CN115633783A - 一种多糖纳米剂型的制备方法和应用 - Google Patents
一种多糖纳米剂型的制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
一种多糖纳米剂型的制备方法和应用，属于食品与医药领域，具体方案包括以下步骤：步骤一、将多糖溶于去离子水中得到溶液A；步骤二、在搅拌的条件下将无水乙醇逐滴加到溶液A中，继续搅拌，得到悬浮液B；步骤三、将悬浮液B离心分离，沉淀物即为多糖纳米剂型；所述多糖为黑松露多糖、红乳牛肝菌多糖或红菇多糖。本发明制备的黑松露多糖纳米剂型可以显著促进巨噬细胞增殖，对小鼠正常肝细胞具有辐射防护效果，具有蛋白吸附效果好、稳定性强等优点，可以有效解决生物大分子多糖在食品与医药领域中生物利用度低的问题。
Description
技术领域
本发明属于食品与医药领域，具体涉及一种多糖纳米剂型的制备方法和应用。
技术背景
多糖作为构成生命体的基本物质之一，广泛存在于各种生物中，其具有经济、安全、副作用少、生物活性广泛等优点，目前被广泛应用于医药及功能食品领域。红乳牛肝菌作为一种食用真菌，具有良好的抗氧化、抗炎活性。红乳牛肝菌多糖(SBP)表现出良好的抗炎、辐射防护活性。红菇是一种药食同源真菌，红菇多糖(RVP)具有抗氧化、抗炎、降血糖等活性。黑松露作为一种名贵的药食同源型真菌，具有多种广泛的药理活性。黑松露多糖(TP)作为黑松露子实体富含的主要活性物质之一，表现出优异的抗氧化、抗炎、免疫调节等生物活性。相比于一些中草药来源的生物多糖，TP还具有毒副作用小、生物安全性好等优点。但是以上多糖分子量庞大，可达数万甚至百万Da。巨大的分子量、松散的分子结构导致其难以透过细胞屏障被机体吸收利用，使其生物利用度较低，阻碍其在生物与医药领域的高效应用。
发明内容
本发明为了解决TP、SBP、RVP的生物利用度低、体内生物活性差的问题，提供一种多糖纳米剂型的制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种多糖纳米剂型的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将多糖溶于去离子水中得到溶液A；
步骤二、在搅拌的条件下将无水乙醇逐滴加到溶液A中，继续搅拌，得到悬浮液B；
步骤三、将悬浮液B离心分离，沉淀物即为多糖纳米剂型；所述多糖为黑松露多糖、红乳牛肝菌多糖或红菇多糖。
进一步的，步骤一中，多糖与去离子水的质量体积比为10-20mg/mL。
进一步的，步骤二中，溶液A与无水乙醇的体积比为1:5-1:20。
进一步的，步骤三中，沉淀物使用无水乙醇洗涤。
进一步的，步骤一中，多糖的制备方法包括以下步骤：
步骤1、以脱脂的黑松露粉末、红乳牛肝菌粉末或红菇粉末为原料，超纯水为溶剂，混合均匀后进行水浴提取，提取温度为90℃，提取时间为2h，得到提取液C；
步骤2、将提取液C经过离心分离得到上清液，上清液经过抽滤、浓缩得到浓缩液D；
步骤3、向浓缩液D中加入体积分数为95％的乙醇，于4℃环境下静置12h醇沉，随后离心分离，获得沉淀物，沉淀物加水复溶后经过7000Da透析袋透析36h，将透析后的溶液真空冷冻干燥，相应的获得黑松露多糖、红乳牛肝菌多糖或红菇多糖。
进一步的，步骤1中，原料与溶剂的料液比为1:30g/mL。
进一步的，步骤3中，浓缩液D与体积分数为95％的乙醇的体积比为1:4。
进一步的，步骤1中，脱脂的步骤为：将粉碎的黑松露粉末、红乳牛肝菌粉末或红菇粉末用体积分数为95％的乙醇浸泡，抽滤后舍弃滤液，将滤渣烘干，相应的得到脱脂后的黑松露粉末、红乳牛肝菌粉末或红菇粉末，其中，粉碎的黑松露粉末、红乳牛肝菌粉末或红菇粉末与体积分数为95％的乙醇的料液比为1:30g/mL。
