CN1155907A - 瓜尔豆的转化 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种瓜尔豆属豆科植物的转化和再生的方法，特别是土壤杆菌介导的瓜尔豆的转化，转化是通过下述方法完成的：将一段重组DNA序列引入至少一个细胞或原生质体，利用至少一种选择培养基或生芽培养基，培养基中包含至少一种选自生长素抑制物(例如2-对氯苯氧基)-2-甲基丙酸(PCIB))、β-内酰胺酶抑制物(如舒巴坦)和乙烯抑制物(如硫代硫酸银)的化合物，产生遗传修饰的外植体，以得到一种在其基因组中包含至少一段重组DNA序列的遗传修饰的植物或其一部分；涉及用该方法产生的遗传修饰的植物；涉及例如β-内酰胺酶抑制物舒巴坦的物质协助瓜尔豆或其它植物转化的应用。

Description

瓜尔豆的转化

发明领域

本发明涉及一种瓜尔豆属豆科植物的转化、再生和选择的方法。具体地说，涉及土壤杆菌介导的瓜尔豆(Cyamopsis tetragonoloba)的转化，涉及用该方法产生的遗传修饰的植物，还涉及例如β-内酰胺酶抑制物舒巴坦(sulbactam)的物质协助瓜尔豆和其它植物转化的应用。

发明背景豆科植物的转化蝶形花科(豆科)是世界上最重要的双子叶植物科。由于其巨大的经济价值，人们已投入巨大的力量用遗传工程改善其农业性状。

土壤杆菌介导的转化是一种常用的将基因转移到植物中的方法。迄今已用土壤杆菌成功转化的植物物种无一例外的是双子叶植物(与单子叶植物相反)，不过不是所有的双子叶植物都容易转化。

一些植物科，例如茄科，已经证明特别适合于土壤杆菌介导的基因转移，而其它科，例如蝶形花科，则因其极难被转化而闻名。

已用多种途径尝试生产转基因大豆(Glycine max)。叶子和原生质体被用做外植体来源，但这样做未能再生出转化植物。用根癌土壤杆菌注射大豆子叶得到转基因植物，但是在许多试验过的基因型中仅有一种用这种方法成功地转化，(Hinchee等，生物/技术6：915，1988)。WO 94/02620描述了一种方法，用胚轴或子叶节及一系列为大豆转化专门设计的步骤，包括特定温度、pH值和土壤杆菌浓度生产转基因大豆。

可是，用子叶做外植体并不普遍适用于豆科植物的转化。在大多数情况下外植体采用其它来源。例如，对豌豆(Pisum sativum)转化，采用来自芽培养物和发芽的上胚轴的外植体作外植体，这样得到的转基因愈伤组织6个月后再生出植物(Pounti-Kaerlas等，植物细胞报导，8：321，1989)。

对白色三叶草(Trifolium repens)转化，用土壤杆菌注射苗尖得到转基因植物(Voisey等，植物细胞报导，13：309，1994)。

曾经尝试过转化其它一些豆科植物。例如，用根癌土壤杆菌注射菜豆(Phaseolus vulgaris)的子叶节和胚轴得到转基因的愈伤组织，但没有得到转基因植物(McClean等，植物细胞、组织和器官培养，24：131，1991)。豇豆属也一样(Garcia等，植物科学48：49，1986)。尽管有相当多的努力，尚未见报导花生(Arachis hypogaea)的转基因植物。

  本发明人试图用Hinchee等描述的大豆子叶操作流程转化瓜尔豆，但未获成功。加上其它研究者报导的结果，这表明豆科植物转化方法的选择是实证性的，不能得到有科学基础的一般原则。因此，要根据所研究的属、种，甚至是基因型的具体要求来研制转化一种豆科植物的转化操作流程和外植体来源。

大量的见于报导的有关获得各种不同豆科植物的转基因植物的尝试清楚地表明，豆科植物的转化非常困难，甚至对本领域的专业人员也是如此。在约100种有经济价值的豆科植物物种中，只有不到5种已被转化，这个事实也进一步说明了这一点。因此，一种先前没有转化的豆科植物属或种的成功转化决非例行操作。瓜尔豆瓜尔豆(Cyamopsis tetragonoloba)是一种由于其种子中高含量的半乳甘露聚糖(galactomannan)而具有很高经济价值的豆科植物。瓜尔豆半乳甘露聚糖又叫瓜尔豆胶，作为粘性增强剂用于食品或非食品用途。

