提取核酸。在某些实施例中，此技术使用乙醇、甲醇或异丙醇进行醇沉淀。在某些实施例中，此技术使用苯酚、氯仿或其任何组合。在某些实施例中，此技术使用氯化铯。在某些实施例中，此技术使用乙酸钠、乙酸钾或乙酸铵或任何其它常用于沉淀DNA的盐。在某些实施例中，此技术利用基于柱或树脂的核酸纯化方案，如通常商业销售的那些，一个非限制性实例将是可从西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich)获得的GenElute细菌基因组DNA试剂盒。在某些实施例中，提取后将核酸储存在水、Tris缓冲液或Tris-EDTA缓冲液中，然后再进行后续分析。在示例性实施例中，在水中提取核酸材料。在一些情况下，提取不包括核酸纯化。

在示例性qPCR测定中，将核酸样品与对样品中可能存在或不存在的靶核酸具有特异性的引物和探针以及DNA聚合酶结合。用热循环仪进行扩增反应，所述热循环仪加热和冷却用于核酸扩增的样品，并以特定波长照射样品以激发探针上的荧光团并检测发射的荧光。对于TaqMan^TM方法，探针可以是包括荧光团和淬灭剂的可水解探针，当与靶核酸杂交时，所述探针被DNA聚合酶水解。在一些情况下，当达到阈值的扩增循环数小于30个循环、29个循环、28个循环、27个循环、26个循环、25个循环、24个循环、23个循环、22个循环、21个循环或20个循环时，确定靶核酸的存在。

在一些实施例中，提供了通过检测和量化从受试者获得的生物样品中透明质酸、CD44、PKCζ和/或

的可溶性蛋白水平来检测和量化所述受试者中的所述水平。透明质酸、CD44、PKCζ和/或

可以通过使用基于抗体的测定来检测，其中利用了对透明质酸、CD44、PKCζ和/或

具有特异性的抗体(例如，抗透明质酸、抗CD44、抗PKCζ和/或抗

抗体)。对于基于抗体的检测方法，抗体可以与透明质酸、CD44、PKCζ和/或

的任何区结合。示例性的分析方法包括进行酶联免疫吸附测定(ELISA)。ELISA测定可以是夹心ELISA或直接ELISA。另一种示例性分析方法包括单分子阵列，例如Simoa。其它示例性检测方法包括免疫组织化学和侧向层析检测。

在一些情况下，可以通过检测透明质酸和/或CD44与透明质酸和/或CD44的其它结合配偶体之间的结合来检测透明质酸和/或CD44蛋白。分析透明质酸和/或CD44以及其它结合配偶体之间结合的方法包括进行体内或体外或离体测定。在一些情况下，测定可以包括免疫共沉淀(co-IP)、拉下实验、交联蛋白相互作用分析、标记转移蛋白相互作用分析或远-蛋白质印迹分析、基于FRET的测定，包括例如FRET-FLIM、酵母双杂交测定、BiFC或分裂荧光素酶测定。

治疗锯齿状结肠直肠癌的方法

本公开提供了用程序性细胞死亡配体-1(PD-L1)的拮抗剂对患有微卫星稳定(MSS)锯齿状结肠直肠癌(CRC)的受试者进行治疗引起处于初始/腺瘤阶段的锯齿状肿瘤的消退。然而，用PD-L1的拮抗剂对患有特征在于强反应性和免疫抑制性基质的晚期腺癌的MSS/锯齿状CRC受试者进行治疗仅在联合施用转化生长因子β1(TGF-β1)受体抑制剂的抑制剂时才引起锯齿状肿瘤的消退，所述抑制剂用于使锯齿状肿瘤对抗PD-L1治疗敏感。进一步公开的是，在MSS/锯齿状CRC肿瘤的肠上皮细胞(IEC)中，透明质酸(HA)及其受体CD44(一种与肿瘤发生有关的生长因子)的表达增加，这表明阻断HA与CD44之间的相互作用可以为改善患有MSS/锯齿状CRC的患者的肿瘤发生提供合适的治疗方案。

本文所公开的方面提供了通过向受试者施用治疗有效量的一种或多种本文公开的治疗剂来治疗受试者的疾病或病状或疾病或病状的亚型的方法。在一些情况下，疾病或病状包括结肠直肠癌(CRC)、胰腺癌、炎性肠病、溃疡性结肠炎、克罗恩氏病、纤维化、纤维狭窄或其组合。在一些实施例中，所述受试者是哺乳动物。在一些情况下，CRC的亚型包括锯齿状CRC。在一些情况下，锯齿状CRC包括锯齿状CRC的MSS亚型。在一些实施例中，受试者是人。在一些实施例中，受试者是小鼠、大鼠、猴或兔。

治疗剂

本文所公开的方面提供了通过向受试者施用治疗有效量的本文公开的治疗剂来治疗受试者的疾病或病状或疾病或病状的亚型的方法，条件是与未患有所述疾病或病状的个体中PKCζ和

的表达水平相比，在从所述受试者获得的生物样品中检测到PKCζ和

的低表达水平。在一些实施例中，治疗剂有效地降低或增加治疗靶标的活性或表达。治疗靶标的非限制性实例包括PD-L1、PD-1、TGF-β1、TGF-βR1、透明质酸、CD44和透明质酸酶。治疗剂的非限制性实例包括上述治疗靶标的激动剂和拮抗剂。

PDL-1活性或表达的抑制剂

本文所公开的方面提供了通过向受试者施用治疗有效量的程序性死亡配体1(PD-L1)活性或表达的抑制剂来治疗受试者的疾病或病状或疾病或病状的亚型的方法，条件是与不患有所述疾病或病状的个体中PKCζ和

表达水平。在某些实施例中，本文公开了抑制或降低患有疾病或病状的受试者中程序性死亡配体1(PD-L1)活性或表达的方法，所述方法包括：a)与不患有所述疾病或病症的个体中PKCζ和

的表达水平相比，鉴定所述受试者具有低PKCζ和

表达水平；和b)向所述受试者施用治疗有效量的PD-L1活性或表达的抑制剂。使用本文公开的任何检测方法，可以鉴定受试者具有低PKCζ和

表达水平。

在一些情况下，PD-L1活性或表达的抑制剂为间接抑制剂。在一些情况下，PD-L1活性或表达的抑制剂为直接抑制剂。在一些情况下，PD-L1活性或表达的抑制剂包括PD-L1或程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)或两者的别构调节剂。在一些情况下，PD-L1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗体片段。在一些实施例中，抗体包括单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单结构域抗体、双抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗独特型抗体、双特异性抗体或其组合。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括IgG抗体。在一些情况下，抗体或抗体片段与PD-L1结合。在一些情况下，抗体或抗体片段与程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)结合。在一些情况下，PD-L1表达活性的抑制剂包括小分子。在一些情况下，PD-L1的小分子抑制剂与PD-L1特异性结合。在一些情况下，PD-L1的小分子抑制剂与PD-1特异性结合。PD-L1活性或表达的抑制剂的非限制性实例包括派姆单抗(pembrolizumab)、阿妥珠单抗(atezolizumab)(例如

)、阿维单抗(avelumab)(例如

)、德瓦鲁单抗(durvalumab)(例如

)、纳武单抗(nivolumab)(例如

)、eFT508、LY3300054、HMS-936559、CK-301、匹地利珠单抗(pidilzumab)、AMP-224、AM P-514、PDR001、西米普利单抗(cemiplimab)。

TGF-β1活性或表达的抑制剂

本文所公开的方面提供了通过向受试者施用治疗有效量的TGF-β1活性或表达的抑制剂来治疗所述受试者的疾病或病状或疾病或病状的亚型的方法，条件是与不患有所述疾病或病状的个体中PKCζ和

表达水平。在某些实施例中，本文公开了用于抑制或降低患有疾病或病状的受试者中TGF-β1活性或表达的方法，所述方法包括：a)与不患有所述疾病或病状的个体中PKCζ和

的表达水平相比，鉴定所述受试者具有低PKCζ和

表达水平；和b)向所述受试者施用治疗有效量的TGF-β1活性或表达的抑制剂。使用本文公开的任何检测方法，可以鉴定受试者具有低PKCζ和

表达水平。

在一些情况下，TGF-β1活性或表达的抑制剂为间接抑制剂。在一些情况下，TGF-β1活性或表达的抑制剂为直接抑制剂。在一些情况下，TGF-β1活性或表达的抑制剂包括TGF-β1或TGF-β1受体(TGF-βR1)或两者的别构调节剂。在一些情况下，TGF-β1活性或表达的抑制剂包括抗体或抗体片段。在一些实施例中，抗体包括单克隆抗体、嵌合抗体、CDR移植抗体、人源化抗体、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、二硫键连接的Fv、scFv、单结构域抗体、双抗体、多特异性抗体、双特异性抗体、抗独特型抗体、双特异性抗体或其组合。在一些实施例中，抗体或其抗原结合片段包括IgG抗体。在一些情况下，抗体或抗体片段与TGF-β1结合。在一些情况下，抗体或抗体片段与TGF-βR1结合。在一些情况下，TGF-β1表达活性的抑制剂包括小分子。在一些情况下，TGF-β1的小分子抑制剂与TGF-β1特异性结合。在一些情况下，TGF-β1的小分子抑制剂与TGF-βR1特异性结合。TGF-β1活性或表达的抑制剂的非限制性实例包括加卢尼赛替布(LY2157299)、非苏木单抗(fresolimumab)(GC1008)、lucanix(belagenpumatucel-L)LY550410、LY580276和曲贝德生(Trabedersen)。

透明质酸活性或表达的抑制剂

本文所公开的方面提供了通过向受试者施用治疗有效量的透明质酸活性或表达的抑制剂来治疗受试者中疾病或病状或疾病或病状的亚型的方法，条件是与不患有所述疾病或病状的个体中PKCζ和

表达水平。在某些实施例中，本文公开了用于抑制或降低患有疾病或病状的受试者中透明质酸活性或表达的方法，所述方法包括：a)与不患有所述疾病或病状的个体中PKCζ和

的表达水平相比，鉴定所述受试者具有低PKCζ和

表达水平；和b)向所述受试者施用治疗有效量的透明质酸活性或表达的抑制剂。使用本文公开的任何检测方法，可以鉴定受试者具有低PKCζ和

表达水平。

在一些情况下，透明质酸活性或表达的抑制剂为间接抑制剂。在一些情况下，透明质酸活性或表达的抑制剂为直接抑制剂。在一些情况下，透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸或CD44或两者的别构调节剂。

在一些情况下，透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸酶或透明质酸酶活性或表达的激动剂。透明质酸酶的非限制性实例包括培沃透明质酸酶α(PVHA)。在一些情况下，透明质酸活性或表达的抑制剂包括外源性透明质酸酶。在一些情况下，外源性透明质酸酶包括重组透明质酸酶。在一些情况下，重组透明质酸酶包括人重组透明质酸酶。

在一些实施例中，透明质酸表达活性的抑制剂(例如，PVHA)，所述抑制剂可以作为单一疗法向受试者施用。在一些实施例中，在施用透明质酸表达活性的抑制剂的情况下，不向受试者施用任何其它治疗剂。设想的是，在一些实施例中，与其它组合治疗方法相比，以治疗有效剂量单独使用透明质酸表达活性的抑制剂作为单一疗法足以有效地治疗受试者的锯齿状肿瘤。

在一些实施例中，透明质酸表达活性的抑制剂、透明质酸酶或透明质酸酶活性或表达的激动剂的剂量是治疗有效剂量。例如，当透明质酸活性或表达的抑制剂是PVHA时，PVHA的治疗有效量介于0.01mg/kg至0.5mg/kg之间，介于0.02mg/kg至0.4mg/kg之间，或介于0.05mg/kg至0.3mg/kg之间。

可替代地和/或另外，与未经治疗的个体相比，治疗有效量的透明质酸活性或表达的抑制剂足以将受试者中的肿瘤发生减少至少20％、至少30％、至少40％、至少50％。在一些实施例下，肿瘤发生是通过对锯齿状息肉和癌进行计数来量化的。

可替代地和/或另外，与未经治疗的个体相比，治疗有效量的透明质酸活性或表达的抑制剂足以将受试者中的肿瘤负担减少至少20％。在一些实施例中，肿瘤负担是使用肿瘤总数、肿瘤平均大小或肿瘤负荷中的至少一个来量化的。可替代地和/或另外，治疗有效量的透明质酸活性或表达的抑制剂足以减少肿瘤中的透明质酸沉积。在一些实施例中，所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以减少所述肿瘤中的胶原沉积。

在一些情况下，透明质酸活性或表达的抑制剂包括拮抗剂、抗体或抗体片段。在一些情况下，拮抗剂、抗体或抗体片段与透明质酸结合。在一些情况下，抗体或抗体片段与70％、80％、90％或100％的透明质酸分子结合。在一些情况下，抗体或抗体片段与CD44结合。在一些情况下，抗体或抗体片段抑制透明质酸与CD44之间的结合和/或激动作用。

在一些情况下，透明质酸表达活性的抑制剂包括小分子。在一些情况下，透明质酸表达活性的抑制剂包括有效抑制透明质酸与CD44之间的结合和/或激动作用的小分子。在一些情况下，透明质酸的小分子抑制剂与透明质酸特异性结合。在一些情况下，透明质酸的小分子抑制剂与CD44特异性结合。透明质酸活性或表达的抑制剂的非限制性实例包括4-甲基伞形酮(4-MU)、透明质酸酶PH20(rHuPH20)、重组人透明质酸酶、聚乙二醇化的重组人透明质酸酶。

在一些情况下，透明质酸的间接抑制剂包括CD44的直接抑制剂。在一些情况下，CD44的直接抑制剂包括抗CD44抗体或抗体片段。在一些情况下，CD44的直接抑制剂包括DNA疫苗。在一些情况下，CD44的直接抑制剂包括CD44siRNA。在一些情况下，透明质酸的间接抑制剂包括CD44的直接抑制剂。在一些情况下，CD44的直接抑制剂包括抗CD44缀合细胞疗法。CD44活性或表达的抑制剂的非限制性实例包括AMC303和RG7356。

药物组合物

在本公开的一些实施例中，提供了含有PD-L1活性或表达的抑制剂、TGF-β1活性或表达的抑制剂、和/或透明质酸活性或表达的抑制剂、另一种治疗剂或其任何组合的药物组合物。在一些实施例中，药物组合物包含PD-L1活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，药物组合物包含TGF-β1活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，药物组合物包含PD-L1活性或表达的抑制剂和TGF-β1活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，药物组合物包含PD-L1活性或表达的抑制剂和透明质酸活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，药物组合物包含TGF-β1活性或表达的抑制剂和透明质酸活性或表达的抑制剂。在一些实施例中，药物组合物包含透明质酸的抑制剂。在一些实施例中，本公开的药物组合物被制备成溶液、于甘油、液体聚乙二醇中的分散体及其在油中的任何组合、固体剂型、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体调配物、包括纳米颗粒的剂型、包括微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合。在一些实施例中，如本文所描述的药物组合物包含赋形剂。在一些实施例中，赋形剂是《药用赋形剂手册(Handbook of Pharmaceutical Excipients)》,美国制药协会(American PharmaceuticalAssociation)(1986)中所描述的赋形剂。合适的赋形剂的非限制性实例包括缓冲剂、防腐剂、稳定剂、粘结剂、压实剂、润滑剂、螯合剂、分散增强剂、崩解剂、调味剂、甜味剂、着色剂。

