CN115651091A

CN115651091A - 一种高抗凝血海参肠多糖及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115651091A
Application number: CN202211412950.6A
Authority: CN
Inventors: 刘雪; 贾爱荣; 张绵松; 刘昌衡; 崔婷婷; 徐振鲁
Original assignee: Biology Institute of Shandong Academy of Sciences
Current assignee: Biology Institute of Shandong Academy of Sciences
Priority date: 2022-11-11
Filing date: 2022-11-11
Publication date: 2023-01-31
Anticipated expiration: 2042-11-11
Also published as: CN115651091B

Abstract

本发明公开了一种高抗凝血海参肠多糖及其制备方法与应用，属于海洋生物多糖制备技术领域。本发明的高抗凝血海参肠多糖分子量为171.5kDa，单糖组成包括岩藻糖，总糖含量为53.36％，蛋白含量为0.67％，硫酸基含量为28.31％。其对活化部分凝血酶时间(APTT)，凝血酶时间(TT)，凝血酶原时间(PT)均有显著的延长作用，尤其是对APTT的延长作用，显著高于肝素，且浓度为50μg/mL时，APTT已达500s以上；还可显著降低纤维蛋白原(FIB)含量。本发明的高抗凝血海参肠多糖是一种多作用机制、高抗凝血、高纯度岩藻多糖，将海参肠变废为宝，提高海参产业附加值，同时减轻环境压力。

Description

一种高抗凝血海参肠多糖及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于海洋生物多糖制备技术领域，具体涉及一种高抗凝血海参肠多糖及其制备方法与应用。

背景技术

公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

海参具有极高的营养价值和药用价值，自古就被视为营养滋补佳品和名贵药材，位列“海八珍”之一。我国海参产业发展迅速，2020年，产值已超过600亿元。近年来，海参精深加工行业逐渐兴起。但是，总体而言，海参加工工业仍处于传统加工阶段，加工模式粗放，加工过程中往往会产生大量残体、下脚料、废液等，不仅造成资源浪费，而且会对周围环境形成严重的污染。开发利用海参加工废弃物，对于海参行业意义重大。海参肠是海参加工过程中主要的一种废料，通常被丢弃，利用度不高，但是，研究表明，海参肠中含有多种活性物质，如多糖、蛋白质、皂苷、益生菌等。如果提取其中活性成分，将其应用于食品营养和药学领域，将极大提高海参产业附加值，也可减轻环境污染。

海参多糖是海参中重要的活性成分之一，近年来研究较多，但是，主要集中在体壁多糖，海参肠多糖的研究十分有限。从海参肠中获取高活性多糖成分，对海参肠的开发利用具有重要意义。心脑血管疾病是当今世界上威胁人类最严重的疾病之一，传统抗凝血药物中，肝素统领市场长达半个多世纪，但是肝素具有多种副作用，且肝素在其主要制备原料如猪肠和牛肺中浓度低。近年来“疯牛病”等动物疾病频发，也导致肝素类药物安全性下降。因此，寻找新的肝素替代资源成为国际上的研究热点。海洋多糖已被证明具有良好的抗凝血活性，但是大部分海洋多糖的抗凝活性与肝素相比仍有一定差距。基于此，为了更好的开发利用海参加工副产物，提高海参产业附加值，同时寻找肝素类似物，本申请提供一种高抗凝血海参肠多糖及其制备方法。

发明内容

为了解决现有技术的不足，本发明的目的是提供一种高抗凝血海参肠多糖及其制备方法与应用，本发明提供的高抗凝血海参肠多糖显著延长APTT，延长作用高于肝素，且浓度为50μg/mL时，APTT已达500s以上；浓度为200μg/mL以内时，即可显著延长TT，PT，降低FIB含量。