半乳甘露聚糖存在于胚乳中，胚乳占种子干重的约35％，其中80-90％是纯的半乳甘露聚糖。大胚乳在蝶形花科中是一种不寻常的特征，通常蝶形花科中种子的胚乳部分几乎没有或仅存遗迹，而豆科植物的供萌芽的营养储备大多贮于增大的子叶中。

具有含半乳甘露聚糖的大子叶的豆科植物物种还无一例见于报导说已经被遗传转化。舒巴坦

土壤杆菌介导的基因转移的一个内在缺陷是细菌在转化后继续生长。为了防止植物材料的过度生长，必须有效地消灭细菌，通常是加入青霉素类的抗生素(β-内酰胺)如羧苄青霉素、头孢噻肟等。

选用青霉素类物质是因为它们原则上对植物组织无毒。然而在实践中，这些化合物经常对外植体表现相当的毒性。这种植物毒性除去直接毒性效应之外的一个可能原因是，抗生素在细菌和植物组织同时存在的情况下在长的温育时间内逐渐降解。不合需要的降解产物的一个例子是来自十分常用的抗生素羧苄青霉素，它被降解成苯乙酸。苯乙酸有类似生长素的性质，故引起外植体上愈伤组织生长加强，因而有损于再生。

因此，最好能够小剂量地使用抗生素和/或使用没有这种不良副效应的抗生素。在转化瓜尔豆的工作过程中，发明者发现了β-内酰胺酶抑制物舒巴坦大幅度降低了青霉素类物质的必需浓度，因而极大地提高了转化效率和降低了成本。

由于这种新方法涉及的是常常必须从转化过程中清除的细菌，因而该方法控制土壤杆菌生长可普遍应用于植物的转化，而不限于某种特定的植物物种。

发明简述

一方面，本发明涉及一种瓜尔豆属的遗传修饰植物或其一部分，所述植物或植物部分在基因组中包含至少一段重组DNA序列。

本发明另一方面涉及一种生产瓜尔豆属的遗传修饰植物或其一部分的方法，其包括下列步骤：将一段重组DNA序列引入至少一个细胞或原生质体，用至少一种选择培养基或生芽培养基，这种培养基至少包含一种选自生长素抑制物，β-内酰胺酶抑制物和乙烯抑制物的化合物，来生成遗传修饰的外植体，以此得到一种在其基因组中包含至少一段重组DNA序列的遗传修饰植物或其一部分。

本发明另一方面涉及一种生产遗传修饰植物的方法，其中至少一种用于细胞、原生质体、愈伤组织或植物部分的选择和生长的培养基包含至少一种物质，它抑制细菌生长或者增强细菌生长抑制物的效应而没有任何显著的植物生长调节效应或植物毒性效应。

另一方面，本发明涉及一种嵌合植物，它能够生产转基因种子并通过将体外培养的遗传修饰芽嫁接到非体外培养的植物上而获得。发明详述

在本应用中，术语“遗传修饰植物”和“转基因植物”指的是本领域中通常所理解的意义，即经改变后其基因组包含至少一段重组DNA序列的植物。“重组DNA序列”典型地是能够在植物中表达或影响基因表达的序列，但也可以是，例如，一段可用作标记的序列，它并不一定表达或影响基因表达。表达的或影响基因表达的序列通常对天然形式的所研究植物来说是外来基因，但也可能是例如天然基因稍加改变的形式或例如一段启动子或调节子序列，它可以导致天然基因表达发生改变。此处公开的生产遗传修饰植物的方法的目的在于一般意义的遗传转化，而不限于任何特定种类的DNA序列的引入。