在一些实施例中，赋形剂是缓冲剂。合适的缓冲剂的非限制性实例包括组氨酸、柠檬酸钠、碳酸镁、碳酸氢镁、碳酸钙和碳酸氢钙。在一些实施例中，在本公开的药物组合物中使用组氨酸、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化镁、乳酸镁、葡萄糖酸镁、氢氧化铝、柠檬酸钠、酒石酸钠、乙酸钠、碳酸钠、多磷酸钠、多磷酸钾、焦磷酸钠、焦磷酸钾、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、磷酸三钠、磷酸三钾、偏磷酸钾、氧化镁、氢氧化镁、碳酸镁、硅酸镁、乙酸钙、甘油磷酸钙、氯化钙、氢氧化钙和其它钙盐或其组合作为缓冲剂。

在一些实施例中，赋形剂包括防腐剂。合适的防腐剂的非限制性实例包括抗氧化剂，如α-生育酚和抗坏血酸盐，以及抗菌剂，如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇和苯酚。在一些实例中，抗氧化剂进一步包括但不限于EDTA、柠檬酸、抗坏血酸、丁基化羟基甲苯(BHT)、丁基化羟基茴香醚(BHA)、亚硫酸钠、对氨基苯甲酸、谷胱甘肽、没食子酸丙酯、半胱氨酸、蛋氨酸、乙醇和N-乙酰半胱氨酸。在一些情况下，防腐剂包括井冈霉素A(validamycin A)、TL-3、正钒酸钠、氟化钠、N-a-甲苯磺酰基-Phe-氯甲基酮、N-a-甲苯磺酰基-Lys-氯甲基酮、抑肽酶、苯甲基磺酰氟、二异丙基氟磷酸酯、激酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、胱天蛋白酶抑制剂、颗粒酶抑制剂、细胞粘附抑制剂、细胞分裂抑制剂、细胞周期抑制剂、脂质信号传导抑制剂、蛋白酶抑制剂、还原剂、烷化剂、抗菌剂、氧化酶抑制剂或其它抑制剂。

在一些实施例中，如本文所描述的药物组合物包含粘结剂作为赋形剂。适合的粘合剂的非限制性实例包括淀粉、预胶凝淀粉、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、乙基纤维素、聚丙烯酰胺、聚乙烯噁唑烷酮、聚乙烯醇、C12-C18脂肪酸醇、聚乙二醇、多元醇、糖、低聚糖和其组合。在一些实施例中，药物调配物中使用的粘结剂选自淀粉，马铃薯淀粉、玉米淀粉、小麦淀粉；糖类，如蔗糖、葡萄糖、右旋糖、乳糖、麦芽糊精；天然和合成树胶；明胶；纤维素衍生物，如微晶纤维素、羟丙基纤维素、羟乙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素、甲基纤维素、乙基纤维素；聚乙烯吡咯烷酮(聚维酮)；聚乙二醇(PEG)；蜡；碳酸钙；磷酸钙；醇，如山梨糖醇、木糖醇、甘露醇和水或其任何组合。

在一些实施例中，如本文所描述的药物组合物包含润滑剂作为赋形剂。适合的润滑剂的非限制性实例包括硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、氢化植物油、氢化蓖麻油(sterotex)、聚氧乙烯单硬脂酸酯、滑石、聚乙二醇、苯甲酸钠、月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁以及轻矿物油。在一些实施例中，药物调配物中使用的润滑剂选自金属硬脂酸盐(如硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸铝)、脂肪酸酯(如硬脂富马酸钠)、脂肪酸(如硬脂酸)、脂肪醇、山嵛酸甘油酯、矿物油、石蜡、氢化植物油、亮氨酸、聚乙二醇(PEG)、金属月桂基硫酸盐(如月桂基硫酸钠、月桂基硫酸镁)、氯化钠、苯甲酸钠、乙酸钠和滑石或其组合。

在一些实施例中，药物调配物包含分散增强剂作为赋形剂。在一些实施例中，合适的分散剂的非限制性实例包括淀粉、海藻酸、聚乙烯吡咯烷酮、瓜尔胶、高岭土、膨润土、纯化木质纤维素、羟基乙酸淀粉钠、异无定形硅酸盐和微晶纤维素作为高HLB乳化剂表面活性剂。

在一些实施例中，如本文所描述的药物组合物包含崩解剂作为赋形剂。在一些实施例中，崩解剂是非泡腾崩解剂。合适的非泡腾崩解剂的非限制性实例包括淀粉，如玉米淀粉、马铃薯淀粉、其预胶化和改性淀粉；甜味剂；粘土，如膨润土；微晶纤维素；海藻酸盐；羟基乙酸淀粉钠；胶，如琼脂、瓜尔胶、槐豆胶、卡那亚胶、果胶和黄蓍胶。在一些实施例中，崩解剂是泡腾崩解剂。合适的泡腾崩解剂的非限制性实例包括碳酸氢钠与柠檬酸的组合以及碳酸氢钠与酒石酸的组合。

在一些实施例中，赋形剂包括调味剂。在一些实施例中，掺入外层的调味剂选自合成调味油和调味芳香剂；天然油；植物、叶、花和果实的提取物；以及其组合。在一些实施例中，调味剂可以选自由以下组成的组：肉桂油；冬青油；薄荷油；丁香油；干草油；茴香油；桉叶；香草；柑橘油，如柠檬油、橙油、葡萄油和葡萄柚油；和水果香精，包括苹果、桃、梨、草莓、覆盆子、樱桃、李子、菠萝和杏。

在一些实施例中，赋形剂包括甜味剂。合适的甜味剂的非限制性实例包括葡萄糖(玉米糖浆)、右旋糖、转化糖、果糖及其混合物(当不用作载体时)；糖精及其各种盐，如钠盐；二肽甜味剂，如阿斯巴甜；二氢查耳酮化合物、甘草甜素；甜叶菊(Stevia Rebaudiana)(甜菊苷(Stevioside))；蔗糖的氯代衍生物，如三氯蔗糖；以及糖醇，例如山梨糖醇、甘露醇、木糖醇等。

在一些情况下，如本文所描述的药物组合物包含着色剂。合适的着色剂的非限制性实例包括食品、药物和化妆品颜料(FD&C)、药物和化妆品颜料(D&C)或外部药物和化妆品颜料(Ext.D&C)。着色剂可以用作染料或其对应的色淀。

在一些情况下，如本文所描述的药物组合物包含螯合剂。在一些情况下，螯合剂是杀真菌螯合剂。实例包括但不限于：乙二胺-N,N,N′,N′-四乙酸(EDTA)；EDTA的二钠盐、三钠盐、四钠盐、二钾盐、三钾盐、二锂盐和二铵盐；EDTA的钡螯合物、钙螯合物、钴螯合物、铜螯合物、镝螯合物、铕螯合物、铁螯合物、铟螯合物、镧螯合物、镁螯合物、锰螯合物、镍螯合物、钐螯合物、锶螯合物或锌螯合物；反式-1,2-二氨基环己烷-N,N,N′,N′-四乙酸单水合物；N,N-双(2-羟乙基)甘氨酸；1,3-二氨-2-羟丙烷-N,N,N′,N′-四乙酸；1,3-丙二胺-N,N,N′,N′-四乙酸；乙二胺-N,N’-二乙酸；乙二胺-N,N′-二丙酸二盐酸盐；乙二胺-N,N′-双(亚甲基膦酸)半水合物；N-(2-羟乙基)乙二胺-N,N′,N′-三乙酸；乙二胺-N,N,N′,N′-四(亚甲基膦酸)；O,O′-双(2-氨基乙基)乙二醇-N,N,N′,N′-四乙酸；N,N-双(2-羟基苄基)乙二胺-N,N-二乙酸；1,6-己二胺-N,N,N′,N′-四乙酸；N-(2-羟乙基)亚氨基二乙酸；亚氨基二乙酸；1,2-二氨基丙烷-N,N,N′,N′-四乙酸；次氮基三乙酸；次氮基三丙酸；次氮基三(亚甲基磷酸)的三钠盐；7,19,30-三氧杂-1,4,10,13,16,22,27,33-八氮杂双环[11,11,11]三十五烷六氢溴化物；或三亚乙基四胺-N,N,N′,N",N″′,N″"-六乙酸。

还设想了包含一种或多种本文公开的免疫治疗剂和一种或多种其它抗微生物剂或抗真菌剂的组合产品，例如，多烯，如两性霉素B(amphotericin B)、两性霉素B脂质复合物(ABCD)、脂质体两性霉素B(L-AMB)和脂质体制霉菌素(liposomal nystatin)；唑类和三唑类，如伏立康唑(voriconazole)、氟康唑(fluconazole)、酮康唑(ketoconazole)、伊曲康唑(itraconazole)、波扎康唑(pozaconazole)等；葡聚糖合成酶抑制剂，如卡泊芬净(caspofungin)、米卡芬净(micafungin)(FK463)和V-棘白菌素(V-echinocandin)(LY303366)；灰黄霉素(griseofulvin)；烯丙胺，如特比萘芬(terbinafine)；氟胞嘧啶或其它抗真菌剂，包括本文所述的那些抗真菌剂。另外，设想的是，肽可以与局部抗真菌剂组合，如环吡酮胺(ciclopirox olamine)、卤普罗近(haloprogin)、托萘酯(tolnaftate)、十一烯酸酯(undecylenate)、局部制霉菌素(topical nysatin)、阿莫罗芬(amorolfine)、布替萘芬(butenafine)、萘替芬(naftifine)、特比萘芬(terbinafine)和其它局部剂。在一些情况下，药物组合物包含另外的药剂。在一些情况下，药物组合物中存在治疗有效量的另外的药剂。

在普通储存和使用条件下，如本文所描述的药物组合物包含防止微生物生长的防腐剂。在某些实施例中，如本文所描述的药物组合物不包含防腐剂。适用于可注射使用的药物形式包括无菌水溶液或分散体和用于临时制备无菌可注射溶液或分散体的无菌粉末。药物组合物包含载体，所述载体是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，甘油、丙二醇和液体聚乙二醇)和/或植物油或其任何组合的溶剂或分散介质。例如通过使用如卵磷脂等包衣、在分散体的情况下通过维持所需粒度以及通过使用表面活性剂来维持合适流动性。通过各种抗细菌剂和抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸、硫柳汞等带来防止微生物的作用。在许多情况下，包括等渗剂，例如糖或氯化钠。可以通过在组合物中使用延迟吸收剂(例如，单硬脂酸铝和明胶)延长可注射组合物的吸收。

对于在水溶液中的肠胃外施用，例如，如果需要，应当适合地缓冲液体剂型并且用足够的盐水或葡萄糖使液体稀释剂等渗。液体剂型特别适用于静脉内、肌肉内、皮下、肿瘤内和腹膜内施用。就此方面，鉴于本公开，可以采用的无菌水性介质将是本领域技术人员已知的。例如，在某些情况下，将一剂溶于1mL至20mL等渗NaCl溶液中，然后添加到100mL至1000mL流体(例如碳酸氢钠缓冲盐水)中，或在打算输注的部位处进行注射。

在某些实施例中，通过将治疗剂以所需的量根据需要与以上枚举的各种其它成分一起并入适当的溶剂中，然后进行过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。通常，通过将各种灭菌的活性成分并入无菌媒剂中来制备分散体，所述无菌媒剂含有基础分散介质和来自上文枚举的那些的所需其它成分。在一些情况下，本文所公开的组合物以中性或盐形式调配。药学上可接受的盐包括例如酸加成盐(与蛋白质的游离氨基形成)，并且其与例如盐酸或磷酸等无机酸或如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸等有机酸形成。在一些情况下，与游离羧基形成的盐源自如氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁等无机碱和如异丙胺、三甲胺、组氨酸、普鲁卡因(procaine)等有机碱。在一些实施例中，调配后，药物组合物将以与剂量调配物相容的方式并以治疗有效量施用。

在某些实施例中，本公开的药物组合物包含与药学上可接受的载体组合的有效量的本文公开的治疗剂。如本文所使用的，“药学上可接受的”包括不干扰活性成分的生物学活性的效力和/或对所施用的患者无毒的任何载体。合适的药物载体的非限制性实例包括磷酸盐缓冲盐水溶液、水、乳液(如油/水乳液)、各种类型的润湿剂和无菌溶液。药学上可接受的载体的另外的非限制性实例可包括凝胶、生物可吸收基质材料、含有免疫治疗剂的植入元件、或任何其它适合的媒剂、递送或分配器件或材料。例如，通过常规方法调配此类载体，并以有效量向受试者施用。

在一些实施例中，药物组合物是包含免疫治疗剂(例如，免疫检测点抑制剂、调节因子或活化剂)和缓冲剂的调配物。在一些实施例中，免疫治疗剂以约10mg/mL至约50mg/mL、约15mg/mL至约50mg/mL、约20mg/mL至约45mg/mL、约25mg/mL至约40mg/mL、约30mg/mL至约35mg/mL、约25mg/mL至约35mg/mL或约30mg/mL至约40mg/mL、约15mg/mL、约20mg/mL、约25mg/mL、约30mg/mL、约33.3mg/mL、约35mg/mL、约40mg/mL、约45mg/mL或约50mg/mL的浓度存在。在一些实施例中，调配物包含包括组氨酸的缓冲剂(例如，组氨酸缓冲剂)。在某些实施例中，缓冲剂(例如，组氨酸缓冲剂)以约1mM至约20mM、约2mM至约15mM、约3mM至约10mM、约4mM至约9mM、约5mM至约8mM、或约6mM至约7mM、约1mM、约2mM、约3mM、约4mM、约5mM、约6mM、约6.7mM、约7mM、约8mM、约9mM、约10mM、约11mM、约12mM、约13mM、约14mM、约15mM、约16mM、约17mM、约18mM、约19mM或约20mM的浓度存在。在一些实施例中，缓冲剂(例如，组氨酸缓冲剂)以约6mM至约7mM、约6.7mM的浓度存在。在其它实施例中，缓冲剂(例如，组氨酸缓冲剂)具有约4至约7、约5至约6、约5.5或约6的pH。

在一些实施例中，调配物进一步包含碳水化合物。在某些实施例中，碳水化合物是蔗糖。在一些实施例中，碳水化合物(例如，蔗糖)以约50mM至约150mM、约25mM至约150mM、约50mM至约100mM、约60mM至约90mM、约70mM至约80mM、或约70mM至约75mM、约25mM、约50mM、约60mM、约70mM、约80mM、约90mM、约100mM或约150mM的浓度存在。

在一些实施例中，调配物进一步包含表面活性剂。在某些实施例中，表面活性剂是聚山梨酯20。在一些实施例中，表面活性剂或聚山梨醇酯20以约0.005％(w/w)至约0.025％(w/w)、约0.0075％(w/w)至约0.02％(w/w)或约0.01％(w/w)至0.015％(w/w)、约0.005％(w/w)、约0.0075％(w/w)、约0.01％(w/w)、约0.013％(w/w)、约0.015％(w/w)或约0.02％(w/w)的浓度存在。在某些实施例中，调配物是重构调配物。例如，在一些情况下，通过将冻干调配物溶解在稀释剂中，使得免疫治疗剂分散在重构调配物中来制备重构调配物。在一些实施例中，冻干调配物用约0.5mL至约2mL，如约1mL的注射用水或缓冲液重构。在某些实施例中，冻干调配物用1mL注射用水在临床场所重构。