为了实现上述目的，本发明的技术方案为：

一方面，一种高抗凝血海参肠多糖，所述高抗凝血海参肠多糖分子量为25.1-171.5kDa，单糖组成包括岩藻糖；

所述海参肠多糖从海参肠中提取获得。

另一方面，上述高抗凝血海参肠多糖的制备方法，包括如下步骤：

S1、将海参肠干燥粉碎、脱脂；

S2、向脱脂后的海参肠粉中加入乙酸钠缓冲液、木瓜蛋白酶、EDTA及半胱氨酸进行酶解提取，提取后固液分离，收集上清液；

S3、向上清液中加入氯化十六烷基吡啶CPC溶液，室温反应10-30h，收集沉淀；

S4、将沉淀溶解于NaCl∶乙醇混合溶液中，搅拌均匀后与乙醇混合静置，收集沉淀部分；

S5、将步骤S4所得沉淀用乙醇洗涤、烘干后，透析脱盐，浓缩、冻干得到混合海参肠多糖；

S6、将混合海参肠多糖通过Q-Sepharose Fast Flow离子交换色谱分离，洗脱、收集洗脱液得到海参肠多糖。

本发明的高抗凝血海参肠多糖对活化部分凝血酶时间(APTT)，凝血酶时间(TT)，凝血酶原时间(PT)均有显著的延长作用，降低FIB含量，尤其是对APTT的延长作用，显著高于肝素，且浓度为50μg/mL时，APTT已达500s以上，高于多种海洋多糖对APTT的延长作用；浓度在200μg/mL以内，即可显著延长TT，PT，降低FIB含量，因而第三方面，一种上述高抗凝血海参肠多糖在制备抗凝血保健食品和/或药物中的应用。

本发明的有益效果为：

本发明的高抗凝血海参肠多糖可显著延长APTT，TT，PT，降低FIB含量，尤其是对APTT的延长作用，显著高于肝素，且浓度为50μg/mL时，APTT已达500s以上，高于多种海洋多糖对APTT的延长作用，且浓度在200μg/mL以内，即可显著延长TT，PT，降低FIB含量。

本发明的高抗凝血海参肠多糖是一种多机制高抗凝血、高纯度岩藻多糖，可以通过抑制内源性凝血途径，外源性凝血途径发挥抗凝血作用，也可通过抑制凝血酶介导的纤维蛋白的形成发挥抗凝血作用，来源于海参废弃物，用于制备抗凝血保健食品和/或药物可提高海参产业附加值，减少环境污染。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为本发明实施例1的海参肠多糖单糖组成测定高效液相色谱图；

图2为本发明实施例1的海参肠多糖分子量测定标准曲线；

图3为本发明实施例1的海参肠多糖体外抗凝血活性APTT分析(注：仪器检测限为500s，超出仪器检测限，以500s计)；

图4为本发明实施例1的海参肠多糖体外抗凝血活性PT分析(注：仪器检测限为500s，超出仪器检测限，以500s计)；

图5为本发明实施例1的海参肠多糖体外抗凝血活性TT分析(注：仪器检测限为500s，超出仪器检测限，以500s计)；

图6为本发明实施例1的海参肠多糖SCG3体外抗凝血活性FIB含量分析；

图7为本发明实施例1的海参肠多糖SCG3总糖含量测定标准曲线；

图8为本发明实施例1的海参肠多糖SCG3蛋白含量测定标准曲线；

图9为本发明实施例1的海参肠多糖SCG3硫酸基含量测定标准曲线；

图10为本发明实施例1的海参肠多糖SCG3红外光谱图；

图11为本发明实施例1的海参肠多糖SCG3核磁共振¹H谱；

图12为本发明实施例1的海参肠多糖SCG3核磁共振¹³C谱。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

鉴于目前海参产业附加值低，海参加工副产物利用率低以及肝素类药物有多种副作用、安全性下降的问题，本发明提出了一种高抗凝血海参肠多糖及其制备方法与应用。

本发明的一种典型实施方式，提供了一种高抗凝血海参肠多糖，所述高抗凝血海参肠多糖分子量为25.1-171.5kDa，单糖组成包括岩藻糖；

所述海参肠多糖从海参肠中提取获得。

该实施方式的一些实施例中，所述高抗凝血海参肠多糖分子量为171.5kDa，单糖组成包括岩藻糖，总糖含量为53.36％，蛋白含量为0.67％，硫酸基含量为28.31％。

其中，所述岩藻糖由非硫酸化岩藻糖，4-硫酸化岩藻糖及2-硫酸化岩藻糖或2,4-硫酸化岩藻糖构成。

本发明的高抗凝血海藻多糖可显著延长APTT，延长作用高于肝素，浓度为50μg/mL时，APTT已达500s以上；浓度为200μg/mL以内时，即可显著延长TT，PT，降低FIB含量，对内源性凝血途径，外源性凝血途径均有抑制作用，同时可抑制凝血酶介导的纤维蛋白的形成、降低FIB含量，属于多作用机制高抗凝血多糖。

