CN115605753A - 用于疏松细胞的过程记录载玻片及其使用方法 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及用于疏松细胞的过程记录载玻片及其使用方法。单区域到多区域载玻片，其中每个区域包含一到四个对照靶标，适用于通过特殊染色、IHC或CC等进行处理。每个区域可以通过疏水屏障界定以形成孔。载玻片具有适合捕获疏松细胞和细胞碎片的粘合剂涂层。

Description

用于疏松细胞的过程记录载玻片及其使用方法
优先权和交叉引用
本申请要求2019年12月31日提交的美国临时申请第62/955,501号的优先权，其全部内容通过引用并入本文。
技术领域
本申请涉及用于疏松细胞的过程记录载玻片及其使用方法。
背景技术
目前有许多种载玻片包含由疏水屏障界定的样品孔。这些载玻片中的一些已经开发和制造出了许多孔，例如100个孔。然而，这些载玻片都没有包含对照靶标以提供用于处理样品的第一染色试剂和第二染色试剂的定量测量。
测定抗体试剂浓度的方法包括测定稀释样品在280nm处的吸光度。然后生成分析报告以给出包装小瓶的浓度，通常在0.8至1.2mg/ml之间。然而，吸光度测量假定所有抗体蛋白都是完整的。如果铰链以一定百分比断裂，但Fab和Fc结构域仍然存在，则测量值保持不变。使用抗体时，在取出等分试样之前，将抗体的温度提高到25℃。当不再需要进一步处理载玻片时，将小瓶送回在4℃储存。所有的蛋白质都会随着年龄的增长而分解，从铰链处的失效开始。为了解决活性抗体的这种衰减，实验室方案只是在购买后6个月后丢弃小瓶。可能是降解没有严重到影响染色组织切片。然而，将小瓶放在外面过夜会显着缩短抗体活力的寿命。由于抗体费用的原因，大多数时候实验室只是忽略了这个缺陷并希望获得最好的结果。只有在使用已知的细胞对照时，这种早期失效才会显现出来。
发明内容
本申请的一些实施例的载玻片通过在每个样品孔内包含对照靶标来解决这种情况。对照靶标的一个功能是量化所应用的第一抗体的功能浓度。
对于基于疏松细胞的载玻片，没有共同驻留的过程质量控制(PQC)解决方案。疏松细胞应用包括巴氏涂片、血液涂片和用于各种应用的多孔/多患者载玻片。最常见的是，多患者载玻片用于巴氏涂片的体积处理。
通过让细胞有足够的时间沉至载玻片表面，可以从应用的浆液中捕获疏松细胞。载玻片包含粘合剂涂层，当细胞沉淀下来时，该涂层会共价捕获细胞。在一些实施例中，在单层粘合剂上使用保形粘合剂以确保细胞和粘合剂之间的结合密度更高。Erie Gold Plus就是这种保形粘合剂载玻片的一个例子。尽管在某些情况下，在捕获性能方面，优质的氨基硅烷载玻片粘合剂就足够了。
可以通过使用疏水涂料(例如环氧树脂或聚氨酯)印刷图案来制造带有样品孔的载玻片。几种印刷工艺是实用的并且可以包括丝网印刷、转印、喷墨或滚珠。此类载玻片由许多供应商制造。印刷过程中的一个因素是不用加热来固化油漆，因为热量通常会降低粘合剂的亲水性。
在某些应用中，使用疏水屏障是不可行的。一个例子是血液涂片，其在涂片过程容易将涂片特定区域中的多种血细胞类型分离。涂片通常是通过从楔子的背面拉动样品滴而形成的。速度和楔角与血液粘度有关。PQC靶标可作为基准标记放置在载玻片上，以告知用户应将患者样品施加到何处。
单个样品载玻片可能会或可能不会使用疏水屏障。在经典形式中，可以在没有任何疏水屏障环的情况下制作血液涂片和巴氏涂片载玻片。自动巴氏涂片机将患者样品处理成可控的细胞密度浆液或滤盘上的湿层。将浆液施加在疏水屏障环内，以沉降一段时间，从而去除多余的液体。其中一个例子是未发布的Veracell巴氏涂片。滤盘上的湿层被转印到载玻片上，因此不需要屏障环。ThinPrep载玻片就是一个例子。
本申请的一些实施例在此结合了PRS对照靶标作为没有疏水屏障的载玻片的基准标记。作为基准标记，对照靶标点将位于工作区域的四个角落，名义上定义为1.5cm×1.5cm区域。作为一般规则，不使用疏水屏障的载玻片只能处理一个患者的生物材料样品。对照靶标将位于1.5cm×1.5cm区域内的边缘。虽然图1A包括1.5cm×1.5cm区域，但本领域普通技术人员将理解不同尺寸的区域都在本公开的范围内。
