CN115634210A - 一种模拟酶微球和牙周炎用组合物、制法及其牙周炎注射用制剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种模拟酶微球和牙周炎用组合物、制法及其牙周炎注射用制剂，模拟酶微球是由赋形剂与模拟酶Ag‑TiO_2‑x组成的实心微球，具有较强的模拟酶效应，与H₂O₂混合能够催化低浓度H₂O₂(0.01‑0.1mol/L)产生大量羟基自由基，大大降低了过氧化物的使用浓度，提升低浓度H₂O₂的抗、杀菌效率，有助于提升过氧化物在牙周局部治疗中的使用安全性。本发明还提供了由上述模拟酶微球与H₂O₂混合组成的牙周炎用组合物以及包含该组合物的牙周炎注射用制剂，该组合物集合了多种抗菌机制，是一种安全性能高的牙周局部治疗药物成分。

Description

一种模拟酶微球和牙周炎用组合物、制法及其牙周炎注射用 制剂

技术领域

本发明涉及生物医学技术领域，具体涉及一种模拟酶微球和牙周炎用组合物、制法及其牙周炎注射用制剂。

背景技术

作为一种常见的慢性细菌性疾病，牙周炎主要由牙菌斑的微生物生物膜引起和维持的，可导致牙齿脱落，严重影响美观、咀嚼功能和生活质量。

目前临床上控制细菌感染的方法包括机械刮治、使用抗生素和局部冲洗。然而，机械刮治的治疗过程使患者非常痛苦、耗时长，并且，对仪器无法到达的部位，如牙周袋深处的治疗效果有限。抗生素由于存在副作用和细菌耐药性问题，并不是牙周炎治疗的最佳方案。过氧化氢(H₂O₂)作为广泛应用于牙周局部冲洗的常规抗菌剂，虽然可有效杀灭牙周菌群，但由于使用时浓度较高(0.5M-1M)，在杀灭细菌的同时也会对健康组织造成损害。

因此，如何高效，彻底，安全地清除牙周病原菌是本研究的主要难点。

发明内容

针对现有技术中存在的上述问题，本发明提供一种。

具体发明内容如下：

第一方面，本发明提供一种模拟酶微球，所述模拟酶微球为赋形剂与模拟酶Ag-TiO_2-x组成的实心微球。

可选地，所述赋形剂为海藻酸钠、PLGA、PCL、或PDMS。

可选地，所述模拟酶微球的直径为205-250μm。

第二方面，本发明提供一种牙周炎用组合物，所述组合物由上述第一方面所述的模拟酶微球与H₂O₂混合组成；

其中，所述H₂O₂的浓度为0.01-0.1mol/l。

第三方面，本发明提供一种制备上述第二方面所述的组合物的方法，所述方法包括：

S1、将模拟酶Ag-TiO_2-x分散于二氯甲烷或水溶液中，形成质量浓度为15mg/mL的模拟酶分散液；

S2、将体积比为1：1的所述模拟酶分散液与赋形剂混合均匀，形成微球前驱体溶液；

S3、将微球前驱体溶液装入静电液微滴装置，并使微球前驱体溶液在高压静电场作用下连续滴出到接收溶液中，静置固化、清洗，得到所述模拟酶微球；

S4、将体积比为1：1的所述模拟酶微球与H₂O₂混合后形成所述治疗牙周炎的组合物。

可选地，所述赋形剂为海藻酸钠、PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)、PCL(聚已内酯)或PDMS(聚二甲基硅氧烷)；

当所述赋形剂为海藻酸钠时，所述接收溶液为氯化钙溶液、氯化铜溶液、氯化钴溶液、氯化锌溶液和氯化亚铁溶液中的任意一种；

当所述赋形剂为PLGA或PCL时，所述接收溶液为无水乙醇溶液；

当所述赋形剂为PDMS时，所述接收溶液为Tween80溶液。

可选地，所述高压静电场的工作电压为5kV～20kV。

可选地，所述模拟酶Ag-TiO_2-x的制备方法包括：

S11、将2g TiO₂和1.5g NaBH₄进行研磨混合后，置于管式炉中进行真空还原反应，加热温度为360℃，反应时间为30min，得到富含氧空位和Ti³⁺的TiO_2-x；

S12、将200mg所述TiO_2-x与15mL 2.1mg/mL的硝酸银水溶液混合，加入无水乙醇15mL作为牺牲剂，并加入1mL氨水调节PH至碱性，在紫外光照条件下处理1小时，银离子原位还原在TiO_2-x表面形成所述模拟酶Ag-TiO_2-x。