组合疗法

在某些实施例中，本公开的方法包括在施用一种或多种另外的疗法之前和之后或与其组合施用如本文公开的治疗剂。另外的疗法的实例可包括但不限于化疗、放疗、抗癌剂或其任何组合。另外的疗法可以与免疫疗法的施用同时或相对于其依次施用。在某些实施例中，本公开的方法包括在施用一种或多种抗癌剂或癌症疗法之前、之后或与其组合施用如本文公开的免疫疗法。抗癌剂包括但不限于化学治疗剂、放射治疗剂、细胞因子、免疫检查点抑制剂、抗血管生成剂、凋亡诱导剂、抗癌抗体和/或抗细胞周期蛋白依赖性激酶剂。在某些实施例中，癌症疗法包括化学疗法、生物疗法、放射疗法、免疫疗法、细胞疗法、激素疗法、抗血管疗法、冷冻疗法、毒素疗法和/或手术或其组合。在某些实施例中，本公开的方法包括在施用一种或多种另外的免疫调节剂之前、之后或与其组合施用如本文公开的免疫疗法。在一些实施例中，免疫调节剂包括能够抑制与肿瘤或癌症相关的抗病毒免疫的任何化合物、分子或物质。另外的免疫调节剂的非限制性实例包括抗CD33抗体或其可变区、抗CD11b抗体或其可变区、COX2抑制剂，例如塞来昔布(celecoxib)、细胞因子，如IL-12、GM-CSF、IL-2、IFN3和1FNy，以及趋化因子，如MIP-1、MCP-1和IL-8。

在某些实施例中，当另外的疗法是细胞疗法时，示例性的细胞疗法包括但不限于免疫效应细胞疗法、嵌合抗原受体T细胞(CAR-T)疗法、自然杀伤细胞疗法和嵌合抗原受体自然杀伤(NK)细胞疗法。NK细胞或CAR-NK细胞或NK细胞和CAR-NK细胞的组合可以与本文公开的方法组合使用。在一些实施例中，NK细胞和CAR-NK细胞衍生自人类诱导多能干细胞(iPSC)、脐带血或细胞系。在一些实施例中，NK细胞和CAR-NK细胞包括细胞因子受体和自杀基因。在一些实施例中，NK细胞和CAR-NK细胞的特征在于CD56的存在和CD3表面标志物的不存在。在一些实施例中，NK细胞和CAR-NK细胞靶向肿瘤细胞(包括实体瘤)和/或携带病毒的细胞。在一些实施例中，NK细胞和CAR-NK细胞与透明质酸的抑制剂组合施用。在一些实施例中，NK细胞和CAR-NK细胞与抗PD-L1疗法组合施用。

在某些实施例中，当另外的疗法是放射疗法时，示例性剂量是5,000拉德(50Gy)至100,000拉德(1000Gy)或50,000拉德(500Gy)或在所列举范围内的其它适当剂量。可替代地，辐射剂量为约30Gy至60Gy、约40Gy至约50Gy、约40Gy至48Gy或约44Gy，或所列举范围内的其它适当剂量，其中所述剂量例如通过上述剂量学研究来确定。如本文所使用的，“Gy”可以指等于100拉德的特定辐射吸收剂量的单位。Gy是“戈瑞(Gray)”的缩写。

在某些实施例中，当另外的疗法是化学疗法时，示例性化学治疗剂包括但不限于烷化剂(例如氮芥衍生物、亚乙基亚胺、烷基磺酸盐、肼和三嗪、亚硝基脲和金属盐)、植物生物碱(例如长春花生物碱(vinca alkaloid)、紫杉烷类、鬼臼毒素(podophyllotoxin)和喜树碱类似物)、抗肿瘤抗生素(例如蒽环类药物、色霉素等)、抗代谢物(例如叶酸拮抗剂、嘧啶拮抗剂、嘌呤拮抗剂和腺苷脱氨酶抑制剂)、拓扑异构酶I抑制剂、拓扑异构酶II抑制剂以及其它抗赘生物药剂(例如核糖核苷酸还原酶抑制剂、肾上腺皮质类固醇抑制剂、酶、抗微管剂以及类视黄醇)。示例性化学治疗剂包括但不限于阿那曲唑(anastrozole)

如比卡鲁胺(bicalutamide)

硫酸博来霉素(bleomycinsulfate)

白消安(busulfan)

白消安注射液

卡培他滨(capecitabine)

N4-戊氧羰基-5-脱氧-5-氟胞嘧啶核苷、卡铂(carboplatin)

卡莫司汀(carmustine)

苯丁酸氮芥(chlorambucil)

顺铂(cisplatin)

克拉屈滨(cladribine)

环孢菌素(cyclophosphamide)(

或

)、阿糖胞苷(cytarabine)、胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)

阿糖胞苷脂质体注射液

达卡巴嗪(dacarbazine)

放线菌素(dactinomycin)(放线菌素D(Actinomycin D)、Cosmegan)、盐酸柔红霉素(daunorubicinhydrochloride)

柠檬酸柔红霉素脂质体注射液

地塞米松(dexamethasone)、多西他赛(docetaxel)

盐酸阿霉素(doxorubicinhydrochloride)

依托泊苷(etoposide)

磷酸氟达拉滨(fludarabine phosphate)

5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)

氟他胺(flutamide)

替扎他滨(tezacitibine)、吉西他滨(Gemcitabine)(双氟脱氧胞苷(difluorodeoxycitidine))、羟基脲(hydroxyurea)

伊达比星(Idarubicin)

异环磷酰胺(ifosfamide)

伊立替康(irinotecan)

L-天冬酰胺酶(L-asparaginase)

亚叶酸钙(leucovorin calcium)、美法仑(melphalan)

6-巯嘌呤(6-mercaptopurine)

甲氨蝶呤(methotrexate)

米托蒽醌(mitoxantrone)

米罗他(mylotarg)、紫杉醇(paclitaxel)

菲尼克斯(phoenix)(Yttrium90/MX-DTPA)、喷司他丁(pentostatin)、具有卡莫司汀植入物的聚苯丙生20(polifeprosan 20)

柠檬酸他莫西芬(tamoxifen citrate)

替尼泊苷(teniposide)

6-硫鸟嘌呤(6-Thioguanine)、噻替派(thiotepa)、替拉扎明(tirapazamine)

注射用盐酸拓扑替康(topotecan hydrochloride forinjection)

长春花碱

长春新碱(vincristine)

和长春瑞滨(virorelbine)

依鲁替尼(Ibrutinib)、艾代拉尼西(idelalisib)和本妥昔单抗(brentuximab vedotin)。

示例性烷化剂包括但不限于氮芥、亚乙基胺衍生物、烷基磺酸盐、亚硝基脲和三氮烯：乌拉莫司汀(uracil mustard(Aminouracil

Uracil nitrogen

))(Aminouracil

Uracilnitrogen

)、氮芥(chlormethine)

环磷酰胺(

Revimmune^TM)、异环磷酰胺(ifosfamide)

美法仑

苯丁酸氮芥

哌泊溴烷(pipobroman)

三亚乙基蜜胺(triethylenemelamine)

三亚乙基硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramine)、替莫唑胺(Temozolomide)

噻替派

白消安

卡莫司汀

洛莫司汀(lomustine)

链脲菌素(streptozocin)

和达卡巴嗪

另外的示例性烷化剂包括但不限于奥沙利铂

替莫唑胺(

和

)；放线菌素(也称为放线菌素-D、

)；美法仑(也称为L-PAM、L-肉溶素和苯丙氨酸氮芥(phenylalanine mustard)、

)；六甲蜜胺(Altretamine)(也称为六甲嘧胺(hexamethylmelamine，HMM)、

)；卡莫司汀

苯达莫司汀(Bendamustine)

白消安(

和

)；卡铂

洛莫司汀(也称为CCNU、

)；顺铂(也称为CDDP、

和

)；苯丁酸氮芥

环孢菌素(

和

)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺(imidazole carboxamide)、

)；六甲蜜胺(也称为六甲嘧胺(HMM)、

)；异环磷酰胺

泼尼氮芥(Prednumustine)；丙卡巴肼(Procarbazine)

二氯甲基二乙胺(Mechlorethamine)(也称为氮芥、芥子碱(mustine)和盐酸甲氯乙胺(mechloroethamine hydrochloride)、

)；链脲菌素

噻替派(也称为硫代磷酰胺、TESPA和TSPA、

)；环孢菌素

和盐酸苯达莫司汀(Bendamustine HCl)

示例性蒽环类药物包括但不限于例如阿霉素(

和

)；博来霉素(bleomycin)

柔红霉素(daunorubicin)(盐酸柔红霉素、道诺霉素(daunomycin)和盐酸红比霉素(rubidomycin hydrochloride)、

)；柔红霉素脂质体(柠檬酸柔红霉素脂质体、

)；米托蒽醌(DHAD、

)；表柔比星(epirubicin)(Ellence^TM)；伊达比星(

Idamycin

)；丝裂霉素C(mitomycinC)

格尔德霉素(geldanamycin)；除莠霉素(herbimycin)；近灰霉素(ravidomycin)；和脱乙酰近灰霉素(desacetylravidomycin)。

示例性长春花生物碱包括但不限于酒石酸长春瑞滨(vinorelbine tartrate)

长春新碱

和长春地辛(vindesine)

长春花碱(也称为硫酸长春碱(vinblastine sulfate)、长春碱(vincaleukoblastine)和VLB、

和

)；和长春瑞滨

示例性蛋白体抑制剂可以是但不限于硼替佐米

卡非佐米(carfilzomib)(PX-171-007、(S)-4-甲基-N—((S)-1-(((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基)-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉乙酰胺基)-4-苯并丁酰胺基)-戊酰胺)；马里佐米(marizomib)(NPI-0052)；柠檬酸伊沙佐米(ixazomib citrate)(MLN-9708)；地兰佐米(delanzomib)(CEP-18770)；和O-甲基-N-[(2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰基-O-甲基-N-[(1S)-2-[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯基甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)。

如本文所使用的，“与……组合”意指将治疗剂和另外的疗法作为处理方案或计划的一部分施用于受试者。在某些实施例中，组合使用不要求免疫疗法和另外的疗法在施用前进行物理组合，也不要求在相同的时间范围内施用。例如，并且并非通过限制的方式，将免疫疗法和一种或多种药剂同时施用于被治疗的受试者，或同时施用，或以任何顺序或在不同时间点依次施用。

在各个实施例中，另外的疗法以液体剂型、固体剂型、栓剂、可吸入剂型、鼻内剂型、脂质体调配物、包括纳米颗粒的剂型、包括微粒的剂型、聚合物剂型或其任何组合的形式施用。在某些实施例中，在约1周至约2周、约2周至约3周、约3周至约4周、约4周至约5周、约6周至约7周、约7周至约8周、约8周至约9周、约9周至约10周、约10周至约11周、约11周至约12周、约12周至约24周、约24周至约48周、约48周或约52周或更长的时间段内施用另外的疗法。在某些情况下，另外的疗法的施用频率为每日一次、每日两次、每周一次、每三周一次、每四周一次(或每月一次)、每8周一次(或每2个月一次)、每12周一次(或每3个月一次)、或每24周一次(每6个月一次)。

人锯齿状结肠直肠癌的模型

模型

本文所公开的方面提供了人锯齿状结肠直肠癌(CRC)的模型。在一些情况下，所述模型是组织模型。在一些情况下，所述组织模型包括类器官。在一些情况下，所述模型包括动物模型。在一些情况下，所述模型包括特异性抑制PRKCI和PRKCZ表达，使得

和PKCζ不被表达的遗传信息。在一些情况下，所述模型包括特异性减少PRKCI和PRKCZ表达，从而引起

和PKCζ的表达减少的遗传信息。

在一些实施例中，本文公开了人锯齿状CRC的动物模型。在一些情况下，所述动物模型包括PRKCI和PRKCZ的敲除或敲低。在一些情况下，使用同源重组、基于核酸酶的基因编辑(例如，CRISPR/Cas9)、位点特异性重组(例如，重组介导的盒交换、翻转切除开关、Cre-loxP重组系统)、基于四环素的系统(例如，Tet-On/Off)、内部核糖体进入位点或其组合来产生敲除或敲低。在一些情况下，所述动物模型包括哺乳动物。在一些情况下，所述动物模型包括小鼠、大鼠、猴。在一些情况下，所述

在一些实施例中，本文公开了产生锯齿状结肠直肠癌的动物模型的方法，所述方法包括：a)提供作为Prkci^fl/fl和Prkcz^fl/fl的动物，其中所述动物具有侧接于包括Prkci和Prkcz的基因的loxP位点；和将所述作为Prkci^fl/fl和Prkcz^fl/fl的动物与表达Cre重组酶的动物杂交，所述重组酶与小肠和大肠的绒毛和隐窝上皮细胞中普遍存在的启动子可操作地连接，从而产生在所述小肠和大肠的绒毛和隐窝上皮细胞中Pkcζ和

缺失的转基因动物。

本文所公开的方面提供了具有人锯齿状CRC的

和PKCζ缺失的人锯齿状CRC的动物模型。所述动物模型的特征可以在于体型和体重减小，以及存活率比野生型(WT)动物差(图1，小图A-C)。在一些情况下，所述动物模型的肠扩张和充盈，表明肠功能改变(图1，小图A)。所述动物模型的特征可以在于肠隐窝中潘氏细胞数量的减少，和/或潘氏细胞的错误定位(图8，小图A)。在一些情况下，所述动物模型包括小肠和结肠中的变形的增生外观，所述增生外观类似于人锯齿状表型(图1，小图D)。在一些情况下，所述动物模型包括与人微囊性或富含杯状细胞的锯齿状增生(图8，小图B)相似的细胞形态学特征，所述锯齿状增生是一种可通过替代通路进展为CRC的癌前病变。在一些情况下，所述动物模型在具有扩张和扭曲的隐窝的结肠和肠中出现自发性无蒂锯齿状腺瘤/息肉(SSA/P)(图1，小图D和E)。在一些情况下，SSA/P发展成肠肿瘤，所述肠肿瘤的数量随着动物年龄的增长而增加(图1，小图F和图9，小图C)。在一些情况下，所述肿瘤位于结肠的近端位置(图1，小图G，图1，小图H，和图8，小图D)。在一些情况下，所述肿瘤进展为粘膜内(图1，小图D)和/或浸润性腺癌(图1，小图I)。在一些情况下，所述动物模型的特征可以在于包括选自表7的多个基因的DKO^IEC转录组特征。在一些情况下，所述转录组谱特征包括来自表7的2个基因、3个基因、4个基因、5个基因、6个基因、7个基因、8个基因、9个基因、10个基因、15个基因、20个基因、25个基因或30个基因。

本文所公开的方面提供了具有

和PKCζ缺失的人锯齿状CRC的动物模型，其特征在于独特的癌症干细胞转录组谱。在一些情况下，与不具有

和PKCζ缺失的动物相比，所述动物模型的特征可以在于透明质酸表达增加(例如，过度表达)。在一些情况下，透明质酸的过度表达定位于所述动物模型的锯齿状肿瘤的基质中。在一些情况下，所述动物模型的特征可以在于CD44表达增加。在一些情况下，CD44的过度表达定位于肠上皮细胞中。在一些情况下，随着锯齿状CRC从增生进展为无蒂锯齿状腺瘤/息肉(SSA/P)，以及从SSA/P进展为癌，透明质酸和/或CD44表达增加。在一些情况下，与具有