术语“植物部分”一般指任何植物部分，例如组织或器官，而非完整植物，包括未分化的愈伤组织和分化的植物部分如枝、叶、根、果实、种子等。

如上所述，本发明特别涉及瓜尔豆属的遗传修饰植物，具体地说，是指植物物种瓜尔豆。遗传修饰的瓜尔豆植物可以由上述方法产生，其中第一步是将一段重组DNA序列引入至少一个细胞或原生质体，重组DNA的引入可以用生产遗传修饰的植物常用的方法来完成，包括土壤杆菌介导的转移，例如用根癌土壤杆菌Ti质粒或发根病土壤杆菌Ri质粒作载体，也可以用例如微注射、电穿孔或粒子轰击。优选的方法(在下面的实施例中描述)是土壤杆菌介导的基因转移。如下所述，用根癌土壤杆菌转化子叶得到良好结果，尽管所用子叶来自萌发了相当长的时间，例如11～12天的种子。

将所需重组DNA引入选定的植物材料(例如组织、细胞或原生质体)后，用至少一种选择培养基或生芽培养基，培养基中包含至少一种选自生长素抑制物、β-内酰胺酶抑制物和乙烯抑制物的化合物，来生成遗传修饰的外植体。因为已发现这些化合物的一种或几种在选择培养基和/或生芽培养基中会使愈伤组织减小而再生和转化的芽的频率增大。优选地，选择培养基包含至少一种生长素抑制物和一种β-内酰胺酶抑制物，生芽培养基包含至少一种β-内酰胺酶抑制物。更优选地，选择培养基包含一种生长素抑制物，一种β-内酰胺酶抑制物和一种乙烯抑制物，生芽培养基包含一种生长素抑制物和一种乙烯抑制物。

抑制物(生长素抑制物，β-内酰胺酶抑制物，乙烯抑制物)可以通过消除或降低相应化合物的量(即通过抑制这些化合物的生物合成或通过降解这些化合物)或者通过抑制这些化合物的作用而发挥作用。尽管不希望受到任何特定理论的束缚，我们认为这些抑制物的效应至少在一部分上涉及抗生素效应或抑制“类生长素”效应，因为生长素存在会导致愈伤组织生长增强，因而使芽再生和转化芽分离的频率降低。那些直接作为生长素抑制物而起作用的化合物显然如此。对于β-内酰胺酶抑制物，上面用例子解释了舒巴坦的一种可能效应是消除降解产物苯乙酸(来自抗生素羧苄青霉素)，苯乙酸具有不需要的类生长素性质，导致愈伤组织生长增强。类似地，乙烯抑制物，除了它对乙烯的直接作用，从而可能阻止发育的芽过早衰老之外，据信也因为乙烯与生长素反应有关而具有有益的作用。应用生长素抑制物和乙烯抑制物无论采用任何类型的基因转移都是有利的，例如细菌介导的转移，如土壤杆菌介导的转移，以及其它方法如微注射。电穿孔和微粒轰击，而应用β-内酰胺酶抑制物特别适合于用土壤杆菌或其它生产β-内酰胺酶的细菌株进行基因转化的操作流程。

优选的生长素抑制物是2-对氯苯氧基-2-甲基丙酸(PCIB)，可用于选择培养基，可选地用于生芽培养基，浓度约0.01～10mg/l，典型地约0.05-5mg/l例如0.1-2mg/l。其它可用的生长素抑制物是例如2，3，5-三碘苯甲酸(TIBA)、N-萘基邻氨甲酰苯甲酸(NPA)、整形素、2，4，6-三氯苯氧基乙酸和7-氯吲哚乙酸。

优选的β-内酰胺酶抑制物是舒巴坦(可得自Pfizer，商品名Betamaze)，舒巴坦可用于选择培养基或生芽培养基，浓度约10-100mg/l，典型地约20-500mg/l，例如约50-200mg/l。

优选的乙烯抑制物是硫代硫酸银，典型地用于选择培养基或生芽培养基，浓度最高为50μM，典型地约0.1-10μM，例如约0.5-5μM。其它可用的乙烯抑制物有例如氨基乙氧基乙烯基甘氨酸(AVG)，钴和降冰片。

除上述化合物外，发现某些其它化合物用于选择培养基和/或生芽培养基时也有良好效果。例如，发现将镍盐加入选择培养基后转化频率得到提高。因此，选择培养基优选地含有镍盐，如NiCl₂·6H₂O，例如浓度为约0.1-10mg/l，如0.5-5mg/l。发现苯基腺嘌呤(BAP)也导致较好结果。因此选择培养基优选地含有BAP，例如浓度约0.1-10mg/l，诸如1-5mg/l。BAP也可用于生芽培养基，浓度类似。