第四方面，本发明提供一种牙周炎注射用制剂，所述制剂包含上述第二方面所述的组合物。

与现有技术相比，本发明具有以下优点：

本发明提供的模拟酶微球是由赋形剂与模拟酶Ag-TiO_2-x组成的实心微球，其中，模拟酶Ag-TiO_2-x具有较强的模拟酶效应，与H₂O₂混合能够催化低浓度H₂O₂(0.01-0.1mol/l)产生大量羟基自由基，大大降低了过氧化物的使用浓度，提升低浓度H₂O₂的抗菌效率，有助于提升过氧化物在牙周局部治疗中的使用安全性。进一步地，合适的赋形剂使模拟酶Ag-TiO_2-x以微球形式存在，由于球形结构具备一定的质量和体积，不容易被唾液等稀释并带走，在牙周袋的存留时间比悬混液形式的模拟酶Ag-TiO_2-x在牙周袋的存留时间长，这有利于模拟酶Ag-TiO_2-x稳定的发挥催化作用，是一种安全性能高的牙周局部治疗药物成分。

本发明还提供了由上述模拟酶微球与H₂O₂混合组成的牙周炎用组合物，该组合物集合了多种抗菌机制，一方面，组合物中的模拟酶Ag-TiO_2-x具有较强的模拟酶效应，能够催化低浓度H₂O₂(0.01-0.1mol/l)产生大量羟基自由基，大大提升低浓度H₂O₂的抗、杀菌效率，组合物中低浓度H₂O₂也使该组合物在牙周局部的应用更加安全。另一方面，模拟酶Ag-TiO_2-x可被近红外激光激活，从而产生光热效应，可使组合物作用处的温度升高，并长时间保持在48℃左右，温度的升高可以明显降低牙周细菌的抗力，但不会对牙周周围组织造成损害，温度的升高同时还强化了模拟酶Ag-TiO_2-x的模拟酶效应，使H₂O₂分解加快。此外，模拟酶Ag-TiO_2-x在H₂O₂的作用下，可以长期缓慢释放微量Ag⁺，从而使Ag⁺发挥抑菌作用。

附图说明

为了更清楚地说明本申请实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1示出了本发明实施例提供的模拟酶微球制作过程示意图；

图2示出了本发明实施例提供的模拟酶微球体视显微镜图；

图3示出了本发明实施例提供的模拟酶微球粒径分布统计图；

图4示出了本发明实施例提供的模拟酶微球光热效应的热成像图；

图5示出了本发明实施例提供的模拟酶微球的光热效应的实时升温曲线图；

图6示出了本发明实施例提供的模拟酶微球被猪牙龈阻挡后光热效应的实时升温曲线图；

图7示出了本发明实施例提供的模拟酶微球降解靛蓝胭脂红(IC)的结果图；

图8示出了本发明实施例提供的模拟酶微球分解H₂O₂的结果图；

图9示出了银离子抑制戈式链球菌增殖率结果图；

图10示出了银离子抑制牙龈卟啉单胞菌增殖率结果图；

图11示出了本发明实施例提供的模拟酶微球释放银离子情况的结果图；

图12示出了本发明实施例提供的组合物抗戈氏链球菌悬浮菌结果图；

图13示出了本发明实施例提供的组合物抗牙龈卟啉单胞菌悬浮菌结果图；

图14示出了本发明实施例提供的组合物抗戈氏链球菌生物膜结果图；

图15示出了本发明实施例提供的组合物抗牙龈卟啉单胞菌生物膜结果图。

具体实施方式

提供下述实施例是为了更好地进一步理解本发明，并不局限于所述最佳实施方式，不对本发明的内容和保护范围构成限制，任何人在本发明的启示下或是将本发明与其他现有技术的特征进行组合而得出的任何与本发明相同或相近似的产品，均落在本发明的保护范围之内。

实施例中未注明具体实验步骤或者条件，按照本领域内的现有技术所描述的常规实验步骤的操作或条件即可进行。所用试剂以及其他仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规试剂产品。

