CN115634219A

CN115634219A - 苄索氯铵在制备用于防治三阴性乳腺癌的药物中的应用

Info

Publication number: CN115634219A
Application number: CN202211111828.5A
Authority: CN
Inventors: 廖兴华; 周梦莹; 于琪英
Original assignee: Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Current assignee: Wuhan University of Science and Engineering WUSE
Priority date: 2022-09-13
Filing date: 2022-09-13
Publication date: 2023-01-24

Abstract

本发明提出了苄索氯铵在制备用于防治三阴性乳腺癌的药物中的应用，苄索氯铵可以抑制三阴性乳腺癌细胞增殖，尤其是其可以诱导三阴性乳腺癌细胞MDA‑MB‑231、BT549发生焦亡，增加CD8+T细胞浸润，改善肿瘤免疫微环境，达到治疗三阴性乳腺癌的目的。同时苄索氯铵具有价廉、安全、副作用小的优点，可将其作为一种治疗三阴性乳腺癌的药物。

Description

苄索氯铵在制备用于防治三阴性乳腺癌的药物中的应用

技术领域

本发明涉及医药技术领域，尤其涉及苄索氯铵在制备用于防治三阴性乳腺癌的药物中的应用。

背景技术

三阴性乳腺癌(TNBC)是乳腺癌中治疗难度最大、预后最差的病理类型，占乳腺癌总发病率的15-20％。严重危害女性身心健康，是临床亟待攻克的重要实验。同时由于缺失激素受体和人表皮生长因子受体2(HER2)会使TNBC对靶向治疗无反应并且预后不良。辅助化疗是TNBC目前主要的全身治疗方式。但化疗全身毒副作用大、易出现耐药。因此，寻找新的安全、有效的抑制三阴性乳腺癌生长的抗肿瘤药物刻不容缓。

免疫检查点抑制剂(ICIs)疗法为肿瘤患者带来了新的希望，但在TNBC中ICIs疗法的响应率尚低。Rita Nanda及其团队报道显示派姆单抗(anti-PD-1)治疗TNBC患者的总缓解率为18.5％(n＝5/27)，而在经治的转移性TNBC患者中，派姆单抗的总缓解率则不足5％。因此研究者尝试将化疗、放疗或者靶向治疗与ICIs联合使用。虽然在其他癌症中已取得了一定的成效，但Impassion131结果提示与紫杉醇单药相比阿替利珠单抗联合紫杉醇并没有降低TNBC患者癌症进展和死亡风险。鉴于TNBC高度的异质性及复杂的肿瘤免疫微环境，仍需探索新的辅助手段提高TNBC患者的ICIs治疗效果。

苄索氯铵是美国食品药品监督局批准用于急救用品，是一种杀菌消毒剂，也是新型的防腐剂，具有较好的表面活性，广泛用于日化、医药等领域做防腐杀菌剂。但对于三阴性乳腺癌而言，并没有相关文献与专利报道苄索氯铵对三阴性乳腺癌细胞生长有抑制作用。

发明内容

有鉴于此，本发明提出了苄索氯铵在制备用于防治三阴性乳腺癌的药物中的应用，为治疗三阴性乳腺癌提供了一种新的药物。

本发明的技术方案是这样实现的：第一方面，本发明提供了苄索氯铵在制备用于防治三阴性乳腺癌的药物中的应用。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述苄索氯铵的有效浓度为5-20μM。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述苄索氯铵通过抑制三阴性乳腺癌细胞增殖，诱发三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、BT549焦亡，增加CD8+T细胞浸润，改善肿瘤免疫微环境，达到治疗三阴性乳腺癌的目的。

第二方面，本发明提供了苄索氯铵和anti-PD-1单抗在制备抗癌药物中的应用。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述癌症为三阴性乳腺癌。

在以上技术方案的基础上，优选的，所述苄索氯铵的有效浓度为5-20μM，所述anti-PD-1单抗的浓度为10mg/kg。

第三方面，本发明提供了苄索氯氨在制备增加三阴性乳腺癌细胞对anti-PD-1单抗的敏感性的药物中的应用。

第四方面，本发明提供了苄索氯氨在制备anti-PD-1单抗增敏剂中的应用。

本发明的苄索氯铵在制备用于防治三阴性乳腺癌的药物中的应用相对于现有技术具有以下有益效果：

(1)苄索氯铵可以抑制三阴性乳腺癌增殖，尤其是其可以诱发三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、BT549发生焦亡，增加CD8+T细胞浸润，从而改善肿瘤免疫微环境，使冷肿瘤变为热肿瘤。同时苄索氯铵具有价廉、安全、副作用小的优点，可将其作为一种治疗三阴性乳腺癌的药物。