或PKCζ缺失的动物相比和/或与野生型(WT)动物相比，所述动物模型的特征在于包括Irf7、Oas1a、Isg15和/或Cxcl10的干扰素应答基因的表达降低。在一些情况下，所述动物模型的特征可以在于包括Olfm4、Ascl2和/或Lgr5的干细胞生物标志物的表达减少。

本文所公开的方面提供了具有

和PKCζ缺失的人锯齿状CRC的动物模型，其发展的肿瘤在转录水平上与人MMS锯齿状肿瘤高度相似。在一些情况下，动物模型进一步被表征为锯齿状CRC的微卫星稳定(MSS)转录组谱(图8，小图E和图8，小图F)。与CRC中MSS表型相关的基因的非限制性实例包括FLNB、GLCE、CCDC146、GTF2IRD2、GTF2IRD2B、GTF2IRD2P1、INADL、DOCK5、MACF1、AKAP7、TTC19、MAP1B、PTK7、BIK、SHROOM3、KLK7、RHBDL2、PLK2、EPM2AIP1、AHNAK、PSTPIP2、NMU、EPB41L4A、ACTA2、PHLDB2、ISM1、KITLG、PTPRD、SLC7A8、RASGRF1、YPEL1、UBASH3B、VSIG2、MYCL1、IL8、TCF7、TLR4、ACAA2、TET2、ENPP3、ST6GAL2、CFTR、MYCN、PALLD、ARAP2、MYOF、ARHGAP29、MT1E、BICC1、ABCC3、NRXN3、C19orf45 SFRP5、REN、NEDD9、APCDD1、CXCL6、C6orf15、INPP4B、SGPL1、KIT、TMEM211、CCDC3、CXCL14、UCA1、C16orf62、HSPA2、SPATA18、MPZL2、FHL2、CSGALNACT1、LOC100506403、RUNX1、ID4、ACTG1P4、AMY1A、AMY1B、AMY1C、AMY2A、AMY2B、NDP、CD200、PDE9A、SLCO1B3、TUBA1A、ANXA3、IL17RD、PTCHD4、NTRK2、LPAR6、CHRNB1、ANXA1、CAPN8、EDN1、TSPAN2、KLK10、PDE4D、CYP4X1、ATP8A1、TWSG1、MYLK、TGFB3、TRIM22和FSTL1。在一些情况下，所述动物模型富集了细胞外信号调节激酶(ERK)通路和/或Yes相关蛋白(YAP)通路中的一种或多种基因的表达。在一些情况下，在肠上皮细胞(IEC)中检测到一种或多种基因的富集。可以在动物模型中富集的ERK通路中的基因的非限制性实例包括ARAF、DLK1、MAP3K1(MEKK1)、MAP3K2(MEKK2)、MAP3K3(MEKK3)、MAP3K4(MEKK4)、MAP4K1(HPK1)、MOS、PAK1、RAF1、MAP2K1(MEK1)、MAP2K2(MEK2)、MAP2K3(MEK3)、MAP2K4(MKK4、JNKK1)、MAP2K5(MEK5)、MAP2K6(MEK6、MKK6)、MAP2K7(JNKK2)、MAPK1(ERK2)、MAPK3(ERK1)、MAPK6(ERK3)、MAPK7(ERK5)、MAPK8(JNK1)、MAPK9(JNK2)、MAPK10(JNK3)、MAPK11(P38BETA)、MAPK12(P38GAMMA)、MAPK13(SAPK4、SERK4)、MAPK14(P38ALPHA)、ATF2(CREB2)、CREB1、CREBBP(CBP)、EGFR、ELK1、ETS1、ETS2、JUN、KCNN1(KCA2.1)、MAPKAPK2、MAPKAPK5、MAX、MEF2C、MKNK1、MYC、NFATC4(NFAT3)、SMAD4(MADH4)、TRP53(P53)、COL1A1、EGR1、FOS、HSPA5(GRP78)、HSPB1(HSP27)、JUN、MYC、TRP53(P53)、HRAS、KRAS、KSR1、MAP2K1(MEK1)、MAP2K2(MEK2)、NRAS、CDC42、CHUK(IKBKA)、GRB2、HRAS、KCNN1(KCA2.1)、KRAS、MAP2K1(MEK1)、MAP2K2(MEK2)、MAP2K4(MKK4、JNKK1)、MAP4K1(HPK1)、NRAS、RAC1、SFN(14-3-3Σ)、LAMTOR3(MP1)、MAP3K1(MEKK1)、MAPK8IP1(JIP1)、MAPK8IP2(JIP2)、MAPK8IP3(JIP3)、CCNA1、CCNA2、CCNB1、CCNB2、CCND1、CCND2、CCND3、CCNE1、CDK2、CDK4、CDK6、CDKN1A(P21CIP1、WAF1)、CDKN1B(P27KIP1)、CDKN1C(P57KIP2)、CDKN2A(P16INK4A)、CDKN2B(P15INK4B)、CDKN2C(P18INK4C)、CDKN2D(P19INK4D)和E2F1、RB1或其类似物。可以在动物模型中富集的YAP通路中的基因的非限制性实例包括ACTG1、AMOT、AMOTL1、AMOTL2、CASP3、CRB1、CRB2、CRB3、CSNK1D、CSNK1E、DCHS1、DCHS2、DIAP2、DLG1、DVL2、FAT1、FAT2、FAT3、FAT4、FJX1、AJUBA、LIMD1、LIX1L、LLGL1、LLGL2、LPP、NF2、RASSF2、RASSF4、SCRIB、WTIP、WWC1、ZDHHC18、LATS2、MOB1B、MOB1A、SAV1、STK3、STK4、TAZ、YAP1、MST1、WWTR1、HIPK2、MAPK10(JNK3)、MEIS1、PRKCI、PRKCZ、SMAD1(MADH1)、TEAD1、TEAD2、TEAD3、TEAD4、TRP63(TP73L)、TSHZ1、TSHZ2、TSHZ3、WNT1、CASP3、CCNE1、CCNE2、MYC、PPP2CB、PPP2R1A、PPP2R2D、PTPN14、RERE、NF2、TAZ、YAP1、CRB1、CRB2、CRB3、DCHS1、DCHS2、FAT1、FAT2、FAT3、FAT4、LATS1、LATS2、MST1、SCRIB、STK3、STK4、GPC5、HMCN1、POTEG、TAOK1、TAOK2、TAOK3、TJP1、TJP2、MPDZ、MPP5、NPHP4、PARD3、PARD6G、YWHAB、YWHAE、YWHAQ和YWHAZ或其类似物。

本文所公开的方面提供了产生与人锯齿状CRC相似的免疫抑制肿瘤环境的具有

和PKCζ缺失的人锯齿状CRC的动物模型。在一些情况下，与不具有

和PKCζ缺失的动物相比并且与

或PKCζ缺失的动物相比，所述动物模型的特征可以在于CD45+细胞的增加(图3，小图A)。在一些情况下，与WT动物中的程序性死亡配体1(PD-L1)的表达水平相比，所述动物模型的特征可以在于PD-L1的表达水平增加。在一些情况下，在CD45+细胞中可检测到PD-L1的表达水平增加。在一些情况下，与WT动物相比，所述动物模型的特征可以在于CD8+细胞减少。在一些情况下，所述动物模型的特征可以在于干扰素应答受损。参与干扰素应答的基因的非限制性实例包括IRF7、OAS1A、ISG15和CXCL10。

本文所公开的方面提供了产生类似于人锯齿状CRC的活化基质应答的具有

和PKCζ缺失的人锯齿状CRC的动物模型。在一些情况下，所述动物模型的特征可以在于α平滑肌肌动蛋白(αSMA)增加(图3，小图K)。在一些情况下，所述动物模型的特征可以在于胶原沉积增加(图3，小图L和图10，小图C)。在一些情况下，所述动物模型的特征可以在于包括表皮生长因子受体(EGFR)、双调蛋白(Areg)和表调蛋白(Ereg)的配体的基质源性生长因子增加。

使用人锯齿状结肠直肠癌的模型的方法

本文所公开的方面提供了使用本文公开的模型筛选锯齿状肿瘤发生的调节剂的方法。锯齿状肿瘤发生的调节剂可以包括本文公开的治疗剂或另外的疗法。本文在一些实施例中公开了筛选锯齿状肿瘤发生的调节剂的方法，所述方法包括：a)提供本文公开的人锯齿状结肠直肠癌(CRC)的模型；b)使所述模型与肿瘤发生的推定调节剂接触；和c)检测所述模型中一个或多个肿瘤相关参数的一个或多个变化。肿瘤相关参数的非限制性实例包括CD8+T细胞向锯齿状肿瘤的募集、无蒂锯齿状腺瘤(SSA)向腺癌的进展、锯齿状肿瘤的数量、锯齿状肿瘤的大小、锯齿状肿瘤的总负荷、α平滑肌肌动蛋白(αSMA)表达的增加或胶原沉积或其组合。在根据本发明方法可如何使用肿瘤相关参数的非限制性实例中，推定调节剂负调节肿瘤发生，条件是观察到去往锯齿状肿瘤的CD8+T细胞增加；推定调节剂负调节肿瘤发生，条件是没有观察到SSA向腺癌进展；推定调节剂负调节肿瘤发生，条件是与在模型与推定调节剂接触之前模型中的锯齿状肿瘤的数目相比，观察到锯齿状肿瘤的数目减少；推定调节剂负调节肿瘤发生，条件是与在模型与推定调节剂接触之前模型中的锯齿状肿瘤的大小相比，观察到锯齿状肿瘤的大小更小；推定调节剂负调节肿瘤发生，条件是与在模型与推定调节剂接触之前模型中的锯齿状肿瘤的肿瘤负荷相比，观察到锯齿状肿瘤的总负荷降低；推定调节剂负调节肿瘤发生，条件是与在模型与推定调节剂接触之前模型中αSMA的表达相比，未观察到αSMA的表达增加；推定调节剂负调节肿瘤发生，条件是与在模型与推定调节剂接触之前模型中的胶原沉积相比，未观察到胶原沉积的增加；推定调节剂选自由以下组成的组：程序性死亡配体1(PD-L1)活性或表达的抑制剂、转化生长因子β1(TGF-β1)活性或表达的抑制剂和透明质酸活性表达的抑制剂。

实施例

提供以下实施例是为了更好地说明所要求的发明，而不应理解为限制本发明的范围。在提及特定材料的程度上，其仅出于说明的目的，并且并不旨在限制本发明。本领域的技术人员可以开发等效的手段或反应物，而无需运用发明能力，也无需脱离本发明的范围。

实施例1.两种aPKC的缺失引起小肠和结肠中锯齿状肿瘤的发展

为了测试在不存在其它致癌损伤的情况下，肠上皮中

和PKCζ的组合缺失是否足以驱动肿瘤发生，将Prkci^fl/fl和Prkcz^fl/fl小鼠与Villin-cre小鼠杂交，以产生在IEC中

(LKO^IEC)、PKCζ(ZKO^IEC)或两种aPKC(DKO^IEC)缺失的小鼠系。DKO^IEC小鼠以预期的孟德尔比率出生，但表现出比野生型(WT)小鼠减少的体型和体重，以及更差的存活率(图1，小图A-C)。DKO^IEC肠道经常出现扩张和充盈，表明了改变的肠道功能和肠道梗阻(图1，小图A)，并且隐窝中的潘氏细胞(Paneth cells)数量严重减少，如通过溶菌酶免疫组织化学(IHC)测定的(图8，小图A)。剩余的潘氏细胞错误定位于上隐窝和绒毛处，并且还发现了未成熟分化的细胞群，所述未成熟分化的细胞群对潘氏细胞(溶菌酶)和杯状细胞(阿尔新蓝)的标志物染色呈阳性(图8，小图A)。DKO^IEC小鼠在小肠和结肠中都表现出变形的“锯齿状”增生外观，所述增生外观与人锯齿状表型相似(图1，小图D)。这种相似性延伸到DKO^IEC肠内存在的细胞形态学特征，所述细胞形态学特征与人类微囊泡状或富含杯状细胞的锯齿状增生相似(图8，小图B)，所述锯齿状增生是一种可通过常规“腺瘤-癌”顺序的替代通路发展为CRC的癌前病变。7周龄后，DKO^IEC小鼠的小肠和结肠均出现自发性无蒂锯齿状腺瘤/息肉(SSA/P)，所述无蒂锯齿状腺瘤/息肉具有扩张和扭曲的隐窝(图1，小图D和图1，小图E)。与几乎从不发展成肿瘤的单一aPKC缺失的小鼠(LKO^IEC和ZKO^IEC)(图8，小图C)形成鲜明对比的是，DKO^IEC小鼠表现出肠道肿瘤的有效和进行性发展，所述发展随着小鼠年龄的增长而增加(图1，小图F和图8，小图C)。虽然在小肠的不同区域的肿瘤分布中没有发现显著差异，但是在结肠中存在对近端位置的偏好(图1，小图G，图1，小图H和图8，小图D)，所述偏好密切反映了人锯齿状CRC的行为。结肠肿瘤偶尔伴有粘蛋白包涵(图1，小图H)。还观察到以隐窝侧向出芽和细胞学非典型形式的异常隐窝形成，指示存在伴随的发育异常变化(图1，小图D)。此外，DKO^IEC肠肿瘤的一大子集发展为粘膜内(图1，小图D)并且甚至是浸润性腺癌(图1，小图I)。也就是说，72.2％(13/18)和81.3％(13/16)的小鼠分别在小肠和结肠中发展为腺癌。

浸润性腺癌不仅包括管状腺癌组成部分，偶尔还包括低分化癌(图1，小图J)或印戒细胞癌，其形态学特征在于丰富的胞质内粘蛋白将核推向外周，如Ki67和阿尔新蓝双阳性细胞所指示的(图1，小图K)。还观察到严重的促结缔组织增生变化，从而指示这些肿瘤的侵袭性较高(图1，小图L)。考虑到低分化粘液细胞和印戒细胞外观与人锯齿状肿瘤的MSS和侵袭性表型相关，强烈表明DKOIEC小鼠肿瘤在形态学上模仿人锯齿状疾病MSS。事实上，对微卫星重复标志物的分析证明，DKOIEC肿瘤为MSS(图8，小图E和图8，小图F)。在这些肿瘤中，没有观察到代表性DNA-MMR基因的mRNA表达的变化(图8，小图G)。与人锯齿状肿瘤中MSS/MSI-L和CpG岛甲基化表型(CIMP)-低/CIMP阴性谱之间的正相关一致，定义CIMP的标志物都没有改变(图8，小图H)。此外，在DKO^IEC小鼠肠道中未检测到衰老(图8，小图I)。与在由KRAS或BRAF驱动的锯齿状肿瘤中报告的情况相似，并且与SSA/P是未完全转化的癌前病变的观点一致，观察到SSA/P中p53、p21和p16的表达增加，当肿瘤达到癌阶段时所述表达全部恢复(图8，小图J)。共同地，这些结果表明肠上皮中