包含用于容纳样品的疏水屏障环的载玻片很少超过10个孔，每个孔包含容纳区域。将样品施加在孔的中心，并将孔填充到几乎溢出的体积。当载体缓冲剂蒸发时(尤其是在加热加速的情况下)，细胞往往会从孔的边缘脱落，并会在中心堆积。对照靶标将分布在孔的工作外围的四个等距位置。染色试剂：用于IHC应用的抗体蛋白沉淀速度比在沉积物边缘往往具有最高浓度的细胞更快。因此，细胞浆液通常会避免在靶标所在的位置沉降。然而，染色试剂将有足够的时间被对照靶标捕获。与任何染色过程一样，一旦生物材料变湿，生物材料通常会保持湿润，直到染色完成。
染色过程仅限于支持两种第一抗体，其中一种抗体是基于小鼠的抗体，另一种抗体是兔宿主抗体。在单一的第一抗体配置中，对照靶标将捕获小鼠或兔宿主抗体。有许多配置选项可以应用于对照靶标：
·单一的第一抗体(基于小鼠或兔)的4点梯度密度系列；
·一对用于小鼠抗体另一对用于兔抗体的2点梯度密度系列；
·4靶点，可以是小鼠抗体、兔抗体、小鼠第二抗体和小鼠第二抗体；或者
·以上任意组合。
本申请的一些实施例涉及载玻片，该载玻片包括被配置为容纳包含疏松细胞的样品的检测区域，以及对照区域，所述对照区域被配置为：
指示免疫组化或细胞化学检测过程中的中间步骤的误差和性能度量，并为分别定性或定量确定染色疏松细胞的抗原密度和颜色密度或染色细胞表面和内部的颜色密度提供参考，
其中所述检测区域包括至少一个区域，
所述对照区域围绕所述至少一个区域，并且
所述对照区域包括至少一个对照靶标用于提供参考。
在至少一个实施例中，还包括构造成与部分结合的粘合剂涂层，其中所述粘合剂涂层包含至少一种选自以下组的端基：-ROH、-R(C＝O)OH、-RNH2、-R(C＝O)NH2和-RNH3。
在至少一个实施例中，检测区域的至少一个孔中的每个孔为圆形、正方形或长方形。
在至少一个实施例中，对照区域在检测区域的区域角落处。
在至少一个实施例中，对照区域在检测区域的区域内。
在至少一个实施例中，对照区域在检测区域的区域之外。
在至少一个实施例中，对照区域包括至少一个对照点或对照点阵列。
在至少一个实施例中，对照靶标被构造成捕获小鼠、兔或小鼠+兔宿主的第一抗体；小鼠、兔或小鼠+兔第二抗体；或苏木精和伊红染色剂。
在至少一个实施例中，第一抗体在其FcγRI位点被蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或附着于载体蛋白或包括诸如胶乳的材料的珠粒的FcγRI结合肽捕获。
在至少一个实施例中，苏木精和伊红被附着于胺包覆的包括诸如胶乳的材料的珠粒的化学靶标捕获。
在至少一个实施例中，第一靶标对包括两种不同的浓度，其中一种浓度为100％，另一种浓度为30-70％。
在至少一个实施例中，还包括粘合剂层。
在至少一个实施例中，粘合剂是氨基硅烷。
在至少一个实施例中，对照区域由部分疏水屏障或完全疏水屏障界定。
在至少一个实施例中，检测区域的至少一个孔包含样品。
在至少一个实施例中，还包括疏水材料涂层。
在至少一个实施例中，疏水材料是环氧树脂或聚氨酯。
在至少一个实施例中，对照靶标包括第一靶标、第一抗体、第二靶标、第二抗体、成像参考、2D成像参考靶标、3D成像参考靶标或靶标阵列。
在至少一个实施例中，第二靶标可以具有两种不同的浓度，其中一种浓度为100％，另一种浓度为30-70％。
在至少一个实施例中，参考成像点包括至少一个：
·黑色参考靶标，其中该黑色参考靶标包括碳尘；
·白色参考靶标，其中该白色参考靶标包括金属氧化物或金属硫酸盐；或者
·透明靶标，其中该透明靶标包括针对任何免疫组织化学、免疫化学或细胞化学试剂的非反应性蛋白质。
在至少一个实施例中，成像参考点包括用于白色参考靶标和黑色参考靶标的酸酐基环氧树脂；和
·用于透明靶标的来自哺乳类马科动物的蛋白质。
本申请的一些实施例还涉及一种使用上述载玻片检测细胞的方法，该方法包括：
将包含疏松细胞的样品置于所述检测区域，
将对照靶标置于所述对照区域，
对疏松细胞和对照靶标进行染色，其中染色过程包括：
将至少一个第一靶标施加到所述载玻片的所述对照区域，将至少一个与该部分缀合的第一靶标施加到所述载玻片的对照区域，或将至少一个与一个部分缀合的第二靶标施加到所述载玻片的对照区域，和
将产生颜色的染色试剂施加到所述检测区域和所述对照区域，
评估染色过程的质量，
其中评估过程包括评估疏松细胞和对照靶标的染色结果，
定性确定疏松细胞的状态。
在至少一个实施例中，所述至少一个对照靶标被配置为捕获小鼠、兔或小鼠+兔宿主的第一抗体；小鼠、兔或小鼠+兔第二抗体；或苏木精和伊红染色剂。