一种所述的多糖纳米剂型的应用，所述多糖纳米剂型应用在辐射防护食品中。相比于现有技术，本发明具有如下优点：
有益效果：本发明与现有技术相比具有如下优势：
1、本发明制备的TP纳米剂型TP-NPs、SBP纳米剂型SBP-NPs、RVP纳米剂型RVP-NPs主要依靠分子间氢键等非共价作用力结合，不涉及化学改建，产物可控、绿色、安全。
2、本发明制备的TP纳米剂型TP-NPs、SBP纳米剂型SBP-NPs、RVP纳米剂型RVP-NPs具有较小的尺寸、均匀的球状形貌，同时其具有较强的pH稳定性、温度稳定性及离子强度稳定性。
3、本发明制备的TP纳米剂型TP-NPs、SBP纳米剂型SBP-NPs、RVP纳米剂型RVP-NPs可以显著提升其对正常肝细胞AML-12的辐射防护能力以及对巨噬细胞RAW 264.7的促增殖能力。
附图说明
图1中，A、B、C、D分别为TP及不同条件下制备的TP-NPs(NP-1、NP-2、NP-3)的SEM微观形貌图；
图2中，A为TP及TP-NPs(NP-1、NP-2、NP-3)的FT-IR图谱；B为TP及TP-NPs(NP-1、NP-2、NP-3)的XRD图谱；
图3为TP及TP-NPs(NP-1、NP-2、NP-3)对RAW 264.7细胞增殖能力的影响效果图，其中脂多糖(LPS)作为阳性对照；
图4中，A、B分别为TP及TP-NPs(NP-1、NP-2、NP-3)对AML-12细胞的安全性和辐射防护能力效果图，NC代表空白对照组，IR代表辐照模型组；
图5为TP及TP纳米颗粒NP-3对蛋白质的吸附能力效果图；
图6中，A、B、C分别为NP-3的pH、温度、离子强度稳定性效果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步的说明，但并不局限于此，凡是对本发明技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，均应涵盖在本发明的保护范围中。下述实施例中所使用的实验方法若无特殊说明，均为常规方法。
具体实施方式一
本发明提供一种多糖纳米剂型的制备方法，用以解决黑松露多糖(TP)、红乳牛肝菌多糖(SBP)、红菇多糖(RVP)的生物利用度低、体内生物活性差的问题，该方法制备的多糖纳米剂型主要依靠TP、SBP、RVP中各自的分子间氢键结合，依靠非共价作用力组装而成。该方法制备的纳米剂型具有尺寸小、稳定性强、生物利用度高等优点，可以有效解决生物与医药领域中，多糖类生物大分子因分子量过大导致的生物利用度低、体内活性差等问题。
具体方案如下：
一种多糖纳米剂型的制备方法，包括以下步骤：
步骤一、将多糖溶于去离子水中得到溶液A，其中多糖与去离子水的质量体积比为10-20mg/mL；
步骤二、在磁力搅拌的条件下将无水乙醇逐滴加到溶液A中，继续磁力搅拌2h，得到悬浮液B；溶液A与无水乙醇的体积比为1:5-1:20；优选的，所述溶液A与无水乙醇的体积比为1:5、1:10、1:20，该比例下制备的TP-NPs(分别记为NP-1、NP-2、NP-3)具有促进RAW264.7细胞增殖、对AML-12细胞辐射防护活性。所述溶液A与无水乙醇的体积比为1:4时，所得TP-NPs(NP-3)具有优异的蛋白吸附能力和pH、温度、离子强度稳定性。
步骤三、将悬浮液B在10000rmp条件下离心15min，用无水乙醇洗涤沉淀物3次，即得多糖纳米剂型；所述多糖为黑松露多糖、红乳牛肝菌多糖或红菇多糖。
进一步的，步骤一中，多糖的制备方法包括以下步骤：