当插入DNA序列包含一个卡那霉素抗性基因时，则卡那霉素，例如以卡那霉素硫酸盐形式，浓度约50-300mg/l，典型地约100-200mg/l，例如约130-160mg/l存在于选择培养基中也表明出良好效果。也发现当外植体(典型地是从中收获芽的外植体)转移到第二选择培养基时，该培养基中的卡那霉素浓度比第一选择培养基要低，优选地不超过125mg/l，典型地20-100mg/l，例如30-70mg/l，此时也得到良好的结果。相似地，其它氨基糖苷抗生素诸如湿霉素、新霉素、链霉素和庆大霉素也可以与含有相关抗生素抗性基因的插入DNA序列一起用于选择培养基。其它选择试剂，例如除草剂或正选择试剂诸如甘露糖或木糖也可采用。

再生芽经选择与收获，可用多种方法确定遗传转化芽的存在。其中之一(除上述应用抗生素及插入抗生素抗性基因外)是应用报告基因β-葡糖苷酸酶，其应用见下述及WO 93/05l63。

得到的转基因瓜尔豆芽再利用已知方法再生成整个植株，即用芽直接生根或将转基因芽嫁接到移植生长的已生根植株。后一种方法将转基因芽嫁接到移植生长的植株(它们本身是转基因的或者不是)的茎上，是很适用的，能得到生产转基因种子的嵌合植株。进一步发现，将转基因芽嫁接到幼苗上，例如7-28天的幼苗，典型地为12-21天的幼苗上，将得到特别好的结果。

如上所述，本发明的另一方面涉及一种生产遗传修饰植物的方法，其中用于选择或生长细胞、原生质体、愈伤组织或植物部分的至少一种培养基包含至少一种物质，该物质能抑制细菌生长或者增强细菌生长抑制物的效应而没有任何显著的植物生长调节效应或植物毒性效应，例如β-内酰胺酶抑制物。这一方面涉及到这一事实，即应用例如β-内酰胺酶抑制物诸如舒巴坦的优势效应不仅限于瓜尔豆的转化和选择，而且普遍适用于任何植物中土壤杆菌介导的基因转化(或者是在其它生产β-内酰胺酶的细菌菌株存在下)，其目的在于消除转化后所不需要的细菌生长。该方法显著的实用性和经济效益在于，选择培养基和生芽培养基中青霉素类抗生素的用量大大降低，例如降至没有β-内酰胺酶抑制物时必需量的10％的水平。β-内酰胺酶抑制物是舒巴坦时，其用量在上面给出。

本发明进一步由下面的非限制性的实施例说明。实施例瓜尔豆转化的一般操作流程幼苗

瓜尔豆种子在亚氯酸钠溶液中消毒，溶液含有2.5％自由氯，pH7.0，每100ml溶液加2滴Tween 80。种子(约10g每100ml)被搅拌25分钟，用无菌水洗5次，在滤纸上过夜干燥。

然后将种子播种到萌发培养基上，置于暗处25℃4天。然后以12小时/72小时日/夜规律继续萌发7天。用富含营养的萌发培养基得到高质量的瓜尔豆幼苗。萌发培养基：4.43g/l MSMO(Sigma M 6899)20g/l   蔗糖8.0g/l  琼脂pH 5.8  (用KOH调)根癌土壤杆菌悬液

LB-培养基中过夜培养(温育17～18小时)以制备土壤杆菌悬液，细菌培养物中不加乙酰丁香酮。LB培养基：10g/l   细菌培养用胰蛋白胨10g/l   NaCl5.0g/l  酵母提取物pH7.4   (用NaOH调)转化和共培养

大多数情况下细菌悬液用LB培养基稀释剂OD 0.1(660nm)，不过OD约为1时也得到好的结果。

从12天的幼苗上切下带约2mm长的下胚轴的子叶。用镊子将子叶弄碎得到伤口表面，置于土壤杆菌悬浮液30分钟。

共培养的优选操作流程是所谓三明治法，即将外植体置于滤纸上，滤纸再置于共培养培养基上。用液体共培养培养基浸透的滤纸盖在外植体上以防外植体干燥。共培养培养基：0.43g/l MS基本盐混合物(Sigma M5524)20g/l    蔗糖100mg/l  肌肉肌醇0.1mg/l  硫胺素HCl0.5mg/l  吡咯醇HCl0.5mg/l  烟酸1.0μM   硫代硫酸银8.0g/l   琼脂pH5.1