在至少一个实施例中，第一抗体在FcγRI位点被蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或附着于载体蛋白或活化珠的FcγRI结合肽捕获。
在至少一个实施例中，苏木精和伊红被附着于活化珠的化学靶标捕获。
附图的简要说明
图1A是根据至少一个实施例的具有疏水屏障环的载玻片的顶视图，其中还包含对照靶标。
图1B是根据至少一个实施例的具有疏水屏障环的载玻片的一部分的俯视图，其中还包含对照靶标。
图2是根据至少一个实施例的具有疏水屏障环的载玻片的俯视图，其中每个屏障环都包含对照靶标。
图3A是根据至少一个实施例的具有p16INK4a和Ki-67第一抗体的对照靶标的巴氏试验片的俯视图。
图3B是根据至少一个实施例的p16INK4a和Ki-67第一抗体的对照靶标的俯视图。
图4是根据至少一个实施例的用于巴氏染色的支持PQC靶标的ThinPrep兼容巴氏涂片的俯视图。
详细说明
以下公开内容提供了用于实现本文所提供的技术主题的不同特征的多个不同的实施例或示例。下面描述组件和布置的特定示例以简化本公开。当然，这些仅是示例，并不旨在进行限制。例如，在下面的描述中，在第二特征之上形成第一特征可以包括第一特征和第二特征直接接触形成的实施例，还可以包括在第一特征和第二特征之间形成附加特征使得第一特征和第二特征可以不直接接触的实施例。另外，本公开可以在各个示例中重复参考数字和/或字母标记。该重复是出于简单和清楚的目的，并且其本身并不指示所讨论的各个实施例和/或配置之间的关系。
另外，用于免疫组织化学方法以及免疫化学方法的试剂(例如酶溶液和过氧化物酶显色试剂)在工作温度或室温下的稳定性有限。稳定性有限导致需要频繁制备试剂。此外，非特异性抗体结合导致错误结果也是一个问题。
第一靶标
在一些实施例中，对照靶标102包括一个或多个第一靶标以测试第一抗体试剂。
如本文所用，术语“第一靶标”是指仅通过其FcγR1位点之一特异性结合第一抗体的反应性和非反应性组分的组合物。如本文所用，术语“第一蛋白质”是指与第一抗体的FcγRI结合的蛋白质。如本文所用，术语“第一伪蛋白质”是指不会与任何第一抗体或第二抗体反应的蛋白质。如本文所用，术语“最大靶标密度”是指相邻蛋白质的最大单层密度。如本文所用，术语“替代抗原”是指未被IHC或ICC检测中使用的第一抗体靶向的蛋白，但是尽管如此，其仅通过在IHC或ICC检测中使用的第一抗体(基于小鼠或兔的抗体)的两个FcγRI区之一与该第一抗体结合。如本文所用，术语“仅小鼠替代抗原”是指仅与基于小鼠的第一抗体的FcγRI发生独特反应的蛋白质或抗原。如本文所用，术语“仅兔替代抗原”是指仅与基于兔的第一抗体的FcγR1发生独特反应的肽或蛋白质。
胎盘哺乳动物蛋白的重量在50-65kDa之间。第一抗体IgG蛋白由两个Fab和一个Fc域组成，通常以Y形建模。Fc通过铰链连接至两个Fab结构域。通过使用拮抗剂抗原肽接种宿主，所有非结合的抗体都在宿主哺乳动物(最常见的是小鼠或兔)中生长。宿主通过在可以捕获交配抗原的抗体的Fab结构域N末端附近组装结合氨基酸序列，来生产抗体从而对抗有害的拮抗剂抗原肽。抗体的Fc结构域始终是宿主哺乳动物。宿主抗体的Fc结构域通常具有三个可用于第二抗体的结合位点，以最高亲和力至最低亲和力的顺序排列：FcγRI(CD64)，FcγRII(CD32)和FcγRIII(CD16)。
选择第一伪蛋白质对小鼠、兔、山羊、牛和绵羊无反应性，因为这些通常可以与第二抗体结合。在一些实施例中，伪第一蛋白质是马科的任何成员：马、驴、斑马、貘或犀牛。BSA(牛血清白蛋白)不是合适的伪蛋白质，因为BSA在没有加热和时间的情况下不会与组织或大多数载玻片粘合化学物质共价结合。牛、绵羊和山羊也不适合作为伪蛋白质，因为在某些情况下，根据第一抗体的特异性，这些蛋白质可能会与小鼠或兔混淆。
第一蛋白质是宿主抗小鼠或宿主抗兔。宿主仅限于山羊或马科的任何成员。
基于肽的第一蛋白质也可以由小鼠或兔FcγRI反应性肽组成，其中在C末端半胱氨酸残基与载体蛋白例如KLH亚基(钥孔血蓝蛋白)共价连接。KLH亚基在其游离胺位点被Sulfo-SMCC激活，通过缀合而与肽的半胱氨酸残基结合。单独的未激活的KLH亚基就足以制造第一伪蛋白质。