光热治疗(photothermal therapy，PTT)，是利用具有较高光热转换效率的材料，将其注射入人体内部，利用靶向性识别技术聚集在肿瘤组织附近，并在外部近红外光(NIR)的照射下，将光能转化为热能来杀死癌细胞的一种治疗方法。PTT主要应用于肿瘤治疗领域，也有研究将其引用于牙周抗菌领域，如Lin J,He Z等人报告了介孔二氧化硅包覆的金纳米双椎体应用于牙周局部光热抗菌(Hybrid Hydrogels for Synergistic PeriodontalAntibacterial Treatment with Sustained Drug Release and NIR-ResponsivePhotothermal Effect.Int J Nanomedicine.2020 Jul 29；15:5377-5387.)，Shi E，Bai L等人制备了含有吲哚菁绿(ICG)和多阳离子刷的自组装纳米颗粒，具有光热和光催化效应(Self-assembled nanoparticles containing photosensitizer and polycationicbrush for synergistic photothermal and photodynamic therapy againstperiodontitis.J Nanobiotechnology.2021 Dec 11；19(1):413.)。但这些新制备的材料的使用存在一定的安全风险，如，Lin J,He Z等人的材料虽然对牙周病原菌有较高的抗菌效能，但是作用时温度上升超过48℃，局部过高热对正常组织会有极大的损害，不利于临床应用；其次，Shi E，Bai L等人提供的材料在发挥光热效应时虽然能够将温度控制在50℃下，但是引入的ICG等有机染料有一定的毒性，需要在治疗完毕后进行冲洗，不能在牙周袋内长时间存留。为治疗增加不便和安全风险。

基于对上述相关技术的了解，本发明提供一种模拟酶微球和牙周炎用组合物、制备方法及其牙周炎注射用制剂，其中，以本发明提供的牙周炎用组合物作为有效成分能，注射入牙周袋组织后能发挥出多种抗菌机制的优势，够实现高效，彻底，安全地清除牙周病原菌，是一种安全性能高的牙周局部治疗药物成分。

本发明具体实施方式如下：

第一方面，本发明提供一种模拟酶微球，所述模拟酶微球为赋形剂与模拟酶Ag-TiO_2-x组成的实心微球。

具体实施时，本发明提供的模拟酶微球是由赋形剂与模拟酶Ag-TiO_2-x组成的实心微球，其中，模拟酶Ag-TiO_2-x为过氧化物样酶，具有过氧化氢/过氧化物酶等酶活性的材料，即，在酸性条件下，H₂O₂在模拟酶存在条件下生成强氧化能力的羟基自由基(OH)。一方面，本发明提供的模拟酶微球能够催化低浓度H₂O₂(0.01-0.1mol/l)产生大量羟基自由基。另一方面，模拟酶Ag-TiO_2-x可被近红外激光激活，从而产生光热效应。此外，合适的赋形剂使模拟酶Ag-TiO_2-x以实心微球形式存在于组合物中，实心微球结构的模拟酶Ag-TiO_2-x能够长期在液体环境存留，作用于牙周袋时，直径控制在205-250μm的实心微球结构具备一定的质量和体积，不容易被唾液等稀释并带走，在牙周袋的存留时间比悬混液形式的模拟酶Ag-TiO_2-x在牙周袋的存留时间长，这有利于模拟酶Ag-TiO_2-x稳定的发挥作用。具体实施时，所述赋形剂可为PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)、海藻酸钠、PCL(聚已内酯)或PDMS(聚二甲基硅氧烷)。

第二方面，本发明提供一种牙周炎用组合物，所述组合物由上述第一方面所述所述的模拟酶微球与H₂O₂混合组成；

其中，所述H₂O₂的浓度为0.01-0.1mol/l。

具体实施时，本发明提供的牙周炎用组合物集合了多种抗菌机制，一方面，组合物中的模拟酶Ag-TiO_2-x具有较强的模拟酶效应，能够催化低浓度H₂O₂(0.01-0.1mol/l)产生大量羟基自由基，大大提升低浓度H₂O₂的抗菌效率，组合物中低浓度的H₂O₂也使该组合物在牙周局部的应用更加安全。另一方面，模拟酶Ag-TiO_2-x可被近红外激光激活，在按照0.25W/cm²×2min+0.15W/cm²×8min的程序进行红外光照射时产生的光热效应可使组合物作用处的温度升高并长时间保持在48℃左右，温度的升高可以明显降低牙周细菌的抗力，且48℃不会对牙周周围组织造成损害，温度的升高同时还强化了模拟酶Ag-TiO_2-x的模拟酶效应，使H₂O₂分解加快。此外，模拟酶Ag-TiO_2-x在低浓度H₂O₂的作用下，可以长期缓慢释放微量Ag⁺，从而发挥Ag⁺的抑菌效能。