共培养以12小时/12小时日/夜规律25℃进行3天。共培养后，外植体用加了100mg/l羧苄青霉素、100mg/l头孢噻肟和1000mg/l溶菌酶的1/10MS-培养基冲洗2-3次，共45分钟，同时以100rpm搅拌。选择

外植体转移到选择培养基中，如上(25℃，12小时日/12小时夜)温育。选择培养基：3.2g/l    Gamborg B5(Sigma G5893)20g/l     蔗糖1.0mg/l   苄氨基嘌呤0.05mg/l  赤霉酸(GA3)1.0μM    硫代硫酸银1.0mg/l   NiCl₂·6H₂O0.5mg/l   2-对氯苯氧基-2-甲基丙酸(PCIB)50mg/l    头孢噻肟50mg/l    羧苄青霉素100mg/l   舒巴坦(Betamaze)145mg/l   卡那霉素硫酸盐  pH5.7转基因芽的收获初次收获：

4星期后，收获大于3mm的芽，转移到芽培养基上。10-14天后检查芽的指示基因β葡糖苷酸酶(GUS)活性，见下述。GUS-阳性的芽转移到新鲜芽培养基上，而将GUS-阴性的芽弃去。芽培养基：3.2g/l   Gamborg B5(Sigma G5893)20g/l    蔗糖0.1mg/l  苄基氨基嘌呤1.0μM   硫代硫酸银0.1mg/l  赤霉酸(GA3)100mg/l  头孢噻肟100mg/l  舒巴坦(Betamaze)8.0g/l    琼脂   pH5.7二次收获

初次收获后，外植体(从中收获了芽)转到卡那霉素浓度较低(50mg/l)的第二选择培养基中。再过4个星期，收获芽，做GUS检测，阳性芽转移到新鲜培养基上，将阴性芽弃去。转基因芽的分析

切下幼叶叶尖，转移到含有200μl X-Gluc溶液的多孔培养皿(multidish well)中。35℃温育16小时后，叶尖用96％乙醇脱色，显微镜下确定显蓝色染色程度。X-gluc溶液(50ml)：0.2M Na₂HPO₄                       15.5ml0.2M NaH₂PO₄                        9.5mlH₂O                                 19.5ml0.1M K₃(Fe(CN)₆)                   0.25ml0.1M K₄(Fe(CN)₆)·3H₂O            0.25ml0.1M Na₂-EDTA                        5.0mlX-gluc(环己基铵5-溴-4-氯-3-吲哚基      50mg-β-D-葡糖醛酸)嫁接

转基因芽的生根通过嫁接来实现。长0.5-1.0cm，选出表现健康的绿色的芽嫁接到以32℃/25℃ 14小时/10小时日/夜规律生长的1.5-2月大的瓜尔豆植株上。嫁接前，除去最上面的两片叶子外所有的叶子都被除掉，在茎上节的部位几乎垂直的切口处嫁接转基因芽。嫁接的植株移至湿度培养箱5-6天。转基因植物

转基因植物然后移到生长培养箱中，让转基团芽进一步生长。生长条件如上。约2个月后收获含有大量转基团种子的成熟荚果。实施例1不同品种瓜尔豆的转化

本实施例给出利用上述方法对几个瓜尔豆品种的转化。

瓜尔豆品种	GUS+芽数
		Lewis	8
Santa Cruz	3
		Indian	6

GUS+(GUS阳性，即转化的)芽数目按每1000个用nopaline土壤杆菌菌株C58转化的外植体计算得来。美国品种Lewis给出最高数目的含有GUS基因带成功转化的标记的转基因芽，该品种用于下面的实施例中。实施例2土壤杆菌