本发明的另一种典型实施方式，提供了上述高抗凝血海参肠多糖的制备方法，包括如下步骤：

S1、将海参肠干燥粉碎、脱脂；

S4、将沉淀溶解于NaCl溶液-乙醇混合溶液中，搅拌均匀后与乙醇混合静置，收集沉淀部分；

该实施方式的一些实施例中，海参肠干燥方式为冷冻干燥。

该实施方式的一些实施例中，脱脂具体为：取粉碎得到的海参肠粉，加入5-10倍体积的丙酮浸泡脱脂。

该实施方式的一些实施例中，乙酸钠缓冲液浓度为0.1-0.3mol/L，优选为0.1mol/L；优选的，粉碎得到的海参肠粉与乙酸钠缓冲液的料液比为1：20-30g/mL。

该实施方式的一些实施例中，木瓜蛋白酶酶活为700-900U/mg，优选为800U/mg；优选的，每克粉碎得到的海参肠粉采用0.04-0.08g木瓜蛋白酶处理。

该实施方式的一些实施例中，EDTA及半胱氨酸终浓度均为4-6mmol/L，优选为5mmol/L。

该实施方式的一些实施例中，酶解提取，提取温度为50-70℃，时间为20-30h。

该实施方式的一些实施例中，CPC溶液质量体积比为10％；粉碎得到的海参肠粉与CPC溶液的料液比为1：1.6-2g/mL。

该实施方式的一些实施例中，NaCl溶液-乙醇混合溶液中NaCl溶液与乙醇的体积比为100:15；优选的，所述NaCl溶液浓度为2-3mol/L，乙醇的浓度为95％，体积百分数。

该实施方式的一些实施例中，混合溶液与乙醇混合静置时，两者体积比为混合溶液：乙醇＝1:3-6；优选的，所述静置，静置温度为4-8℃，时间为12-24h。

该实施方式的一些实施例中，所述透析脱盐，截留分子量为6000Da。

该实施方式的一些实施例中，洗脱具体为：依次用蒸馏水、1mol/L氯化钠水溶液、2mol/L氯化钠水溶液、3mol/L氯化钠水溶液洗脱，收集1、2、3mol/L氯化钠洗脱组分。

本发明的第三种典型实施方式，提供了上述高抗凝血海参肠多糖在制备抗凝血保健食品和/或药物中的应用。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本发明的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本发明的技术方案。

实施例1

一种高抗凝血海参肠多糖的制备方法，包括如下步骤：

S1、将新鲜海参肠沥净，冷冻干燥，粉碎，得到海参肠粉；取100g海参肠粉，加入5倍体积丙酮浸泡脱脂，重复2次；静置离心后，海参肠粉自然晾干。

S2、向海参肠粉加入0.1mol/L乙酸钠缓冲液，粉碎得到的海参肠粉与乙酸钠缓冲液的料液比为1：20g/mL；8g木瓜蛋白酶(800U/mg)，EDTA及半胱氨酸终浓度均为5mmol/L，60℃下搅拌反应20h后，离心，收集上清液。

S3、向上清液中加入10％(w/v)的氯化十六烷基吡啶(CPC)溶液，粉碎得到的海参肠粉与CPC溶液的料液比为1：1.6g/mL，搅拌后静置24h，离心，收集沉淀部分。

S4、将S3中所得沉淀充分溶于3mol/L NaCl溶液∶95％(v/v)乙醇＝100:15(v/v)的混合溶液中，加入混合溶液3倍体积的95％(v/v)乙醇溶液，4℃静置24小时，离心，收集沉淀部分。

S5、将S4中所得沉淀通过Q Sepharose Fast Flow离子交换色谱分离，依次用蒸馏水、1mol/L氯化钠水溶液、3mol/L氯化钠水溶液洗脱，收集1-3mol/L氯化钠水溶液洗脱液，减压浓缩、透析脱盐(截留分子量为6000Da)，脱盐后的溶液减压浓缩、冷冻干燥，得到冻干样品3中海参肠多糖。