KLH作为全蛋白约为8000kDa。在全蛋白质状态下，其pH或温度不稳定，这将导致蛋白质分离成亚基：390kDa的KLH1和350kDa的KLH2。当Sulfo-SMCC激活时，这些亚基中的任何一个都可用作载体蛋白，用于带有半胱氨酸残基的肽(通常在该肽的C末端)。
参照图1，在一些实施例中，第一靶标被布置成第一靶标阵列1021至1024。在一些实施例中，第一靶标阵列102是第一靶标密度梯度阵列。在一些实施例中，阵列中的每个靶标必须具有相同的最大靶标密度(蛋白质/表面积)。但是，第一和伪第一蛋白质之间的比例是按比例增加的，以确保可以鉴定出宽范围的第一抗体稀释剂。通常，两个第一替代抗原靶标检测足以将浓度映射到检测转移曲线。在一些实施例中，第一靶标密度梯度阵列包括多个第一靶标装载点，其中一个阵列是基于小鼠的而另一个阵列是基于兔的。
在一些实施例中，第一靶标的密度以线性方式增加或减少，例如100％，80％，60％，40％等。在一些实施例中，第一靶标的密度以对数方式增加或减少，例如100％，33％，10％，3％等。
在一些实施例中，在第一靶标密度梯度阵列中，在具有最高第一靶标密度的装载点中，第一靶标密度足够高，使得第一靶标不能在染色过程中使装载点饱和。
在一些实施例中，通用替代抗原是蛋白A或蛋白G。蛋白A结合FcγRI和胎盘哺乳动物Fab结构域内的某些区域。蛋白G仅与大多数胎盘哺乳动物的FcγRI位点结合。
在一些实施例中，替代抗原必须仅对小鼠或兔具有特异性。为了支持特异性，替代抗原可以分别由抗小鼠和抗兔蛋白、载体蛋白上的抗小鼠和抗兔肽、或抗小鼠和抗兔VHH蛋白域组成。
在一些实施例中，伪替代抗原包括来自马科的动物或有蹄类的胎盘哺乳动物(除山羊外)的抗体。马科包括马、驴、貘、犀牛和骡等动物。马科在进化和遗传上相距更远，从而减少了非特异性染色的发生。不能使用山羊，因为第二染色通常在测序中使用抗山羊蛋白，该蛋白会结合任何未反应的山羊第一位点。
尽管在染色过程中使用的替代抗原和第一抗体之间的相互作用方式不同于实际抗原和第一抗体之间的相互作用方式，但是替代抗原靶标可以评估第一抗体的有效性。第一抗体用于以mg/ml为单位的浓度检测法。但是，该检测法并未表明代表完整IgG蛋白的检测法的百分比。由于靶标中替代抗原的密度浓度是已知的，因此可以确定捕获所施加的第一抗体浓度。通过外推可以确定共存组织切片的抗原密度。抗原密度在组织上的可分辨性受到第一抗体(单克隆或多克隆)、第二抗体和第二染色的酶增益的累积置换作用的限制。所施加的第一抗体的浓度取决于组织类型，并且总是有一些多余的余量。因此，假定第一抗体在其置换限制内结合所有可用的抗原位点。
在一些实施例中，第一靶标密度梯度阵列是通用替代抗原的装载点阵列。在一些实施例中，阵列中的装载点包括增加的或降低的替代抗原的密度。在一些实施例中，将替代抗原与一种或多种伪蛋白质(例如伪替代抗体)混合，并且通过改变替代抗原与伪蛋白质之间的比例同时保持最大靶标浓度来增加或降低替代抗原浓度。
在一些实施例中，对照区域102包括替代抗原靶标的至少两个阵列。在一些实施例中，对照区域140包括包括抗小鼠抗体的第一替代抗原靶标阵列和包括抗兔抗体的第二替代抗原靶标阵列，两者均与伪替代抗原混合以形成所需的反应密度，同时保持最大靶标密度。
因此，根据这些实施例，通过IHC或ICC步骤，替代抗原第一靶标可以使用第二靶标带来的酶增益和抗原修复因子来评估第一抗体浓度。
2D/3D靶标
在一些实施例中，对照靶标，例如第一靶标、第二靶标或抗原修复靶标包括2D靶标。
如本文所用，术语“2D靶标”是指肽、蛋白质、抗原、抗体或任何其他对照靶标材料沉积在载玻片上的2D平面上。
2D靶标更易于沉积，因此制造成本相对较低。因此，在考虑成本时优选2D靶标。
在一些实施例中，对照靶标，例如第一靶标、第二靶标或抗原修复靶标包括3D靶标。
如本文所用，术语“3D靶标”是指将肽、蛋白质、抗原、抗体或任何其他对照靶标材料中的至少一种施加至支撑结构，和沉积在载玻片上的3D空间中的复合物。
在一个或多个实施例中，通过在载玻片上形成3D支架并将对照靶标材料沉积在支架上来构建3D靶标。在一些实施例中，3D支架是多糖簇。多糖与肽或蛋白质表面上的羟基或胺基形成共价键，将蛋白质连接在一起并将靶标固定在载玻片涂层粘合剂上。在一些实施例中，对照靶标通过甲醛固定而被固定在3D支架上。然后，靶标由2D和3D组分组成。