和PKCζ的同时缺失导致SSA/P的发展，所述SSA/P进一步进展为具有高度促结缔组织增生侵袭性表型的MSS浸润性癌。

实施例2.在DKO^IEC肠上皮中激活ERK而非Wnt/β-连环蛋白信号传导

通过锯齿状通路产生的结肠直肠癌(CRC)不仅在形态学上不同于常规的腺瘤-癌表型，而且在信号传导和遗传学的角度也不同。遗传差异的特征在于Wnt/β-连环蛋白信号传导通路的突变，所述突变在锯齿状息肉中不太常见。值得注意的是，DKO^IEC肿瘤中的SSA/P和腺癌细胞都没有显示核β-连环蛋白染色的累积。然而，在来自Apc^fl/+；LKO^IEC小鼠的肿瘤中观察到核β-连环蛋白染色的累积(图2，小图A和图2，小图B)。为了确定DKO^IEC肠的表型的信号传导通路，对这些小鼠的肠样品进行了无偏转录组分析(RNA-seq)。对来自DKO^IEC肿瘤的转录组数据的研究揭示了MEK、EGFR和KRAS特征的阳性富集(图2，小图C)。DKO^IEC肠组织的免疫组织化学(IHC)证明了ERK通路的强烈激活，如通过磷酸-ERK和磷酸-EGFR的染色增加所确定的(图2，小图D)。靶向基因组测序未鉴定鼠Braf(B637E)和Kras(G12D、G12V和G13D)基因中突变的潜在编码热点的任何改变，所述改变与锯齿状肿瘤发生相关。这强烈表明，两种aPKC同时失活会激活ERK通路，与Braf或Kras的遗传改变无关。值得注意的是，对来自DKO^IEC肠组织的转录组数据进行的基因集富集分析(GSEA)还揭示了YAP通路的激活(图2，小图E)，通过IHC证实了这一点(图2，小图D)。将这些转录组数据与从锯齿状病变、管状或管状绒毛腺瘤以及MSI或MSS CRC的人类器官产生的基因特征进行比较，证明在DKO^IEC肿瘤中上调的基因与锯齿状CRC和MSS CRC的基因特征正相关(图2，小图F)。类似地，当将人锯齿状肿瘤与常规癌、管状腺瘤、腺瘤性息肉或正常结肠进行比较时，来自DKO^IEC IEC的基因特征显著上调(图2，小图G)。这两种互补的方法揭示了DKO^IEC肿瘤在转录水平上与人MSS锯齿状肿瘤高度相似。

实施例3.DKO^IEC小鼠的肠免疫抑制和基质活化

如Ki67染色所确定的，IEC中两种aPKC的组合缺失促进了细胞增殖的协同增加，所述细胞增殖的协同增加与锯齿状肿瘤的自发性产生相关(图9，小图A)。LKO^IEC肠上皮还显示出细胞死亡增加，如通过切割的胱天蛋白酶3和TUNEL的染色所示，但是DKO^IEC肿瘤中的细胞死亡显著低于LKO^IEC肿瘤中的细胞死亡(图9，小图B和图9，小图C)。DKO^IEC肿瘤中细胞死亡的减少可以解释为什么这些小鼠发展成癌症，而LKO^IEC小鼠没有，并且不能超越肿瘤前期。值得注意的是，在LKO^IEC中有大量CD45⁺细胞浸润，但在ZKO^IEC组织中没有(图3，小图A)。重要的是，这种浸润在DKO^IEC SSA/P和癌中协同增加(图3，小图A)，这表明肠上皮中两种aPKC的同时缺失触发了一种免疫应答，所述免疫应答对DKO^IEC小鼠的致瘤表型可能是关键的。不受特定理论的束缚，这些发现表明DKO^IEC小鼠的免疫微环境允许自发性锯齿状CRC的发展。LKO^IEC肠组织显示出比WT组织显著更高的CD8⁺T细胞浸润(图3，小图B)，表明

的缺失导致CD8+驱动的免疫应答的激活。然而，CD8+T细胞被排除在DKO^IEC小鼠的SSA/P和癌区域之外(图3，小图B和图10，小图A)。在DKOIEC肿瘤中的CD45+细胞中观察到程序性死亡配体1(PD-L1)的显著表达(图3，小图C)，与两种aPKC同时缺失导致强免疫抑制环境(可能有利于癌症)的观点一致。免疫细胞群的流式细胞术分析显示CD8+T细胞的比例在LKO^IEC肠组织中增加，在DKOIEC肿瘤中降低至正常(图3，小图D)，而PD-L1+/CD45+细胞的比例在DKOIEC肿瘤中特异性增加(图3，小图E)。此外，DKO^IEC肿瘤还显示出Foxp3+Treg细胞比例的显著增加(图3，小图F)，这导致肿瘤中Treg/CD8+比率的显著增加(图3，小图G)。另外，在DKO^IEC肿瘤中观察到产生IL-17A的CD4+T细胞(Th17细胞)的比例显著增加(图3，小图H)。此外，这些肿瘤显示出CD11b+髓样细胞的急剧积聚(图3I)，包括Ly6ChighLy6G–单核细胞和Ly6C+Ly6G+多形核细胞(图3，小图J)。这些群分别使人联想到单核细胞(M-MDSC)和粒细胞(G-MDSC)髓源性抑制细胞。然而，总CD4+T、B220+B和NK1.1+NK细胞的比例没有变化(图10，小图B)。这些数据强烈表明，DKO^IEC肿瘤表现出抑制CD8+T细胞应答的免疫抑制微环境，并且因此允许癌前细胞通过锯齿状通路发展为恶性肿瘤。

DKO^IEC肠病变显示了αSMA的增强表达，αSMA是癌相关成纤维细胞的真正标志物，并且αSMA在癌中表达最高(图3，小图K)。这种基质应答伴随着肿瘤区域中胶原表达和沉积的增加(图3，小图L和图10，小图C)以及TGF-β依赖性转录物的富集(图10，小图D)。此外，在DKO^IEC肿瘤中，存在与基质活化和基质衍生的生长因子相关的转录物，如EGFR、Areg和Ereg的配体上调(图10，小图E)，所述上调通过Ereg的原位杂交得到证实(图3，小图M)。支持DKO^IEC肿瘤的激活的基质/间充质表型，DKO^IEC肿瘤转录物的GSEA揭示了上皮间充质转化(EMT)的基因特征正富集(图10，小图F)。这些结果以及DKOIEC肿瘤中免疫抑制表型的增加和CD8+T细胞浸润的抑制证明了IEC中两种aPKC的缺失引起了有利于癌症的肠道微环境的诱导。这种微环境通过锯齿状通路驱动，并且具有强烈的促结缔组织增生和间充质应答。

实施例4.肠炎症驱动锯齿状肿瘤发生

用广谱抗生素组合治疗DKO^IEC小鼠，所述治疗消除了肠炎症和免疫应答，如IHC和FACS分析所指示，所述治疗显著降低了CD45⁺细胞的浸润(图4，小图A-C)。更重要的是，这种治疗显著消除了肿瘤发生(图4，小图D-E)。这种效应伴随着Ki67⁺细胞数量的减少以及磷酸-ERK和YAP染色的减少(图4，小图F-G)。与DKO^IEC小鼠类似，LKO^IEC小鼠具有增加的隐窝细胞增殖和CD45⁺细胞浸润，以及磷酸-ERK和YAP的增强的表达，所述增强的表达通过抗生素治疗恢复到正常水平(图11，小图A-C)。然而，DKO^IEC小鼠出现了自发性锯齿状肿瘤，而LKO^IEC小鼠没有(图1，小图A-L)。因此，尽管锯齿状肿瘤发生很大程度上取决于炎症驱动的过程，但炎症是不够的。DKO^IEC肠上皮中PKCζ的缺乏提供了肿瘤发展所需的另外的改变。

实施例5.CD8⁺T细胞在由锯齿状通路驱动的肿瘤发生中的作用

如果CD8⁺T细胞积聚的增加解释了LKO^IEC小鼠不能发生自发性肿瘤的原因，那么体内CD8⁺竭耗将促进LKO^IEC小鼠锯齿状肿瘤发生，其程度与DKO^IEC相当。施用中和抗CD8抗体有效地竭耗了大约70％的浸润性CD8⁺T细胞(图4，小图H)，并且重要的是，重现了DKO^IEC小鼠的锯齿状肿瘤表型(图4，小图I-K)。与DKO^IEC肿瘤相似，通过耗竭CD8⁺T细胞诱导的LKO^IEC肿瘤显示SSA/P的细胞形态学特征，包括腺癌的发展(图4，小图L)，以及增殖增加、细胞死亡减少和基质活化增强(图4，小图L-M)。因此，在DKO^IEC IEC中CD8⁺T细胞应答的缺乏是肠锯齿状肿瘤自发性发生的基础。在这种情况下，在缺乏CD8⁺T细胞浸润的DKO^IEC肿瘤中细胞死亡减少的事实表明，尽管细胞死亡增加和随后的炎症可能对肿瘤起始很重要，但必须减少细胞死亡才能使肿瘤发展到更恶性的阶段。因此，免疫监测的中断有助于减少DKO^IEC肿瘤中的细胞死亡；这使得DKO^IEC小鼠比LKO^IEC小鼠更有效地发展成癌症，而LKO^IEC小鼠则无法超越肿瘤前期阶段。

实施例6.DKO^IEC肠上皮细胞中受损的干扰素应答

为了更好地理解DKO^IEC IEC损害CD8⁺T细胞应答并驱动锯齿状肿瘤起始的机制，探索了IEC中

的损失促进CD8⁺T细胞应答的通路。

缺失的IEC的一个关键特性是细胞死亡增加，所述细胞死亡增加可能启动与免疫原性细胞死亡(ICD)相关的CD8⁺T细胞应答。RNA-Seq数据证明了符合ICD应答(图5，小图A)的若干危险信号的上调，以及ATP分泌(图5，小图B)。与这些数据一致，

缺失的肠上皮MODE-K细胞在对若干ICD刺激的应答中显示出凋亡增加(图5，小图C和图12，小图A)，表明在不存在

的情况下，IEC更倾向于经历ICD。

干扰素通路也是负责CD8⁺T细胞介导的抗肿瘤免疫的关键级联。因此，探索了

在用poly(I:C)刺激后MODE-K细胞的干扰素应答中的作用。有趣的是，

缺失的MODE-K细胞表现出对干扰素相关转录物的更强诱导作用，所述转录物包括Cxcl10(一种CD8⁺募集的必需趋化因子)(图5，小图D)。因为干扰素应答调节抗原呈递，所以通过流式细胞术分析MHC I类蛋白的表达。一致地，

的缺失显著增加了H-2K^k和H-2D^k重链在MODE-K细胞表面的表达(图5，小图E)。所有这些数据都表明，在不存在

的情况下，CD8⁺T细胞应答更高。为了加强这些结果，使用表达模型抗原卵白蛋白(OVA)的MC38细胞作为靶细胞以及使用从OT-I小鼠分离的CD8⁺T细胞作为特异性效应细胞，进行了CD8⁺T细胞介导的细胞毒性测定。重要的是，MC38细胞中

的不存在显著增加了OT-I细胞介导的杀伤(图5，小图F)，表明肠上皮细胞中

的缺失促进了CD8⁺T细胞应答，有助于防止肿瘤的发生。

为了确定PKCζ的缺失如何削弱由

的缺失诱导的CD8⁺T细胞应答，进行了转录组数据的分析。分析揭示，与WT组织相比，在DKO^IEC肿瘤中，干扰素α和干扰素γ应答基因是高度下调的基因特征(图12，小图B)。然而，这项分析没有确定干扰素通路的缺陷是否是IEC中aPKC缺失的直接结果，或者是否涉及肿瘤中另一种浸润细胞类型。对来自WT、LK^OIEC、ZKO^IEC和DKO^IEC小鼠的IEC样品的转录组分析显示，参与干扰素γ应答的基因是DKO^IEC中下调最多的基因特征。此外，与WT IEC相比，这两个特征在ZKO^IEC中也是下调最严重的(图5，小图G)。与WT相比，在ZKO^IEC IEC中也观察到干扰素应答基因的减少，并且与LKO^IEC相比，在DKO^IEC中也观察到干扰素应答基因的减少(图5，小图H和图12，小图D)。这些数据证实PKCζ的缺失通过以细胞自主方式抑制干扰素细胞应答而促成了锯齿状肿瘤发生。

使用含有(WT)或缺乏(ZKO)PKCζ的类器官的3D培养物进行了一系列离体实验。DNA甲基转移酶抑制剂(DNMTi)最近被用于转录上调双链RNA感应通路的人内源性活化剂，所述通路最终刺激I型和III型干扰素应答。将两种类型的类器官与DNMTi 5-氮杂-2-脱氧胞苷(5-AZA-CdR)一起温育24小时，然后在不存在此药物的情况下进行细胞培养。重要的是，5-AZA-CdR治疗强烈诱导了关键干扰素应答基因Irf7、Oas1a、Isg15和Cxcl10在WT类器官中的表达，并且这种表达在ZKO类器官中被严重消除(图5，小图I)。这些结果表明，IEC中的PKCζ是离体干扰素通路内源性激活所必需的。重要的是，

缺失的细胞中PKCζ的基因缺失严重抑制了干扰素转录物的表达(图5，小图J)以及在

缺陷细胞中过度激活的干扰素信号传导级联中关键元件的表达(图5，小图K)。还观察到ZKO^IEC IEC中“同种异体移植物_排斥”特征的阴性富集(图5，小图G)。对ZKO^IEC中下调基因的NextBio分析揭示了与GO术语“通过MHC I类进行的肽抗原的抗原加工和呈递”的显著相关性(图5，小图L)。因此，用5-AZA-CdR进行的刺激上调了WT类器官表面上的MHC I类长链H-2K^b，但没有上调ZKO类器官表面上的MHC I类长链H-2K^b(图5，小图M)，证明了在PKCζ缺失的条件下抗原呈递的缺陷。此外，IHC分析证明，在LKO^IEC小鼠的肠组织中MHC I类标志物上调，所述标志物在DKO^IEC小鼠中完全消除(图5，小图N)。

共同地，这些结果证实了PKCζ在IEC干扰素应答的控制中起着关键作用，并支持了DKO^IEC小鼠中干扰素应答受损是CD8⁺浸润缺陷和肠锯齿状肿瘤自发性发展的原因这一观点。

实施例7.由aPKC缺失驱动的锯齿状肿瘤的治疗干预

为了在治疗上利用PD-L1⁺/CD45⁺细胞对DKO^IEC肿瘤浸润的增加，从10周龄开始，用抗PD-L1抗体治疗DKO^IEC小鼠3周(图13，小图A)。这种治疗使肿瘤的数量、平均大小和总负荷以及癌症发病率显著下降，所述下降与CD8⁺细胞在肿瘤区域的募集的伴随增加相关(图13，小图B–D)。然而，当小鼠在13周龄开始接受治疗时，抗PD-L1治疗没有显示出任何治疗效果(图13，小图E)，此时这些小鼠表现出更严重的肿瘤负担和增加的肿瘤侵袭性(图13，小图F-H)。因此，一旦锯齿状肿瘤形成并变得更具侵袭性，就会对抗PD-L1疗法产生耐药性。晚期DKO^IEC肿瘤的特性之一是高促结缔组织增生应答，所述应答被认为是CRC进展为高恶性、高侵袭和低患者存活率的关键机制。值得注意的是，与来自13周龄小鼠的肿瘤相比，来自16周龄DKO^IEC小鼠的肿瘤显示αSMA的表达和胶原沉积增加(图13，小图I)，表明活化的基质是DKO^IEC肿瘤对疗法的耐药性的潜在促成因素。