步骤1、将粉碎的黑松露粉末、红乳牛肝菌粉末或红菇粉末过40目筛，然后按照1:30(g/mL)的料液比用体积分数为95％的乙醇浸泡12h，抽滤后舍弃滤液，将滤渣烘干，相应的得到脱脂后的黑松露粉末、红乳牛肝菌粉末或红菇粉末；以脱脂的黑松露粉末、红乳牛肝菌粉末或红菇粉末为原料，超纯水为溶剂，按照料液比为1:30g/mL的比例混合均匀后进行水浴提取，提取温度为90℃，提取时间为2h，得到提取液C；
步骤2、将提取液C经过4000rpm离心15min，分离得到上清液，上清液经过抽滤、旋转蒸发浓缩得到浓缩液D；
步骤3、向浓缩液D中加入4倍体积的体积分数为95％的乙醇，于4℃环境下静置12h醇沉，随后3500rmp离心15min，获得沉淀物，沉淀物加水复溶后经过7000Da透析袋透析36h，将透析后的溶液真空冷冻干燥，相应的获得黑松露多糖、红乳牛肝菌多糖或红菇多糖。
具体实施方式二
具体实施方式一所述的多糖纳米剂型应用在辐射防护食品中。
实施例1
一种多糖纳米剂型的制备方法，包括以下步骤：
步骤1、将粉碎的黑松露粉末经过40目过筛，然后按照1:30(g/mL)的料液比用95％(V/V)的乙醇浸泡12h，抽滤后舍弃滤液，将滤渣烘干得脱脂后的黑松露粉末；以脱脂后的黑松露粉末为原料，超纯水为溶剂，按照料液比1:30(g/mL)的比例混合均匀，然后进行水浴提取，提取温度为90℃，提取时间为2h，得到提取液C。
步骤2、提取液C经过4000rpm离心15min得上清液，上清液经过抽滤、旋转蒸发浓缩得浓缩液D。
步骤3、向浓缩液D加入4倍体积的95％(V/V)乙醇，于4℃冰箱中静置12h醇沉，随后3500rmp离心15min，获得沉淀物；沉淀物加水复溶后经过7000Da透析袋透析36h，将透析后的溶液通过真空冷冻干燥机冷冻干燥后获得黑松露多糖(TP)。
步骤一、将TP溶于去离子水中得到溶液A，其中TP与去离子水的质量体积比为20mg/mL。
步骤二、在磁力搅拌条件下，将无水乙醇逐滴加入到溶液A中，继续磁力搅拌2h，得到悬浮液B。
步骤三、悬浮液B在10000rmp条件下离心15min，并用无水乙醇洗涤沉淀3次，得到TP纳米剂型TP-NPs。可将洗涤后的TP-NPs悬浮于适量去离子水中，冷冻干燥后保存，用于后续检测。
按照上述方法，步骤二中分别控制溶液A与无水乙醇的体积比为1:5、1:10、1:20，其余步骤均相同，制备TP-NPs，分别命名为NP-1、NP-2、NP-3。
按照上述方法，步骤1中将黑松露换为红乳牛杆菌和红菇，其他步骤相同，分别制备红乳牛肝菌多糖纳米颗粒SBP-NPs、红菇多糖纳米颗粒RVP-NPs。
由表1所示，TP、SBP、RVP均可以通过本发明方法制备为纳米剂型。后续检测中以TP-NPs为检测对象进行分析。
表1为不同多糖溶液与无水乙醇体积比条件下制备的TP-NPs、SBP-NPs、RVP-NPs的粒径及PDI
1.1 TP和TP-NPs的显微形貌
将TP、NP-1、NP-2、NP-3冻干粉分别均匀黏附在导电胶上，用洗耳球吹去未黏附粉末，在粉末表面喷涂一层薄金，增强导电性。通过扫描电子显微镜(SEM,ZEISS Gemini 300)观察它们的微观形貌。
由图1所示，A、B、C、D分别为TP、NP-1、NP-2、NP-3的SEM微观形貌图。TP为片状结构，整体尺寸较大。NP-1、NP-2呈现出多孔构型，但是表面颗粒的球状形貌不明显，颗粒度不足。NP-3呈现明显的纳米球相互聚集的外观形貌。本发明创新的利用反溶剂沉淀法，通过加入反溶剂来诱导饱和溶液为溶质的沉淀提供驱动力，在临界溶质浓度下，多糖分子相互碰撞聚集，团聚形成纳米颗粒。反溶剂比例较大的情况下，溶液过饱和度增加，所形成纳米颗粒的粒径较小。相比于TP，NP-1、NP-2、NP-3均由较小尺寸的颗粒聚集而成，在机体内它们可以分散为较小的颗粒单元，更易透过细胞屏障被机体吸收利用。