(2)苄索氯氨与anti-PD-1单抗联合使用的时候，比单独使用anti-PD-1单抗的明显地抑制了三阴性乳腺癌细胞的生长，说明苄索氯铵的加入可以增加三阴性乳腺癌细胞对anti-PD-1单抗的敏感性，可将苄索氯氨作为anti-PD-1单抗的增敏剂，并将苄索氯氨与anti-PD-1单抗联合用药，治疗三阴性乳腺癌。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是苄索氯铵对三阴性乳腺癌细胞增殖的影响图；

图2为不同浓度苄索氯铵对MDA-MB-231和BT549细胞克隆形成的影响；

图3是苄索氯铵对三阴性乳腺癌细胞晚期凋亡的影响图；

图4是苄索氯铵对三阴性乳腺癌细胞焦亡的影响图；

图5为不同浓度的卞索氯铵诱导三阴性乳腺癌细胞LDH释放的结果图；

图6为不同浓度的卞索氯铵诱导MDA-MB-231和BT549细胞caspase3活化及GSDME N端剪切体形成；

图7是苄索氯铵对免疫全能小鼠体内三阴性乳腺癌细胞的成瘤能力的影响图；

图8是苄索氯铵增加三阴性乳腺癌细胞对anti-PD1单抗敏感性的结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。

实施例1 CCK-8细胞活性检测

1.细胞铺板：收集MDA-MB-231和BT549细胞(购买于美国菌种保藏中心细胞库)，进行细胞计数，按照每孔3000个细胞的量铺于96孔板中，培养过夜。

2.药物处理：用DMEM或者RPMI 1640完全培养基稀释苄索氯铵至处理浓度(0μM，5μM，10μM，15μM，20μM)，然后替换96孔板中原有的培养基，分别处理24h、48h和72h。

3.CCK-8检测：按照1:10(w/v)的稀释比例，用DMEM完全培养基稀释CCK-8(CCK-8细胞增殖检测试剂盒)，得到含有CCK-8的培养基；然后用含有CCK-8的培养基替换96孔板中原有的培养基，另外将含有CCK-8的培养基加入没有培养细胞的孔中作为空白对照，每孔100μL。再将96孔板放于37℃恒温培养箱中孵育1h后，用酶标仪读板检测(450nm)，全程避光操作。

4.结果：结果如图1所示，其中，图1A为不同浓度的苄索氯铵对MDA-MB-231细胞生长能力影响；图1B为不同浓度的苄索氯铵对BT549细胞的生长能力影响。图中显示，随着浓度梯度和时间梯度的药物处理，三阴性乳腺癌细胞的生长受到了明显的抑制，由此说明苄索氯铵可以抑制三阴性乳腺癌细胞的增殖。

实施例2细胞克隆形成试验

1.取处于对数生长期的处理后细胞，消化并吹散成单个细胞悬液，并在高倍镜下计算细胞密度。

2.设置接种密度为1000个/孔，加入完全培养基，混匀置于37℃，5％CO₂的细胞培养箱内培养2周。

3.每日镜下观察细胞状态，根据细胞生长情况决定是否更换培养基。当孔板中形成肉眼可见的克隆细胞时，即可终止培养。弃上清液，予以细胞用1×PBS轻柔浸洗2次。加入通用型组织固定液1ml，在室温下固定15min。然后弃除固定液，每孔加入适量结晶紫染色液室温染15min，然后用自来水小心洗去染色液，室温干燥。

4.结果分析：拍照存档，并利用计数软件计数克隆，克隆形成率＝(克隆数/接种细胞数)×100％，以此反映细胞的增殖能力与群体依赖性。

5.结果：结果如图2所示，图中显示随着浓度梯度的药物处理，三阴性乳腺癌细胞的克隆形成能力受到了明显的抑制，即苄索氯铵可以用于抑制三阴性乳腺癌细胞的克隆形成能力。

实施例3细胞凋亡

1.药物处理：收集MDA-MB-231和BT549细胞铺于6孔板中，使细胞密度大约为50％，分别加入含有0μM、10μM、15μM和20μM苄索氯铵的DMEM培养基处理细胞。