在一个或多个实施例中，3D靶标是由与第一或第二靶标材料共价结合的亚微米珠粒构成的。然后使用甲醛固定来稳定第一或第二靶标材料，以抵抗正常的抗原修复过程。然后，所沉积的靶标包括2D和3D组分。
与2D靶标相比，3D靶标的行为与染色样品更为相似。IHC或ICC的染色样品(例如组织切片和细胞)具有高度。样品的高度通常为4微米至10微米。染色中靶向的抗原位点可以在组织切片的暴露表面拓扑结构上的任何位置。因此，样品中的抗原位点在该切片的底表面的顶部或者沿着组织的侧壁的任何地方可以是平坦的。因此，与2D靶标相比，样品侧壁上的抗原能够从色原中沉淀出更多的着色剂。将3D组分包括在2D组分中会创建一个阶跃偏移，可以将其应用于其他2D靶标点以形成虚拟3D阵列。发明人通过实验发现任何介于80nm至0.5μm之间的3D靶标都会像组织切片一样暗染。大于0.6μm的珠粒在透射光照射下会造成过多的光损失，即使没有发生染色，也会使珠粒看起来很暗。然而，当使用反射光照射时，没有这种问题。
另外，在染色过程中通常使用的试剂DAB在相对短的时间内老化，从而导致颜色和强度的变化。本发明人已经发现，DAB染色的3D靶标的颜色和强度变化与样品相似。
特殊染色
在一些实施例中，对照靶标包括特殊染色。
在一些实施例中，特殊染色包括阿尔新蓝(Alcian Blue)、苯胺蓝-耐光橙G溶液(Analine Blue-Orange G Solution)、偶氮卡红染色(Azan Stain)、比耳朔夫斯基银染(Bielschowsky silver stain)、布朗本-革兰氏染色(Brow&Benn-Gramm Stain)、焦油紫(Cresyl Violet)、二氨基联苯胺(DAB)、丰塔纳马松(Fontana Masson)、戈登-斯威特浸银染(Gordon and Sweet's silver staining)、戈塞特六氨银染色法(Grocett'sMethanamine silver method)、霍尔胆红素染色法(Hall's Bilirubin stain)、琼斯六胺银法(Jones Methanamine silver method)、劳克坚牢蓝(Luxol Fast Blue)、劳克坚牢蓝-焦油紫(Luxol Fast Blue-Cresyl Violet)、黏卡红(梅耶法)(Mucicarmine(Mayer'sMethod))、穆勒-莫里胶体铁(Muller-Mowry colloidal Iron)、耐光橙G(Orange G)、核固红(Nuclear Fast Red)、带淀粉酶消化的过碘酸雪夫氏(PAS with Diastase Digestion)、过碘酸雪夫氏(PAS)(Periodic Acid Schiff(PAS))、磷钨酸(Phosphotungstic Acid)、苏木素(Haematoxylin)、天狼星红(Picro Sirius Red)、酸化甲苯胺蓝(Toluidine BlueAcidified)、一步三色戈莫理氏染色(Trichrome-Gomoris One-Step)、马森三色染色(Trichrome-Masson's)、维多利亚蓝(Victoria Blue)、钙盐染色(Von Kossa)、魏格特雷琐辛品红(Weigert's Resorcin Fuchsin)、魏格特铁苏木素(Weigert's IronHaematoxylin)、萋-尼氏染色法(Zell-Neelsen Method)或其组合。
亚微米乳胶珠粒的直径尺寸范围为200nm至5μm，其表面具有暴露的胺位点。如WO2018/228576中所述，化学靶标都具有羟基端基，用于与乳胶珠粒上的胺结合。反应速度较慢，但稳定摇动可使反应在24小时内完成。
成像参考靶标
在一些实施例中，对照区域102还包括成像参考靶标。在一些实施例中，成像靶标包括一个或多个黑色靶标、一个或多个白色靶标或透明靶标。
包括染色的生物材料的显微镜载玻片的数字成像正在发展，以对染色材料进行预筛查和可能的全面诊断确定。在一些实施例中，在染色过程之后，对载玻片进行成像，在该过程中调节光的照射水平或暴露情况，以使数字图像在白色或黑色边界处均不处于压缩状态。基本假设是白色和黑色靶标代表染色信号水平可以达到的极限。然而，这样做时，数字标度上存在压缩，因为黑色比组织切片的染色黑得多，白色白得多。