第三方面，本发明提供一种制备上述第二方面所述的组合物的方法，图1示出了本发明实施例提供的牙周炎用组合物的制备方法流程图，如图1所示，该方法包括如下步骤：

S1、将模拟酶Ag-TiO_2-x分散于二氯甲烷溶液或水中，形成质量浓度为15mg/mL的模拟酶分散液；

S2、将体积比为1：1的所述模拟酶分散液与赋形剂混合均匀，形成微球前驱体溶液；

S3、将微球前驱体溶液装入静电液滴装置，并使微球前驱体溶液在高压静电场作用下连续滴出到接收溶液中，静置固化、清洗，得到所述模拟酶微球；

S4、将体积比为1：1的所述模拟酶微球与H₂O₂混合后形成所述治疗牙周炎的组合物。

具体实施时，为延长模拟酶Ag-TiO_2-x在牙周袋中的作用时间，本发明利用赋形剂以及静电液滴装置将悬混液状态的模拟酶Ag-TiO_2-x转化为固态微球形态，其中，通过控制高压静电场的作用电压在5kV～20k之间，可以获得直径为205-250μm的模拟酶微球。高压静电场的作用电压优选6-12kV。

具体实施时，所选赋形剂可以是海藻酸钠、PLGA(聚乳酸-羟基乙酸共聚物)、PCL(聚已内酯)和PDMS(聚二甲基硅氧烷)中的任意一种。当赋形剂选择海藻酸钠时，接收溶液为氯化钙溶液、氯化铜溶液、氯化钴溶液、氯化锌溶液和氯化亚铁溶液中的任意一种；当赋形剂选择PLGA或PCL时，接收溶液为无水乙醇溶液；当赋形剂选择PDMS时，接收溶液为Tween80溶液。

具体实施时，本发明提供的模拟酶Ag-TiO_2-x的制备方法包括：

S11、将2g TiO₂和1.5g NaBH₄进行研磨混合后，置于管式炉中进行真空还原反应，加热温度为360℃，反应时间为30min，得到富含氧空位和Ti³⁺的TiO_2-x；

S12、将200mg所述TiO_2-x与15mL 2.1mg/mL的硝酸银水溶液混合，加入无水乙醇15mL作为牺牲剂，并加入1mL氨水调节PH至碱性，在紫外光照条件下处理1小时，银离子原位还原在TiO_2-x表面形成所述模拟酶Ag-TiO_2-x。

第四方面，本发明提供一种牙周炎注射用制剂，所述制剂包含上述第二方面所述的组合物。

为使本领域技术人员更加清楚地理解本申请，现通过以下实施例对本申请所述的一种模拟酶微球和牙周炎用组合物、制法及其牙周炎注射用制剂进行详细说明。

实施例1：模拟酶Ag-TiO_2-x的制备

本实施例中的TiO_2-x是通过商品级TiO₂得到的，通过硼氢化钠管式炉高温真空还原法制得富含氧空位和Ti³⁺的TiO_2-x，再通过紫外光照还原法，将硝酸银中的银离子原位还原在TiO_2-x表面，形成模拟酶Ag-TiO_2-x:具体过程为:

将2gTiO₂和1.5gNaBH₄进行研磨混合后，置于管式炉中进行真空还原反应，加热温度为360度，反应时间为30分钟，得到富含氧空位和Ti³⁺的TiO_2-x。

将制得的TiO_2-x(200mg)与2mg/mL的硝酸银水溶液(15mL)混合，加入无水乙醇15mL作为牺牲剂，并加入1mL氨水调节PH至碱性，在紫外光照条件下处理1小时，银离子原位还原在TiO_2-x表面形成所述模拟酶Ag-TiO_2-x。

实施例2：模拟酶微球的制备

步骤1：分散Ag-TiO_2-x材料：取Ag-TiO_2-x适量，在超声震荡作用下，分散于去离子水中，形成15mg/mL的Ag-TiO_2-x分散液，备用。

步骤2：将步骤1制得的Ag-TiO_2-x分散液吸入到螺口注射器中，将质量分数为1.5％的海藻酸钠溶液吸入到另一只螺口注射器中，两支螺口注射器通过螺口注射器连接体连接，来回推动注射器以混匀二者，即得微球前驱体溶液。其中Ag-TiO_2-x分散液与1.5％海藻酸钠溶液体积比为1：1。