1.2傅里叶红外光谱(FT-IR)及X-射线衍射(XRD)分析
1.2.1 FT-IR分析
用Tensor II傅里叶红外光谱仪(Bruker,Ettilingen,Germany)测定TP和TP-NPs(NP-1、NP-2、NP-3)的红外图谱。将研钵、杵和压片装置用无水乙醇擦拭干净，再分别取TP和NP-1、NP-2、NP-3冻干粉与溴化钾粉末按照1:100的比例放入研钵中，用杵仔细按同一方向缓慢研磨，直至研磨均匀，将粉末放入压片装置中，压片3min，可见压片透明均一，无裂片，放入红外检测装置中，进行检测并应用红外分析软件OMNIC 8.0进行分析。
由图2A所示，相比于TP，NP-1、NP-2、NP-3在3400cm-1处的吸收峰增大，此吸收峰为-OH的伸缩振动特征吸收峰。并且其余吸收峰未产生明显变化，证明未有新的化学键生成。-OH可以作为氢键的供体与受体，证明氢键主要参与NP-1、NP-2、NP-3的形成。无未知副产物产生，产物更加安全。同时氢键作为一种较强的分子间非共价键，将多糖分布松散的基团相互连接，形成结构紧致，粒径较小的纳米颗粒。这种较强的分子间作用力赋予纳米颗粒良好的稳定性，使其在多变的外部环境中保持良好的纳米结构。稳定性实验检测结果也表明了这一点。
1.2.2 XRD分析
用X-射线衍射仪(Rigaku SmartLab 9kW,Japan)测定TP和TP-NPs(NP-1、NP-2、NP-3)的晶体结构。检测条件：电压45kV，电流200mA，2θ(°)范围为5-90°，速度5°/min。
由图2B所示，TP、NP-1、NP-2均未显示出晶体结构的特征吸收峰，属于非晶体结构。NP-3出现特征吸收峰，表现出部分晶体结构特征，该晶体结构可以使NP-3更易被细胞摄取，表现出更优的生物利用度和生物活性。
1.3 TP和TP-NPs对RAW 264.7细胞的促增殖能力检测
收集生长状态良好的RAW 264.7细胞，血球计数板计数并调整细胞浓度，以1×104/mL的细胞浓度接种于96孔板中，37℃、5％CO2培养箱中培养12h使其充分贴壁。12h后分别加入不同浓度的TP溶液和TP-NPs(NP-1、NP-2、NP-3)悬浮液10μL于对应的孔，PBS组和LPS(1μg/mL)组分别作为阴性对照和阳性对照，每个实验组做5个重复孔，于37℃、5％CO2培养箱中继续培养24h。24h之后，取出96孔板，小心吸走96孔板中的细胞培养液，并避光配置含10％胎牛血清和10％CCK-8溶液的DMEM培养基，每孔避光加入110μL混合培养基，于37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育1-2h。然后使用酶标仪测定450nm处吸光度。
由图3所示，相比于Control组，TP、NP-1、NP-2、NP-3组均能显著提升RAW 264.7细胞的细胞活力，且该效果呈剂量依赖性，证明TP、NP-1、NP-2、NP-3均能促进RAW 264.7巨噬细胞增殖。相比于TP组，NP-1、NP-2、NP-3组的促增殖效果更明显，且NP-3组最佳。证明TP可以促进RAW 264.7巨噬细胞增殖，具有一定的免疫调节功能。本发明制备的TP-NPs可以在一定程度上提升该效果，表现出更好的免疫调节功效。
1.4 TP和TP-NPs对AML-12细胞的辐射防护能力检测
1.4.1 TP和TP-NPs对AML-12细胞的剂量安全性检测