检验了一些去除有害作用的根癌土壤杆菌菌株对瓜尔豆的转化，发现它们都适用。例如，对四种不同菌株(冠瘿碱菌株LBA 4404，Ditta等，美国国家科学院院刊77：7347，1980和来自C58的三种菌株)每种菌株处理500个瓜尔豆外植体。每种菌株均产生11-26个再生芽，其中1-3个是GUS阳性芽。相似地，另一土壤杆菌菌株(L，L-succinamopine菌株EHA101)，用来处理2500个外植体，得到25个再生芽，其中8个GUS阳性。LBA4404也用来处理2500个外植体，得到67个再生芽，其中17个GUS阳性。

所用的根癌土壤杆菌菌株在T-DNA区含有编码β-葡糖苷酸酶(用于GUS检测)和新霉素磷酸转移酶(用于含卡那霉素培养基上的选择)的基因。实施例3卡那霉素选择

本实施例中，选择培养基中卡那霉素硫酸盐最适浓度为145mg/l，不过用125-145mg/l范围内浓度也得到有效的转化。用100mg/l或更低浓度的卡那霉素得到接近100％的转化频率，尽管只得到少数几个转基因芽。

卡那霉素硫酸盐浓度(mg/l)	再生芽数	GUS+芽数
			125	21	3
135	19	5
			145	15	8

每种处理中用土壤杆菌菌株EHA101转化总共1600个外植体。二次收获，其中卡那霉素浓度降低，得到约50％的转基因芽。若卡那霉素浓度保持在125-145mg/l，二次收获仅得到几个转基因芽。实施例4BAP和NiCl₂

本实施例显示了在选择培养基中加入苄基腺嘌呤(BAP)和NiCl₂的良好效果。

BAP(mg/l)	NiCl2-6H2O(mg/l)	GUS+芽数
			1.0	0	1
1.0	1.0	4
			5.0	0	2
5.0	1.0	4

每种处理中，用土壤杆菌菌株EHA101转化总共1200个外植体。加入5mg/l BAP既增加了转化体数目又增加了再生芽的总数。再生芽总数在5mg/l BAP时为1mg/l BAP时的约两倍。

加入1mg/l NiCl₂·6H₂O，转化频率高2-4倍，可能是由于所用的MS和Gamborg B5培养基缺镍。实施例5硫代硫酸银

本实施例显示硫代硫酸银(STS)大大提高了转化频率。

STS浓度(μM)	GUS+芽数
		0	4
2.5	12
		5.0	8
10.0	7

GUS+芽数目按每1000个用EHA101转化的外植体计算。硫代硫酸银浓度为2.5μM时得到的转化体比0、5.0或10.0μM硫代硫酸根时多得多。

STS导致的转化频率提高是由于芽质量极大提高。缺乏STS，转基因芽矮小呈病黄色，而STS的存在维持了芽的生长。由于已知银离子抑制乙烯的作用，STS的良好效果可能是由于容器中乙烯效用的降低，从而防止过早衰老。实施例6PCIB

PCIB(2-对-氯苯氧基-2-甲基丙酸)有抗生长素效果，能抑制愈伤组织形成。缺少PCIB时，选择操作流程中形成大量愈伤组织，有损于再生。

加0.1-2mg/l PCIB大大降低了愈伤组织的量，增加了再生和转基因芽的数目。实施例7舒巴坦

本实施例显示β-内酰胺酶抑制物舒巴坦极大降低了选择所需的羧苄青霉素和头孢噻肟的量并增大转化频率。

羧苄青霉素(mg/l)	头孢噻肟(mg/l)	舒巴坦(mg/l)	GUS+芽数
				800	0	0	2
100	100	100	5
				50	50	100	9

每种处理中用EHA101转化总共800个外植体。所有3种处理均消除土壤杆菌。

用800mg/l羧苄青霉素时转基因生芽状况差，呈病黄色。转移到芽培养基上后也不能恢复，许多转基因芽最后死亡。

在50或100mg/l羧苄青霉素及200mg/l舒巴坦上选择的转基团芽长势良好，呈正常绿色，在体外(in vitro)可保持相当长时间。实施例8苯基噻二唑基脲(Thidiazuron)

加入细胞激动素苯基噻二唑基脲(TDZ)极大地增加转化频率。如下表显示，选择培养基中最适TDZ浓度在0.3-30mg/l范围内。转化频率增至1.5-1.8倍。

苯基噻二唑基脲(mg/l)	外植体数	GUS+芽数	转化频率(％)
				0	5076	34	0.67
0.3	742	8	1.08
				1.0	741	9	1.21
3.0	1522	16	1.05
				4.5	797	5	0.63