步骤3：将步骤2制得的工作微球前驱体溶液装入静电液微滴装置中，使前驱溶液液滴在5kV～20kV(优选12kV)的高压静电场中连续滴出到含1％CaCl₂溶液中，形成海藻酸钙微球(模拟酶微球)；反应体系的温度为室温。

步骤4：将步骤3制得海藻酸钙微球静置1小时，待其自然沉降后，用UP水清洗三次后，放置于常温下备用。

实施例3：模拟酶微球的制备

步骤1：分散Ag-TiO_2-x材料，取Ag-TiO_2-x适量，在超声震荡作用下，分散于二氯甲烷溶液中中，形成15mg/mL的Ag-TiO_2-x分散液，备用；

步骤2：将步骤1制得的Ag-TiO_2-x分散液吸入到螺口注射器中，将质量分数为5％的PLGA(聚乳酸：羟基乙酸，50:50，分子量50000-60000)二氯甲烷溶液吸入到另一只螺口注射器中，两支螺口注射器通过螺口注射器连接体连接，来回推动注射器以混匀二者，即得微球前驱体溶液。其中Ag-TiO_2-x分散液与5％PLGA溶液体积比为1：1。

步骤3：将步骤2制得的工作微球前驱体溶液装入静电液微滴装置中，使前驱溶液液滴在5kV～20kV(优选6kV)的高压静电场中连续滴出到无水乙醇中，形成PLGA微球(模拟酶微球)；反应体系的温度为室温。

步骤4：将步骤3制得PLGA微球静置1小时，待其自然沉降后，用UP水清洗三次后，放置于常温下备用。

实施例4：模拟酶微球的制备

步骤1：同实施例2步骤1；

步骤2：将步骤1制得的Ag-TiO_2-x分散液吸入到螺口注射器中，将质量分数为5％的PCL(分子量80000)二氯甲烷溶液吸入到另一只螺口注射器中，两支螺口注射器通过螺口注射器连接体连接，来回推动注射器以混匀二者，即得微球前驱体溶液。其中Ag-TiO_2-x分散液与5％PLGA溶液体积比为1：1。步骤3：将步骤2制得的工作微球前驱体溶液装入静电液微滴装置中，使前驱溶液液滴在5kV～20kV(优选6kV)的高压静电场中连续滴出到无水乙醇中，形成PCL微球(模拟酶微球)；反应体系的温度为室温。

步骤4：将步骤3制得PLGA微球静置1小时，待其自然沉降后，用UP水清洗三次后，放置于常温下备用。

实施例5：模拟酶微球的制备

步骤1：同实施例1步骤1；

步骤2：将步骤1制得的Ag-TiO_2-x分散液吸入到螺口注射器中，将质量分数为10％的PDMS溶液吸入到另一只螺口注射器中，两支螺口注射器通过螺口注射器连接体连接，来回推动注射器以混匀二者，即得微球前驱体溶液。其中Ag-TiO_2-x分散液与10％PDMS溶液体积比为1：1。

步骤3：将步骤2制得的工作微球前驱体溶液装入静电液微滴装置中，使前驱溶液液滴连续滴出到10％TWEEN80水溶液中，持续搅拌20min；继续80℃加热搅拌6h形成PDMS微球(模拟酶微球)。

步骤4：将步骤3制得PDMS微球静置1小时，待其自然沉降后，用UP水清洗三次后，放置于常温下备用。

实施例6：模拟酶微球的制备

步骤1：同实施例1步骤1；

步骤2：同实施例1步骤2。

步骤3：将步骤2制得的工作微球前驱体溶液装入静电液微滴装置中，使前驱溶液液滴在5kV～20kV(优选12kV)的高压静电场中连续滴出到含1％ZnCl₂溶液中，形成海藻酸锌微球(模拟酶微球)；反应体系的温度为室温。

步骤4：将步骤3制得海藻酸锌微球静置1小时，待其自然沉降后，用UP水清洗三次后，放置于常温下备用。

实施例7：模拟酶微球的制备

步骤1：同实施例1步骤1；

步骤2：同实施例1步骤2。

步骤3：将步骤2制得的工作微球前驱体溶液装入静电液微滴装置中，使前驱溶液液滴在5kV～20kV(优选12kV)的高压静电场中连续滴出到含1％CuCl₂溶液中，形成海藻酸铜微球(模拟酶微球)；反应体系的温度为室温。