2.收集细胞：药物处理24h后，先收集上清中发生凋亡的细胞，离心3min后弃上清，然后把贴壁的细胞用0.25％的胰蛋白酶消化，收集于同一离心管中，离心3min后弃上清；然后用PBS缓冲液清洗两次后进行染色。

3.染色：首先用300μL的Binding Buffer(细胞凋亡检测试剂盒)重悬细胞，然后每管加入3μL的Annexin V-FITC，混匀后再加入3μL的Propidium Iodide混匀，然后避光室温反应10min。

4.流式检测：染色结束后用FACS Calibur System流式细胞仪检测，上机前，样品用400目滤网过滤去除颗粒物。

5.结果：结果如3所示，其中，图3A为不同浓度的卞索氯铵对MDA-MB-231和BT549细胞凋亡的影响；图3B为不同浓度的卞索氯铵对MDA-MB-231细胞凋亡的影响；图3C为不同浓度的卞索氯铵诱导BT549细胞发生晚期凋亡的统计结果。图3显示苄索氯铵处理后，卞索氯铵明显地诱导了MDA-MB-231和BT549细胞的凋亡，且主要以晚期凋亡为主，说明细胞膜存在破裂情况。

实施例4细胞焦亡检测

收集MDA-MB-231和BT549细胞铺于6孔板中，使细胞密度大约为50％，分别加入含有0μM、10μM、15μM和20μM苄索氯铵的DMEM培养基处理细胞，对照组加入等量DMSO。处理24h后，采集图像，同时收取上清进行LDH Release Assay。同样处理细胞24h后提取细胞中蛋白，进行WesternBlot检测。

结果见图4，其中，图4A为不同浓度的卞索氯铵对MDA-MB-231细胞焦亡的影响；图4B为不同浓度的卞索氯铵对BT549细胞焦亡的影响。实验结果显示苄索氯铵对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549焦亡呈现浓度依赖性作用。在图4中可见阴性对照组的细胞生存状态良好，使用不同浓度苄索氯铵诱导焦亡的组呈现焦亡的特殊形态学特征。

将收取的上清进行LDH ReleaseAssay，检测不同浓度下的卞索氯铵诱导三阴性乳腺癌细胞LDH释放的结果图，结果见图5，其中，图5A为不同浓度的卞索氯铵诱导MDA-MB-231细胞释放LDH的统计结果；图5B为不同浓度的卞索氯铵诱导BT549细胞释放LDH的统计结果。可见梯度苄索氯铵处理后上清中LDH活性明显高于对照组，且呈浓度依赖性。

图6为Western Blot检测结果，所用抗体为Caspase-3和GSDME检测Caspase-3和GSDME的剪切激活情况。结果显示Caspase-3和GSDME剪切条带均呈现上升趋势，说明苄索氯铵介导的焦亡依赖于Caspase-3和GSDME的剪切激活情况。以上实验结果显示苄索氯铵可诱导三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231和BT549细胞焦亡。

实施例5免疫全能鼠皮下成瘤实验

1.本实验的动物实验严格遵守动物护理机构的指导原则，且获得华中科技大学同济医学院附属同济医院动物实验伦理委员会批准。

2.本实验所用的实验动物为6-8周龄雌性小鼠(Balb/c，购买于北京华阜康)，共10只，其中对照组5只和实验组5只，构建Balb/c小鼠皮下成瘤模型：

(1)细胞收集：收集细胞进行细胞计数，以每只Balb/c小鼠1×10⁵个4T1细胞(鼠源性三阴性乳腺癌细胞系)的量计算总细胞数，细胞用PBS缓冲液重悬。

(2)接种：对Balb/c小鼠进行麻醉(通过无痛及有痛刺激来评估麻醉程度，确定小鼠处于麻醉状态)后，用1mL注射器(25G针头)取上述重悬细胞对Balb/c小鼠进行皮下注射。

3.细胞注射一周后，观察Balb/c小鼠的成瘤情况并进行测量，当肿瘤达到50-100mm³的大小后，开始以腹腔注射的方式给药。先用DMSO配制苄索氯铵母液50mg/mL，再用无菌水稀释成使用浓度，每只小鼠每次给药100μL。分别为0mg/kg，5mg/kg(腹腔注射)，各5只，每天给药一次，连给5天后改为每2天给一次。