在一些实施例中，有两个成像参考对照靶标位于疏水屏障外部或内部，但不在样品孔内，它们代表用于透射光和反射光成像的黑色和白色参考。
成像参考 透射光 反射光
白 透明点 黑色颜料点
黑 黑色颜料点 透明点
由于环氧树脂涂料本身就具有光泽，因此环氧树脂涂料具有较高的第一表面反射率，这是目镜对于反射光照射的白色参考。对于透射光，相同的黑点使光透射变得模糊，成为透射黑色参考。透明点用作透射光的白色参考，同时作为反射光的黑色参考。为了简化疏水屏障的制造，屏障材料是黑色环氧树脂涂料，其带有一个额外的小孔，成为如前所述的其他成像参考。
用透射光成像导致组织上抗原密度的错报。发生这种情况是因为染色组织不是所有抗原位点都在单个平面上的整体平板。而是，组织可以在其厚度内的任何地方具有抗原位点。第二染色产生着色剂颗粒，该着色剂颗粒继续沉淀，直到颗粒覆盖酶位点并阻止继续沉淀为止。如果抗原位点在组织切片的侧壁上，则该酶将永远不会被覆盖，并且沉淀将过度表达抗原的存在。对于透射光，由于沉淀的着色剂较浓，因此会出现“暗”。相反，反射光只能“看见”着色剂堆的顶面，从而可以更准确地指示抗原密度。
在一些实施例中，白色靶标具有接近纯白色的颜色。因为难以获得纯白色，所以在一些实施例中，白色靶标的颜色与纯白色相差5-10％。与纯白色相距不到5％的白色很难产生，与纯白色相距超过10％的颜色有时准确度不足以作为染色信号强度的对照。
在一些实施例中，白色靶标包括白色颜料。在一些实施例中，白色颜料是当不暴露于强光下时随时间推移稳定的金属氧化物或金属硫酸盐颜料。在一些实施例中，白色颜料包括氧化铝、氧化钛或硫酸钡。在一些实施例中，金属氧化物或金属硫酸盐为珠粒形式。
在一些实施例中，黑色靶标包括黑色颜料。在一些实施例中，黑色颜料包括碳基颜料。在一些实施例中，黑色颜料包括碳尘。在一些实施例中，碳尘的直径小于2微米。
在一些实施例中，成像参考靶标制剂不含表面活性剂，从而防止油墨/涂料对这些载玻片可经历的染色和试剂具有反应性。
在一些实施例中，成像参考靶标通过压印章被印刷在载玻片上。在其他实施例中，由于注射器能够控制靶标沉积的大小，因此成像参考靶由注射器印刷。
由于所有数字化范围都在载玻片定义的黑/白内(与使用纯黑/白参考相比)，使用成像参考靶标，使数字分析得到了优化。数字分析有助于对对照靶标的颜色进行插值，以便更精确地确定染色样品中存在的抗原的量。使用图像参考靶标是为了协助数字分析的校准，以便提供用于测量对照靶标上的反应量的参考点。
沉积对照靶标的方法
在一些实施例中，本说明书针对将对照靶标沉积在过程记录载玻片上的方法。在一些实施例中，载玻片和对照靶标与如上所述的那些相同或相似。
在一些实施例中，沉积对照靶标的方法包括：将第一对照靶标或第二对照靶标沉积在载玻片上。
在一些实施例中，沉积第一对照靶标或第二对照靶标包括：制备预定浓度的对照靶标溶液；固定对照靶标；并将溶液印刷到载玻片上。
在一些实施例中，制备对照靶标的溶液包括：制备包括对照靶标和多糖的溶液，以用作蛋白质和载玻片粘合剂之间的接头。
在一些实施例中，固定对照靶标包括：用甲醛固定对照靶标。甲醛使对照靶标交联，从而使对照靶标可以进行正常的抗原修复方案。
在一些实施例中，对照靶标是交联的。在组织内，蛋白质与组织的其他部分结合，这些其他部分往往会阻止蛋白质扩散和变性。由于溶液中的对照靶标包括疏松的蛋白质，因此对照靶标对热和pH值更加敏感，因此易于在载玻片上发生扩散和变性，尤其是在IHC或ICC中进行AR处理时。
真菌生长抑制剂可以是硫柳汞或吡啶-2-亚磺酸钠盐(Krovin 500)的绿色替代品。
在一些实施例中，第一靶标如下制备：
形成一组1ml的第一蛋白主稀释液，浓度为45μg/ml。根据需要用dH2O稀释驴抗小鼠，驴抗兔和驴IgG(H&L)蛋白，以达到45μg/ml的浓度。通常，购买时这些蛋白质的浓度在1至10mg/ml之间。加入10μl真菌生长抑制剂。真菌生长抑制剂可以是硫柳汞或吡啶-2-亚磺酸钠盐(Krovin 500)的绿色替代品。
在40-60℃下，用10μl 0.2％甲醛将每个主稀释液固定1-4小时。
加入30μl浓度为0.45％的直链淀粉作为线性聚合物(包括真菌生长抑制剂)并混合30分钟。
加入20μl 0.1M碳酸氢铵以淬灭任何未反应的甲醛。
使用主蛋白溶液形成“小鼠与驴”和“兔与驴”的靶标混合物，其中每个靶标都包括700μl的主蛋白溶液。