步骤4：将步骤3制得海藻酸铜微球静置1小时，待其自然沉降后，用UP水清洗三次后，放置于常温下备用。

实施例8：模拟酶微球的制备

步骤1：同实施例1步骤1；

步骤2：同实施例1步骤2。

步骤3：将步骤2制得的工作微球前驱体溶液装入静电液微滴装置中，使前驱溶液液滴连续滴出到含1％FeCl₂溶液中，形成海藻酸亚铁微球(模拟酶微球)；滴出的微液滴在5kV～20kV的高压静电场中向下滴入含Fe²⁺溶液中；优选12kV。反应体系的温度为室温。

步骤4：将步骤3制得海藻酸亚铁微球静置1小时，待其自然沉降后，用UP水清洗三次后，放置于常温下备用。

实施例9：模拟酶微球的制备

步骤1：同实施例1步骤1；

步骤2：同实施例1步骤2。

步骤3：将步骤2制得的工作微球前驱体溶液装入静电液微滴装置中，使前驱溶液液滴连续滴出到含1％CoCl₂溶液中，形成海藻酸钴微球(模拟酶微球)；滴出的微液滴在5kV～20kV的高压静电场中向下滴入含Co²⁺溶液中；优选12kV。反应体系的温度为室温。

步骤4：将步骤3制得的海藻酸钴微球静置1小时，待其自然沉降后，用UP水清洗三次后，放置于常温下备用。

实施例10：牙周炎用组合物的制备

将实施例2-9制得的任意一种模拟酶微球与浓度为0.01M-0.1M的双氧水按体积比1：1混合，得到牙周炎用组合物。

实施例11：性能验证实验

以下性能表征实验选用实施例2制得的海藻酸钙微球(Ag-TiO_2-x@Alginate，ATA)。

1.模拟酶微球的光热效应验证

对海藻酸钙微球(Ag-TiO_2-x@Alginate，ATA)进行808nm近红外激光照射，采用热电偶联温度计监测组合物每分钟的温度变化。使用热成像仪记录温度变化的实时红外热成像图。

另取ATA和UPH₂O的体积比为1:1的混合物装入1.5ml离心管中，近红外暴露10min。设置不同的激光功率密度(0.15W/cm²、0.25W/cm²、0.15/0.25W/cm²双功率转换)，确定合适的升温曲线。为探讨牙周袋的光热效应，将新鲜猪牙龈置于含有ATA的EP管表面，记录0.25W/cm²近红外照射下的升温曲线。

图2示出了本发明实施例提供的模拟酶微球体视显微镜图，图3示出了本发明实施例提供的模拟酶微球粒径分布统计图，如图2-3所示，模拟酶微球为均匀的球体结构，直径分布范围在205-250μm之间。

图4示出了本发明实施例提供的模拟酶微球光热效应的热成像图，图5示出了本发明实施例提供的模拟酶微球的光热效应的实时升温曲线图，图6示出了本发明实施例提供的模拟酶微球被猪牙龈阻挡后光热效应的实时升温曲线图，如图4-图6所示，Ag-TiO_2-x@Alginate具有非常优异的光热性能，在0.25W/cm²照射2min后，再转换至0.15W/cm²的功率照射，可使温度控制在50℃以下。并且，即使在猪牙龈的阻挡下，ATA溶液的温度仍然能轻易超过40度。

2.模拟酶微球的模拟酶效应验证

本实施步骤中，采用单变量控制方法对靛蓝胭脂红(IC)的降解试验，测定了ATA对质量分数为6％的H₂O₂的催化能力，揭示了ATA微球的模拟酶活性，说明各组分在IC降解中的作用：分组设置如下：

G1组：a.6％H₂O₂，b.ATA，c.ATA/6％H₂O₂；

G2组：a.H₂O，b.6％H₂O₂，c.ATA/6％H₂O₂。

其中，G2组在47℃水浴下处理，观察升温对模拟酶效应的促进作用。在所有含有的ATA组中，200μLATA按需要加入1mL UP H₂O或6％H₂O₂中。各组分别加入100PPM的IC电缆胭脂红溶液1mL。整个降解过程在无近红外照射下持续20min，在608nm处测定OD值。

图7示出了本发明实施例提供的模拟酶微球降解靛蓝胭脂红(IC)的结果图，其中，图7横坐标中的47℃代表G2组中a.H₂O对降解IC的影响；H₂O₂代表G1组中a.6％H₂O₂对降解IC的影响；H₂O₂(47℃)代表G2组中b.6％H₂O₂对降解IC的影响；ATA代表G1组中b.ATA对降解IC的影响；ATA/H₂O₂代表G1组中的c.ATA/6％H₂O₂对降解IC的影响；ATA/H₂O₂(47℃)代表G2组中c.ATA/6％H₂O₂对降解IC的影响；如图7所示，H₂O₂对靛蓝胭脂红降解微弱，而引入ATA后，IC的剩余量大幅度下降，而温度的上升使得ATA/H₂O₂对IC的降解更加彻底，这些结果证明了ATA优异的模拟酶效应以及升温对模拟酶效应的加强。