使用传代次数为3-6代的AML-12细胞，待细胞生长至最佳时期时，消化细胞重悬后稀释计数，将细胞悬液加入96孔板中，每孔体积为90μL，约5000个细胞/孔。于37℃、5％CO2培养箱中培养12h使细胞贴壁，12h后分别加入不同浓度的TP溶液和TP-NPs(NP-1、NP-2、NP-3)悬浮液10μL于对应的孔，PBS组作空白对照，每个实验组做5个重复孔，于37℃、5％CO2培养箱中继续培养24h。24h之后，取出96孔板，小心吸走96孔板中的细胞培养液，并避光配置含10％胎牛血清和10％CCK-8溶液的培养基，每孔避光加入110μL混合培养基，于37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育1-2h。然后使用酶标仪测定450nm处吸光度，并计算细胞活力。
由图4A所示，不同浓度的TP及TP-NPs(NP-1、NP-2、NP-3)处理后，AML-12细胞的细胞活力均未下降，且有一定程度的提升，其中NP-3效果最佳。证明在100-400μg/mL的浓度下TP及TP-NPs(NP-1、NP-2、NP-3)对AML-12细胞无毒，且具有一定程度的促增殖作用，其中NP-3效果最佳。
1.4.2 TP和TP-NPs对AML-12细胞辐射防护能力检测
使用传代次数为3-6代的AML-12细胞，待细胞生长至最佳时期时，消化细胞重悬后稀释计数，将细胞悬液加入96孔板中，每孔体积为90μL，约5000个细胞/孔。于37℃、5％CO2培养箱中培养12h使细胞贴壁，12h后分别加入不同浓度的TP溶液和TP-NPs(NP-1、NP-2、NP-3)悬浮液10μL于对应的孔，每个实验组做5个重复孔，于37℃、5％CO2培养箱中继续培养12h后，除NC组外，其余组均进行60Co-γ射线辐照，辐照总剂量为6Gy，辐照剂量率2Gy/min。24h之后，取出96孔板，小心吸走96孔板中的细胞培养液，并避光配置含10％胎牛血清和10％CCK-8溶液的培养基，每孔避光加入110μL混合培养基，于37℃，5％CO2的细胞培养箱中孵育1-2h。然后使用酶标仪测定450nm处吸光度，并计算细胞活力。
由图4B所示，辐照之后，IR组细胞活力显著降低，TP-NPs(NP-1、NP-2、NP-3)处理后，细胞活力有一定程度的恢复，且NP-3恢复效果最佳。以上结果表明本发明制备的TP-NPs(NP-1、NP-2、NP-3)对辐照导致的AML-12细胞活力降低具有一定的防护作用。
1.5 TP和NP-3对蛋白质的吸附能力检测
以牛血清白蛋白(BSA)为模型研究TP和NP-3对蛋白质吸附情况。将15mg的TP、15mg的NP-3分别与25mg的BSA共同溶解于100mL PBS(pH 7.4)溶液中。每隔一段时间，从混合溶液中吸取1mL液体，10000rpm离心20min，使用BCA蛋白定量试剂盒检测上清中未被吸附的蛋白质。25mg BSA溶解于100mL的去离子水中混合溶液作为空白对照。计算不同时间后TP及NP-3对蛋白质的吸附能力。
由图5所示，TP对蛋白质具有一定的吸附能力，但是其吸附效率较低。本发明方法制备的NP-3在同样时间段对蛋白质的吸附能力显著高于TP。证明本发明方法制备的TP-NPs可以有效提升蛋白质吸附能力，更易与细胞膜表面蛋白结合，从而提升细胞对其摄取能力，进一步提升生物利用度与体内生物活性。
1.6 NP-3的稳定性检测
1.6.1 NP-3的pH稳定性检测
取适量NP-3加入去离子水中制备为悬浮液，将悬浮液分为4组。各组分别取2mL与2mLpH为2、5、7、9的去离子水(用0.5M的HCl和NaOH调节pH)混合。室温下孵育2h，随后检测其粒径和PDI。