接下来，研究锯齿状DKO^IEC肿瘤的强基质应答是否是肿瘤进展和获得更具侵袭性表型的关键。因为CRC的基质活化依赖于TGF-β信号传导，用TGF-βR1特异性抑制剂加卢尼赛替布(LY2157299)治疗10周龄的DKO^IEC小鼠(图6，小图A)。虽然这种治疗没有减少DKO^IEC小鼠中的肿瘤数量、大小或负荷(图6，小图B)，但是抑制了SSA/P向腺癌阶段的发展，并且特别降低了浸润性癌症的发生率(图6，小图C和图6，小图D)。与公认的TGF-β在基质活化中的作用一致，用加卢尼赛替布治疗产生基质磷酸-SMAD2和胶原沉积的抑制(图6，小图D)，以及TGF-β应答基因，如Angptl2、Cdkn2b、Il11和Ereg的表达减少(图6，小图E)。此外，流式细胞术分析证明在这种治疗后肿瘤中的Th17细胞比例减少(图6F)，所述减少与TGF-β在Th17细胞分化中的关键作用一致。然而，这种治疗没有显著改变CD8⁺T、Treg或CD11b⁺髓样细胞的比例(图6，小图G-J)。

PD-L1⁺/CD45⁺细胞浸润DKO^IEC肿瘤的比例不受加卢尼赛替布的影响(图6，小图K-L)，这可以解释为什么这种治疗不能恢复CD8⁺T细胞的浸润。这还表明活化的基质通过促进肿瘤进展而有助于DKO^IEC小鼠的肿瘤发生，但对锯齿状肿瘤的发生并不关键，所述锯齿状肿瘤最可能由CD8⁺T细胞应答失活介导。从治疗的角度来看潜在相关性，当用加卢尼赛替布和抗PD-L1的组合治疗23周龄的DKO^IEC小鼠的平行群组时(图6，小图M)，肿瘤的数量、大小、负荷和侵袭性显著降低(图6，小图N-O)，伴随着CD8⁺T细胞向肿瘤中的浸润增加(图6，小图P和图6，小图Q)。然而，Treg细胞的比例没有变化，尽管CD11b⁺髓样细胞显著减少(图6，小图R和图6，小图S)。这些结果表明，尽管抗PD-L1疗法对更晚期和促结缔组织增生的锯齿状癌症无效，但当SSA/P向腺癌的进展通过抑制TGF-β信号传导而变钝时，这些癌症对抗PD-L1治疗变得敏感。

实施例8.人锯齿状肿瘤显示aPKC的表达减少

为了确定人锯齿状肿瘤中aPKC损失的相关性，对病理学分类为SSA/P或管状腺瘤(TA)的息肉进行了分析。SSA/P被认为是将进展为锯齿状结肠直肠癌(CRC)的上皮前期病变，而TA被认为是遵循常规CRC。识别两种aPKC的抗体(图14，小图A)用于免疫染色30个SSA/P和30个TA样品，以及来自健康个体的20个对照。aPKC水平仅在SSA/P中显著降低，并且在TA样品中没有显著降低(图7，小图A和图7，小图B)，所述降低确立了人锯齿状肿瘤中aPKC缺失的相关性。

为了确定两种aPKC的低水平是否与CRC样品中的锯齿状特征相关，使用生物信息学查询了癌症基因组图谱网络(Cancer Genome Atlas Network，TCGA)中结肠直肠腺癌患者的大数据集。因为这些CRC样品在遗传和形态上是异质性的，并且没有通过锯齿状或常规通路对其前体来源进行注释，所以首先基于aPKC表达对患者进行分层，并使用锯齿状或传统腺瘤基因特征进行GSEA。根据PRKCI和PRKCZ的中值表达对患者进行分类。此分析证明，与PRKCI^高PRKCZ^高组相比，PRKCI^低PRKCZ^低组中锯齿状基因特征的显著阳性富集(图7，小图C)。

接下来，基于分子谱使用CCS(结肠癌亚型)分类对CRC患者进行分类。此分类包括三个子组：CCS1表示染色体不稳定；CCS2是MSI/CIMP⁺；并且CCS3主要是MSS，并且与锯齿状肿瘤相关，包括那些基质和EMT基因上调的锯齿状肿瘤，并定义了存活率最差的患者子集。在CCS3亚型中，两种aPKC的mRNA水平都显著降低(图7，小图D，图14，小图B和图14，小图C)。此外，通过两种aPKC的表达进行分层的样品显示了CCS分类对患者的明显隔离。CCS3亚型主要由PRKCI^低PRKCZ^低组(图7，小图E，图14，小图D和图14，小图E)构成，所述组与PRKCI^高PRKCZ^高亚组(图7，小图F和图14，小图F)相比与更差的预后相关联，所述预后与CCS3患者的不良预后一致。根据aPKC水平对TCGA患者进行分层也验证了这些激酶在EMT、KRAS和YAP通路的负调节以及TGF-β信号传导激活中的关键作用(图7，小图G)。此外，根据KRAS或BRAF突变状态对CRC患者进行的分析揭示，存在被表征为PRKCI^低PRKCZ^低的亚群，所述亚群还是是BRAF和KRAS的WT(图14，小图G)。这些患者的转录组的GSEA显示与上调的锯齿状和下调的腺瘤特征正相关，并且在EMT和炎性特征中阳性富集(图14，小图H)，与DKO^IEC肿瘤的表型非常一致。在KRAS或BRAF中也有突变的PRKCI^低PRKCZ^低样品比这两个致癌基因中任一个突变但为PRKCI^高PRKCZ^高的样品显示出更多的间质性和炎性表型(图14，小图I和图14，小图J)。这些结果证明，人CRC中两种aPKC的同时缺失产生了一种不同于锯齿状KRAS或BRAF突变组的额外表型，所述额外表型的特征在于基质和炎性应答。因此，PRKCI^低PRKCZ^低患者预后不良(图7，小图F和图14，小图F)可以由两种aPKC失活产生的EMT/炎性环境来解释。

PRKCI^低PRKCZ^低组的CRC患者的aPKC水平与炎性应答之间的负相关性(图7，小图G和图14，小图H-J)表明人肠道炎症与锯齿状肿瘤发生之间的潜在联系。查询了人炎性肠病(IBD)数据集，所述数据集包括克罗恩氏病(CD)和溃疡性结肠炎(UC)患者的数据。大多数数据集显示，与健康个体相比，在两种类型的IBD患者中，两种aPKC转录物的水平降低，并且锯齿状、EMT和炎性基因特征的富集增加(图7，小图H)。相比之下，CCS3亚型表现出免疫抑制表型，其特征在于更低水平的免疫刺激分子(尤其是与CCS2[MSI/CIMP⁺]亚型相比)和较高水平的免疫抑制分子，所述两种分子都与PRKCI和PRKCZ水平降低相关(图14，小图K和图14，小图L)。来自上文所描述的DKO^IEC肿瘤的结果证明了免疫监视缺陷，所述免疫监视缺陷解释了DKO^IEC小鼠模型中锯齿状肿瘤的起始，其特征在于从DKO^IEC肿瘤中排除了CD8⁺T细胞。为了在人类患者中验证这种表型，使用抗CD8⁺和抗aPKC抗体对从近端结肠收集的人CRC样品队列进行免疫染色，众所周知，SSA/P和锯齿状癌经常位于近端结肠。值得注意的是，具有低水平aPKC的CRC样品显示出比那些具有高aPKC表达水平的样品显著更低的CD8⁺T细胞浸润(图7，小图I和图7，小图J)。共同地，这些结果强烈支持慢性炎症是通过锯齿状通路发展CRC的关键，并且aPKC的缺失是所述过程和免疫抑制表型发展的核心事件。

实施例9.一般方法

小鼠

根据以下中所述的程序获得Prkcz^fl/fl、Prkci^fl/fl、Apc^fl/fl、Villin-cre和Lgr5-EGFP-ires-creERT2(Lgr5-creERT2)小鼠：Llado等人,“通过PKCζ直接磷酸化β-连环蛋白和Yap抑制肠干细胞功能和肿瘤发生(Repression of Intestinal Stem Cell Function andTumorigenesis through Direct Phosphorylation ofβ-catenin and Yap by PKCζ)”.《细胞报告(Cell Reports)》(2015)10,740-754；Nakanishi等人,“

对潘氏细胞命运、肠道炎症和肿瘤发生的控制(Control of Paneth Cell Fate,Intestinal Inflammation,and Tumorigenesis by

)”.《细胞报告》(2016)16,3297-3310。对于CD8+T细胞介导的细胞毒性测定(图5，小图A-N)，使用8至12周龄的OT-I TCR Tg(OT-I)小鼠(杰克逊实验室(Jackson Laboratory))。所有小鼠品系在C57BL/6背景下产生，并在无病原体条件下出生和维持。处死小鼠，并收集小肠和结肠用于分析。动物处置和实验程序符合机构指南，并由桑福德伯纳姆普利贝斯医学发现研究所机构动物护理和使用委员会(Sanford BurnhamPrebys Medical Discovery Institute Institutional Animal Care and UseCommittee)批准。所有基因分型均通过PCR进行。所有实验均使用年龄和性别匹配的小鼠。对于抗生素治疗，分别在饮用水中向10周龄的DKO^IEC或LKO^IEC小鼠施用氨苄青霉素(ampicillin)(1g/l)、新霉素(neomycin)(1g/l)、甲硝唑(metronidazole)(1g/l)和万古霉素(vancomycin)(0.5g/l)的组合，持续6或4周，直到所述小鼠被处死。

对于CD8+T细胞耗竭(图4，小图A-L)，对10周龄的LKO^IEC小鼠腹腔内注射200μg抗CD8抗体(克隆2.43)或对照IgG，每周两次，持续5周，直到所述小鼠被处死。对于TGF-βR1特异性抑制实验，用剂量为10mg的加卢尼赛替布(taurielo等人,2018)经口服治疗10周龄的DKO^IEC小鼠，每天两次，持续6周，直到所述小鼠被处死。用媒剂治疗对照小鼠。对于检查点免疫疗法，对10周龄或13周龄的DKO^IEC小鼠腹腔内注射剂量为10mg/kg(体重)的抗PD-L1抗体(克隆6E11)，每周两次，持续3周，直到所述小鼠被处死。对于抗PD-L1抗体和TGF-βR1特异性抑制剂的组合疗法，每天两次用剂量为10mg的加卢尼赛替布经口服治疗23周龄的DKO^IEC小鼠，并且每周两次腹膜内注射剂量为10mg/kg(体重)的抗PD-L1抗体，持续3周，直到所述小鼠被处死。抗PD-L1抗体由de Sauvage FJ(基因泰克公司(Genentech))提供。

人样品

在结肠镜检查或手术期间从20名正常健康个体、30名无蒂锯齿状腺瘤/息肉个体、30名管状腺瘤个体、25名近端结肠癌个体的结肠中收集组织样品。根据斯克里普斯格林医院伦理委员会(Ethics Committee of Scripps Green Hospital)批准的方案，从所有患者处获得了书面知情同意书。未经鉴定的样品被送到桑福德伯纳姆普利贝斯(SBP)医学发现研究所，并用于组织学分析。本研究已获得SBP医学发现研究所IRB委员会的批准。

细胞培养实验

在95％空气和5％ CO2的气氛中，MODE-K细胞、293T和MC38OVA细胞在补充有10％FBS、2mM谷氨酰胺和100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素的DMEM(Cellgro，#15-017-CV)中进行培养。对于ATP测量和免疫原性细胞死亡蛋白质印迹，将细胞用奥沙利铂(20μM)、硼替佐米(0.1μm)或10ng/ml TNFα(西格玛公司(Sigma))和2.5μg/ml CHX(西格玛公司)处理24小时。使用Varioskan Lux读数仪(例如赛默飞世尔公司(Thermo Fisher)，如制造商所指示的)通过基于荧光素的ATPlite测定(例如珀金埃尔默公司(Perkin Elmer))测量细胞外ATP水平。对于poly(I:C)处理，使用Lipofectamine 2000(例如英杰公司(Invitrogen))用0.5ug/ml的poly(I:C)(例如因维沃根公司(InVivoGen))转染细胞。用磷酸酶和蛋白酶抑制剂在RIPA缓冲液(20mM Tris-HCl、37mM NaCl、2mM EDTA、1％Triton-X、10％甘油、0.1％SDS和0.5％脱氧胆酸钠)中裂解用于蛋白质分析的细胞。将细胞提取物变性，进行SDS-PAGE，转移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(例如通用电气医疗集团(GE Healthcare))上，并用STAR方法试剂表中列出的特异性抗体进行免疫印迹。

为了敲低293T

细胞中的PKCζ和MC38OVA细胞中的

从OpenBiosystems公司获得靶向人PKCζ的TRC慢病毒shRNA(TRCN0000001219)和靶向小鼠PKC？/ι的TRC shRNA(TRCN000022757)。通过使用XtremeGene HP转染试剂(例如罗氏公司(Roche))将编码shRNA的质粒与psPAX2(例如Addgene质粒#12260)和pMD2.G(例如Addgene质粒#12259)包装质粒共转染到活跃生长的293T细胞中。转染后48小时收集含有病毒的上清液，过滤以去除细胞，并且然后在8μg/ml聚凝胺(例如密理博公司(Millipore))存在下用于感染靶细胞。在嘌呤霉素(puromycin)选择(1μg/ml)后分析细胞以确认敲低。为了在293T

细胞中敲除PKCζ，从Addgene获得靶向人PKCζ的慢病毒向导RNA质粒(BRDN0001149519)和表达Cas9和杀稻瘟菌素(blasticidin)抗性的慢病毒载体。用含有病毒的上清液处理细胞，并用嘌呤霉素和杀稻瘟菌素进行选择。来自单细胞的集落被扩增并通过免疫印迹筛选PKCζ。为了在MODE-K细胞中敲除

使用CRISPR设计工具设计了靶向小鼠

的20-核苷酸单向导RNA(sgRNA)序列。将sgRNA克隆到lentiCRISPR v2载体中，并转导到MODE-K细胞中。用嘌呤霉素选择细胞，并扩增来自单细胞的集落，并通过免疫印迹筛选

组织学、免疫组织化学、免疫荧光和原位杂交

分离器官，在冰冷的PBS中冲洗，在4℃下在10％中性缓冲福尔马林中固定过夜，脱水并包埋在石蜡中。用苏木精和曙红(H&E)对切片(5μm)进行染色。对于免疫组织化学，将切片脱蜡、再水合，并且然后进行抗原修复处理。在蛋白封闭无血清溶液(DAKO)中封闭后，将组织与初级抗体在4℃下一起温育过夜，然后与生物素化的二级抗体一起温育。在室温下，将内源性过氧化物酶在含3％ H2O2的水中淬灭10分钟。使用亲和素/生物素复合物(例如，Vectastain Elite；载体实验室(Vector Laboratories))，使用二氨基联苯胺作为色原体对抗体进行可视化。对于免疫荧光，将新鲜冷冻的器官包埋在Tissue-Tek OCT化合物(例如，Sakura)中，并将10μm的切片固定在甲醇中，用PBS洗涤，并且然后与初级抗体一起温育。将洗涤的切片与Alexa缀合的二级抗体(例如，生命技术公司(Life Technologies))一起温育，并用蔡司LSM 710NLO共聚焦显微镜检查。按照制造商的说明，使用RNAscope荧光多重测定试剂盒(高级细胞诊断公司(Advanced Cell Diagnostics))进行鼠Ereg的原位杂交。与鼠Ereg的CDS区相对应的探针(登录号：NM_007950.2，探针区：116–1496；高级细胞诊断公司；目录号：437981)。使用原位细胞死亡检测试剂盒TMR红色(赛默飞世尔(Thermo))进行TUNEL分析细胞死亡。按照制造商的说明(西格玛HT15-1KT)进行马森氏三色染色。