进一步采用过氧化氢试剂盒检测催化剂的催化效率。将ATA与10mM的H₂O₂按体积比1:1混合，反应10min后测定剩余H₂O₂浓度。

图8示出了本发明实施例提供的模拟酶微球分解H₂O₂的结果图，其中，图8横坐标中的H₂O₂代表对照组实验；H₂O₂/NIR代表对H₂O₂进行10min红外光照后H₂O₂浓度；ATA/H₂O₂代表ATA与10mM的H₂O₂按体积比1:1混合反应10min后剩余H₂O₂浓度；ATA/H₂O₂/NIR代表ATA与10mM的H₂O₂按体积比1:1混合后进行红外光照10min后剩余H₂O₂浓度；ATA/H₂O₂(47℃)代表在47℃水浴条件下，ATA与10mM的H₂O₂按体积比1:1混合反应10min后剩余H₂O₂浓度，如图8所示，在ATA的辅助下，H₂O₂的分解加快，而在NIR光的激发下，H₂O₂的分解进一步加快。

3.模拟酶微球的银离子释放性能和抑菌能力评估

本实施步骤中，首先测定银离子对戈式链球菌和牙龈卟啉单胞菌的抑制浓度。用BHI培养基将细菌稀释至1×10⁶CFU/mL。在菌悬液中加入相同体积的AgNO₃溶液，得到不同的银离子浓度(0、0.5、1、2、3mg/L)。孵育48h后，将稀释后的菌悬液均匀涂布于血板上，再培养48h。

图9示出了银离子抑制戈式链球菌增殖率结果图；图10示出了银离子抑制牙龈卟啉单胞菌增殖率结果图，如图9、图10所示，当银离子浓度达到1mg/L时，就开始对戈式链球菌产生抑菌作用，24小时抑菌率为50％，当银离子浓度达到0.5mg/L时，就开始对牙龈卟啉单胞菌产生抑菌作用，24小时抑菌率为100％。

进一步地，通过银离子释放实验，考察ATA微球的稳定性和抑菌潜力。分为ATA/H₂O₂/NIR、ATA/H₂O₂、ATA/NIR、ATA四组。其中，ATA与10mM H₂O₂的体积比为1:1。反应10min后，所有组置于黑暗条件下静置24h。采用电感耦合等离子体光学发射光谱仪(ICP-OES)检测溶液中Ag⁺的浓度。

图11示出了本发明实施例提供的模拟酶微球释放银离子情况的结果图，如图11所示，单独的ATA，无论是否光照都几乎不释放银离子，但是在H₂O₂或者H₂O₂与NIR的协同刺激下，ATA的银离子释放量大幅度增加。

4.验证有效成分(ATA+H₂O₂+NIR)对悬浮菌的抗菌作用

用牙龈卟啉单胞菌和戈氏链球菌进行抗菌研究，采用平板涂布法评价ATA的抗菌效果。所有细菌在脑心肉汤培养基中培养。设Control(50μL UPH₂O)；Control/NIR(50μLUPH₂O)；H₂O₂(50μL 20mMH₂O₂)；H₂O₂/NIR(50μL 20mMH₂O₂)；ATA(100μl ATA+50μl UPH₂O)；ATA/NIR(100μl ATA+50μl UPH₂O)；ATA/H₂O₂(100μL ATA+50μL 20mM H₂O₂)；ATA/H₂O₂/NIR(100μL ATA+50μL 20mM H₂O₂)。每组混合菌悬液50μL(10⁸CFU/mL)，近红外实验各组按0.25W/cm²×2min+0.15W/cm²×8min的程序辐照菌悬液，将菌悬液稀释10⁸倍，在血琼脂平板上培养48h后观察计数菌落，以空白对照组菌数计算菌体存活率评价其抑菌效果。

图12示出了本发明实施例提供的组合物抗戈氏链球菌悬浮菌结果图，图13示出了本发明实施例提供的组合物抗牙龈卟啉单胞菌悬浮菌结果图，如图12、13所示，H₂O₂对细菌的作用在加入ATA后得到了加强，而在NIR的加入后，ATA/H₂O₂/NIR的抗菌率达到了100％。