除了增大转化频率，苯基噻二唑基脲也有利于后续的转基因芽的克隆。实施例9嫁接

转基因芽的生根通过嫁接来实现。尽管如上述，嫁接到发育成熟的植株(1.5-2月大)上是可以的，嫁接到12-21天大的幼苗上成功率更高。

将消毒的瓜尔豆种子置于萌发培养基上(见上)，然后按13小时/11小时日/夜规律25℃培养12-21天，得到幼苗。剪下子叶，胚轴竖直下切0.5-1cm深。转基因芽置于切口上，用一小段消毒绳缚紧。5-10天后去掉绳子，嫁接的小植株移至土壤中。

在嫁接到这样的幼苗上的49个转基因芽中，有42个存活(89％)并得到具有正常表现型的可育植株。实施例10Southern印迹分析

为了确证转基因的存在和转基因瓜尔豆株系中基因拷贝数，从叶子样本中提取基因组DNA用HindIII消化，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。用Hybond N+(Amersham)进行Southern印迹，在生产商推荐的缓冲液中68℃进行预杂交和杂交。DNA探针是用“Ready to go”试剂盒(Pharmacia)随机活化标记的PMI基因或GUS基因。在杂交缓冲液中加入1×10⁶CPM/ml的标记引物。

图1给出用PMI基因作探针的Southem印迹分析。除泳道1外，每一泳道均有2.1kb的深带，2.1kb是用HindIII消化得到的预期的DNA片段大小。泳道1显示相似大小的一种浅带。泳道8是非转基因瓜尔豆株系(line)。

图2给出用GUS基因作探针的Southem印迹分析，大多数泳道显示一种深带，表明这些株系含有一份GUS基因，泳道7中DNA消化得到4条带，表示该株系含4份GUS基因。泳道8是非转基因瓜尔豆株系。

图1给出转基因瓜尔豆株系的基因组Southern分析。不同转基因瓜尔豆株系的10μg基因组DNA用HindIII消化，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。DNA印到Hybond N+上，与含有〔³²P〕dCTP标记的PMI基因的探针杂交。〔³⁵S〕DNA标记物(Amersham)用作分子量标记物(MW)。

图2给出转基因瓜尔豆株系的基因组Southern分析。不同转基因瓜尔豆株系的10μg基因组DNA用HindIII消化，在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。DNA印到Hybond  N+上，与含有〔³²P〕dCTP标记的GUS基因的探针杂交。〔³⁵S〕DNA标记物(Amersham)用作分子量标记物(MW)。实施例11转基因后代的分析

在一些独立的瓜尔豆转化体中研究了转基因的遗传和分离。初级转化体自交，播下一定量种子(10-20个)。GUS检测(见上)显示出第二代植株中GUS基因的存在。

转化体序号	播种数	GUS阳性数目	GUS阴性数目	GUS阳性百分比％
					P16	20	11	9	55％
P18	20	12	8	60％
					P31	10	7	3	70％

该表显示GUS基因稳定遗传，近似单个显性基因分离。另外，GUS基因保持其活性。

Claims (33)

1.一种瓜尔豆属的遗传修饰植物或植物部分，该植物或植物部分在其基因组中含有至少一段重组DNA序列。

2.权利要求1的瓜尔豆的遗传修饰植物或植物部分，该植物为瓜尔豆。

3.得自权利要求1或2的植物的种子、幼苗或植物部分。

4.一种生产瓜尔豆属的遗传修饰植物或其部分的方法，其包括下列步骤：将一段重组DNA序列导入至少一个细胞或原生质体，用至少一种选择培养基或生芽培养基，生成遗传修饰的外植体，以得到在基因组中含有至少一段重组DNA序列的遗传修饰植物或其部分，所述培养基中包含至少一种选自生长素抑制物、β-内酰胺酶抑制物和乙烯抑制物的化合物。