S6、测定3种样品的APTT，PT，TT，FIB以评价其抗凝血活性。选定高活性样品，对其进行结构分析。

实验例1

以下是对3种海参肠多糖的活性分析和结构测试结果，包括对3种海参肠多糖的单糖组成分析、分子量分析、抗凝血活性测定及高活性组分的理化性质分析、红外光谱分析及核磁共振波谱分析。

海参肠多糖混合物经分离纯化得到3种组分，按照洗脱液离子强度的大小，分别命名为SCG1，SCG2和SCG3，其中SCG3的洗脱液离子强度最高。

单糖组成测定结果显示(图1)，3种多糖的单糖组成显著不同，且按照SCG1-SCG3的顺序，岩藻糖的比例逐渐增大，SCG3仅含有岩藻糖，单糖组成简单。

分子量测定(图2)结果显示，3种多糖的分子量显著不同，分别为25.6kDa，112.4kDa，171.5kDa，按照SCG1-SCG3的顺序，分子量逐渐增大，其中SCG3的分子量最大，为171.5kDa。

凝血机制中，APTT是筛选通过内源性凝血途径发挥抗凝血作用的指标，PT是筛选通过外源性途径发挥抗凝血作用的指标，TT则反映了药物是否能影响凝血过程中凝血酶介导的纤维蛋白形成。

图3显示了3种海参肠多糖对APTT的影响，3种多糖均可显著延长APTT，延长作用按照SCG1-SCG3的顺序逐渐增强，其中，SCG3作用最强，高于阳性对照肝素，且浓度为50μg/mL时，APTT已达500s以上。

图4、图5显示了3种海参肠多糖对PT和TT的延长作用，3种多糖均可显著延长PT和TT，且按照SCG1-SCG3的顺序，延长作用逐渐增强，且浓度为200μg/mL，SCG3的PT和TT均可达到500s以上。

根据上述结果可知，海参肠多糖提取物经阴离子交换色谱柱分离，按照洗脱液离子强度从低到高的顺序得到3种多糖SCG1-SCG3，3种多糖的结构和抗凝血活性均有显著不同。按照SCG1-SCG3的顺序，岩藻糖的比例逐渐升高，SCG3仅含有岩藻糖；分子量逐渐升高，SCG3的分子量最大；抗凝血活性逐渐增强，SCG3的活性最高。

SCG3对APTT的延长作用高于阳性对照肝素，50μg/mL时，APTT已达500s以上。SCG3对TT和PT也具有显著的延长作用，200μg/mL时，TT和PT均可达到500s以上，说明SCG3可以通过抑制内源性凝血途径，外源性凝血途径发挥抗凝血作用，也可通过抑制凝血酶介导的纤维蛋白的形成发挥作用。

此外，通过图6可知，SCG3还可显著降低FIB的含量，FIB主要由肝脏合成，在凝血酶的水解下最后形成不溶的纤维蛋白，从而达到促凝血的作用，降低FIB的含量可抑制血液的凝固。

根据上述结果可知，SCG3对APTT，TT，PT均有显著的延长作用，尤其是APTT，且可显著降低FIB含量，表明SCG3对多种凝血途径均有抑制作用，是一种多机制高抗凝血活性多糖。

对SCG3的结构进行分析：理化性质测定(图7-图9)结果显示，SCG3的总糖含量为53.36％，蛋白含量为0.67％，硫酸基含量为28.31％。前述单糖组成测定结果表明，SCG3主要含有岩藻糖，是一种岩藻多糖。联合理化性质测定结果可知，SCG3是一种高纯度岩藻多糖。

图10为SCG3的红外光谱图，3700～3200cm^-1处有极大吸收峰，源自于O-H的伸缩振动；3000～2800cm^-1处有两个明显的吸收峰，多出现于2900cm^-1周围，主要是由岩藻糖甲基所导致的；1650cm^-1处为多糖类物质常见的微量水分缔合羟基造成；1250cm^-1、840cm^-1处的吸收峰表明存在硫酸基团，其中1250cm^-1处的吸收峰归属于S＝O的不对称伸缩振动，840cm^-1附近的吸收峰为C-O-S的轴向配位的伸缩振动。此外，970cm^-1左右存在吡喃环末端次甲基的摇摆振动(岩藻糖)说明其含有大量的岩藻糖，红外光谱进一步验证SCG3是一种高纯度岩藻多糖。