流式细胞术分析

使用新鲜小肠组织和类器官制剂进行流式细胞术实验。对于小肠组织的分析，将十二指肠、空肠和回肠的一半用于固有层的免疫细胞群的定量流式细胞术分析。简而言之，将小肠在冷PBS中清洗，切成小块，在HBSS中用EDTA(5mM)温育，并在37℃下用胶原酶(0.05mg/ml)消化30分钟，然后采用不连续Percoll分离法(40％和75％)纯化免疫细胞。收集在界面处浓缩的细胞，并在冷PBS中洗涤。用裂解缓冲液(BD Pharm Lyse)去除红细胞，并且使用台盼蓝对活细胞进行计数，然后用小鼠Fc封闭(纯化的抗小鼠CD16/CD32；1:50；克隆2.4G2；BD Pharmingen)在4℃下饱和30分钟，然后与特异性染色抗体一起温育。

对于IL-17A细胞内染色，将细胞在10μg/ml布雷菲德菌素A(brefeldin A)的存在下用50ng/ml的佛波醇肉豆蔻酸酯乙酸酯和500ng/ml的离子霉素(ionomycin)在37℃、5％CO2下预处理3小时。然后用特异性细胞外抗体对细胞进行染色，根据制造商的说明用固定/透化溶液试剂盒(例如，BD Cytofix/Cytoperm)对细胞进行透化，并且最后与抗IL-17A(克隆TC11-18H10；BD Pharmingen)特异性抗体一起在Perm/Wash缓冲液中在4℃下温育过夜。对于FOXP3细胞内染色，用特异性细胞外抗体对细胞进行染色，用相同的BD Cytofix/Cytoperm试剂盒对细胞进行透化，并且最后用Perm/Wash缓冲液中的抗FOXP3(克隆FJK-16s)特异性抗体在4℃过夜染色。

为了产生小肠类器官，将类器官收集在冰冷的TrypLE溶液(例如，生命技术公司)中以去除基质胶，然后吸移5个循环并在37℃下温育5分钟以获得单细胞悬液。将细胞在PBS3％ FBS中洗涤两次，并在室温下用具有100μg/ml DNA酶I的PBS重悬10分钟，然后用抗H-2Kb(克隆AF6-88.5.5.3；e生物科学公司(eBioscience))染色。对于MODE-K细胞中的抗原呈递，将细胞在PBS中洗涤，用胰蛋白酶消化并用温培养基洗涤。然后，将细胞重悬并用抗H-2Kk(克隆36-7-5；百进生物公司(BioLegend))和抗H-2Dk(克隆号15-5-5；BD Pharmingen)染色。7-AAD染色后排除死细胞。所有流式细胞术实验均在桑福德伯纳姆普利贝斯医学发现研究所共享FACS设施的BD LSRFortessa 14色分析仪上进行，并使用FlowJo软件(树星公司(Tree Star Inc.))分析流式细胞术数据。

对于MC38OVA细胞的T细胞杀伤测定，根据制造商的说明，使用EasySep小鼠CD8+T细胞分离试剂盒(例如，干细胞技术公司(StemCell Technologies,Inc))通过磁性分选从OT-I小鼠的脾脏中分离CD8+T细胞。为了产生效应细胞，用固定化抗CD3(10μg/mL)和可溶性抗CD28(5μg/mL)(Bio X细胞)以106/mL培养原初T细胞3天。3天后，将效应CD8+T细胞与1×104个表达OVA的MC38靶细胞(shNT和

)或MC38靶细胞以不同比率(2:1；1:1；1:2；1:10；1:20；1:50)在37℃、5％ CO2下共培养24小时。MC38细胞系用作阴性对照。收获上清液，并根据制造商的说明使用Pierce LDH细胞毒性测定试剂盒(赛默飞世尔科技公司(ThermoScientific))进行分析，以确定特异性细胞毒性。对于PI染色，当添加OT-I细胞时，向培养基中添加100μM的碘化丙啶。在与OT-I细胞共培养24小时后，使用Varioskan LUX多模式酶标仪(例如赛默飞世尔科技公司)测量PI信号。

肠上皮细胞分离和小肠类器官培养

肠上皮细胞(IEC)分离如先前Llado等人,“通过PKCζ直接磷酸化β-连环蛋白和Yap抑制肠干细胞功能和肿瘤发生(Repression of Intestinal Stem Cell Function andTumorigenesis through Direct Phosphorylation ofβ-catenin and Yap by PKCζ)”.《细胞报告》(2015)10,740-754所描述的进行，并有一些修改。简而言之，取出小肠，将其用不含氯化镁和钙(PBS-/-)的冷PBS洗涤，纵向打开，切成5mm的碎片，然后用冷PBS-/-洗涤若干次，直至干净。将切割的组织碎片与含有10％ FBS的PBS-/-EDTA(5mM)在4℃下温育40-60分钟。然后通过剧烈摇晃将IEC从结缔组织中机械分离出来，然后通过100μm筛网过滤到50ml锥形管中以去除组织碎片。将分离的IEC沉淀，并且然后裂解用于RNA或蛋白质提取。对于小肠类器官培养，从腹膜内注射他莫昔芬(tamoxifen)(如西格玛公司)的Lgr5-creERT2；Apc^fl/fl(WT)或Lgr5-creERT2；APC^fl/fl；Prkcz^fl/fl(ZKO)小鼠收集小肠腺瘤组织。将分离的腺瘤组织切碎成小片，并在消化缓冲液(含有10％ FBS、青霉素/链霉素、1mg/ml Xl型胶原酶、0.1mg/ml DNA酶l、10μM Y-27632的杜氏改良的伊格尔氏培养基(Dulbecco′s ModifiedEagle′s Medium))中于37℃下温育15-20分钟。将消化的腺瘤碎片用PBS-/-洗涤，然后通过100μm筛网过滤至50ml锥形管中，以去除基质碎片。分离后对腺瘤碎片进行计数，并且将总共250–500个碎片与100μl生长因子还原基质胶混合，并铺在12或24孔板中。基质胶聚合后，添加1ml培养基(含有10mM HEPES、1X Glutamax、1X B27补充剂、50ng/ml EGF和10μM Y-27632的高级DMEM/F12)。对于检查干扰素应答的实验，用3μM的5-AzA-CdR(西格玛公司)处理类器官。温育24小时后，用新鲜的无药物培养基替换所述培养基，然后将类器官培养另外3天用于RNA或流式细胞术分析。

微卫星不稳定性(MSI)分析

对于微卫星不稳定性(MSI)的检查，使用从WT和DKO^IEC小鼠组织分离的DNA，通过PCR扩增五个微卫星重复标志物。用表1中提供的FAM标记的正向引物和反向引物扩增10ngDNA，所述正向引物和反向引物对于先前验证的鼠微卫星标志物Bat24、Bat26、Bat30、Bat37、Bat64具有特异性。将Hi-Di和LIZ大小标准品添加到样品中，并且在3730xl DNA分析仪(Eton生物科技(Eton Bioscience))上进行扩增片段的分离和检测。用来自应用生物系统公司(Applied Biosystems)的Peak Scanner^TM软件分析数据，以鉴定每个标志物的等位基因模式。基于优势等位基因的大小和等位基因变体的存在，比较正常和肿瘤组织的等位基因模式并评分。具有大于或等于40％MSI的肿瘤样品被分类为MSI-高(MSI-H)，小于40％的肿瘤样品被分类为MSI-低(MSI-L)，并且没有改变的样品被分类为微卫星稳定(MSS)。

表1.用于MSI分析的示例性引物序列

基因符号	正向引物序列	反向引物序列
			Bat24	6FAM-CATAGACCCAGTGCTCATCTTCGT	CATTCGGTGGAAAGCTCTGA
Bat26	6FAM-TCACCATCCATTGCACAGTT	CTGCGAGAAGGTACTCACCC
			Bat30	6FAM-ATTTGGCTTTCAAGCATCCATA	GGGAAGACTGCTTAGGGAAGA
Bat37	6FAM-TCTGCCCAAACGTGCTTAAT	CCTGCCTGGGCTAAAATAGA
			Bat64	6FAM-CCCACACTCCTGAAAACAGTCAT	CCCTGGTGTGGCAACTTTAAGC

RNA提取和分析

使用TRIZOL试剂(例如，英杰公司)和RNeasy Mini试剂盒(例如，凯杰公司(Qiagen))从小鼠组织和培养的类器官提取总RNA，随后进行DNA酶(DNase)处理。在使用Nanodrop 1000分光光度计(例如，赛默飞世尔科技公司)进行量化后，使用随机引物和MultiScribe逆转录酶(例如，应用生物系统公司)对RNA进行RNA-seq处理或逆转录。使用CFX96实时PCR检测系统与SYBR Green Master Mix(伯乐公司(BioRad))和表2中描述的引物，通过扩增20ng互补DNA来分析基因表达。扩增参数设置为95℃，持续30秒；58℃，持续30秒以及72℃，持续30秒(总共40个循环)。每个样品的基因表达值相对于18S RNA归一化。

表2.用于qRT-PCR分析的示例性引物序列

基因符号	正向引物序列	反向引物序列
			Angptl2	GGAGGTTGGACTGTCATCCAGAG	GCCTTGGTTCGTCAGCCAGTA
Cdkn2b	ACGCTGCCACTGGAGATTG	ATGGGGCTGGGGAGAAAGA
			Il11	CTGCACAGATGAGAGACAAATTCC	GAAGCTGCAAAGATCCCAATG
Ereg	ATCCGAGGATAACTGTACCG	TCACATCGCAGACCAGTGTAG
			Irf7	ATGCACAGATCTTCAAGGCCTGGGC	GTGCTGTGGAGTGCACAGCGGAAGT
Oasla	GAGGTTCAGCATGAGAGACGTT	ACACAGTTGGTACCAGTGCTTG
			Isg15	TGGGACCTAAAGGTGAAGATGCTG	TCAGGCGCAAATGCTTGATCAC
Cxcl10	GGATCCCTCTCGCAAGGA	ATCGTGGCAATGATCTCAACA
			18s	GTAACCCGTTGAACCCATT	CCATCCAATCGGTAGTAGCG
Ifnb	TTGCCATCCAAGAGATGCTCCAGA	AGAAACACTGTCTGCTGGTGGAGT
			Nlrc5	TGGAGGAGGTCAGTTTGC	ATGCTCCTGATTGCTGTGTAG
CXCL10	GTGGCATTCAAGGAGTACCTC	GCCTTCGATTCTGGATTCAG
			IFNB	AGGACAGGATGAACTTTGAC	TGATAGACATTAGCCAGGAG

RNA测序(RNA-seq)

对于全小肠组织的RNA-seq，从3个WT空肠、3个DKO^IEC非肿瘤空肠和3个DKOIEC肿瘤中提取总RNA。对于肠上皮细胞(IEC)的RNA-seq，从3个WT、4个LKO^IEC、3个ZKO^IEC和4个DKO^IEC小鼠的正常空肠IEC中提取总RNA。每个样品均从独立的小鼠提取。RNA-seq研究是在SBP医学发现研究所的基因组学中心进行的。简而言之，使用

Poly(A)mRNA磁性分离模块分离poly(A)RNA，并使用

(马萨诸塞州伊普斯威奇的新英格兰生物实验室(NEB，Ipswich MA))的

UltraTM定向RNA文库制备试剂盒制备带条形码文库。使用高输出V2试剂盒(Illumina)在Illumina NextSeq 500上汇集文库并进行单端测序(1X75)。测序Fastq文件被上传到BaseSpace并用RNAexpressApp(Illumina)处理以获得每个基因的原始读段计数。使用RNAexpressApp生成基因矩阵文件，并使用T-检验比较和类别的log2比率进行比较。

生物信息学分析

来自锯齿状肿瘤(GSE4045、GSE76987、GSE79460、GSE43841、GSE36758、GSE46513、GSE45270)、CRC(GSE5851、GSE33113)和炎性肠病样品数据集(GSE36807、GSE59071、GSE10616、GSE10714、GSE52746、GSE6731和GSE9386)的原始基因表达数据可通过基因表达综合(Gene Expression Omnibus，GEO)直接访问。通过cBioportal下载癌症基因组图谱(TCGA)结肠直肠腺癌的RNS-seq数据(具有mRNA数据的肿瘤样品(RNA Seq V2)，来自379名患者的382个肿瘤样品)。GenePattern用于折叠基因矩阵文件或评估差异基因表达的统计学显著性。使用GENE-E软件生成基因表达的热图表示。使用GSEA3.0软件与1000个基因集排列，使用基因排序度量T检验与集合h.all.v6.1.符号(H)、c2.all.v6.1.符号(C2)、c6.all.v6.1.符号(C6)或定制基因集来进行基因集富集分析(GSEA)。表3示出了包括与微卫星稳定的结肠直肠癌表型(MSS CRC)相关的基因的基因列表。表4提供了包括在MSS CRC、锯齿状病变和管状或管状绒毛腺瘤中上调的基因的基因特征。表5提供了包括在MSS CRC、锯齿状病变和管状或管状绒毛腺瘤中下调的基因的基因特征。表6提供了一组基因特征，所述基因特征是基于与对照相比，在锯齿状息肉病患者的无蒂锯齿状息肉(SSA/P)中通过RNA-seq增加的一系列前50个基因转录物而产生的。表7提供了基于一系列基因转录物产生的基因特征，与WTIEC相比，所述基因特征在DKO^IEC IEC中通过RNA-seq显著增加(logFC＞1，FDR＜0.01)。

表3.微卫星稳定(MSS)结肠直肠癌(CRC)基因特征

FLNB	EPB41L4A	MYCN	CCDC3	NTRK2
					GLCE	ACTA2	PALLD	CXCL14	LPAR6
CCDC146	PHLDB2	ARAP2	UCA1	CHRNB1
					GTF2IRD2	ISM1	MYOF	C16orf62	ANXA1
INADL	KITLG	ARHGAP29	HSPA2	CAPN8
					DOCK5	PTPRD	MT1E	SPATA18	EDN1
MACF1	SLC7A8	BICC1	MPZL2	TSPAN2
					AKAP7	RASGRF1	ABCC3	FHL2	KLK10
TTC19	YPEL1	NRXN3	CSGALNACT1	PDE4D
					MAP1B	UBASH3B	C19orf45	RUNX1	CYP4X1
PTK7	VSIG2	SFRP5	ID4	ATP8A1
					BIK	MYCL1	REN	ACTG1P4	TWSG1
SHROOM3	IL8	NEDD9	NDP	MYLK
					KLK7	TCF7	APCDD1	CD200	TGFB3
RHBDL2	TLR4	CXCL6	PDE9A	TRIM22
					PLK2	ACAA2	C6orf15	SLCO1B3	FSTL1
EPM2A1P1	TET2	INPP4B	TUBA1A	GTF2IRD2B
					AHNAK	ENPP3	SGPL1	ANXA3	GTF2IRD2P1
PSTPIP2	ST6GAL2	KIT	IL17RD
					NMU	CFTR	TMEM211	PTCHD4

表4.MSS-CRC、锯齿状病变和管状或管状绒毛腺瘤中上调的基因特征

表5.MSS-CRC、锯齿状病变和管状或管状绒毛腺瘤中下调的基因特征

表6.无蒂锯齿状息肉(SSA/P)中上调的来自RNA-seq的基因特征

MUC5AC	TFF1	AQP5	ST3GAL4	DPCR1
					KLK10	SLC6A14	PI3	SDR16C5	RAB3B
TM4SF4	DUOX2	CLDN1	ALDOB	FIBCD1
					CTSE	ANXA10	S100P	HOXB13	NXF3
VSIG1	HTRID	DUSP4	KRT7	PDZK1IP1
					TFF2	KLK11	GJP5	GJB4	ZIC5
SERPINB5	DUOXA2	SLC6A20	APOB	CEACAM18
					KLK7	CDH3	TRIM29	PSCA	CXCL1
REG4	VNN1	PRSS22	CIDEC	MDF1
					MUC17	SULT1C2	TACSTD2	XKR9	ONECUT2