如图6A所示，在不同pH条件下孵育2h之后，NP-3的粒径和PDI未显著增加，证明本发明方法制备的TP-NPs具有良好的pH稳定性，可以满足一般功能性食品的生产及储备要求。
1.6.2 NP-3的温度稳定性检测
取适量NP-3加入去离子水中制备为悬浮液，将悬浮液分为4组，分别在4、25、37、60℃条件下孵育2h，然后恢复至室温，随后检测其粒径和PDI。
如图6B所示，在不同温度条件下孵育2h之后，NP-3的粒径和PDI未显著增加，证明本发明方法制备的TP-NPs具有良好的温度稳定性，可以满足一般功能性食品的生产及储备要求。
1.6.3 NP-3的离子强度稳定性检测
取适量NP-3加入去离子水中制备为悬浮液，将悬浮液分为5组，各组分别取2mL与2mL 200、400、600、800、1000mM的NaCl溶液混匀(NaCl的终浓度分别为100、200、300、400、500mM)，室温下孵育2h，随后检测其粒径和PDI。
如图6C所示，在不同离子强度条件下孵育2h之后，NP-3的粒径和PDI未显著增加，证明本发明方法制备的TP-NPs具有良好的离子强度稳定性，可以满足一般功能性食品的生产及储备要求。
Claims (10)
1.一种多糖纳米剂型的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、将多糖溶于去离子水中得到溶液A；
步骤二、在搅拌的条件下将无水乙醇逐滴加到溶液A中，继续搅拌，得到悬浮液B；
步骤三、将悬浮液B离心分离，沉淀物即为多糖纳米剂型；所述多糖为黑松露多糖、红乳牛肝菌多糖或红菇多糖。
2.根据权利要求1所述的多糖纳米剂型的制备方法，其特征在于：步骤一中，多糖与去离子水的质量体积比为10-20mg/mL。
3.根据权利要求1所述的多糖纳米剂型的制备方法，其特征在于：步骤二中，溶液A与无水乙醇的体积比为1:5-1:20。
4.根据权利要求1所述的多糖纳米剂型的制备方法，其特征在于：步骤三中，沉淀物使用无水乙醇洗涤。
5.根据权利要求1所述的多糖纳米剂型的制备方法，其特征在于：步骤一中，多糖的制备方法包括以下步骤：
步骤1、以脱脂的黑松露粉末、红乳牛肝菌粉末或红菇粉末为原料，超纯水为溶剂，混合均匀后进行水浴提取，提取温度为90℃，提取时间为2h，得到提取液C；
步骤2、将提取液C经过离心分离得到上清液，上清液经过抽滤、浓缩得到浓缩液D；
步骤3、向浓缩液D中加入体积分数为95％的乙醇，于4℃环境下静置12h醇沉，随后离心分离，获得沉淀物，沉淀物加水复溶后经过7000Da透析袋透析36h，将透析后的溶液真空冷冻干燥，相应的获得黑松露多糖、红乳牛肝菌多糖或红菇多糖。
6.根据权利要求5所述的一种多糖纳米剂型的制备方法，其特征在于：步骤1中，原料与溶剂的料液比为1:30g/mL。
7.根据权利要求5所述的一种多糖纳米剂型的制备方法，其特征在于：步骤3中，浓缩液D与体积分数为95％的乙醇的体积比为1:4。
8.根据权利要求5所述的一种多糖纳米剂型的制备方法，其特征在于：步骤1中，脱脂的步骤为：将粉碎的黑松露粉末、红乳牛肝菌粉末或红菇粉末用体积分数为95％的乙醇浸泡，抽滤后舍弃滤液，将滤渣烘干，相应的得到脱脂后的黑松露粉末、红乳牛肝菌粉末或红菇粉末。
9.根据权利要求8所述的一种多糖纳米剂型的制备方法，其特征在于：粉碎的黑松露粉末、红乳牛肝菌粉末或红菇粉末与体积分数为95％的乙醇的料液比为1:30g/mL。
10.一种权利要求1-9任一权利要求所述的多糖纳米剂型的应用，其特征在于：所述多糖纳米剂型应用在辐射防护食品中。
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