图11为SCG3的核磁共振氢谱图，低场区δ5.00-5.50ppm为α-L-Fucp异头氢所在的区域，信号主要出现在δ5.04，5.23及5.50ppm处，根据文献报道推测分别为非硫酸化岩藻糖，4-硫酸化岩藻糖及2-硫酸化岩藻糖或2,4-硫酸化岩藻糖的异头氢信号。

图12为SCG3的核磁共振碳谱图，δ180ppm处未出现糖醛酸或乙酰氨基羰基位的吸收峰，表明SCG3不含有糖醛酸和乙酰氨基单糖，不属于海参糖胺聚糖，进一步表明SCG3是一种高纯度海参岩藻多糖。

综上所述，SCG3由非硫酸化岩藻糖，4-硫酸化岩藻糖及2-或2,4-硫酸化岩藻糖构成，总糖含量为53.36％，硫酸基含量为28.31％，表明SCG3是一种高纯度岩藻多糖。此外，SCG3对4种代表性抗凝指标APTT、PT、TT、FIB均有显著活性，尤其是APTT，延长作用高于肝素，浓度为50μg/mL时，APTT已达500s以上，表明SCG3是一种多机制高抗凝血活性多糖。因此，SCG3是一种多机制高抗凝血活性、高纯度岩藻多糖。

以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种高抗凝血海参肠多糖，其特征在于，所述高抗凝血海参肠多糖分子量为25.1-171.5kDa，单糖组成包括岩藻糖；

所述海参肠多糖从海参肠中提取获得。

2.如权利要求1所述的高抗凝血海参肠多糖，其特征在于，所述高抗凝血海参肠多糖分子量为171.5kDa，单糖组成包括岩藻糖，总糖含量为53.36％，蛋白含量为0.67％，硫酸基含量为28.31％。

3.如权利要求2所述的高抗凝血海参肠多糖，其特征在于，所述岩藻糖由非硫酸化岩藻糖，4-硫酸化岩藻糖及2-硫酸化岩藻糖或2,4-硫酸化岩藻糖构成。

4.权利要求1-3任一所述高抗凝血海参肠多糖的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1、将海参肠干燥粉碎、脱脂；

5.根据权利要求4所述的高抗凝血海参肠多糖的制备方法，其特征在于，海参肠干燥方式为冷冻干燥；

所述脱脂具体为：取粉碎得到的海参肠粉，加入5-10倍体积的丙酮浸泡脱脂。

6.根据权利要求4所述的高抗凝血海参肠多糖的制备方法，其特征在于，所述乙酸钠缓冲液浓度为0.1-0.3mol/L，优选为0.1mol/L；粉碎得到的海参肠粉与乙酸钠缓冲液的料液比为1：20-30g/mL；

所述木瓜蛋白酶酶活为700-900U/mg，优选为800U/mg；每克粉碎得到的海参肠粉采用0.04-0.08g木瓜蛋白酶处理；

所述EDTA及半胱氨酸终浓度均为4-6mmol/L，优选为5mmol/L；

或，所述酶解提取，提取温度为50-70℃，时间为20-30h。

7.根据权利要求4所述的高抗凝血海参肠多糖的制备方法，其特征在于，所述CPC溶液质量体积比为10％；粉碎得到的海参肠粉与CPC溶液的料液比为1：1.6-2g/mL；

或，所述NaCl溶液-乙醇混合溶液中NaCl溶液与乙醇的体积比为100:15；优选的，所述NaCl溶液浓度为2-3mol/L，乙醇的浓度为95％，体积百分数；

混合溶液与乙醇混合静置时，两者体积比为混合溶液：乙醇＝1:3-6；优选的，所述静置，静置温度为4-8℃，时间为12-24h。

8.根据权利要求4所述的高抗凝血海参肠多糖的制备方法，其特征在于，所述透析脱盐，截留分子量为6000Da。

9.根据权利要求4所述的高抗凝血海参肠多糖的制备方法，其特征在于，所述洗脱具体为：依次用蒸馏水、1mol/L氯化钠水溶液、2mol/L氯化钠水溶液、3mol/L氯化钠水溶液洗脱，收集1、2、3mol/L氯化钠洗脱组分。

10.权利要求1-3任一所述高抗凝血海参肠多糖在制备抗凝血保健食品和/或药物中的应用。