在一些实施例中，第二靶标如下制备：
形成一组1ml的第二蛋白主稀释液，浓度为45μg/ml。根据需要用dH2O稀释小鼠、兔和驴IgG(H&L)蛋白，以达到45μg/ml的浓度。通常，购买时这些蛋白质的浓度在10至60mg/ml之间。加入10μl真菌生长抑制剂。
在40-50℃下，用10μl 0.2％甲醛将每个主稀释液固定1-4小时。
加入30μl浓度为0.45％的直链淀粉作为线性聚合物(具有真菌生长抑制剂)并混合30分钟。
加入20μl 0.1M碳酸氢铵以淬灭任何未反应的甲醛。
使用主蛋白溶液形成“小鼠与驴”和“兔与驴”的靶标混合物，其中每个靶标都包括700μl的主蛋白溶液。
在一些实施例中，根据以下步骤，以一个印刷周期将准备好的第一靶标或第二靶标或成像参考靶标印刷到载玻片上：
将靶标溶液印刷到涂有粘合剂的显微镜上；
在60℃空气中干燥，直到所有水蒸发掉，然后冷却；
通过喷雾将石蜡-溶剂混合物喷涂在已印刷的靶标阵列上；
回流石蜡以完成靶标阵列的密封并排出溶剂。因此，使石蜡恢复其硬化状态和固态。
实施例
以下实施例旨在说明而非限制本公开。尽管以下实施例是可以使用的典型示例的类型，但是可以替代地使用本领域技术人员已知的其他程序。
实施例中使用的材料可通过商业购买获得。
实施例1.集成过程质量控制的P16INK4a和Ki-67样品载玻片
目前有支持P16INK4a和Ki-67染色的多孔测试载玻片，但这些多孔测试载玻片缺乏任何对照，因此染色结果假定AR处理是按照协议进行的并且第一抗体试剂是一致的，它们在载玻片之间或抗体的批次代码之间具有一致功效的功能。
图4示出了10孔的示例，其中每个孔包含四个对照靶标。对于每个第一抗体，四个对照靶标被分成对，一个用于小鼠宿主，另一个用于兔宿主。该靶标对由100％2D/3D靶标和50％2D/3D靶标组成。靶标的作用是验证第一抗体是否已施加，并且它们的浓度足以正确地对孔内包含匹配抗原位点的细胞进行染色。
此外，有两个成像参考对照靶标位于疏水屏障外部或内部，但不在样品孔内，它们代表用于透射光和反射光成像的黑色和白色参考。
成像参考 透射光 反射光
白 透明点 黑色颜料点
黑 黑色颜料点 透明点
由于环氧树脂涂料本身就具有光泽，因此环氧树脂涂料具有较高的第一表面反射率，这是目镜对于反射光照射的白色参考。对于透射光，相同的黑点使光透射变得模糊，成为透射黑色参考。透明点用作透射光的白色参考，同时作为反射光的黑色参考。为了简化疏水屏障的制造，屏障材料是黑色环氧树脂涂料，其带有一个额外的小孔，成为如前所述的其他成像参考。
靶标位于患者样品区域周围，实验室试图尽量减少所用试剂的数量，并且通常没有使用足够的方法来正确处理样品。通过在四个角设置靶标，确认在整个处理过程中已施用足够的染色材料，使得更加容易覆盖患者样品。
实施例2.集成过程质量控制的传统手工巴氏涂片载玻片
在世界各地常规制作手工巴氏涂片载玻片。没有对患者样品进行预处理，因此涂片包括粘液和其他细胞碎片。如同一发明人在WO2018/228576中详述的(其通过引用并入本文)，结合已知行为化学靶标以捕获染色试剂的性能是可能的。为此，在制造载玻片时，将对涂有粘合剂的空白载玻片施加额外的PQC靶标。PQC靶标可以进行数字成像，结果可用于指导染色试剂的使用寿命。
实施例3.集成过程质量控制的ThinPrep巴氏涂片载玻片
主要的自动化宫颈涂片处理系统是ThinPrep。自动化系统从小瓶中取出部分患者样品，以过滤掉粘液，并在一定程度上过滤掉任何红细胞或其他碎片。清洁后的样品通过接触印刷方法沉积在涂有粘合剂的载玻片上。载玻片有四个基准点，大致位于样品存放区域之外的矩形的四个角处。当对染色结果进行数字成像时，基准标记的独特形状可识别载玻片的来源，由Cytyc样品制备系统执行样品处理。ThinPrep技术中缺少的元素是验证染色试剂和处理是否根据需要执行的载玻片上的PQC。PQC向成像系统提供处理缺陷和试剂降解的信息，否则这些信息是不可用的。标准巴氏染色试剂(5次染色3步序列)包括三种具有已知漂移和降解行为的试剂：苏木精、伊红和磷钨酸。结合已知行为化学靶标来捕捉染色试剂的性能是可能的。为此，在制造ThinPrep载玻片时，将施加额外的PQC靶标。成像系统现在具有必要的PQC信息，以提供染色试剂性能的反馈，并建立基础，通过该基础可以改变染色颜色以呈现标准化视图而不会影响诊断决策标准。