4.给药过程中，每两天对Balb/c小鼠体重和移植瘤的大小进行测量。两周后，将Balb/c小鼠安乐死并将肿瘤取出，并进行免疫组化染色，评估CD8+T细胞浸润情况。

5.结果：结果如图7所示。其中，图7A为免疫全能小鼠体内皮下肿瘤，图7B为免疫全能小鼠体内皮下肿瘤生长曲线，图7C为肿瘤体积统计结果，图7D为免疫全能小鼠的CD8+T细胞浸润情况。图A、图B和图C表明Balb/c小鼠体内皮下成瘤受到苄索氯铵的明显抑制，表明苄索氯铵可以抑制三阴性乳腺癌的肿瘤生长。图7D免疫组化结果显示，经过苄索氯铵处理后，小鼠肿瘤内部的CD8+T细胞浸润明显增加。图7E显示给药后的2组小鼠的体重统计结果，显示2组小鼠之间体重并无显著差异，证明苄索氯铵作为抗肿瘤药物的使用的安全性。

实施例6苄索氯氨增加三阴性乳腺癌细胞对anti-PD1的敏感性

1.本实验所用的实验动物为6～8周龄雌性小鼠(Balb/c，购买于北京华阜康)，共20只，平均分为4组，构建Balb/c小鼠皮下成瘤模型：

2.细胞注射一周后，观察Balb/c小鼠的成瘤情况并进行测量，当肿瘤达到50-100mm³的大小后，开始以腹腔注射的方式给药，苄索氯铵给药同前。PD-1单克隆抗体(10mg/kg)在第4、6、9和11天单独或与苄索氯铵联合腹膜内给药。

3.给药过程中，每两天对Balb/c小鼠体重和移植瘤的大小进行测量。两周后，将Balb/c小鼠安乐死并将肿瘤取出。

4.结果：结果如图8所示，其中，图8A为免疫全能小鼠体内皮下肿瘤；图8B为肿瘤体积大小的变化；图8C为肿瘤重量统计结果；图8D为免疫全能小鼠的体重变化。肿瘤的生长曲线表明Balb/c小鼠体内皮下成瘤受到苄索氯铵的明显抑制，且联合给药组的肿瘤生长受到最大的抑制，以上结果说明苄索氯氨增加三阴性乳腺癌细胞对anti-PD1的敏感性。另外，图8D显示4组小鼠之间体重并无显著差异，说明苄索氯氨与anti-PD-1单抗联合使用的安全性。

苄索氯氨与anti-PD-1单抗联合使用的时候，比单独使用anti-PD-1单抗的明显地抑制了三阴性乳腺癌细胞的生长，所述可将苄索氯氨与anti-PD-1单抗联合用药，来治疗三阴性乳腺癌。同时也说明苄索氯铵的加入可以增加三阴性乳腺癌细胞对anti-PD-1单抗的敏感性，可将苄索氯氨作为anti-PD-1单抗的增敏剂。

以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.苄索氯铵在制备用于防治三阴性乳腺癌的药物中的应用。

2.如权利要求1所述的苄索氯铵在制备用于防治三阴性乳腺癌的药物中的应用，其特征在于：所述苄索氯铵的有效浓度为5-20μM。

3.如权利要求1所述的苄索氯铵在制备用于防治三阴性乳腺癌的药物中的应用，其特征在于：所述苄索氯铵通过抑制三阴性乳腺癌细胞增殖，诱发三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231、BT549焦亡，增加CD8+T细胞浸润，改善肿瘤免疫微环境，达到治疗三阴性乳腺癌的目的。

4.苄索氯铵和anti-PD-1单抗在制备抗癌药物中的应用。

5.如权利要求4所述的苄索氯铵和anti-PD-1单抗在制备抗癌药物中的应用，其特征在于：所述癌症为三阴性乳腺癌。

6.如权利要求4所述的苄索氯铵和anti-PD-1单抗在制备抗癌药物中的应用，其特征在于：所述苄索氯铵的有效浓度为5-20μM，所述anti-PD-1单抗的浓度为10mg/kg。

7.苄索氯氨在制备增加三阴性乳腺癌细胞对anti-PD-1单抗的敏感性的药物中的应用。

8.苄索氯氨在制备anti-PD-1单抗增敏剂中的应用。