5.权利要求4的方法，其中用含有至少一种生长素抑制物和一种β-内酰胺酶抑制物的选择培养基和含有至少一种β-内酰胺酶抑制物的生芽培养基，生成遗传修饰的芽。

6.权利要求5的方法，其中选择培养基含有一种生长素抑制物、一种β-内酰胺酶抑制物和一种乙烯抑制物，生芽培养基含有一种生长素抑制物和一种乙烯抑制物。

7.权利要求4-6中任一权项的方法，其中生长素抑制物是2-对氯苯氧基-2-甲基丙酸(PCIB)，β-内酰胺酶抑制物是舒巴坦。

8.权利要求4-7中任一权项的方法，其中选择培养基中含有作为生长素抑制物的PCIB，浓度为0.01-10mg/l，作为β-内酰胺酶抑制物的舒巴坦，浓度为10-1000mg/l，生芽培养基中含有作为β-内酰胺酶抑制物的舒巴坦，浓度为10-1000mg/l。

9.权利要求8的方法，其中选择培养基含有PCIB，浓度为0.05-5mg/l，例如0.1-2mg/l。

10.权利要求8或9的方法，其中选择培养基和/或生芽培养基含有舒巴坦，浓度为20-500mg/l，例如50-200mg/l。

11.权利要求4-10中任一权项的方法，其中选择培养基进一步含有卡那霉素。

12.权利要求11的方法，其中选择培养基含有卡那霉素硫酸盐，浓度50-300mg/l，典型地为100-200mg/l，例如130-160mg/l。

13.权利要求12的方法，其中外植体从选择培养基转移到第二选择培养基，该培养基含有的卡那霉素硫酸盐浓度比第一选择培养基中的低，优选地不超过125mg/l，典型地为20-100mg/l，例如30-70mg/l。

14.权利要求4-13中任一权项的方法，其中选择培养基和/或生芽培养基含有作为乙烯抑制物的硫代硫酸银，浓度最高为50μM。

15.权利要求14的方法，其中选择培养基和/或生芽培养基含有硫代硫酸银，浓度为0.1-10μM，例如0.5-5μM。

16.权利要求4-15中任一权项的方法，其中选择培养基和/或生芽培养基进一步含有镍盐。

17.权利要求4-16中任一权项的方法，其中选择培养基和/或生芽培养基进一步含有赤霉素。

18.权利要求4-17中任一权项的方法，其中选择培养基和/或生芽培养基进一步含有青霉素类的抗生素，如羧苄青霉素或头孢噻肟。

19.权利要求4-18中任一权项的方法，其中转化在子叶上进行。

20.权利要求19的方法，其中子叶来自萌发至少4天的种子，典型地为至少7天，例如至少10天。

21.权利要求4-20中任一权项的方法，该方法用于生产瓜尔豆的遗传修饰植株。

22.权利要求4-21中任一权项的方法，其中遗传修饰的芽嫁接到幼苗或移植生长的生根植株上。

23.一种生产遗传修饰植物的方法，其中至少一种用于细胞、原生质体、愈伤组织或植物部分的选择或生长的培养基含有至少一种下述物质，该物质可抑制细菌生长或者增强细菌生长抑制物的作用而没有任何显著的植物生长调节作用或植物毒性作用。

24.权利要求23的方法，其中所述物质是一种β-内酰胺酶抑制物。

25.权利要求24的方法，其中β-内酰胺酶抑制物是舒巴坦。

26.权利要求25的方法，其中舒巴坦存在于至少一种选择培养基或生长培养基中，浓度为10-1000mg/l，典型地是20-500mg/l，例如50-200mg/l。

27.权利要求24-26中任一权项的方法，其中在生产β-内酰胺酶的菌株的存在下，β-内酰胺酶抑制物与减量的抗生素一起使用。

28.权利要求23-27中任一权项的方法，其中所述物质用于土壤杆菌介导的基因转移。

29.权利要求23-28中任一权项的方法，其中细菌生长抑制物被用于生产瓜尔豆的遗传修饰植株。

30.能够生产转基因种子的嵌合植物，它是通过将体外培养的遗传修饰芽嫁接到非体外培养的植株上而获得的。

31.权利要求30的嵌合转基因植物，它属于蝶形花科。

32.权利要求31的嵌合转基因植物，它属于瓜尔豆属。

33.权利要求32的嵌合转基因植物，它是瓜尔豆。

Images