5.验证有效成分(ATA+H₂O₂+NIR)对细菌生物膜的抗菌作用。

收集新鲜健康人磨牙，制备牙本质片基质，用于形成细菌生物膜的基底。用环钻将牙根切割成直径4mm、厚度1mm的圆形牙本质。每片牙釉质片在无水乙醇中浸泡24h，在紫外线下消毒1h。为了模拟龈下环境，将牙釉质片浸泡在50％热灭活FBS生理盐水中过夜，用血清膜预覆盖牙釉质。处理后的牙质片与10⁸个细菌共培养72h形成生物膜，培养基每24h更换一次。在细菌培养基中加入1％的蔗糖，以提高生物膜的粘附力。为验证ATA的抗生物膜效果，实验组设置为Control、H₂O₂、ATA/NIR、ATA/H₂O₂和ATA/H₂O₂/NIR。每组加入100μL的UPH₂O或100mM的H₂O₂。近红外组按0.25W/cm²×2min+0.15W/cm²×8min的程序照射，含有ATA的组均加入100μL的ATA微球。反应10分钟后，按照厂家说明用SYTO-9和PI染色，并用共聚焦激光扫描显微镜成像。

图14示出了本发明实施例提供的组合物抗戈氏链球菌生物膜结果图，图15示出了本发明实施例提供的组合物抗牙龈卟啉单胞菌生物膜结果图，如图14、15显示，H₂O₂对细菌生物膜仅有微弱的抗菌，当加入ATA微球后，死亡细菌的数量明显增加，当得到NIR的照射后，细菌大部分死亡。

以上对本发明所提供的一种模拟酶微球和牙周炎用组合物、制法及其牙周炎注射用制剂进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明的原理及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (10)

1.一种模拟酶微球，其特征在于，所述模拟酶微球为赋形剂与模拟酶Ag-TiO_2-x组成的实心微球。

2.根据权利要求1所述的模拟酶微球，其特征在于，所述赋形剂为海藻酸钠、PLGA、PCL、或PDMS。

3.根据权利要求1所述的模拟酶微球，其特征在于，所述模拟酶微球的直径为205-250μm。

4.一种牙周炎用组合物，其特征在于，所述组合物由权利要求1-3任一所述的模拟酶微球与H₂O₂混合组成；

其中，所述H₂O₂的浓度为0.01-0.1mol/L。

5.一种制备如权利要求4所述的组合物的方法，其特征在于，所述方法包括：

S1、将模拟酶Ag-TiO_2-x分散于二氯甲烷或水溶液中，形成质量浓度为15mg/mL的模拟酶分散液；

S2、将体积比为1：1的所述模拟酶分散液与赋形剂混合均匀，形成微球前驱体溶液；

S3、将微球前驱体溶液装入静电液微滴装置，并使微球前驱体溶液在高压静电场作用下连续滴出到接收溶液中，静置固化、清洗，得到所述模拟酶微球；

S4、将体积比为1：1的所述模拟酶微球与H₂O₂混合后形成所述治疗牙周炎的组合物。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述赋形剂为海藻酸钠、PLGA、PCL或PDMS；

当所述赋形剂为海藻酸钠时，所述接收溶液为氯化钙溶液、氯化铜溶液、氯化钴溶液、氯化锌溶液和氯化亚铁溶液中的任意一种；

当所述赋形剂为PLGA或PCL时，所述接收溶液为无水乙醇溶液；

当所述赋形剂为PDMS时，所述接收溶液为Tween80溶液。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述高压静电场的工作电压为5kV～20kV。

8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述H₂O₂的浓度为0.01-0.1mol/l。

9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述模拟酶Ag-TiO_2-x的制备方法包括：

S11、将2g TiO₂和1.5g NaBH₄进行研磨混合后，置于管式炉中进行真空还原反应，加热温度为360℃，反应时间为30min，得到富含氧空位和Ti³⁺的TiO_2-x；

S12、将200mg所述TiO_2-x与15mL 2.1mg/mL的硝酸银水溶液混合，加入无水乙醇15mL作为牺牲剂，并加入1mL氨水调节PH至碱性，在紫外光照条件下处理1小时，银离子原位还原在TiO_2-x表面形成所述模拟酶Ag-TiO_2-x。

10.一种牙周炎注射用制剂，其特征在于，所述制剂包含权利要求4所述的组合物。

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