上面概述了几个实施例的特征，使得本领域技术人员可以更好地理解本公开的各方面。本领域技术人员应该理解，他们可以容易地将本公开用作设计或修改其他工艺和结构的基础，以实现与本文介绍的实施例相同的目的和/或实现相同的优点。本领域技术人员还应该认识到，这样的等同构造不脱离本公开的精神和范围，并且在不背离本公开的精神和范围的情况下，它们可以进行各种改变、替换和变更。

Claims (20)

1.载玻片，包括：
检测区域，其被配置为容纳包含疏松细胞的样品，其中所述检测区域包括至少一个区域，以及
对照区域，其围绕所述至少一个区域，其中所述对照区域包括至少一个对照靶标，且所述对照区域被配置为：
指示免疫组化或细胞化学检测过程中的中间步骤的误差和性能度量，并且为分别定性或定量确定染色疏松细胞的抗原密度和颜色密度或染色细胞表面和内部的颜色密度提供参考。
2.根据权利要求1所述的载玻片，其中所述检测区域的所述至少一个区域由疏水屏障界定以形成孔。
3.根据权利要求1所述的载玻片，还包括构造成与部分结合的粘合剂涂层，其中所述粘合剂涂层包含至少一种选自以下组的端基：-ROH、-R(C＝O)OH、-RNH2、-R(C＝O)NH2和-RNH3。
4.根据权利要求2所述的载玻片，其中所述检测区域的孔为圆形、正方形或长方形。
5.根据权利要求2所述的载玻片，其中所述对照区域在所述检测区域的所述至少一个区域的角落处。
6.根据权利要求2所述的载玻片，其中所述对照区域在所述检测区域的所述孔内。
7.根据权利要求1所述的载玻片，其中所述对照区域在所述检测区域的区域之外。
8.根据权利要求1所述的载玻片，其中所述对照区域包括至少一个对照点或对照条。
9.根据权利要求1所述的载玻片，其中所述对照区域由部分疏水屏障或完全疏水屏障界定。
10.根据权利要求1所述的载玻片，其中所述检测区域的所述至少一个孔包含所述样品。
11.根据权利要求1所述的载玻片，还包括疏水材料涂层，其中所述疏水材料是环氧树脂或聚氨酯。
12.根据权利要求1所述的载玻片，其中所述至少一个对照靶标包括第一靶标、第一抗体、第二靶标、第二抗体、成像参考、2D成像参考靶标、3D成像参考靶标或靶标阵列。
13.根据权利要求1所述的载玻片，其中所述至少一个对照靶标被配置为捕获小鼠、兔或小鼠+兔宿主的第一抗体；小鼠、兔或小鼠+兔第二抗体；或苏木精和伊红染色剂。
14.根据权利要求13所述的载玻片，其中所述第一抗体在FcγRI位点被蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或附着于载体蛋白或活化珠的FcγRI结合肽捕获。
15.根据权利要求13所述的载玻片，其中所述苏木精和伊红被附着于活化珠的化学靶标捕获。
16.根据权利要求13所述的载玻片，其中所述第一抗体对包含两种不同的浓度，其中第一浓度为100％，第二浓度为30-70％。
17.使用根据权利要求1所述的载玻片检测细胞的方法，所述方法包括：
将包含疏松细胞的样品置于所述检测区域，将所述至少一个对照靶标置于所述对照区域，对所述疏松细胞和所述至少一个对照靶标进行染色，其中染色过程包括：
将至少一个第一靶标施加到所述载玻片的所述对照区域，将至少一个与该部分缀合的第一靶标施加到所述载玻片的对照区域，或将至少一个与一个部分缀合的第二靶标施加到所述载玻片的对照区域，和
将产生颜色的染色试剂施加到所述检测区域和所述对照区域，评估染色过程的质量，其中评估过程包括评估所述疏松细胞和所述对照靶标的染色结果，以及定性确定所述疏松细胞的状态。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述至少一个对照靶标被配置为捕获小鼠、兔或小鼠+兔宿主的第一抗体；小鼠、兔或小鼠+兔第二抗体；或苏木精和伊红染色剂。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述第一抗体在FcγRI位点被蛋白A、蛋白G、蛋白A/G或附着于载体蛋白或活化珠的FcγRI结合肽捕获。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述苏木精和伊红被附着于活化珠的化学靶标捕获。
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