表7.DKO肠上皮细胞的转录组特征

存活分析

CRC患者样品(GSE5851、GSE33113、TCGA)被分成四个亚组：PRKCI^低PRKCZ^低、PRKCI^高PRKCZ^低、PRKCI^低PRKCZ^高和PRKCI^高PRKCZ^高，所述分类基于PRKCI和PRKCZ的表达。每个基因的中值表达值被用作临界值。通过GSEA或存活分析比较PRKCI^低PRKCZ低和朋KCI^高PRKCZ^H组。为了生成TCGA患者的卡普兰-迈耶曲线(Kaplan-Meier curves)，处理了369名具有完整整体存活期(OS)信息的患者的临床和基因表达数据，并比较了PRKCI^低PRKCZ^低(n＝88)组和PRKCI^高PRKCZ^高(n＝87)组的5年OS比率。对于GSE5851，比较PRKCI^低PRKCZ^低(n＝27)组和PRKCI^高PRKCZ^H(n＝27)组的无病存活期(DFS)比率。

统计分析

数据呈现为平均值±SEM。使用GraphPad Prism 7执行统计分析。当数据符合D′Agostino检验的正态分布时，使用斯图登氏t检验(Student′s t-test)(双尾非配对)确定组间的显著差异。如果数据不符合此检验，则使用曼-惠特尼检验(Mann-Whitney test)。通过卡方检验(Chi-square test)分析肿瘤发病率的差异(图4J)。卡普兰-迈耶图的差异通过对数秩(Mantel-Cox)检验进行分析(图1C、7F、S7E)。通过进行ANOVA多重比较(克鲁斯卡尔-沃利斯检验(Kruskal-Wallis test))来分析人样品的aPKC染色差异(图7B)。p值指示正常、SSA/P和TA中信号强度(强/中等对弱/负)之间的差异。通过针对CCS3对CCS1/CCS2的费希尔精确检验(Fisher′s exact test)，分析了根据aPKC mRNA表达的CCS1、CCS2或CCS3 CRC亚型中CRC患者比例的差异(图7，小图E，图14，小图C，图14，小图D)。将统计测试的显著性水平设置为p<0.05。

实施例10.表征PVHA透明质酸酶在新型结肠直肠癌小鼠模型中的作用

在锯齿状(DKO^IEC)小鼠模型中的上皮肿瘤细胞显示增加的CD44水平和高活化的表达透明质酸(HA)的基质。HA是干细胞受体CD44的配体。HA有助于基质的屏障作用，使免疫疗法对一些患者无效。进行实验以了解HA抑制剂在DKO^IEC小鼠模型中的作用，从而确定在没有另外的治疗的情况下或在与抗PD-L1疗法共同治疗时，肿瘤发生是否被抑制。

获得Prkcz^fl/fl、Prkci^fl/fl、Apc^fl/fl、Villin-cre和Lgr5-EGFP-ires-creERT2(Lgr5-creERT2)小鼠。将Prkci^fl/fl和Prkcz^fl/fl小鼠与Villin-cre小鼠杂交，以产生在IEC中两个aPKC都缺失的小鼠系(DKO^IEC)。确定DKO^IEC小鼠的基因型。用于确定基因型的示例性方法包括聚合酶链反应(PCR)。

DKO^IEC小鼠从16周龄开始，每周用培沃透明质酸酶α(PVHA)和/或抗PD-L1(例如，抗PD-L1单克隆抗体)治疗两次持续4周。对照DKO^IEC小鼠从16周龄开始每周用媒剂处理两次，持续4周。当联合施用PVHA和抗PD-L1治疗时，在施用抗PD-L1治疗前24小时，向DKO^IEC小鼠施用PVHA。表8示出了6组DKO^IEC小鼠的示例性治疗方案。

表8.DKO^IEC小鼠示例性治疗方案

组	动物数	测试制品1(mg/kg)	测试制品2(mg/kg)
				1	10	媒剂	媒剂
2	10	PVHA(0.0375)	媒剂
				3	10	PVHA(1.0)	媒剂
4	10	媒剂	抗PL-L1(10.0)
				5	10	PVHA(0.0375)	抗PL-L1(10.0)
6	10	PVHA(1.0)	抗PL-L1(10.0)

在最终治疗后的某一时间段，对DKO^IEC小鼠实施安乐死，以评估各种抗肿瘤活性终点。在最终治疗后，合适的时间段包括但不限于1小时、2小时、3小时、4小时、5小时、10小时、15小时、20小时、1天、1.5天、2天或3天。分析抗肿瘤活性终点的数据测量，所述数据测量包括肿瘤评分(例如，数目、大小、病理学表征、侵袭发生率)、H&E、HA染色、CD44染色、CD8染色。通过检测五个微卫星重复标志物的存在或不存在来进行微卫星不稳定性(MSI)检查。用于检测五个微卫星重复标志物存在或不存在的合适的测定包括PCR。从DKO^IEC小鼠中获得血浆样品，并评估HA/生物标志物的存在或不存在。

实施例11.表征PVHA透明质酸酶在新型结肠直肠癌小鼠模型中的作用

用PVHA治疗小鼠：对于透明质酸酶特异性抑制实验，每周给11周龄的aPKC-DKO^IEC小鼠静脉注射两次0.0375mg低剂量或0.2mg/Kg高剂量的PVHA(Halozyme)，持续3周，直到所述小鼠被处死。用媒剂治疗对照小鼠。

组织学、免疫组织化学：分离器官，在冰冷的PBS中冲洗，在4℃下在10％中性缓冲福尔马林中固定过夜，脱水并包埋在石蜡中。对于马森氏三色染色，将切片(5μm)脱蜡、再水合，并且然后按照制造商的说明用三色染色(马森)试剂盒(西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)，#HT15)染色。对于透明质酸染色，将切片(5μm)脱蜡、再水合，并且然后与生物素化透明质酸结合蛋白(密理博西格玛公司(Millipore Sigma)，#385911)在4℃下一起温育过夜，随后与链霉亲和素HRP缀合物(英杰公司，#434323)一起温育。使用二氨基联苯胺进行染色。对于CD8染色，将切片(5μm)脱蜡、再水合，并且然后加热处理以进行抗原修复(柠檬酸盐，pH6)。在蛋白封闭无血清溶液(DAKO)中封闭后，将组织与初级抗体(抗小鼠CD8(BD，#557654))在4℃下一起温育过夜，然后与生物素化的二级抗体一起温育。在室温下，将内源性过氧化物酶在含3％ H2O2的水中淬灭10分钟。使用亲和素/生物素复合物(VectastainElite；载体实验室)，使用二氨基联苯胺作为色原体对抗体进行可视化。

来自aPKC-DKO^IEC小鼠的锯齿状肿瘤显示基质活化增加，并且基质的主要组分之一是透明质酸。图17，小图A展示了在第11周开始对aPKC-DKO^IEC小鼠进行PVHA治疗的实验设计。第14周时，处死经治疗的小鼠，并且量化锯齿状息肉和癌的总数以及浸润性癌症的发生率。如图17，小图B所示，用透明质酸酶(PVHA，Halozyme)治疗这些小鼠抑制了SSA/P向腺癌阶段的发展，并且尤其是以低剂量和高剂量的PVHA减少了浸润性癌症的发生率(n：媒剂＝10，低剂量PVHA处理＝12，高剂量PVHA处理＝9)。

PVHA治疗也减少了aPKC-DKO^IEC小鼠的肿瘤数量、大小和负荷。如图18，小图A所示，获得PVHA实验中治疗的aPKC-DKO^IEC小肠的宏观图像，并分析肿瘤数量、平均大小和肿瘤负荷。箭头表示肿瘤(图18，小图A)。图18，小图B-C示出了展示肿瘤总数、平均大小和肿瘤负荷的量化的图(图18，小图B)，以及在PVHA实验中根据大小的小肠肿瘤数量的分层(图18，小图C；n：媒剂＝10，低剂量PVHA治疗＝12，高剂量PVHA治疗＝9)。低剂量和高剂量的PVHA治疗都有效地显著降低了肿瘤负担，且具有统计学显著性。

用PVHA治疗aPKC-DKO^IEC小鼠还引起肿瘤中透明质酸(图19)和胶原(图20)沉积减少。图19示出了来自用低剂量PVHA(0.0375mg/kg)(n＝5)或媒剂(n＝5)治疗的DKO^IEC小鼠的小肠肿瘤的透明质酸染色，并且图20示出了来自用PVHA(n＝5)或媒剂(n＝5)治疗的DKO^IEC小鼠的小肠肿瘤的马森氏三色染色。

进一步地，对肿瘤的PVHA治疗可以恢复肿瘤中CD8+T细胞的浸润。图21示出了来自用PVHA(n＝5)或媒剂(n＝5)治疗的DKO^IEC小鼠的小肠肿瘤的小肠的CD8染色。应当理解，与媒剂处理的样品相比，在用PVHA治疗的组织中，肿瘤组织中染色的CD8+T细胞的数量显著增加，这意味着在PVHA治疗后，CD8+T细胞对肿瘤的浸润增加。共同地，这些结果证明减弱锯齿状癌症可以通过使用透明质酸抑制剂PVHA来抑制透明质酸沉积。

贯穿本公开，各个实施例以范围格式呈现。应当理解的是，范围格式的描述仅仅是为了方便和简洁起见，并且不应被解释为对任何实施例的范围的不灵活限制。因此，范围的描述应被视为已经具体地公开了所有可能的子范围以及在所述范围内的任何单个数值到下限单位的十分之一，除非上下文另外清楚地指示。例如，对范围如1到6的描述应被视为已经具体地公开了如1到3、1到4、1到5、2到4、2到6、3到6等子范围，以及所述范围内的任何单独值，例如1.1、2、2.3、5和5.9。无论范围的广度如何，这都适用。这些中间范围的上限和下限可以独立地包括在更小的范围中，并且也涵盖在本发明内，这受制于所陈述的范围中的任何明确排除的限值。在所陈述范围包括极限中的一个或两个极限的情况下，排除那些被包括在内的极限中的任一个或两个极限的范围也包括在本发明中，除非上下文另外清楚地指示。

使用的术语仅用于描述特定实施例的目的并且不旨在限制任何实施例。如本文所使用的，除非上下文另外清楚地指明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”旨在也包括复数形式。将进一步理解，当在本说明书中使用时，术语“包括(comprises)”和/或“包括(comprising)”指定所陈述的特征、整数、步骤、操作、要素和/或组件的存在，但不排除存在或添加一个或多个其它特征、整数、步骤、操作、要素、组件和/或其组。如本文所使用的，术语“和/或”包括相关联的所列项中的一个或多个项的任何组合和全部组合。

尽管已经在本文中显示并且描述了本发明的优选实施方式，但是对于本领域的技术人员而言将显而易见的是，此类实施方式仅借助于实施例而提供。在不脱离本发明的情况下，本领域的技术人员现在将意识到许多变化、改变和替代。应当理解，本文所描述的本发明的实施例的各个替代方案都可以用于实践本发明。所附权利要求书旨在限定本发明的范围，并且由此覆盖这些权利要求和其等效物的范围内的方法和结构。

Claims

1.一种治疗受试者的锯齿状肿瘤的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用治疗有效量的透明质酸活性或表达的抑制剂，其中与没有锯齿状肿瘤的个体中的PKCζ和

表达水平。

2.根据权利要求2所述的方法，其中所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括小分子。

3.根据权利要求1至2中任一项所述的方法，其中所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸-CD44结合或激动作用的抑制剂。

4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44的拮抗剂。

5.根据权利要求4所述的方法，其中所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的抗体抑制剂。

6.根据权利要求4所述的方法，所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括CD44活性或表达的小分子抑制剂。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括透明质酸酶活性或表达的激动剂。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括外源性透明质酸酶。

9.根据权利要求7所述的方法，其中所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括重组透明质酸酶。

10.根据权利要求7所述的方法，其中所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括培沃透明质酸酶α(Pegvorhyaluronidase alfa，PVHA)。

11.根据权利要求10所述的方法，其中所述PVHA的治疗有效量介于0.01mg/kg至0.5mg/kg之间。

12.根据权利要求10至11中任一项所述的方法，其中所述PVHA的治疗有效量介于0.02mg/kg至0.4mg/kg之间。

13.根据权利要求10至12所述的方法，其中将所述培沃透明质酸酶α(PVHA)作为单一疗法施用于所述受试者。

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中与未经治疗的个体相比，所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以将所述受试者中的肿瘤发生减少至少30％。

15.根据权利要求14所述的方法，其中所述肿瘤发生是通过对锯齿状息肉和癌进行计数来量化的。

16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中与未经治疗的个体相比，所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以将所述受试者中的肿瘤负担减少至少20％。

17.根据权利要求16所述的方法，其中所述肿瘤负担是使用肿瘤总数、肿瘤平均大小或肿瘤负荷中的至少一个来量化的。

18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以减少所述肿瘤中的透明质酸沉积。

19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以减少所述肿瘤中的胶原沉积。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括血液、血浆、血清或组织活检。

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法，其中所述PKCζ和

的低表达水平包括PKCζ和

的低转录水平、低翻译水平或低活性水平。

22.一种治疗受试者的锯齿状肿瘤的方法，所述方法包括：

向所述受试者施用治疗有效量的透明质酸活性或表达的抑制剂。

23.根据权利要求22所述的方法，其中所述透明质酸活性或表达的抑制剂包括培沃透明质酸酶α(PVHA)。

24.根据权利要求23所述的方法，其中将所述培沃透明质酸酶α(PVHA)作为单一疗法施用于所述受试者。

25.根据权利要求23至24中任一项所述的方法，其中所述PVHA的治疗有效量介于0.01mg/kg至0.5mg/kg之间。

26.根据权利要求23至25中任一项所述的方法，其中所述PVHA的治疗有效量介于0.02mg/kg至0.4mg/kg之间。

27.根据权利要求23至26中任一项所述的方法，与未经治疗的个体相比，所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以将所述受试者中的肿瘤发生减少至少30％。

28.根据权利要求22至27中任一项所述的方法，其中与没有锯齿状肿瘤的个体中的PKCζ和

表达水平。

29.根据权利要求22至28中任一项所述的方法，其中与未经治疗的个体相比，所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以将所述受试者中的肿瘤发生减少至少30％。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述肿瘤发生是通过对锯齿状息肉和癌进行计数来量化的。

31.根据权利要求22至30中任一项所述的方法，其中与未经治疗的个体相比，所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以将所述受试者中的肿瘤负担减少至少20％。

32.根据权利要求31所述的方法，其中所述肿瘤负担是使用肿瘤总数、肿瘤平均大小或肿瘤负荷中的至少一个来量化的。

33.根据权利要求22至32中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以减少所述肿瘤中的透明质酸沉积。

34.根据权利要求22至33中任一项所述的方法，其中所述治疗有效量的所述透明质酸活性或表达的抑制剂足以减少所述肿瘤中的胶原沉积。

35.根据权利要求28至34中任一项所述的方法，其中所述生物样品包括血液、血浆、血清或组织活检。